CONSTRUCCIÓN DEL MISMO

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La invención, tal como expresa el enunciado de la presente memoria descriptiva, se refiere a un dispositivo analítico inmunosensor y al método de construcción de dicho dispositivo. Más en particular, el objeto de la invención se centra en un dispositivo analítico inmunosensor basado en la deposición secuencial de monocapas autoensambladas de polímeros y elementos de afinidad, aplicable para la detección y cuantificación de cualquier analito o antígeno diana en una muestra líquida, y que hace posible realizar el ensayo por desplazamiento, minimizar la adsorción no específica y disminuir por tanto el límite de detección, para todo lo cual dicho dispositivo se configura a partir de una superficie sensora cubierta por monocapas de polímeros (redox o no redox) sobre la que se depositan submonocapas de elementos de afinidad, para posteriormente realizar la reacción de afinidad con un antígeno, peudo- antígeno o un hapteno, que puede estar marcado con una proteína, preferiblemente una enzima (redox o no redox), con un compuesto o una nanopartícula, permitiendo dicho método de construcción del dispositivo desarrollar inmunosensores "a la carta", al poder transducir la señal de manera electroquímica, óptica, y/o piezoeléctrica.

CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El campo de aplicación de la presente invención se enmarca dentro del sector de la industria dedicada a la fabricación de dispositivos analíticos, estando especialmente centrado en el ámbito de los sensores, sondas, sistemas y métodos de detección y cuantificación de analitos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Como es sabido, los sensores e inmunosensores constituyen dispositivos de análisis que se configuran como una herramienta analítica fiable y sencilla que, además, presenta la ventaja de ser barata, portátil, selectiva, de fácil manejo y que requiere de pocos microlitros de muestra para determinar un parámetro concreto. De manera general un sensor o biosensor químico es cualquier dispositivo miniaturizado capaz de responder de manera inequívoca a un analito concreto en el seno de una muestra compleja. Consta, esencialmente, de dos partes: el elemento de reconocimiento que interactúa con el analito y concede selectividad al sensor, y el transductor que permite convertir esa interacción en una señal analítica.

Por su parte, un inmunosensor es un biosensor en el cual el componente biológico es un inmunorreactivo. Generalmente el elemento objetivo es el antígeno (el analito) o el hapteno y el anticuerpo se adhiere al transductor, aunque en algunos casos se obtiene una mejor respuesta cuando el analito, o una forma modificada de él, se adhiere al transductor.

Recientemente el diseño de los biosensores se ha visto implementado por la incorporación de la microelectrónica, las nanotecnologías y los biomateriales mejorando así sus características analíticas y dando lugar una herramienta clave en aquellos casos donde se requiera una toma de decisiones rápida.

La posibilidad de ofrecer información a tiempo real, su sencillez, su uso por personal no especializado y su capacidad para la monitorización en el tiempo, son características que están proporcionando claras ventajas sobre herramientas analíticas convencionales. En este sentido, se necesitan sistemas versátiles que puedan ser diseñados "ad hoc", y por tanto permitan una sencilla implantación. Los (bio)sensores construidos sobre plataformas heterofuncionales permiten identificar y cuantificar compuestos de diferente naturaleza, utilizando elementos de biorreconocimiento en combinación con diferentes principios de transducción e integración de las señales obtenidas.

Para la construcción de las plataforma heterofuncionales destaca la técnica capa por capa (LbL "Layer-by-layer"), que es una técnica en la que las películas se forman depositando capas alternas de materiales de carga opuesta con pasos de lavado intermedios. Las bicapas y los pasos de lavado se pueden realizar de muchas maneras diferentes, incluyendo el recubrimiento por inmersión, recubrimiento por rotación, recubrimiento por pulverización y técnicas de flujo. Las ventajas que ofrece sobre otros métodos de deposición de película delgada es que es extremadamente simple y barata. Hay una amplia variedad de materiales que pueden ser depositados por LbL incluyendo poliiones, metales, cerámicas, nanopartículas y moléculas biológicas. Otra cualidad importante de LbL es el alto grado de control sobre el grosor, que surge debido al crecimiento lineal de las películas con el número de bicapas. Ya que cada bicapa puede ser del orden de unos pocos nm, este método ofrece un fácil control sobre el espesor de la estructura. El objetivo de la presente invención es, pues, el desarrollo de un método para la construcción de un dispositivo analítico que describe la incorporación de elementos de detección y soporte, mediante su inmovilización física creando una interfase organizada y nanoestructurada. Esta arquitectura sensora objeto de la presente invención permitirá, por ejemplo, la detección de sustancias de interés en el campo agroalimentario, biosanitario y medioambiental con cualquier tipo de transducción. Como referencia al estado de la técnica, debe mencionarse la existencia de diferentes registros de patente que divulgan dispositivos analíticos del tipo que aquí concierne, siendo los más próximos los siguientes:

- Patente US 2002/0137193 A1 26.09.2002 que hace referencia a un sistema de ensayo para la detección de una reacción de afinidad de una pareja de ligando-receptor (primer componente y segundo componente), el cual consiste en revestir el electrodo con un polímero redox reticulado que contiene un agente de unión, una enzima que genera un producto, (ambos unidos covalentemente al hidrogel redox) y el primer componente de la pareja receptor-ligando. El complejo que se forma, genera una señal eléctrica cuando se aplica un potencial al electrodo, de manera que la señal eléctrica generada se encuentra relacionada con la presencia o cantidad del segundo componente en la muestra. El primer componente se encuentra inmovilizado en un polímero redox sobre el electrodo. El polímero redox puede ser un polímero de poli(vinil piridina) (poly (4-vinyl pyridine). Además dichos polímeros redox se pueden encontrar formando complejos con metales de transición tales como osmio.

- Patente US 5534132 A 09.07.1996 que describe un biosensor amperométrico para la detección de reacciones de afinidad. Se trata de un electrodo que tiene su superficie sustancialmente cubierta con una lámina de traducción que comprende un hidrogel polímero tridimensional en el que se encuentra inmovilizada una unidad de unión (SBU, selective binding unit) o su complementaria. El agente de unión selectivo sirve para introducir el componente complementario marcado con la enzima redox en el hidrogel, generándose, de este modo, una respuesta amperométrica a través de una reacción de reducción/oxidación electrocatalítica del sustrato de enzima y una transducción de la actividad enzimática redox a través del hidrogel al electrodo. Los polímeros redox utilizados en dicho documento son, entre otros, polímeros derivados de poli(vinil piridina) con complejos de osmio cuaternizados con bromuro de bromoetilamina, para formar un polímero redox reticulable hidrofílico. El documento PN - US2007092973 A1 divulga un film sensor de magnesio formado por un indicador, una sal cuaternaria de amonio, fosforo o imidazol, un surfactante y un ácido. Entre los compuestos químicos que divulga la invención, se encuentra el polímero de carga positiva polietilenimina, y varios agentes de entrecruzamiento derivados de los poli etilenglicoles.

El documento PN - WO0130495 A1 divulga una resina de cambio iónico donde aparecen como agentes de entrecruzamiento de superficie el etilenglicol diglicidil éter y la polietilenimina entre otros. Sin embargo, no se menciona su utilización como sensor amperométrico para la detección de iones magnesio.

Además, como publicaciones de literatura científica, cabe mencionar la existencia de los siguientes documentos:

Reagentless biosensors based on selfdeposited redox polyelectrolyte- oxidoreductases architectures. ARANTZAZU NARVAEZ ET AL. BIOSENSORS & BIOELECTRONICS vol. 15, 2000, páginas 43-52, en el que se describen biosensores basados en la autodeposición de polielectrolitos mediante la técnica LbL (layer-bylayer) sobre la superficie de un electrodo de oro cargado negativamente. Se utiliza también un polímero redox basado en Os.

Electrostatic assemblies for bioelectrocatalytic and bioelectronic applications. ELENA DOMINGUEZ ET AL. ELECTROANALYSIS vol 18, 2006, páginas 1871 -1878, que trata sobre el uso de la tecnología de ensamblaje LbL (layer -by-layer) de electrolitos para la transducción de reacciones catalíticas y de afinidad. Surface charge effects on the redox switching of LbL self-assembled redox polyelectrolyte multilayers. MARIO E. TAGLIAZUCCHI, ERNERTO J. CALVO. JOURNAL OF ELECTROANALYTICAL CHEMISTRY, vol.599, 2007, páginas 249-259, que se refiere a estudios que se llevaron a cabo sobre el efecto de la carga superficial en la transferencia de electrones y la propagación de la carga en multicapas de poli-electrolitos redox autoensamblados electroquímicamente por la técnica LbL (layer by layer).

A la vista de los documentos citados se constata, como era de esperar, que existen en el estado de la técnica imnunosensores electroquímicos basados en la deposición de monocapas de polielectrolitos, así como distintos tipos de sensores amperométricos, sin embargo, ninguna de las invenciones y documentos citados, tomados por separado o en combinación, describe concretamente las características técnicas y constitutivas del dispositivo analítico inmunosensor y el método de construcción de la presente invención, según se reivindica. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Así, lo que la presente invención propone es el desarrollo de un dispositivo analítico que se configura como soporte universal para la construcción de inmunosensores "quasi-reagentless y/o reagentless", ya que se refiere al desarrollo de un método para la construcción de inmunosensores basados en la deposición secuencial de monocapas de polímeros y elementos de afinidad, creando arquitecturas sensoras autoensambladas. Esta construcción se caracteriza por la deposición de una pequeña cantidad de elementos de afinidad que permite la detección del analito en cuestión, mediante un ensayo por desplazamiento.

Más en concreto, el objeto de la invención consiste en un dispositivo analítico constitutivo de una superficie sensora cubierta por monocapas de polímeros (redox o no redox) sobre la que se depositan submonocapas de elementos de afinidad, para posteriormente realizar la reacción de afinidad con un bioconjugado (pseudo-antígeno, hapteno o antígeno que está marcado con un trazador que puede ser una molécula, biomolécula o nanopartícula. Este trazador produce una señal medible).

Estas estructuras permiten desarrollar inmunosensores "a la carta", pudiéndose transducir la señal de manera electroquímica, óptica, y/o piezoeléctrica. Por lo tanto la plataforma sensora desarrollada permite diseñar sensores electroquímicos (incluyen sensores amperométricos, potenciométricos, conductimétricos e impedimétricos), sensores ópticos (basados en fibras ópticas, resonancia de plasmón superficial, sensores de onda evanescente), y sensores piezoeléctricos (incluyen sensores de microbalanza y dispositivos de onda acústica), entre otros, estando su aplicación destinada, por ejemplo, a permitir la detección de sustancias de interés en el campo agroalimentario, biosanitario y medioambiental. La presente invención describe, pues, un método universal para la construcción de inmunosensores basados en interacciones electrostáticas en los que se realiza una deposición secuencial de los distintos elementos.

Con ello, el dispositivo preconizado presenta la ventaja de que permite la detección de un analito directamente en un solo paso, sin necesidad de utilizar ningún inmunoreactivo adicional y en un intervalo de tiempo no mayor de 30 minutos. Esta disposición de polímeros crea una interfase nanoestructurada que permite la deposición de una submonocapa de anticuerpos y del bioconjugado (unido al anticuerpo por afinidad). El dispositivo analítico desarrollado hace posible realizar el ensayo por desplazamiento, minimizar la adsorción no específica y disminuir por tanto el límite de detección. La muestra (pre-tratada o no) es incubada directamente sobre el dispositivo desarrollado, tras un lavado y la adición de un sustrato (si fuera necesario), y se obtiene una respuesta que puede ser electroquímica, óptica o microgravimétrica, o una combinación de éstas. Conviene destacar que el dispositivo analítico preconizado o interfase sensora objeto de la invención permite utilizar una transducción óptica, electroquímica y/o microgravimétrica, según requiera el tipo de análisis. Además, el método de construcción del mismo permite depositar una submonocapa de cualquier anticuerpo y de su bioconjugado, por lo que el dispositivo resultante puede detectar y cuantificar cualquier analito o antígeno diana, para el cual tenga afinidad el anticuerpo elegido.

En definitiva, la invención propone la construcción de un inmunosensor rápido, compacto, y de bajo coste, configurándose como una estructura sensora que, ventajosamente, permite analizar la muestra en un único paso de incubación, sin necesidad de añadir ningún inmunoreactivo.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo analítico inmunosensor que comprende las siguientes capas:

(a) una interfase sensora;

(b) una capa de anticuerpos ensamblada en la capa polimérica catiónica de la interfase sensora; y

(c) un bioconjugado unido por afinidad a la capa de anticuerpos;

caracterizado porque la interfase sensora (a) comprende las siguientes capas secuenciales y ensambladas:

(i) una superficie sensora modificada con compuesto de carga negativa que comprende el grupo -X-(CH ₂ ) _y -S0 ^3" : donde X se selecciona de los grupos -S-, -NH- o -COO-; e y tiene un valor de entre 1 y 6; y

(ii) una estructura polimérica que comprende una capa polimérica que contiene un polímero catiónico.

Por "bioconjugado" se entiende en la presente invención a un antígeno o a un hapteno, con afinidad con el anticuerpo y unido a un trazador que puede ser un compuesto, una nanopartícula o una biomolécula capaz de producir una señal electroquímica, óptica o microgravimétrica o combinaciones adecuadas para una determinación analítica por desplazamiento. El bioconjugado, también puede ser un "pseudo-antígeno", es decir, un antígeno modificado, mediante grupos funcionales para que se le pueda unir a un trazador y de esta forma también se puede modular la afinidad si fuese necesario, y está combinado con un trazador que puede ser un compuesto, una nanopartícula o una biomolécula capaz de producir una señal detectable. El tipo de bioconjugado a utilizar va a depender del analito a detectar junto con los anticuerpos que se seleccionen en la capa anterior y del tipo de señal a detectar, la selección del mismo sería conocimiento general para cualquier experto en la materia.

La biomolécula capaz de producir una señal detectable puede ser o comprender una proteína, más concretamente una enzima (recombinante o no) o una fracción enzimática o una proteína no catalítica. El compuesto capaz de producir una señal detectable puede ser o comprender un cromóforo, un fluoróforo o un radioisótopo.

Por "fracción enzimática" se entiende en la presente invención a una cadena de polipéptidos con actividad catalítica o no. En la presente invención podría ser, sin limitarse a Microperoxidasa M-1 1 , apoenzimas.

Enzimas que se pueden utilizar en la presente invención serían, sin limitarse a, Peroxidasas, como la HRP, Tirosinasas o fosfatasas alcalinas.

Proteínas no catalíticas que se podrían utilizar en la presente invención serían sin limitarse a Seroalbúmina bovina (BSA), lactoalbúmina u ovoalbúmina.

Fluróforos que se pueden utilizar en la presente invención serían, sin limitarse a Fluoresceina y derivados, Rodamina, Cloruro de dansilo, derivados de cumarina o proteínas fluorescentes como la Proteína Verde (GFP). Radioisótopos que se pueden utilizar en la presente invención serían, sin limitarse a ³ H, ¹²⁵ l o ¹⁴ C.

Nanopartículas que se puede utilizar en la presente invención serían, sin limitarse a nanopartículas de oro, plata, quatum-dots, nanotubos, nanohilos, dendrímeros.

En una realización preferida la superficie sensora modificada con compuesto de carga negativa que comprende el grupo -X-(CH ₂ ) _y -S0 ^3" : donde X se selecciona de los grupos -S-, -NH- o -COO-; e y tiene un valor de entre 1 y 3; y más preferiblemente X es -S- y aún más preferiblemente el compuesto de carga negativa es MPS (sulfonato de 3-mercapto-1 -propano). La superficie sensora puede ser cualquier sustrato dependiendo de tipo de inmunosensor, preferiblemente es una superficie plana y puede estar compuesto por un metal, vidrio, cuarzo, material cerámico, plástico o materiales serigrafiados, por ejemplo puede ser de oro, platino, vidrio o carbono vitrificado, que a su vez pueden estar modificados con coloides de mismos o de otro material, entre otros conocidos por cualquier experto en la materia.

La estructura polimérica contiene un polímero catiónico que puede ser redox o no, son polímeros conductores con grupos que se disocian en disoluciones acuosas por lo que quedan como polímeros cargados con cationes. Los polímero redox pueden estar formados por complejante de compuestos de osmio, rutenio o cobalto con bipiridilo, poli(imidazolvinilo), polietilenimina o poli(vinilpiridina) o con un copolímero.

En una realización preferida la estructura polimérica contiene un polímero redox con osmio, o rutenio o derivados del ferroceno, por ejemplo poly(vinilferroceno), como centros redox o un polímero no redox catiónico ramificado o no, por ejemplo como la polietilenimina, o cualquier polímero cuaternizado de poli(vinil piridina) con bromoetilamina. En una realización más preferida el polímero catiónico es un polímero redox derivado de la poli(vinil piridina), poli(vinilpiridina)Os(bpy)2CI cuaternizado con bromoetilamina, donde bpy es bipiridina.

Entrando más detalladamente en las características de la invención, la deposición secuencial de polímeros de carga opuesta permite la deposición controlada del anticuerpo de tal suerte que la interfase así desarrollada permite minimizar la adsorción no específica.

En otra realización preferida, la capa del polímero catiónico de la estructura polimérica se puede repetir hasta 10 veces, es decir, que la estructura polimérica puede comprender hasta 1 1 capas secuenciales y ensambladas del polímero catiónico, comprendiendo entre dichas capas una capa polimérica de un polímero aniónico.

El polímero aniónico es un polímero conductor o polielectrolito, por ejemplo pero sin limitarse poli(4-estirenosulfonato de sodio) (PSS) o Poliacrilato de sodio. En una realización preferida el polímero es PSS.

La naturaleza de los anticuerpos que integran la capa o submonocapa de anticuerpos dependerá del analito a determinar y, por tanto, estará relacionado con el antígeno marcado o bioconjugado. Estos anticuerpos pueden ser mono o policlonales.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de obtención del dispositivo descrito anteriormente que comprende:

(a) deposición de un compuesto de carga negativa que comprende el grupo X-(CH ₂ ) _y -SO ^3" : X se selecciona de los grupos -SH, -NH ₂ o -COOH; e y tiene un valor de entre 1 y 6; en una superficie sensora;

(b) deposición de una capa polimérica de un polímero catiónico sobre la superficie sensora modificada con carga negativa en el paso (a); (c) deposición de una capa de anticuerpos sobre la capa depositada en el paso (b); e

(d) incubación del bioconjugado sobre la capa de anticuerpos formada en el paso (c).

En una realización particular el dispositivo obtenido en la paso (d) se almacena en seco y es refrigerado entre 2-10°C.

En otra realización preferida del método además comprende la deposición de n repeticiones de la capa del polímero catiónico comprendiendo entre dichas capas la deposición de un capa polimérica de un polímero aniónico, donde n varia de entre 1 y 10 veces.

En concreto, el dispositivo analítico se construye mediante la deposición de multicapas de polímeros de carga opuesta. Para ello se produce la quimiosorción de un compuesto con carga negativa, por ejemplo de un mercapto derivado cargado negativamente (HS-(CH ₂ ) _y -S0 ^3" ) y más particularmente MPS (sulfonato de 3-mercapto-1 -propano), en la superficie sensora por ejemplo de un electrodo de oro o de cualquier otra superficie sensora como las descritas anteriormente. Sobre esta monocapa se deposita un polímero catiónico (redox o no) que puede ser poliaminado y/o derivados de poli(vinil piridina) y que permite la deposición controlada de una submonocapa de anticuerpo. Posteriormente se realiza la incubación con el bioconjugado el cual puede ser o comprender una enzima que puede ser redox o no redox (peroxidasa, alcalino fosfatasa, tirosinasa, etc.). El sensor construido puede ser almacenado en seco y frío, por un periodo mínimo de 6 meses antes de usarlo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de análisis cualitativo y/o cuantitativo de un analito mediante ensayo por desplazamiento que comprende: (i) incubar el dispositivo descrito en la presente invención directamente con la muestra que comprende dicho analito; y

(ii) medir la señal obtenida. En una realización preferida del método de análisis la señal obtenida puede ser microgravimétrica o el cambio producido de Unidades de Resonancia, una señal óptica o electroquímica, y ser medida mediante balanza de Cristal de cuarzo, mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) o mediante transducción óptica o electroquímica.

En otra realización preferida del método de análisis previamente al paso (ii) de medida, la muestra tras la incubación es lavada, preferiblemente con agua, y se adiciona un sustrato, este sustrato va a depender del trazador del bioconjugado.

Para este tipo de análisis la muestra deberá estar en forma líquida, por tanto si fuera una muestra sólida se deberá efectuar un tratamiento previo de la misma. Las muestras biológicas preferiblemente son muestras aisladas y por tanto los métodos de análisis son in vitro.

De manera general cualquier analito se puede determinar mediante el método descrito y con el dispositivo de la invención, el analito puede ser tanto de naturaleza química como biológica y de su naturaleza dependerá la capa de anticuerpos y el bioconjugado, y se pueden seleccionar entre otros, sin limitarse a residuos como sulfamidas, por ejemplo sulfametoxazol, sulfadiazina, sulfabenzamida, sulfanitrato, sulfapirazol, sulfapiridina o sulfaquinoxalina; fluoroquinolonas, por ejemplo ciprofloxacino, ofloxacino, moxifloxacino o levofloxacino; aminoglucósidos, por ejemplo estreptomicina, neomicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, paromomicina, kanamicina o framicetina; corticosteroides, por ejemplo hidrocortisona, cortisona, deflazacort, prednisolona, prednisona, metilprednisolona, triamcinolona, fludrocortisona, parametasona, dexametasona o betametasona; Micotoxinas como por ejemplo Aflatoxinas, DON, Ocratoxina, Zearelenona, Fumonisina o Toxina T2/HT2; detección en productos del mar como por ejemplo histamina, ácido Domóico o ácido Okadaico; Detección de alérgenos como almendra, altramuz, cacahuete, leche, Huevo, Mostaza o Soja. Para diagnóstico clínico se puede utilizar para biomarcadores neuropatológicos como Αβ-1 -40, Αβ-1 -42, Αβ-1 -17, Tau, a-sinucleina, DJ1 ; de envejecimiento, isoprostanos, ROS, S-100-B, IL-1 JL-6, IL-8, de riesgo vascular y metabólicos como ácido quinurénico, quinurenina y ácido quinolínico, asociados a procesos inflamatorios y tumorales como el CHI3L1 (YKL-40). Los analitos anteriormente listados son ejemplos y no limitan el alcance de protección de la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del dispositivo de la invención para la detección cualitativa y/o la cuantificación de analitos en muestras, tanto químicos como biológicos.

El análisis o detección tanto cualitativa como cuantitativa de estos analitos es particularmente útil para aplicaciones médicas de diagnóstico, para control de calidad de alimentos o de aguas, entre otras aplicaciones de control y seguridad agroalimentaria o medioambiental.

La detección del analito deseado se realiza tras la incubación del sensor directamente con la muestra, donde el analito presente desplaza el bioconjugado previamente unido al anticuerpo dando lugar a una señal detectable, por ejemplo microgravimétrica o un cambio de Unidades de Resonancia, o bien tras un lavado y la adición del sustrato a la producción de una señal óptica o electroquímica. Mediante el análisis por desplazamiento utilizando el dispositivo de la presente invención se consigue una adsorción no específica mínima y considerablemente menor que por un método de análisis competitivo tradicional. Con el fin de demostrar la universalidad del dispositivo analítico desarrollado en cuando al tipo de transducción, se describen a continuación tres ejemplos de transducción diferentes: En un primer ejemplo, el dispositivo analítico puede contener como polímero catiónico un polímero redox derivado de la poli(vinil piridina), (poly[(vinylpyridine)Os(bpy)2CI) cuaternizado con bromoetilamina y el mareaje del antígeno, hapteno o pseudoantígeno se realiza con una peroxidasa (HRP). El desplazamiento del inmunoreactivo unido al anticuerpo por parte del analito presente en la muestra da lugar a una disminución en la respuesta amperométrica, tras un paso intermedio de lavado. En este caso se produce una comunicación electroquímica entre el polímero redox y la enzima de mareaje con una alta eficacia cuando se añade el sustrato de la enzima. Esta alta eficacia en la comunicación electroquímica se produce como resultado de las interacciones electrostáticas entre los módulos o capas de polímeros. La señal resultante de la reducción electrocatalítica del sustrato (H2O2) es inversamente proporcional a la concentración del analito en la muestra. En un segundo ejemplo se muestra la transducción óptica, tanto mediante la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) como espectrofotométrica. Para el tipo de transducción por SPR el polímero utilizado es catiónico (por ejemplo, poliamina o derivado de poli(vinil piridina cuaternizado con bromoetilamina, redox o no) y un mareaje del antígeno, hapteno o pseudoantígeno con una enzima o proteína no catalítica (por ejemplo BSA, o catalítica como la HRP, fosfatasa alcalina, entre otros). En el primer caso el desplazamiento del bioconjugado por parte de la muestra produce una disminución de las unidades de resonancia. Esta disminución es mayor cuanto más analito exista en la muestra. El análisis se realiza en un único paso en el que no es necesario la adición de ningún reactivo, obteniéndose la respuesta en tiempo real. En el caso de la transducción espectrofotométrica la enzima de mareaje es cualquier enzima que catalice la transformación a un producto coloreado como puede ser una HRP o fosfatasa alcalina. Para ello es necesario un paso de lavado tras la incubación de la muestra y la adición de un sustrato, que una vez catalizado por la enzima resulte en un producto coloreado. La señal espectrofotométrica en este caso es inversamente proporcional a la concentración del analito presente en la muestra.

Por último en un tercer ejemplo se muestra un dispositivo con transducción microgravimétrica. Al igual que en el caso de la técnica de SPR, el polímero catiónico puede no ser redox y la molécula de mareaje puede ser una proteína de gran peso molecular como BSA. La medición del analito se realiza en tiempo real tras la incubación con la muestra, donde el analito presente desplazará al bioconjugado produciendo un cambio de frecuencia proporcional a la concentración. Adicionalmente cuando el bioconjugado contiene una HRP o alcalino fosfatasa la señal puede ser amplificada mediante un sustrato que al ser catalizado por la enzima precipite.

En definitiva, el dispositivo analítico inmunosensor preconizado, siendo del tipo basado en la deposición de monocapas, capas de polímeros y elementos de afinidad sobre una superficie sensora, presenta la particularidad de estar configurado a partir de una estructura polimérica que conforma una interfase sensora en la que se deposita una submonocapa de anticuerpo, donde dicho anticuerpo está unido por afinidad con el bioconjugado, y donde dicho bioconjugado, contiene un trazador: una molécula o compuesto, biomolécula o nanopartícula capaz de producir una señal medible.

Por su parte, el analito puede ser detectado (análisis cualitativo) o cuantificado electroquímicamente, cuando la estructura polimérica puede ser un polímero redox, el bioconjugado puede contener una peroxidasa y el sustrato puede ser H ₂ 0 ₂ ; mediante balanza de Cristal de cuarzo, cuando la estructura polimérica podría ser un polímero redox o no redox catiónico, y el bioconjugado puede contener una proteína o una nanopartícula; mediante SPR, cuando la estructura polimérica podría ser un polímero redox o no redox catiónico, y el bioconjugado puede contener una proteína o una nanopartícula; mediante transducción óptica, cuando la estructura polimérica puede ser un polímero redox o no redox catiónico y el bioconjugado puede contener una peroxidasa o fosfatasa alcalina o Tirosinasa.

En la transducción electroquímica u óptica, se puede contemplar una incubación de una gota de muestra, pretratada o no, por un tiempo no inferior a 0,5 minutos, un lavado con agua y la adición de un sustrato apropiado al trazador; y en una detección o cuantificación en tiempo real, mediante balanza de Cristal de Cuarzo o SPR, se puede contemplar una incubación de una gota de muestra, pretratada o no.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña a la presente memoria descriptiva, como parte integrante de la misma, de un juego de esquemas, en los que con carácter ilustrativo y no limitativo se ha representado lo siguiente:

La figura 1 .- Muestra una representación esquemática del dispositivo analítico objeto de la invención, apreciándose en ella la interfase sensora de capas autoensambladas y el desplazamiento del analito.

La figura 2a.- Muestra una gráfica de la curva de calibrado del inmunosensor amperométrico para residuos de antibióticos y corticoides en medio tamponado. La figura 2b.- Muestra una gráfica de la curva de calibrado del inmunosensor amperométrico para residuos de antibióticos y corticoides en una muestra real: leche. La figura 2c- Muestra una gráfica de la estabilidad a la conservación del inmunosensor amperométrico para cuatro analitos diferentes.

La figura 3.- Muestra una gráfica de la curva de calibrado del inmunosensor óptico con transducción SPR para sulfapiridina en medio tamponado.

La figura 4.- Muestra una gráfica de la curva de calibrado del inmunosensor óptico para dexametasona.

La figura 5.- Muestra una gráfica de la curva de calibrado del inmunosensor piezoeléctrico para sulfapiridina.

La figura 6.- Muestra una gráfica comparativa de inmunosensor por desplazamiento, objeto de la invención con un inmunosensor con formato competitivo tradicional.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Como se muestra en la figura 1 , esta invención describe el método para la construcción de un inmunosensor que incluye una superficie sensora modificado por una monocapa de un mercapto-derivado cargado negativamente (HS-(CH ₂ ) _y -S0 ^3" ), como por ejemplo MPS, al que se le ha depositado un monocapa de un polímero catiónico poliaminado y/o derivado de poli(vinil piridina), el cual puede contener Os o Ru como centro redox. (Esta capa catiónica se puede repetir n veces depositando entre ellas una capa de polímero aniónico, n puede tener un valor de 1 a 10). Tras esta capa de polímero catiónico se deposita una submonocapa de anticuerpos, dando lugar a la interfase sensora. Posteriormente se realiza la incubación con el bioconjugado el cual está marcado con una enzima que puede ser redox o no redox (peroxidasa, alcalino fosfatasa, tirosinasa, etc.). El sensor construido puede ser almacenado en seco a 4°C por un periodo mínimo de 6 meses antes de usarlo.

La detección del analito deseado se realiza tras la incubación del sensor directamente con la muestra, donde el analito presente, desplaza al bioconjugado previamente unido al anticuerpo dando lugar a una señal microgravimétrica o un cambio de Unidades de Resonancia, o bien tras un lavado y la adición del sustrato a la producción de una señal óptica o electroquímica. Esta interfase sensora permite:

- Utilizar una transducción óptica, electroquímica y/o microgravimétrica, según requiera el tipo de análisis.

- Depositar una submonocapa de cualquier anticuerpo, por lo que el dispositivo resultante puede detectar y cuantificar cualquier analito o antígeno diana, para el cual tenga afinidad el anticuerpo elegido.

- Analizar la muestra en un único paso de incubación, sin necesidad de añadir ningún inmunoreactivo.

- En la mayoría de los casos no se necesita ningún tratamiento previo de la muestra.

Con el fin de demostrar la universalidad del dispositivo analítico desarrollado, en cuando al tipo de transducción se describen tres ejemplos de transducción diferentes, así como la deposición de diferentes anticuerpos, permitiendo la detección y cuantificación de diferentes analitos o antígenos diana. La figura 1 representa un esquema del dispositivo analítico objeto de esta invención. El método desarrollado para la construcción de la estructura en multicapas está basado en la deposición secuencial de los diferentes polielectrolitos y se llevó a cabo mediante deposición en gota de las distintas disoluciones sobre la superficie sensora. Este método se describe a continuación:

En primer lugar se procedió a la limpieza de la superficie sensora (1 ): Los electrodos serigrafiados de oro fueron proporcionados por la empresa BioSensor Technology GmbH (Berlín, Alemania). El soporte electródico cerámico posee unas dimensiones de 2,5 cm de largo por 0,7 cm de ancho con un electrodo de trabajo de 1 mm de pasta de Au. El electrodo de pseudo-referencia de Ag/AgCI está integrado en el mismo soporte.

Los electrodos se limpiaron electroquímicamente en una disolución H2SO4 5x10 ^"5 M mediante 30 ciclos de 0,1 - 1 ,5 V. De esta forma se eliminaron las impurezas inherentes de la pasta de serigrafía. La primera monocapa para la construcción del sensor fue la generada por la quimisorción de un mercapto derivado sobre la superficie de oro limpia. Por tanto, sobre una superficie sensora (1 ) anterior se depositó una monocapa autoensamblada de un mercapto derivado (2) cargado negativamente. Para ello la superficie se incubó con 4 μί de una disolución 1 :1 (EtOH/h O) al 50 % de 3-mercapto-1 -propano ácido sulfónico sal de sodio (MPS) 1 mM durante 12 horas a 6°C. (en la figura 1 la capa de mercapto se ha representado como SO ^3" ). Transcurrido el periodo de incubación, los electrodos se sometieron a un abundante lavado con etanol seguido de agua desionizada.

Posteriormente se deposita por interacciones electrostáticas un polímero redox catiónico, poli[(vinilpiridine)Os-(bpy) ₂ CI] parcialmente cuaternizado con Bromoetilamina (P ⁺ ) (3). La inmovilización del polímero redox catiónico sobre los electrodos Oro/MPS se realizó por la incubación de 2 μΙ_ de una disolución acuosa del polímero de 1 mg ml_ ^"1 durante 2 horas, protegidos de la luz y bajo una temperatura controlada de 27°C. Posteriormente, se lavó con agua desionizada y se secaron con corriente de nitrógeno. Esta capa puede hacerse crecer las veces necesarias intercalando un polielectrolito (4) que revierta la carga, como el sulfonato de poliestireno (PSS), a una concentración de 250 μΜ (n puede tener valores entre 1 y 10). Para completar la interfase sensora se depositan los anticuerpos (5) a concentración variable, del orden de pg ml_ ^"1 dependiendo del anticuerpo utilizado en el desarrollo del sensor. Esta interfase sensora (1 -5) y objeto de la invención es común a todos los dispositivos desarrollados e independientemente del tipo de transducción utilizado.

Sobre esta interfase se unen por reacción de afinidad sus bioconjugados (6) marcados específicamente según el tipo de transducción deseada.

La construcción de las capas (5) y (6) específicas para los distintos inmunosensores para cada uno de los analitos diana ejemplarizados, se detalla a continuación:

-Sulfamidas: Para la familia de las Sulfamidas se utilizaron anticuerpos policlonales y bioconjugado específicos, los cuales fueron sintetizados de acuerdo al protocolo descrito en bibliografía (Adrián, et al., J.Agric. Food Chem., 2009, 57, pág. 385-394; Adrián, et al., Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391 , pág. 1703-1712). Para estos inmunosensores se utilizaron 2 μΙ_ de una disolución acuosa del anticuerpo a una concentración de 60 pg ml_ ^"1 durante 2 horas, bajo una temperatura controlada de 27°C. Posteriormente, se lavaron con tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0. Posteriormente los sensores conteniendo el anticuerpo se incubaron con 2 μΙ_ de la disolución del bioconjugado 2,5 mg L ^"1 disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Se lavaron con el mismo tampón fosfato y se secaron.

-Fluoroquinolonas: Para la familia de las Fluoroquinolonas se utilizaron anticuerpos policlonales y bioconjugados específicos, proporcionados por el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de Barcelona (AMRG-CSIC) y se sintetizaron de acuerdo al protocolo descrito en bibliografía (Adrián, et al., J.Agric. Food Chem., 2009, 57, pág. 385-394; Adrián, et al., Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391 , pág. 1703-1712).

Para estos inmunosensores se utilizaron 2 μΙ_ de una disolución acuosa del anticuerpo a una concentración de 10 pg ml_ ^"1 durante 2 horas, bajo una temperatura controlada de 27°C. Posteriormente, se lavaron con tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0.

Posteriormente los sensores conteniendo el anticuerpo se incubaron con 2 μΙ_ de la disolución del bioconjugado 2,1 mg L ^"1 disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Se lava con el mismo tampón fosfato y se seca.

-Aminoglucósidos: Para la familia de los Aminoglucósidos se utilizaron anticuerpos policlonales y bioconjugados específicos, que fueron proporcionados por el grupo de Biomedicina del Departamento de Farmacia del King ^' s College en Londres (Reino Unido). Fueron sintetizados de acuerdo al protocolo descrito en bibliografía (Abuknesha, et al., Journal of Inmunological Methods, 2005, 306, pág. 21 1 -217).

Para estos inmunosensores se utilizaron 2 μΙ_ de una disolución acuosa del anticuerpo a una concentración de 12 pg ml_ ^"1 durante 2 horas, bajo una temperatura controlada de 27°C. Posteriormente, se lavaron con tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0.

Posteriormente los sensores conteniendo el anticuerpo se incubaron con 2 μΙ_ de la disolución del bioconjugado 3,0 mg L ^"1 disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Se lavaron con el mismo tampón fosfato y se secaron.

-Glucocorticoides: Para esta familia se utilizaron anticuerpos policlonales y bioconjugados comerciales (anti-dexa ref.1098, dexa-HRP ref. C1098) suministrados por la empresa Vitaltech (Barcelona, España). Los sensores modificados se incubaron con 2 μΙ_ de una disolución acuosa del anticuerpo a una concentración de 9 pg mL ^"1 durante 2 horas, bajo una temperatura controlada de 27°C. Posteriormente, se lavaron con tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0.

Posteriormente los sensores conteniendo el anticuerpo se incubaron con 2 μΙ_ de la disolución del bioconjugado 1 ,9 mg L ^"1 disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Se lavaron con el mismo tampón fosfato y se secaron.

Estos bioconjugados (6) son desplazados o removidos de la superficie en presencia del analito o antígeno diana (7), permitiendo detectar y cuantificar concentraciones traza y ultratraza de determinados analitos.

En el caso de inmunosensores con detección amperométrica, el bioconjugado está marcado con una enzima redox, en este caso HRP (peroxidasa de rábano) que tras la adición de H ₂ 0 ₂ produce una corriente amperométrica directamente proporcional a la cantidad de peroxidasa presente en el inmunosensor. El analito diana (7) presente en la muestra va a desplazar al bioconjugado previamente unido a la interfase sensora (1 -6), dando lugar a una disminución de la respuesta electroquímica, relacionada con la concentración del analito de interés. Este sistema de ensayo permite detectar el analito sin tratamiento previo de la muestra.

El protocolo analítico consistió en incubar las diferentes muestras en las superficies de los electrodos previamente modificados. Tras no más de 30 minutos, las superficies electródicas se lavaron con agua desionizada y se introdujeron en una disolución sustrato, dando lugar a una respuesta amperométrica inmediata. Las medidas amperométricas de los inmunosensores selectivos fueron obtenidas por un analizador AUTOLAB (Eco Chemie B.V, Holanda) con el software integrado GPES 4.9. El análisis de las curvas de calibrado fueron realizadas a través del software GraphPad Prism TM (GraphPad Software INC, San Diego, California, USA).

Los inmunosensores preparados con las estructuras descritas anteriormente fueron testados entre otros para la determinación de residuos de antibióticos y glucocorticosteroides en muestras de leche, empleando un inmunoensayo competitivo por desplazamiento con detección amperométrica.

Las figuras 2a y 2b ilustran una aplicación sobre superficies electródicas de oro serigrafiado en inmunosensores amperométricos descritos anteriormente. La figura 2a corresponde a la curva de calibrado del inmunosensor amperométrico para residuos de antibióticos y corticoides en medio tamponado.. Y la figura 2b corresponde a la curva de calibrado del inmunosensor amperométrico para residuos de antibióticos y corticoides en una muestra real: leche. Condiciones experimentales para ambas figuras fueron: 250 μΜ H ₂ 0 ₂ en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 a 27°C. E _ap i: 0 mV vs. Ag/AgCI, KCI _sa t El volumen final en celda fue de 16 mL y la disolución de H ₂ 0 ₂ fue preparada a partir de una disolución "stock" protegida de la luz. Ambas figuras relacionan la concentración de analito detectable presente en muestras dopadas en medio tamponado (figura 2a) y en muestras de leche dopadas (figura 2b), tras el cambio en la respuesta amperométrica. De esta manera se detectaron diferentes analitos como dexametasona, sulfapiridina, ciprofloxacino y estreptomicina. La figura 2c muestra la estabilidad de este tipo de dispositivos. Para verificar la estabilidad de los electrodos, los inmunosensores anteriormente descritos fueron almacenados con todos los elementos que lo conforman durante 12 meses, secos y a 4°C de temperatura. Con el fin de establecer la estabilidad de los diferentes inmunosensores, se evaluó su respuesta máxima amperométrica.

Para la transducción óptica mediante la técnica SPR (Resonancia de Plasmón Superficial), la interfase sensora (1 -6) descrita anteriormente, se unió al bioconjugado marcado con una proteína (en este ensayo el trazador utilizado es HRP) en medio tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 durante 10 minutos a un flujo de 10 μί/ΐΎΐίη . (figura 3). En este caso concreto los anticuerpos (5) fueron depositados sobre la superficie de los electrodos modificados mediante un sistema de flujo en un medio tampón acetato pH 4,5 durante 15 minutos a un flujo de 10 μΙ_/ιτΉη .

Al inyectar el analito (7), éste va a desplazar el bioconjugado (6) previamente unido a la interfase sensora (1 -6), dando lugar a una disminución de las unidades de resonancia relacionada con la concentración del analito de interés. Este sistema de ensayo permite detectar el analito diana sin tratamiento previo de la muestra y sin la adición de ningún reactivo ("reagentless").

La citada figura 3 ilustra una curva de calibrado del inmunosensor óptico con transducción SPR para sulfapiridina en medio tamponado. El analito, en este caso sulfapiridina fue inyectado a diferentes concentraciones (desde 0,01 μg/L hasta 200 mg/L)(c-d-e) en medio tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 a un flujo de 10 μΙ_/ΐΎΐίη. El cambio de resonancia fue monitorizada con un BIACORE X Software Set,(GE Healthcare, California USA). El análisis de las curvas de calibrado ha sido realizado a través del software GraphPad Prism TM (GraphPad Software INC, San Diego, California, USA). En la gráfica se muestra la curva de calibrado del inmunosensor óptico con por SPR para la sulfapiridina en medio tamponado con el formato competitivo por desplazamiento. Demostrando que este tipo de formato funciona independientemente del tipo de transducción que se utilice. En el caso de la transducción espectrofotomética, la interfase sensora (1 -6) es unida a un bioconjugado marcado con una enzima que cataliza la transformación a un producto coloreado, enzima que puede ser una HRP o fosfatasa alcalina (en este ensayo el trazador utilizado es HRP, fig. 4). Para ello la interfase sensora se incubó con una disolución del bioconjugado disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Transcurrido ese tiempo, los inmunosensores se lavaron con tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 y almacenados a 4°C hasta el momento de análisis.

Los inmunosensores preparados con las estructuras descritas y optimizadas fueron testados para la determinación de dexametasona en medio tamponado. Tras no más 30 minutos de incubación con las muestras, las superficies sensoras se lavaron con agua desionizada y se introdujeron en una disolución sustrato. Esta disolución fue leída espectrofotométricamente a 650nm en un espectrofotómetro UV/visible UV-160A (SHIMADZU, Columbia, USA). El análisis de las curvas de calibrado ha sido realizado a través del software GraphPad Prism TM (GraphPad Software INC, San Diego, California, USA). Este sistema de ensayo permite detectar analitos sin tratamiento previo de la muestra. La figura 4 ilustra una curva de calibrado del inmunosensor óptico con transducción espectrofotométrica para dexametasona en medio tamponado. Condiciones experimentales: adición sustrato 0,01 % 3, 3', 5, 5'- tetrametilbenzidina y 0,004% H2O2 en 30 tampón citrato pH 5,5. Lectura a 650nm.

Por último, en el caso de la transducción microgravimétrica, la interfase sensora (1 -6) descrita anteriormente, se unió a un bioconjugado marcado con una proteína (en este ensayo correspondiente a la figura 5 el trazador utilizado es HRP) en medio tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Transcurrido ese tiempo, los inmunosensores fueron lavados con tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 y almacenados a 4°C hasta el momento de análisis. En esta ocasión la superficie sensora se ha construido sobre 5 MHz AT-cut cristales de cuarzo con un electrodos de oro cuya área geométrica es de 1 ,37 cm ² . Estos electrodos fueron limpiados previamente a su modificación con una disolución de piraña (70% H ₂ S0 ₄ 30% H ₂ 0 ₂ ) durante 30 minutos y con una disolución de KOH saturada otros 30 minutos. Para finalizar el proceso de limpieza se sumergieron posteriormente los electrodos en una disolución de H ₂ S0 ₄ concentrado (18 M) durante 30 minutos y en una disolución de HNO3 concentrada (6 M) durante 15 minutos.

Posteriormente se construyeron los inmunosensores siguiendo el método descrito anteriormente, es decir, con las mismas capas y la misma metodología descrita anteriormente. Las mediciones de frecuencia se realizaron mediante un medidor de frecuencia Maxtek PM-710 con fuente de potencial integrada. Los datos se registraron y procesaron mediante la conexión del sistema a un ordenador utilizando en programa PMDATALG (Maxtek Inc.).

Los inmunosensores preparados con las estructuras descritas y optimizadas fueron testados para la determinación de sulfapiridina en medio tamponado. La medición del analito se realiza en tiempo real tras la incubación con la muestra, donde el analito presente desplazará al bioconjugado, produciendo un cambio de frecuencia proporcional a la concentración. Adicionalmente cuando el trazador es una HRP o alcalino fosfatasa la señal puede ser amplificada mediante un sustrato que al ser catalizado por la enzima, precipite. Este sistema de ensayo permite detectar el analito diana sin tratamiento previo de la muestra y sin la adición de ningún reactivo ("reagentless").

Una curva de calibrado del inmunosensor desarrollado para sulfapiridina con transducción microgravimétricas en un medio tamponado se muestra en la figura 5. Condiciones experimentales: incubación 100μΙ_ de muestra en medio tamponado 0,1 M pH 7,0.

Descrita suficientemente la naturaleza de la presente invención, así como la manera de ponerla en práctica, no se considera necesario hacer más extensa su explicación para que cualquier experto en la materia comprenda su alcance y las ventajas que de ella se derivan, haciéndose constar que, dentro de su esencialidad, podrá ser llevada a la práctica en otras formas de realización que difieran en detalle de la indicada a título de ejemplo, y a las cuales alcanzará igualmente la protección que se recaba siempre que no se altere, cambie o modifique su principio fundamental. Ejemplo: Comparativa ensayo competitivo tradicional o por desplazamiento objeto de la invención

La figura 6 representa dos curvas de calibrado para diferentes concentraciones de dexametasona en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 en un formato de ensayo competitivo ( A) y por desplazamiento (■). Las barras de error indican las desviaciones estándar de 15 electrodos por concentración.

La primera de ellas ( A) se ha obtenido siguiendo un protocolo de ensayo competitivo tradicional en el que el bioconjugado y la muestra se mezclan, siendo esta mezcla la que se incuba con el sensor que contiene el anticuerpo inmovilizado. La segunda de las curvas, se ha obtenido siguiendo un ensayo competitivo por desplazamiento (■) objeto de la invención que implica que el bioconjugado ya está, por una reacción de afinidad con el anticuerpo, incorporado a la superficie sensora, (No siendo preciso mezclarlo con la muestra). Lo único que hay que adicionar es la muestra, la cual, se incuba en la superficie sensora durante 30 minutos.

Posteriormente se realizaron los ensayos competitivos en los dos formatos: 1 . En el formato competitivo tradicional: Para este ensayo se añadió una concentración 1 ,9 mg L ^"1 de bioconjugado (dexa-HPR) a la muestra, y la mezcla se incubó 30 minutos a temperatura ambiente sobre la superficie sensora conteniendo todas las estructuras y el anticuerpo (anti-dex), capas (1 )-(5) de la figura 1 . Pasado ese tiempo se lavó con agua destilada.

2. Para el formato competitivo por desplazamiento, la superficie sensora conteniendo el anticuerpo (anti-dex) se incubó con 2 μί de la disolución del bioconjugado (dexa-HRP) 1 ,9 mg L ^"1 disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 durante 30 minutos a 27°C. Se lavó con el mismo tampón fosfato y se secó.

Posteriormente la estructura sensora conteniendo, esta vez, el anticuerpo y el bioconjugado, capas (1 )-(6) de la figura 1 , se incubó con la muestra durante 30 minutos. Pasado ese tiempo se lavó con agua destilada.

Las medidas electroquímicas en ambos formatos se llevaron a cabo en una celda con una disolución reguladora de tampón fosfato 0,1 M, pH 7, en la cual se inyectó H2O2 a una concentración final en celda de 250 μΜ, registrándose la corriente catódica a 0 mV vs. Ag/AgCI KCL _sa t. El volumen final en celda fue de 16 mL y la disolución de H2O2 fue preparada a partir de una disolución "stock" protegida de la luz. Como se muestra en la figura 6, la comparación de estos dos formatos de ensayos resulta en el caso del desplazamiento en una curva con un mayor intervalo lineal así como una menor adsorción no específica, llegando esta a cuantificarse como un 30% menor.