ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-CD303

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se situe dans le domaine des anticorps thérapeutiques, destinés au traitement ou à la prévention des tumeurs hématopoïétiques de phénotype CD4+CD56+ ou des maladies inflammatoires, notamment autoimmunes, impliquant les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Elle concerne 5 anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène CD303, ainsi que leurs fragments fonctionnels et dérivés, les acides nucléiques codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère de l'anticorps, des vecteurs d'expression, des cellules hôte, animaux non-humains transgéniques ou plantes transgéniques exprimant ces anticorps, ainsi que les utilisations thérapeutiques de ces anticorps.

ART ANTERIEUR

Les cellules dendritiques (appelées « DC » dans toute la présente description) sont des cellules du système immunitaire présentatrices d'antigènes (CPA). Sous certaines conditions, les DC présentent des prolongements cytoplasmiques similaires aux dendrites des neurones.

Les cellules dendritiques ont deux fonctions principales :

• le déclenchement de la réponse immunitaire adaptative dirigée contre des antigènes du "non-soi" (antigènes étrangers), par présentation de ces antigènes étrangers aux lymphocytes T ; et

• le maintien de la tolérance centrale au "soi", par éducation des lymphocytes T dans le thymus, par le processus dit de « sélection négative ».

Les DC sont capables de se différencier en divers sous-populations, selon les stimuli qu'elles reçoivent. Il existe trois grands types de cellules DC: les cellules DC conventionnelles, les cellules DC plasmacytoïdes (appelées « pDC ») et les cellules DC inflammatoires.

Les DC conventionnelles présentent les antigènes du soi ou du non-soi dans les organes lymphoïdes ou en périphéries. Les DC inflammatoires, probablement dérivées des monocytes sanguins, n'apparaissent qu'en cas de stimulation suite à une inflammation ou une infection. Les DC plasmacytoïdes (pDC) sont circulantes, rondes et sans dendrites à l'état basai, mais acquièrent des dendrites après activation, généralement par un antigène viral. Elles produisent après stimulation une grande quantité d'interférons (IFN) de classe I, et sont principalement impliquées dans la réponse antivirale ou dans les maladies autoimmunes. Sur le plan phénotypique, elles sont notamment caractérisées par les marqueurs suivants : CD4+, CD11 c-, Lin-, CD303+, CD304+.

Les pDC peuvent être à l'origine de tumeurs hématopoïétiques dans lesquelles elles acquièrent un marqueur supplémentaire (CD56). On parle alors de néoplasme de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques (abrégé en « BPDCN » pour « Blastic plasmacytoid dendritic cells neoplasm »). On parle également de tumeurs hématopoïétiques CD4+CD56+. Ces tumeurs hématopoïétiques sont rares (1% des leucémies aiguës) et se présentent sous la forme de nodules cutanés associés à une lympho-adénopathie ou un gonflement de la rate et à une cytopénie fréquente. Les manifestations cutanées sont très rapidement suivies par une infiltration de la moelle osseuse. Il est désormais admis que les cellules hématopoïétiques à l'origine de ces tumeurs sont les pDC.

Les traitements actuels de ces néoplasmes de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques reposent sur une chimiothérapie. Bien que relativement efficace dans un premier temps, ce traitement est caractérisé par des rechutes fréquentes et précoces (environ 9 mois), la médiane de survie globale n'étant que de 13 mois environ. Un autre traitement repose sur une allogreffe de cellules hématopoïétiques, mais ne permet pas non plus de survie à long terme.

Il a été proposé dans WO2012/080642 d'utiliser des anticorps anti-BDCA-2, c'est-à-dire anti-CD303, pour le traitement de ces néoplasmes par déplétion des cellules tumorales. Les pDC sont également impliquées dans certaines maladies inflammatoires, et notamment dans certaines maladies autoimmunes, en particulier par le biais de leur sécrétion d'IFN de type I.

Un traitement repose sur l'utilisation d'anticorps anti-IFNa. Cependant, ce traitement conduit à neutraliser l'IFNa de façon systémique, augmentant ainsi potentiellement le risque d'infections opportunistes. Il a donc également été proposé dans WO01 /365487 et WO2012/080642 d'utiliser des anticorps anti-BDCA-2 (anti-CD303, et notamment l'anticorps AC144) pour le traitement des maladies autoimmunes, par élimination des pDC responsables de l'inflammation locale.

Cependant, afin que ces traitements soient efficaces, il est nécessaire de disposer d'anticorps monoclonaux adaptés et permettant chez l'homme une élimination la plus efficace possible des pDC. Pour cela, des anticorps chimériques ou humanisés avec une forte affinité pour l'antigène CD303 et des capacités effectrices (ADCC, CDC, phagocytose, signalisation via cross-link de CD303 par les Récepteurs Fc, en particulier le récepteur FcgammaRIII (également appelé CD16) et/ou apoptose) leur permettant d'éliminer les pDC en conditions physiologiques sont nécessaires. Ce n'est pas le cas des anticorps anti-CD303 disponibles à ce jour et il existe donc un besoin pour de nouveaux anticorps anti-CD303 ayant les propriétés souhaitées.

WO201 /09339 décrit des anticorps anti-CD303 humanisés, définis par les séquences de leurs chaînes lourdes et légères, et notamment l'anticorps BIIB059, qui est celui possédant la meilleure affinité pour l'antigène CD303. L'anticorps BIIB059 a été produit dans CHO et caractérisé quant à certaines propriétés.

RESUME DE L'INVENTION

Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont générés cinq anticorps monoclonaux chimériques possédant de telles propriétés. Au moins deux de ces anticorps chimériques (122A2 et 102E9) possèdent une capacité de liaison à l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain supérieure à celle de l'anticorps BIIB059 décrit dans WO2014/09339 (en particulier 122A2). De plus, des anticorps humanisés dérivés de ces deux anticorps chimériques ont été générés et caractérisés. Ces anticorps humanisés peuvent être produits avec une meilleure productivité que les anticorps chimériques d'origine et, parmi ceux dérivés de l'anticorps chimérique 122A2, certains possèdent une capacité de liaison à l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain encore supérieure à celle de l'anticorps chimérique d'origine et donc bien supérieure à celle de l'anticorps BIIB059 décrit dans WO2014/09339. Les anticorps chimériques et humanisés produits dans YB2/0 possèdent en outre une forte affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a), et sont capables d'induire de fortes réponses ADCC, même à faible densité antigénique. Les anticorps possèdent en outre une activité CDC et sont capables d'inhiber la sécrétion d'IFN-α et de TNF-a.

Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain (SEQ ID NO :130), ou un fragment fonctionnel ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce que :

a) il entre en compétition pour la liaison à l'antigène CD303 humain avec au moins un anticorps choisi parmi :

i) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 43 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :48 ; ii) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 44 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :49 ;

iii) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 45 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :50 ;

iv) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 46 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :51 ;

v) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 47 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :52 ; et

les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

La présente invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain (SEQ ID NO :130), ou un fragment fonctionnel ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce que :

a) il possède une affinité pour le récepteur FcyRIl la (CD16a) améliorée par rapport à des anticorps dirigés contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain, produits dans la lignée cellulaire CHO ; et

b) les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère d'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention.

La présente invention concerne également un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention.

La présente invention concerne également une cellule hôte, un animal non-humain transgénique ou une plante transgénique comprenant au moins un acide nucléique selon l'invention ou un vecteur selon l'invention.

La présente invention concerne également un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament.

L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des tumeurs hématopoïétiques exprimant l'antigène CD303 ou dans le traitement ou la prévention des maladies inflammatoires, notamment des maladies autoimmunes.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1. Cartes des vecteurs d'expression des anticorps chimériques 122A2 (A), 102E9 (B), 104C12 (C), 114D11 (D), et 104E10 (E), et du vecteur d'expression de l'anticorps BIIB059 (F).

Figure 2. Liaison à l'antigène des anticorps selon l'invention. (A) Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de cellules Jurkat chaine Fc Gamma-CD303 (exprimant environ 25000-35000 molécules CD303/cellule) marquées par les anticorps selon l'invention, à différentes concentrations d'anticorps (représenté en unité logarithmique). (B) Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de cellules CAL-1 (lignée cellulaire de patients BPDCN) marquées par les anticorps chimériques selon l'invention, à différentes concentrations d'anticorps (représenté en unité logarithmique). (C) Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de cellules CAL-1 (lignée cellulaire de patients BPDCN exprimant environ 3000-6000 molécules CD303/cellule) marquées par l'un des anticorps chimériques 122A2 et 102E9, par l'anticorps humanisé BIIB059 ou par un anticorps non pertinent. (D) Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de cellules CAL-1 transfectées par un vecteur d'expression de CD303 et sélectionnées pour leur forte expression de CD303, environ 40000-50000 molécules CD303/cellule, marquées par l'un des anticorps chimériques 122A2 et 102E9, par l'anticorps humanisé BIIB059 ou par un anticorps non pertinent.

Figure 3. Liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a). (A) La fixation au récepteur CD16 des anticorps selon l'invention a été étudiée dans une expérience de compétition utilisant un anticorps anti-CD16 3G8 murin couplé à la phycoérythrine. La liaison de l'anti-CD16 3G8 au CD16 (valeurs de fluorescence MFI) est mesurée en fonction de la concentration croissante ajoutée des anticorps selon l'invention ^g/mL). (B) La fixation au récepteur CD16 des anticorps chimériques ch.122A2 et ch.102E9 selon l'invention, de l'anticorps chimérique Rituxan et de l'anticorps humanisé BIIB059 décrit dans la demande WO2014/09339 a été étudiée dans une expérience de compétition utilisant un anticorps anti-CD16 3G8 murin couplé à la phycoérythrine. La liaison de l'anti-CD16 3G8 au CD16 (valeurs de fluorescence MFI) est mesurée en fonction de la concentration croissante ajoutée des anticorps selon l'invention ^g/mL).

Figure 4. Activités ADCC induites par les anticorps chimériques de l'invention et l'anticorps humanisé BIIB059 vis-à-vis des cellules Jurkat chaine Fc Gamma-CD303 (A) ou des cellules CAL-1 (B). (A) Le pourcentage de lyse par ADCC (% lyse, tel que défini à l'Exemple 2) de cellules cibles Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303 induit par les anticorps chimériques selon l'invention est représenté en fonction de la concentration en anticorps (ng/mL, échelle logarithmique). (B) Le pourcentage de lyse par ADCC (% lyse, tel que défini à l'Exemple 2) de cellules cibles CAL-1 induit par les anticorps chimériques selon l'invention 122A2 et 102E9 et par l'anticorps humanisé BIIB059 est représenté en fonction de la concentration en anticorps (ng/mL, échelle logarithmique).

Figure 5. Inhibition induite par les anticorps de l'invention de la sécrétion d'IFN-a par les pDC. Quantité d'IFN-α (en pg/mL) sécrétée par des pDC purifiées activées au CpG, en présence des anticorps chimériques de l'invention à 10 et 0.1 μg/ml, et d'un anticorps chimérique contrôle non pertinent.

Figure 6. Inhibition induite par les anticorps de l'invention de la sécrétion de TNF-a par les pDC purifiées activées au CpG, en présence des anticorps chimériques (10 g/ml) de l'invention et d'un anticorps chimérique contrôle non pertinent.

Figure 7. Activités CDC induites par les anticorps de l'invention vis-à-vis des cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303. Le pourcentage de lyse par CDC (% lyse, tel que défini à l'Exemple 2) de cellules cibles Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303 induit par les anticorps chimériques selon l'invention est représenté en fonction de la concentration en anticorps (ng/mL, échelle logarithmique).

Figure 8. Cartes du vecteur pCEP4 vide (A) et des vecteurs d'expression des chaînes lourdes ou légères des anticorps humanisés 122A2 (B à H) et 102E9 (I à N).

Figure 9. Liaison à l'antigène des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 102E9. DO à 450nm en fonction de la concentration des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 102E9 testés à 1 ,25 ; 2,5 ; 5 ; 10 et 20 ng/ml, accompagnés des témoins : le surnageant seul (mock) et l'anticorps 102E9 chimérique. (A) Anticorps humanisés 102E9H5, 102E9H6, 102E9H7, 102E9H9, 102E9H10 et 102E9H11. (B) Anticorps humanisés 102E9H13, 102E9H1 , et 102E9H15.

Figure 10. Liaison à l'antigène des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 102E9 à 5 ng/ml d'anticorps. Comparaison des affinités relatives des anticorps humanisés dérivés de 102E9 vis-à-vis de l'ectodomaine CD303, la liaison de l'anticorps chimérique étant à 100%. Les anticorps présentant une liaison proche de celle de l'anticorps chimérique (affinité relative d'au moins 70%) sont signalés par *.

Figure 1 1. Liaison à l'antigène des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps

122A2. DO à 450nm en fonction de la concentration des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 122A2 testés à 1 ,75 ; 2,5 ; 5 ; et 10 ng/ml, accompagnés des témoins : le surnageant seul (mock) et l'anticorps 102E9 chimérique. (A) Anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H6, 122A2H9, 122A2H7, 122A2H10, 122A2H1 , 122A2H17, 122A2H15, et anticorps hybrides 122A2H3 et 122A2H8. (B) Anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H6, 122A2H9, 122A2H7, 122A2H10, 122A2H1 , 122A2H17, 122A2H13, 122A2H18, et 122A2H11. (C) Anticorps humanisés 122A2H15 et 122A2H19, et anticorps hybrides 122A2H4, 122A2H8, 122A2H12, 122A2H16, 122A2H1 , 122A2H2 et 122A2H3.

Figure 12. Liaison à l'antigène des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 102E9 à 5 ng/ml d'anticorps. Comparaison des affinités relatives des anticorps humanisés dérivés de 102E9 vis-à-vis de l'ectodomaine CD303, la liaison de l'anticorps chimérique étant à 100%. Les anticorps présentant une liaison meilleure à celle de l'anticorps chimérique (affinité relative >100%) sont signalés par *.

Figure 13. Liaison à CD303 sur la lignée CAL-1 des différents anticorps dérivés de 122A2 sélectionnés à une concentration de 0,1 μg/ml (en surnageant) : observation de la moyenne d'intensité de fluorescence (MFI) par cytométrie en flux. mAb non pertinent- surnageant: mAb non pertinent dilué dans du surnageant, hum : anticorps humanisé. hyb: anticorps hybride.

Figure 14. Inhibition de la sécrétion d'IFN-α par l'anticorps chimérique 122A2 et des anticorps humanisés dérivés de 122A2.

Figure 15. Cartes des vecteurs d'expression des chaînes lourdes ou légères des anticorps humanisés 122A2H5 (A), 122A2H7 (B), 122A2H9 (C) et 122A2H10 (D), pour production dans YB2/0.

Figure 16. Libération d'IL-2 par des cellules Jurkat CD16 activées par l'anticorps chimérique 122A2, par l'anticorps humanisé 122A2H9, ou par un anticorps non pertinent.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé

La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain (SEQ ID NO : 130), ou un fragment fonctionnel ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce que :

a) il entre en compétition pour la liaison à l'antigène CD303 humain avec au moins un anticorps choisi parmi :

i) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 43 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :48 ; ii) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 44 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :49 ;

iii) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 45 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :50 ;

iv) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 46 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :51 ;

v) Un anticorps dont la région variable de chaîne lourde comprend la séquence SEQ ID NO : 47 et la région variable de chaîne légère comprend la séquence SEQ ID NO :52 ; et

b) les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

Avantageusement, les chaînes lourdes comprennent trois CDR-H (CDR de chaîne lourde selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes, et les chaînes légères comprennent trois CDR-L (CDR de chaîne légère selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :

i) CDR1 -H-famille 1 : SEQ ID NO : 1 , CDR2-H-famille 1 : SEQ ID NO : 2, CDR3- H-famille 1 : SEQ ID NO : 3, CDR1 -L-famille 1 : SEQ ID NO : 4, CDR2-L- famille 1 : SEQ ID NO : 5, CDR3-L-famille 1 : SEQ ID NO : 6; ou ii) CDR1 -H-famille 2 : SEQ ID NO : 7, CDR2-H-famille 2: SEQ ID NO : 8, CDR3- H-famille 2: SEQ ID NO : 9, CDR1 -L-famille 2: SEQ ID NO : 10, CDR2-L- famille 2: SEQ ID NO : 11 , CDR3-L-famille 2: SEQ ID NO : 12.

Le Tableau 1 ci-dessous résume les séquences d'acides aminés des CDR-IMGT des deux familles d'anticorps selon l'invention :

Famille 1 Famille 2

CDR1 -H GYTFTDYS (SEQ ID NO :1 ) GYTFTDXS (SEQ ID NO :7)

CDR2-H ISXYYGDX (SEQ ID NO :2) INTETGXP (SEQ ID NO :8)

CDR3-H ARNXXXYXXXY (SEQ ID NO :3) XRNGYYVGYYAXDY (SEQ ID NO :9)

CDR1 -L QDIXNY (SEQ ID NO :4) SSVXY (SEQ ID NO :10) CDR2-L YTS (SEQ ID NO :5) STS (SEQ ID NO : 1 1 )

CDR3-L QQGXTLPWT (SEQ ID NO :6) QQRRSYPXT (SEQ ID NO : 12)

Tableau 1. Séquences d'acides aminés des CDR des deux familles d'anticorps selon l'invention selon la nomenclature IMGT. Dans chaque séquence, X peut représenter n'importe quel acide aminé. Avantageusement, les chaînes lourdes d'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention comprennent trois CDR-H (CDR de chaîne lourde selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes, et les chaînes légères comprennent trois CDR-L (CDR de chaîne légère selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :

i) CDR1 -H-122A2 : SEQ ID NO : 13, CDR2-H-122A2: SEQ ID NO : 14, CDR3-H- 122A2: SEQ ID NO : 15, CDR1 -L-122A2: SEQ ID NO : 16, CDR2-L-122A2: SEQ ID NO : 17, CDR3-L-122A2: SEQ ID NO : 18;

ii) CDR1 -H-102E9 : SEQ ID NO : 19, CDR2-H-102E9: SEQ ID NO : 20, CDR3-H-

102E9: SEQ ID NO : 21 , CDR1 -L-102E9: SEQ ID NO : 22, CDR2-L-102E9: SEQ ID NO : 23, CDR3-L-102E9: SEQ ID NO : 24;

iii) CDR1 -H-104C12 : SEQ ID NO : 25, CDR2-H-104C12: SEQ ID NO : 26, CDR3- H-104C12: SEQ ID NO : 27, CDR1 -L-104C12: SEQ ID NO : 28, CDR2-L- 104C12: SEQ ID NO : 29, CDR3-L-104C12: SEQ ID NO : 30;

iv) CDR1 -H-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 31 , CDR2-H-1 14D11 : SEQ ID NO : 32, CDR3- H-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 33, CDR1 -L-1 14D11 : SEQ ID NO : 34, CDR2-L- 1 14D1 1 : SEQ ID NO : 35, CDR3-L-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 36; ou v) CDR1 -H-104E10: SEQ ID NO : 37, CDR2-H-104E10: SEQ ID NO : 38, CDR3-H- 104E10 : SEQ ID NO : 39, CDR1 -L-104E10: SEQ ID NO : 40, CDR2-L-104E10:

SEQ ID NO : 41 , CDR3-L-104E10: SEQ ID NO : 42.

Avantageusement, les chaînes lourdes d'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention comprennent une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 43 à 47 ou une séquence ayant au moins 80% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 43 à 47.

En outre ou alternativement, les chaînes légères d'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention comprennent une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 48 à 52 ou une séquence ayant au moins 80% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 48 à 52. Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention possède des chaînes lourdes et légères dont les régions variables ont les séquences d'acides aminés suivantes ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :

i) Anticorps 122A2: chaîne lourde : SEQ ID NO : 43, chaîne légère : SEQ ID NO : 48, ii) Anticorps 102E9: chaîne lourde : SEQ ID NO : 44, chaîne légère : SEQ ID NO : 49, iii) Anticorps 104C12: chaîne lourde : SEQ ID NO : 45 chaîne légère : SEQ ID NO : 50, iv) Anticorps 114D11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 46, chaîne légère : SEQ ID NO : 51 , ou

v) Anticorps 104E10: chaîne lourde : SEQ ID NO : 47, chaîne légère : SEQ ID NO : 52.

Le Tableau 2 ci-dessous résume les segments de gène VH, JH et VL et JL murins utilisés par les différents anticorps selon l'invention et le pourcentage d'identité.

Tableau 2. Segments VH, JH et VL et JL murins utilisés par les différents anticorps selon l'invention, tels que définis par IMGT.

Le Tableau 3 ci-dessous résume les séquences d'acides aminés des CDR et des régions variables des chaînes lourdes et légères des anticorps anti-CD303 générés par les inventeurs : Anticorps 122A2

Chaîne lourde

CDR1-H-

GYTFTDYS (SEQID NO : 13)

IMGT-122A2

CDR2-H-

ISTYYGDS (SEQID NO : 14)

IMGT-122A2

CDR3-H-

ARNGNFYVMDY (SEQID NO : 15)

IMGT-122A2

QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYSMHWVKQSHAKSLEWIGVISTYYGD

VH-122A2 SNYNQKFKGKATMTVDKSSTTAYMELARLTSEDSAIYYCARNGNFYVMDYWGQGTSV

TVSS (SEQID NO : 43)

Chaîne légère

CDR1-L-

QDISNY (SEQID NO : 16)

IMGT-122A2

CDR2-L-

YTS (SEQID NO : 17)

IMGT-122A2

CDR3-L-

QQGNTLPWT (SEQID NO : 18)

IMGT-122A2

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVP

VL-122A2 SRFSGSGSGTDYSLTISNLDQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO :

48)

Anticorps 102E9

Chaîne lourde

CDR1-H-

GYTFTDYS (SEQID NO : 19)

IMGT-102E9

CDR2-H-

INTETGEP (SEQID NO : 20)

IMGT-102E9

CDR3-H-

TRNGYYVGYYAMDY (SEQ ID NO : 21 )

IMGT-102E9

Ql H LVQSG PDLKKPG ETVKI SCKASG YTFTDYSMH WVKQAPG KG LKWMG Wl NTETG

VH-102E9 EPTYADDFKGRFAFSLESSASTAFLQINNLKNEDTSTYFCTRNGYYVGYYAMDYWGQ

GTSVTVSS (SEQID NO : 44)

Chaîne légère

CDR1-L-

SSVIY (SEQID NO : 22)

IMGT-102E9 CDR2-L-

STS (SEQ ID NO : 23)

IMGT-102E9

CDR3-L-

QQRRSYPFT (SEQ ID NO : 24)

IMGT-102E9

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVIYIHWFQQKPGTSPKLWIYSTSYLASGVPAR

VL-102E9

FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRRSYPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 49)

Anticorps 104C12

Chaîne lourde

CDR1-H-

GYTFTDYS (SEQ ID NO : 25)

IMGT-104C12

CDR2-H-

ISPYYGDT (SEQ ID NO : 26)

IMGT-104C12

CDR3-H-

ARNDDYYRFAY (SEQ ID NO : 27)

IMGT-104C12

QVQLQQSGAELVGPGVSVKISCKGSGYTFTDYSMHWVKQSHAKSLEWIGVISPYYGD

VH-104C12 TNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELASLTSEDSAIYFCARNDDYYRFAYWGQGTLV

TVSA (SEQ ID NO : 45)

Chaîne légère

CDR1-L-

QDINNY (SEQ ID NO : 28)

IMGT-104C12

CDR2-L-

YTS (SEQ ID NO : 29)

IMGT-104C12

CDR3-L-

QQGKTLPWT (SEQ ID NO : 30)

IMGT-104C12

DLQMTQTPSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLSWYQEKPDGTFKLLIYYTSRLHSGVP

VL-104C12 SRFSGSGSGTDYSLTVRNLEQEDIGTYFCQQGKTLPWTFGGGTKLEIR (SEQ ID NO

: 50)

Anticorps 114D11

Chaîne lourde

CDR1-H-

GYTFTDSS (SEQ ID NO : 31)

IMGT-114D11

CDR2-H-

INTETGGP (SEQ ID NO : 32)

IMGT-114D11

CDR3-H-

ARNGYYVGYYALDY (SEQ ID NO : 33)

IMGT-114D11 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDSSMHWVQQAPNKGLKWMGWINTETG

VH-114D11 G PTYADDFKG RFAFSLETSARTAYLQI N N LKN EDTATYFCARNG YYVG YYALDYWGQ

GTSVTVSS (SEQID NO : 46)

Chaîne légère

CDR1-L-

SSVFY(SEQID NO : 34)

IMGT-114D11

CDR2-L-

STS (SEQID NO : 35)

IMGT-114D11

CDR3-L-

QQRRSYPYT (SEQID NO : 36)

IMGT-114D11

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVFYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPA

VL-114D11 RFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRRSYPYTFGGGTKLEIK (SEQID NO :

51)

Anticorps 104E10

Chaîne lourde

CDR1-H-

GYTFTDYS (SEQID NO : 37)

IMGT-104E10

CDR2-H-

INTETGEP (SEQID NO : 38)

IMGT-104E10

CDR3-H-

ARNGYYVGYYAMDY (SEQID NO : 39)

IMGT-104E10

Ql QLVQSG PELKKPG ETVKI SCKASG YTFTDYSMH WVKQAPG KG LKWMGWI NTETG

VH-104E10 EPTYADDFKGRFAFSLETSATTAYLQINNFKNEDTATYFCARNGYYVGYYAMDYWGQ

GTSVTVSS (SEQID NO : 47)

Chaîne légère

CDR1-L-

SSVIY (SEQID NO : 40)

IMGT-104E10

CDR2-L-

STS (SEQID NO : 41)

IMGT-104E10

CDR3-L-

QQRRSYPYT (SEQ ID NO : 42)

IMGT-104E10

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVIYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPA

VL-104E10 RFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRRSYPYTFGGGTKLEIK (SEQID NO :

52) Tableau 3. Séquences d'acides aminés des CDR1 , CDR2, et CDR3 des chaînes lourdes et légères selon la nomenclature IMGT, et des fragments VH et VL des anticorps selon l'invention. L'antigène CD303 humain est le membre C de la 4 ^eme famille de domaine lectine de type C et est également appelé CLEC4 (pour « C-type lectin domain family 4, member C ») ; DLEC; HECL; BDCA2; CLECSF7; CLECSF11 ; ou PRO34150 (voir le site EntrezGene pour le gène CLEC4). Il s'agit d'une glycoprotéine transmembranaire de type II de 213 acides aminés, comprenant un court domaine cytoplasmique sans motif de signalisation évident (acides aminés 1 -21 ), une région transmembranaire (acides aminés 22-41 ), un domaine cou (acides aminés 42-82), et un domaine extracellulaire de reconnaissance de carbohydrates (CRD pour « carbohydrate récognition domain » ; acides aminés 83-213) (Dzionek et al-2001 ). La séquence de l'ARNm codant pour cette protéine peut être trouvée sur la base de données Genbank dans sa version du 14 février 2002 sous le n° d'accession AF293615.1 (SEQ ID NO : 129), tandis que la séquence d'acides aminés est accessible sur la base de données Genbank dans sa version du 14 février 2002 sous le n° d'accession AAL37036.1 (SEQ ID NO :130).

Par « anticorps » ou « immunoglobuline », on entend une molécule comprenant au moins un domaine de liaison à un antigène donné et un domaine constant comprenant un fragment Fc capable de se lier aux récepteurs FcR. Chez la plupart des mammifères, comme l'homme et la souris, un anticorps est composé de 4 chaînes polypeptidiques : 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant une flexibilité à la molécule. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant (CL) et d'un domaine variable (VL); les chaînes lourdes étant composées d'un domaine variable (VH) et de 3 ou 4 domaines constants (CH1 à CH3 ou CH1 à CH4) selon l'isotype de l'anticorps. Chez quelques rares mammifères, comme les chameaux et les lamas, les anticorps sont constitués de seulement deux chaînes lourdes, chaque chaîne lourde comprenant un domaine variable (VH) et une région constante.

Les domaines variables sont impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, tandis que les domaines constants sont impliqués dans les propriétés biologiques, pharmacocinétiques et effectrices, de l'anticorps.

La région variable diffère d'un anticorps à un autre. En effet, les gènes codant pour les chaînes lourdes et légères des anticorps sont générés par recombinaison de respectivement trois et deux segments de gènes distincts appelés VH, DH et JH-CH pour la chaîne lourde et VL et JL-CL pour la chaîne légère. Les segments CH et CL ne participent pas à la recombinaison et forment les régions constantes des chaînes lourdes et légères respectivement. Les recombinaisons des segments VH-DH-JH et VL-JL forment les régions variables des chaînes lourdes et légères respectivement. Les régions VH et VL possèdent chacune 3 zones hyper variables ou régions déterminant la complémentarité (CDR), appelées CDR1 , CDR2 et CDR3, la région CDR3 étant la plus variable, puisqu'elle se situe au niveau de la zone de recombinaison. Ces trois régions CDR, et particulièrement la région CDR3, se trouvent dans la partie de l'anticorps qui sera en contact avec l'antigène et sont donc très importantes pour la reconnaissance de l'antigène. Ainsi, les anticorps conservant les trois régions CDR et chacune des chaînes lourde et légère d'un anticorps conservent en grande majorité la spécificité antigénique de l'anticorps d'origine. Dans un certain nombre de cas, un anticorps ne conservant que l'un des CDR, et notamment le CDR3, conserve également la spécificité de l'anticorps d'origine. Les régions CDR1 , CDR2 et CDR3 sont chacune précédées des régions FR1 , FR2 et FR3 respectivement, correspondant aux régions charpentes (framework région FR) qui varient le moins d'un segment VH ou VL à un autre. La région CDR3 est également suivie d'une région charpente FR4.

Les CDR d'un anticorps sont définis à partir de la séquence d'acides aminés de ses chaînes lourdes et légères par rapport à des critères connus de l'homme du métier. Différentes méthodes de détermination des CDR ont été proposées, et la portion de la séquence d'acides aminés d'une région variable de chaîne lourde ou légère d'un anticorps définie comme un CDR varie en fonction de la méthode choisie. La première méthode de détermination est celle proposée par Kabat et al (Kabat et al-1991 ). Dans cette méthode, les CDR sont définis en recherchant les acides aminés responsables de la liaison à l'antigène de l'anticorps. Une 2 ^eme méthode a été proposée par l'IMGT, fondée cette fois sur la détermination des régions hypervariables. Dans cette méthode, une numérotation unique a été définie pour comparer les régions variables quels que soient le récepteur à l'antigène, le type de chaîne ou l'espèce (Lefranc et al. 2003). Cette numérotation fournit une délimitation standardisée des régions charpentes ((FR1 -IMGT : positions 1 à 26, FR2-IMGT : 39 à 55, FR3-IMGT : 66 à 104 et FR4-IMGT : 118 à 128) et des régions déterminant la complémentarité (CDR1 -IMGT : positions 27 à 38, CDR2-IMGT : positions 56 à 65 and CDR3-IMGT : positions 105 à 117). Enfin, il existe également une numérotation dite « commune », dans laquelle la séquence d'un CDR particulier correspond à la séquence commune entre la numérotation de Kabat et la numérotation IMGT. Dans toute la présente description, les séquences de CDR sont indiquées dans la numérotation IMGT. En particulier, les CDR ont été déterminés en utilisant le programme IMGT/V-QUEST disponible sur http: //www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/ et décrit dans Brochet et al-2008. Contrairement aux domaines variables dont la séquence varie fortement d'un anticorps à un autre, les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristique de l'espèce et de l'isotype, avec éventuellement quelques mutations somatiques. Le fragment Fc est naturellement composé de la région constante de la chaîne lourde à l'exclusion du domaine CH1 , c'est-à-dire de la région charnière inférieure et des domaines constants CH2 et CH3 ou CH2 à CH4 (selon l'isotype). Chez les lgG1 humaines, le fragment Fc complet est composé de la partie C-terminale de la chaîne lourde à partir du résidu cystéine en position 226 (C226), la numérotation des résidus d'acides aminés dans le fragment Fc étant dans toute la présente description celle de l'index EU décrit dans Edelman et al- 1969 et Kabat et al-1991 . Les fragments Fc correspondants d'autres types d'immunoglobulines peuvent être identifiés aisément par l'homme du métier par des alignements de séquences.

Le fragment Fc est glycosylé au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes lourdes, d'un N-glycanne lié au résidu asparagine en position 297 (Asn 297).

Les domaines de liaison suivants, situés dans le Fc, sont importants pour les propriétés biologiques de l'anticorps :

domaine de liaison au récepteur FcRn, impliqué dans les propriétés pharmacocinétiques (demi-vie in vivo) de l'anticorps :

Différentes données suggèrent que certains résidus situés à l'interface des domaines CH2 et CH3 sont impliqués dans la liaison au récepteur FcRn.

- domaine de liaison à la protéine du complément C1 q, impliqué dans la réponse CDC (pour « cytotoxicité dépendante du complément ») : situé dans le domaine CH2;

domaine de liaison aux récepteurs FcR, impliqué dans les réponses de type phagocytose ou ADCC (pour « cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps) : situé dans le domaine CH2.

Au sens de l'invention, le fragment Fc d'un anticorps peut être naturel, tel que défini ci-dessus, ou bien avoir été modifié de diverses façons, à condition de comprendre un domaine de liaison aux récepteurs FcR (récepteurs FcyR pour les IgG) fonctionnel, et de préférence un domaine de liaison au récepteur FcRn fonctionnel. Les modifications peuvent inclure la délétion de certaines parties du fragment Fc, pourvu que celui-ci contienne un domaine de liaison aux récepteurs FcR (récepteurs FcyR pour les IgG) fonctionnel, et de préférence un domaine de liaison au récepteur FcRn fonctionnel. Les modifications peuvent également inclure différentes substitutions d'acides aminés susceptibles d'affecter les propriétés biologiques de l'anticorps, pourvu que celui-ci contienne un domaine de liaison aux récepteurs FcR fonctionnel, et de préférence un domaine de liaison au récepteur FcRn fonctionnel. En particulier, lorsque l'anticorps est un IgG, il peut comprendre des mutations destinées à augmenter la liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a), telles que décrites dans WO00/42072, Shields et al-2001 , Lazar et al- 2006, WO2004/029207, WO2004/063351 , WO2004/074455. Des mutations permettant d'augmenter la liaison au récepteur FcRn et donc la demi-vie in vivo peuvent également être présentes, comme décrit par exemple dans Shields et al-2001 , Dall'Acqua et al- 2002, Hinton et al-2004, Dall'Acqua et al-2006(a), WO00/42072, WO02/060919, WO2010/045193, ou WO2010/106180. D'autres mutations, comme celles permettant de diminuer ou d'augmenter la liaison aux protéines du complément et donc la réponse CDC, peuvent ou non être présentes (voir W099/51642, WO2004/074455, Idusogie et al- 2001 , Dall'Acqua et al-2006(b), et Moore et al-2010).

Dans le cadre de la présente invention, des mutants préférés comprenant des mutations permettant d'augmenter la liaison au récepteur FcRn et donc la demi-vie in vivo sont les mutants comprenant les combinaisons de mutations suivantes dans leur fragment Fc, décrites dans WO2010/106180 :

· N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y,

• P230S/N315D/M428L/N434Y,

• E294del/T307P/N434Y,

• T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y,

• V259I/N315D/N434Y, ou

· T256N/A378V/S383N/N434Y,

où la numérotation des acides aminés dans le fragment Fc est celle de l'index EU décrit dans Kabat et al. , Séquences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ), qui est ici incorporé par référence. L'« index EU » ou « index EU de Kabat » se réfère à la numérotation des acides aminés de l'anticorps IgG 1 humain.

De manière alternative, de même que des fragments ou dérivés sans fragment Fc de l'anticorps peuvent être utiles dans le cadre de l'invention, notamment pour le traitement des maladies inflammatoires, notamment autoimmunes, impliquant les pDC, l'anticorps selon l'invention peut aussi posséder un fragment Fc muté dépourvu de fonctions effectrices. Des exemples de mutations conduisant à un fragment Fc muté dépourvu de fonctions effectrices sont les délétions simples des acides aminés en position 293 (Del293) ou 294 (Del294) du fragment Fc, où la numérotation des acides aminés dans le fragment Fc est celle de l'index EU de Kabat (WO2012/175751 ).

Par « anticorps monoclonal » ou « composition d'anticorps monoclonal », on entend une composition comprenant des molécules d'anticorps possédant une spécificité antigénique identique et unique. Les molécules d'anticorps présentes dans la composition sont susceptibles de varier au niveau de leurs modifications post- traductionnelles, et notamment au niveau de leurs structures de glycosylation ou de leur point isoélectrique, mais ont toutes été codées par les mêmes séquences de chaînes lourde et légère et ont donc, avant toute modification post-traductionnelle, la même séquence protéique. Certaines différences de séquences protéique, liées à des modifications post-traductionnelles (comme par exemple le clivage de la lysine C- terminale de la chaîne lourde, la déamidation de résidus asparagine et/ou l'isomérisation de résidus aspartate), peuvent néanmoins exister entre les différentes molécules d'anticorps présentes dans la composition.

Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute la longueur en utilisant tout algorithme bien connu de l'homme du métier tel que l'algorithme de Needleman et Wunsch-1970. Cette comparaison de séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, par exemple le logiciel needle en utilisant le paramètre « Gap open » égal à 10.0, le paramètre « Gap extend » égal à 0.5 et une matrice « Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide sous la dénomination « Align ».

Lorsque le CDR ou la région variable d'un anticorps selon l'invention possède une séquence d'acides aminés qui n'est pas 100% identique à l'une de celles décrites ci- dessus et dans le listing de séquences (séquences de référence) mais qui possède au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec une telle séquence de référence, elle peut présenter des insertions, délétions ou substitutions par rapport à la séquence de référence. Lorsqu'il s'agit de substitutions, la substitution est de préférence réalisée par un acide aminé « équivalent », c'est-à-dire tout acide aminé dont la structure est proche de celle de l'acide aminé d'origine et est donc peu probable de modifier les activités biologiques de l'anticorps. Des exemples de telles substitutions sont présentés dans le Tableau 4 suivant :

Les anticorps peuvent être de plusieurs isotypes, en fonction de la nature de leur région constante : les régions constantes γ, α, μ, ε et δ correspondent respectivement aux immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. Avantageusement, l'anticorps monoclonal présent dans une composition utilisée en tant que médicament dans le cadre de l'invention est d'isotype IgG. En effet, cet isotype montre une capacité à engendrer une activité ADCC (« Antibody- Dépendent Cellular Cytotoxicity », soit Cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps) chez le plus grand nombre d'individus (humains). Les régions constantes γ comprennent plusieurs sous-types : γ1 , j2, j3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, et j4, créant ainsi les sous-isotypes lgG1 , lgG2, lgG3, et lgG4. Avantageusement, l'anticorps monoclonal présent dans une composition utilisée en tant que médicament dans le cadre de l'invention est d'isotype lgG1 ou lgG3, de préférence lgG1.

L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention est avantageusement un anticorps chimérique ou humanisé, en particulier un anticorps chimérique dont la région constante des chaines lourdes et légères est d'origine humaine.

Par anticorps « chimérique », on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée. Avantageusement, si la composition d'anticorps monoclonal pour son utilisation en tant que médicament selon l'invention comprend un anticorps monoclonal chimérique, celui-ci comprend des régions constantes humaines. Partant d'un anticorps non humain, un anticorps chimérique peut être préparé en utilisant les techniques de recombinaison génétique bien connues de l'homme du métier. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant pour la chaîne lourde et la chaîne légère un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable de l'anticorps non humain, et une séquence codant pour la région constante d'un anticorps humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al- 1988.

Par anticorps « humanisé », on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al- 1986 ; Verhoeyen et al- 1988 ; Riechmann et al-1988). Les anticorps humanisés selon l'invention peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art telles les technologies de « CDR grafting », de « resurfacing », de SuperHumanisation, de « Human string content », de « FR libraries », de « Guided sélection », de « FR shuffling » et de « Humaneering », comme résumé dans la revue de Almagro et al-2008.

Outre les 5 anticorps chimériques comprenant les séquences de CDRs ou de régions variables décrites ci-dessus, les inventeurs ont également généré des anticorps humanisés dérivés de deux des 5 anticorps anti-CD303 initialement obtenus. Pour cela, pour chacun des deux anticorps, plusieurs séquences mutées de région variable de chaîne lourde (les mutations visant à rendre la séquence plus proche d'une séquence humaine) et plusieurs séquences mutées de région variable de chaine légère ont été générées et combinées deux par deux les unes avec les autres pour tenter d'obtenir des anticorps humanisés possédant une capacité de liaison à l'antigène CD303 humain (SEQ ID NO : 130) la plus forte possible (avantageusement au moins 70% de la capacité de liaison de l'anticorps murin ou chimérique, plus avantageusement similaire à la capacité de liaison de l'anticorps murin ou chimérique, encore plus avantageusement supérieure à la capacité de liaison de l'anticorps murin ou chimérique). Pour l'anticorps 122A2, les séquences d'acides aminés des régions variables (humanisées, i.e. mutées) de chaine lourde et de chaine légère qui ont été testées sont représentées dans le Tableau 5 ci-dessous:

Mutations par

122A2 - VH de

rapport à la

chaine lourde Séquence

séquence VH

humanisée

chimérique

122A2-VHha L12V/R14K/V17A/S45 QVQLQQSGAEWKPGASVKISCKGSGYTFTDYSM

A/A76V/T85S/A92S/E HWVKQAHAKSLEWIGVISTYYGDSNYNQKFKGKV 97D/S99T/I101V/S123 TMTVDKSSSTAYMELSRLTSDDTAVYYCARNGNFY L VMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 131 )

122A2-VHhb L12V/R14K/V17A/K43 QVQLQQSGAEWKPGASVKISCKGSGYTFTDYSM

R/S45A/A76V/K82T/T HWVRQAHAKSLEWIGVISTYYGDSNYNQKFKGKV 85S/A92S/T95R/E97D TMTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARNGNFY /S99T/I101V/S123L VMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 132)

122A2-VHhc L12V/R14K/V17A/K43 QVQLQQSGAEWKPGASVKISCKGSGYTFTDYSM

R/S45A/H46P/A47G/K HWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDSNYNQKFKGKV

48Q/S49G/A76V/T85S TMTVDKSSSTAYMELSRLTSDDTAVYYCARNGNFY

/A92S/E97D/S99T/I10 VMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 133)

1V/S123L

Mutations par

122A2 - VL de

rapport à la

chaine légère Séquence

séquence VL

humanisée

chimérique 122A2-VKha T7S/S22T/R24Q/S69T DIQMTQSTSSLSASLGDRVTITCQASQDISNYLNWY /F103Y QQKPDGTVKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDY

SLTISNLDQEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEI

K (SEQ ID NO : 134)

122A2-VKhb T7S/T8P/L15V/S22T/ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWY

R24Q/S69T/F103Y QQKPDGTVKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDY

SLTISNLDQEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEI

K (SEQ ID NO : 135)

122A2-VKhc T7S/S22T/R24Q/R66N DIQMTQSTSSLSASLGDRVTITCQASQDISNYLNWY

/S69T/D95Q/F103Y QQKPDGTVKLLIYYTSNLHTGVPSRFSGSGSGTDY

SLTISNLQQEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEI

K (SEQ ID NO : 136)

122A2-VKhd T7S/T8P/L15V/S22T/ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWY

R24Q/R66N/S69T/D95 QQKPDGTVKLLIYYTSNLHTGVPSRFSGSGSGTDY

Q/F103Y SLTISNLQQEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEI

K (SEQ ID NO : 137)

Tableau 5. Séquences d'acides aminés d es régions variables (humanisées, i.e. mutées) de chaine lourde et de chaine légère qui ont été testées pour l'humanisation de l'anticorps 122A2. Des anticorps 122A2 humanisés sont ainsi avantageusement choisis parmi ceux dont les chaines lourdes comprennent une région variable ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 131 à 133, avantageusement parmi ceux dont les chaines lourdes comprennent une région variable ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 131 et 132.

Des anticorps 122A2 humanisés sont également avantageusement choisis parmi ceux dont les chaines légères comprennent une région variable ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 134 à 137, avantageusement parmi ceux dont les chaines légères comprennent une région variable ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 134 et 135.

Les différents anticorps 122A2 humanisés générés par les inventeurs ont des chaines lourdes et des chaines légères comprenant des régions variables ayant les séquences d'acides aminés décrites dans le Tableau 6 ci-dessous. Les anticorps 122A2 humanisés préférés (car présentant une liaison à l'antigène supérieure ou égale à celle de l'anticorps chimérique d'origine) sont ceux dont les chaines lourdes et les chaines légères comprennent des régions variables ayant les séquences d'acides aminés comprenant celles décrites pour les anticorps 122A2H5, 122A2H9, 122A2H6, 122A2H10, 122A2H1 , 122A2H7, 122A2H1 1 et 122A2H1 5 dans le Tableau 6 ci-dessous (présentés en gras dans le Tableau 6 ci-dessous). Les anticorps 122A2 humanisés les plus préférés sont ceux présentant une liaison à l'antigène supérieure à celle de l'anticorps chimérique d 'origine : 122A2H5, 122A2H9, 122A2H6, 122A2H10, 122A2H14, 122A2H7, et en particulier 122A2H5, 122A2H9, 122A2H7, et 122A2H10.

Séquence d'acides aminés Séquence d'acides aminés

Anticorps humanisé dérivé

comprise dans le domaine comprise dans le domaine de 122A2

VH VL (VK)

122A2-VHha 122A2-VKha

122A2H5

(SEQID NO :131) (SEQID NO :134)

122A2-VHha 122A2-VKhb

122A2H9

(SEQID NO :131) (SEQID NO :135)

122A2-VHha 122A2-VKhc

122A2H13

(SEQID NO : 131 ) (SEQID NO :136)

122A2-VHha 122A2-VKhd

122A2H17

(SEQID NO : 131 ) (SEQID NO :137)

122A2-VHhb 122A2-VKha

122A2H6

(SEQID NO :132) (SEQID NO :134)

122A2-VHhb 122A2-VKhb

122A2H10

(SEQID NO :132) (SEQID NO :135)

122A2-VHhb 122A2-VKhc

122A2H14

(SEQID NO :132) (SEQID NO :136)

122A2-VHhb 122A2-VKhd

122A2H18

(SEQID NO :132) (SEQID NO :137)

122A2-VHhc 122A2-VKha

122A2H7

(SEQID NO :133) (SEQID NO :134)

122A2-VHhc 122A2-VKhb

122A2H11

(SEQID NO :133) (SEQID NO :135)

122A2H15 122A2-VHhc 122A2-VKhc

(SEQID NO :133) (SEQID NO :136)

122A2H19 122A2-VHhc 122A2-VKhd

(SEQID NO : 33) (SEQID NO :137)

Tableau 6. Séquences d'acides aminés comprises dans les domaines VH et VL des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2. Les séquences correspondant aux anticorps préférés (car présentant une liaison à l'antigène supérieure ou égale à celle de l'anticorps chimérique d'origine en ELISA) sont présentées en gras.

Pour l'anticorps 102E9, les séquences d'acides aminés des régions variables (humanisées, i.e. mutées) de chaine lourde et de chaine légère qui ont été testées sont représentées dans le Tableau 7 ci-dessous: 102E9 - VH de Mutations par rapport

chaine lourde à la séquence VH Séquence

humanisée chimérique*

102E9-VHha D1 1 E/T18S/K48Q/A77V Ql H LVQSG PELKKPG ESVKISC KASG YTFTDYSM

/E81 D/S82T/A84V/F88 H WVKQAPGQG LKWMGWI NTETG EPTYADDFK Y/N93S/F103Y GRFVFSLDTSVSTAYLQI NSLKNEDTSTYYCTRN

GYYVGYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO : 1 38)

102E9-VHhb D1 1 E/T18S/K43R/K48Q Ql H LVQSG PELKKPG ESVKISC KASG YTFTDYSM

/D69Q/A77V/E81 D/S82 H WVRQAPGQG LKWMGWI NTETG EPTYAQDFK T/A84V/F88Y/N93S/F1 GRFVFSLDTSVSTAYLQI NSLKNEDTSTYYCTRN 03Y GYYVGYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID

NO : 1 39)

102E9-VHhc P9S/D1 1 E/T1 8S/K43R/ QI HLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSMH

K48Q/D69Q/A77V/E81 WVRQAPGQG LKWMGWI NTETG EPTYAQDFKG D/S82T/A84V/F88Y/N9 RFVFSLDTSVSTAYLQINSLKNEDTSTYYCTRNGY 3S/F103Y YVGYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID

NO : 140)

102E9 - VL de Mutations par rapport

chaine légère à la séquence VL Séquence

humanisée chimérique

102E9-VKha V3Q/A9S/I 10F/M1 1 L/K QIQLTQSPSFLSASPGERVTITCSASSSVIYI HWFQ

18R/T48K/S49A/A74S/ QKPGKAPKLWIYSTSYLASGVPSRFSGSGSGTEY S86E/S88T/R93S/A99F TLTISSMEAEDFATYYCQQRRSYPFTFGGGTKLEI

K (SEQ ID NO : 141 )

102E9-VKhb V3Q/A9S/I 10F/M1 1 L/K QIQLTQSPSFLSASPGERVTITCSASSSVIYI HWFQ

18R/S49A/A74S/S88T/ QKPGTAPKLWIYSTSYLASGVPSRFSGSGSGTSY A99F TLTISRMEAEDFATYYCQQRRSYPFTFGGGTKLE

I K (SEQ ID NO : 142)

102E9-VKhc V3Q/A9S/I 10F/M1 1 L/E QIQLTQSPSFLSASPGDRVTITCSASSSVIYI HWFQ

17D/K18R/T48K/S49A/ QKPGKAPKLWIYSTSYLASGVPSRFSGSGSGTEY A74S/S86E/S88T/R93S/ TLTISSMQAEDFATYYCQQRRSYPFTFGGGTKLE E95Q/A99F I K (SEQ ID NO : 143)

Tableau 7. Séquences d 'acides aminés des régions variables (humanisées, i.e. mutées) de chaine lourde et de chaine légère qui ont été testées pour l'humanisation de l'anticorps 102E9. *La position des résidus d'acides aminés correspond à la numérotation unique IMGT.

Des anticorps 102E9 humanisés sont ainsi avantageusement choisis parmi ceux dont les chaines lourdes comprennent une région variable ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 138 à 140, avantageusement parmi ceux dont les chaines lourdes comprennent une région variable ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 139.

Des anticorps 102E9 humanisés sont également avantageusement choisis parmi ceux dont les chaines légères comprennent une région variable ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 141 à 143, avantageusement parmi ceux dont les chaines légères comprennent une région variable ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 142.

Les différents anticorps 102E9 humanisés générés par les inventeurs ont des chaines lourdes et des chaines légères comprenant des régions variables ayant les séquences d'acides aminés décrites dans le Tableau 8 ci-dessous. Les anticorps 102E9 humanisés préférés (car présentant une liaison du niveau de la liaison de l'anticorps chimérique proche de celle de l'anticorps chimérique d'origine : au moins 70% de la liaison de l'anticorps chimérique dans le test ELISA) sont ceux dont les chaines lourdes et les chaines légères comprennent des régions variables ayant les séquences d'acides aminés comprenant celles décrites pour les anticorps 102E9H6, 102E9H7, 102E9H9, et 102E9H10 dans le Tableau 8 ci-dessous (présentés en gras dans le Tableau 8 ci-dessous), plus avantageusement ceux dont les chaines lourdes et les chaines légères comprennent des régions variables ayant les séquences d'acides aminés comprenant celles décrites pour l'anticorps 102E9H10 dans le Tableau 8 ci-dessous.

Séquence d'acides aminés Séquence d'acides aminés

Anticorps humanisé dérivé

comprise dans le domaine comprise dans le domaine de 102E9

VH VL (VK)

102E9-VHha 102E9-VKha

102E9H5

(SEQ ID NO : 138) (SEQ ID NO : 141 )

102E9-VHha 102E9-VKhb

102E9H9

(SEQ ID NO : 138) (SEQ ID NO : 142)

102E9-VHha 102E9-VKhc

102E9H13

(SEQ ID NO : 138) (SEQ ID NO : 143) Séquence d'acides aminés Séquence d'acides aminés

Anticorps humanisé dérivé

comprise dans le domaine comprise dans le domaine de 102E9

VH VL (VK)

102E9-VHhb 102E9-VKha

102E9H6

(SEQ ID NO : 139) (SEQ ID NO : 141 )

102E9-VHhb 102E9-VKhb

102E9H10

(SEQ ID NO : 139) (SEQ ID NO : 142)

102E9-VHhb 102E9-VKhc

102E9H1

(SEQ ID NO : 139) (SEQ ID NO : 143)

102E9-VHhc 102E9-VKha

102E9H7

(SEQ ID NO : 140) (SEQ ID NO : 141 )

102E9-VHhc 102E9-VKhb

102E9H1 1

(SEQ ID NO : 140) (SEQ ID NO : 142)

102E9H15 102E9-VHhc 102E9-VKhc

(SEQ ID NO : 140) (SEQ ID NO : 143)

Tableau 8. Séquences d'acides aminés comprises dans les domaines VH et VL des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9. Les séquences correspondant aux anticorps préférés (car présentant une liaison du niveau de la liaison de l'anticorps chimérique proche de celle de l'anticorps chimérique d'origine : au moins 70% de la liaison de l'anticorps chimérique dans le test ELISA) sont présentées en gras.

Un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention, qui est chimérique avec des régions constantes humaines, ou bien humanisé, comprendra avantageusement une région constante de chaine lourde humaine ayant pour séquence d'acides aminés SEQ ID NO :53 ou SEQ ID NO : 144 (qui correspond à la séquence de région constante de chaine lourde humaine SEQ ID NO :53 avec un résidu lysine additionnel en C-terminal). De plus ou de manière alternative, un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention, qui est chimérique avec des régions constantes humaines, ou bien humanisé, comprendra avantageusement une région constante de chaine légère humaine ayant pour séquence d'acides aminés SEQ ID NO :54. Les séquences préférées de région constante de chaine lourde (SEQ ID NO :53 ou SEQ ID NO : 144) ou légère (SEQ ID NO :54) humaine, d'isotype lgG1 , sont présentées dans le Tableau 9 ci-dessous. ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

Région AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC constante de PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD chaîne lourde GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI E humaine KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP préférée (lgG1 ) ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPG (SEQ ID NO : 53)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

Région AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC constante de PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD chaîne lourde GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI E humaine KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP préférée (lgG1 ) ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPG K (SEQ I D NO -A A4)

Région

constante de RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE chaîne légère SVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYAC EVTH QG LSS PVTKS FN RG EC humaine (SEQ ID NO : 54)

préférée (lgG1 )

Tableau 9. Séquences préférées de région constante de chaîne lourde (SEQ I D NO : 53 ou SEQ ID NO : 1 4) ou légère (SEQ ID NO : 54) humaine. La séquence de région constante de chaîne lourde humaine SEQ I D NO : 144 correspond à la séquence de région constante de chaîne lourde humaine SEQ I D NO : 53 avec un résidu lysine additionnel en C- terminal.

Ainsi, les chaines lourdes et légères des anticorps chimériques ou humanisés, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention comprennent avantageusement les séquences décrites dans le Tableau 10 ci-dessous (ou sont essentiellement constituées ou sont constituées de telles séquences).

Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ I D NO : 43-SEQ I D NO: 53 Fusion SEQ I D NO : 48-SEQ I D NO: 54

122A2

(SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO:60)

Fusion SEQ I D NO : 44-SEQ I D NO: 53 Fusion SEQ I D NO : 49-SEQ I D NO: 54

102E9

(SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO:61 ) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ ID NO : 45-SEQ ID NO:53 Fusion SEQ ID NO : 50-SEQ ID NO: 54

104C12

(SEQID NO:57) (SEQID NO:62)

Fusion SEQ ID NO : 46-SEQ ID NO:53 Fusion SEQ ID NO : 51 -SEQ ID NO:54

114D11

(SEQID NO:58) (SEQID NO:63)

Fusion SEQ ID NO : 47-SEQ ID NO:53 Fusion SEQ ID NO : 52-SEQ ID NO: 54

104E10

(SEQID NO:59) (SEQID NO:64)

Fusion SEQ ID NO : 43-SEQ ID NO:144 Fusion SEQ ID NO : 48-SEQ ID NO: 54

122A2

(SEQID NO:145) (SEQID NO:60)

Fusion SEQ ID NO : 44-SEQ ID NO: 144 Fusion SEQ ID NO : 49-SEQ ID NO: 54

102E9

(SEQID NO:146) (SEQID NO:61)

Fusion SEQ ID NO : 45-SEQ ID NO: 144 Fusion SEQ ID NO : 50-SEQ ID NO: 54

104C12

(SEQID NO:147) (SEQID NO:62)

Fusion SEQ ID NO : 46-SEQ ID NO: 144 Fusion SEQ ID NO : 51 -SEQ ID NO:54

114D11

(SEQID NO:148) (SEQID NO:63)

Fusion SEQ ID NO : 47-SEQ ID NO: 144 Fusion SEQ ID NO : 52-SEQ ID NO: 54

104E10

(SEQID NO:149) (SEQID NO:64)

Anticorps humanisés

Fusion SEQ I D NO : 134-SEQ I D NO: 54

122A2H5

(SEQID NO:153)

Fusion SEQID NO : 135-SEQID NO:54

122A2H9 Fusion SEQID NO : 131 -SEQID

(SEQID NO:154)

NO: 144

Fusion SEQID NO : 136-SEQID NO:54

122A2H13 (SEQID NO:150)

(SEQID NO:155)

Fusion SEQID NO : 137-SEQID NO:54

122A2H17

(SEQID NO:156)

Fusion SEQ I D NO : 134-SEQ I D NO: 54

122A2H6

(SEQID NO:153)

Fusion SEQID NO : 135-SEQID NO:54

122A2H10 Fusion SEQID NO : 132-SEQID

(SEQID NO:154)

NO: 144

Fusion SEQID NO : 136-SEQID NO:54

122A2H14 (SEQID NO:151)

(SEQID NO:155)

Fusion SEQID NO : 137-SEQID NO:54

122A2H18

(SEQID NO:156) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps humanisés

Fusion SEQ I D NO : 134-SEQ I D NO: 54

122A2H7

(SEQID NO:153)

Fusion SEQID NO : 135-SEQID NO:54

122A2H11 Fusion SEQID NO : 133-SEQID

(SEQID NO:154)

NO: 144

Fusion SEQID NO : 136-SEQID NO:54

122A2H15 (SEQID NO:152)

(SEQID NO:155)

Fusion SEQID NO : 137-SEQID NO:54

122A2H19

(SEQID NO:156)

Fusion SEQ I D NO : 141 -SEQ I D NO: 54

102E9H5

(SEQID NO:160)

Fusion SEQID NO : 138-SEQID

Fusion SEQ ID NO : 142-SEQ ID NO: 54

102E9H9 NO: 144

(SEQID NO:161)

(SEQID NO:157)

Fusion SEQ ID NO : 143-SEQ ID NO:54

102E9H13

(SEQID NO:162)

Fusion SEQ I D NO : 141 -SEQ I D NO: 54

102E9H6

(SEQID NO:160)

Fusion SEQID NO : 139-SEQID

Fusion SEQ ID NO : 142-SEQ ID NO: 54

102E9H10 NO: 144

(SEQID NO:161)

(SEQID NO:158)

Fusion SEQ ID NO : 143-SEQ ID NO:54

102E9H1

(SEQID NO:162)

Fusion SEQ I D NO : 141 -SEQ I D NO: 54

102E9H7

(SEQID NO:160)

Fusion SEQID NO : 140-SEQID

Fusion SEQ ID NO : 142-SEQ ID NO: 54

102E9H11 NO: 144

(SEQID NO:161)

(SEQID NO:159)

Fusion SEQ ID NO : 143-SEQ ID NO:54

102E9H15

(SEQID NO:162)

Tableau 10. Séquences d'acides aminés des chaines lourdes et légères des anticorps chimériques ou humanisés selon l'invention.

La chaîne lourde et/ou la chaîne légère de l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention comprend avantageusement en outre au moins un peptide signal hétérologue de séquence SEQ ID NO :65 (MRWSWIFLLLLSITSANA, peptide signal MB7). En effet, ce peptide a été montré comme permettant d'améliorer l'expression et la sécrétion de protéines recombinantes dans des lignées cellulaires eucaryotes supérieures (voir WO201 1 /1 14063). Ainsi, les chaines lourdes des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention comprennent avantageusement une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 66 à 70, constituées de la fusion de N- en C-terminal entre la séquence d'acides aminés du peptide signal MB7 (SEQ ID NO :65) et d'une des séquences d'acides aminés de la région VH des anticorps selon l'invention (SEQ ID NO : 43 à 47), ou sont essentiellement constituées, ou sont constituées de telles séquences. De plus ou de manière alternative, les chaines légères des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention comprennent avantageusement une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 71 à 75, constituées de la fusion de N- en C-terminal entre la séquence d'acides aminés du peptide signal MB7 (SEQ ID NO :65) et d'une des séquences d'acides aminés de la région VL des anticorps selon l'invention (SEQ ID NO : 48 à 52) , ou sont essentiellement constituées, ou sont constituées de telles séquences. En ajoutant les régions constantes de chaîne lourde et de chaîne légère préférées, on obtient des séquences d'acides aminés complètes préférées des anticorps selon l'invention, tel que décrit dans le Tableau 1 1 ci-dessous. Pour la chaîne lourde, la région constante peut en outre contenir un résidu lysine additionnel en C-terminal. Ainsi, les chaines lourdes et légères des anticorps chimériques ou humanisés, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention comprennent avantageusement les séquences décrites dans le Tableau 1 1 ci-dessous (ou sont essentiellement constituées ou sont constituées de telles séquences).

Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 48-

122A2 43-SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO:76) (SEQ ID NO:81 )

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 49-

102E9 44-SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO:77) (SEQ ID NO:82)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 50-

104C12 45-SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO:78) (SEQ ID NO:83) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 51-

114D11 46-SEQID NO:53 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:79) (SEQ ID NO:84)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 52-

104E10 47-SEQID NO:53 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:80) (SEQ ID NO:85)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 48-

122A2 43-SEQID NO:144 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:163) (SEQ ID NO:81)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 49-

102E9 44-SEQID NO: 144 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:164) (SEQ ID NO:82)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 50-

104C12 45-SEQID NO:144 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:165) (SEQ ID NO:83)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 51-

114D11 46-SEQID NO:144 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:166) (SEQ ID NO:84)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 52-

104E10 47-SEQID NO:144 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:167) (SEQ ID NO:85)

Anticorps humanisés

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 134-

122A2H5 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:171)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 135-

122A2H9 SEQID NO:54

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO :

(SEQ ID NO:172)

131-SEQID NO:144

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 136- (SEQ ID NO:168)

122A2H13 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:173)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 137-

122A2H17 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:174) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps humanisés

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 134-

122A2H6 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:171)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 135-

122A2H10 SEQID NO:54

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO :

(SEQ ID NO:172)

132-SEQID NO:144

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 136- (SEQ ID NO:169)

122A2H1 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:173)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 137-

122A2H18 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:174)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 134-

122A2H7 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:171)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 135-

122A2H11 SEQID NO:54

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO :

(SEQ ID NO:172)

133-SEQID NO:144

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 136- (SEQ ID NO:170)

122A2H15 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:173)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 137-

122A2H19 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:174)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 141-

102E9H5 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:178)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 142-

102E9H9 138-SEQID NO:144 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:175) (SEQ ID NO:179)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQID NO : 143-

102E9H13 SEQID NO:54

(SEQ ID NO:180) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps humanisés

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 141 -

102E9H6 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO: 178)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 142-

102E9H10 139-SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO: 176) (SEQ ID NO: 179)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 143-

102E9H14 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO: 180)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 141 -

102E9H7 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO: 178)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 142-

102E9H1 1 140-SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO: 177) (SEQ ID NO: 179)

Fusion SEQ ID NO :65-SEQ ID NO : 143-

102E9H15 SEQ ID NO:54

(SEQ ID NO: 180)

Tableau 1 1. Séquences d'acides aminés des chaînes lourdes et légères des anticorps chimériques et humanisés selon l'invention, avec le peptide signal MB7.

L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention peut être produit à partir de toute cellule hôte, de tout animal non-humain transgénique ou de toute plante transgénique décrite dans la présente description, et notamment ci- dessous dans la partie concernant les acides nucléiques, vecteurs, cellules hôtes, animaux non-humains transgéniques et plantes transgéniques selon l'invention. Par « fragment fonctionnel », on entend un fragment d'anticorps conservant le domaine de liaison à l'antigène et ayant donc la même spécificité antigénique que l'anticorps d'origine, tels que les fragments Fv, ScFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou les dianticorps (« diabodies »). Un fragment fonctionnel d'anticorps selon l'invention est donc avantageusement choisi parmi les fragments Fv, ScFv, Fab, F(ab') ₂ , Fab', scFv-Fc ou les dianticorps (« diabodies »). Par « dérivé » d'un anticorps, on entend une protéine de fusion formée d'un peptide support et d'au moins un des CDR de l'anticorps d'origine permettant de préserver sa capacité à reconnaître CD303. L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention possède avantageusement une faible teneur en fucose, inférieure ou égale à 65%.

Par « teneur en fucose », on entend le pourcentage de formes fucosylées au sein des N- glycannes attachés au résidu Asn297 du fragment Fc de chaque chaîne lourde de chaque anticorps. Par « faible teneur en fucose », on entend une teneur en fucose inférieure ou égale à 65%. En effet, il est aujourd'hui connu que la teneur en fucose d'une composition d'anticorps joue un rôle crucial dans la capacité de cette composition à induire une forte réponse ADCC via le récepteur FcyRIII. Avantageusement, la teneur en fucose est inférieure ou égale à 65%, de préférence inférieure ou égale à 60%, à 55% ou à 50%, voire inférieure ou égale à 45%, à 40%, à 35%, à 30%, à 25% ou à 20%. Cependant, il n'est pas nécessaire que la teneur en fucose soit nulle, et elle peut par exemple être supérieure ou égale à 5%, à 10%, à 15% ou à 20%. La teneur en fucose peut par exemple être comprise entre 5 et 65%, entre 5 et 60%, entre 5 et 55%, entre 5 et 50%, entre 5 et 45%, entre 5 et 40%, entre 5 et 35%, entre 5 et 30%, entre 5 et 25%, entre 5 et 20%, entre 10 et 65%, entre 10 et 60%, entre 10 et 55%, entre 10 et 50%, entre 10 et 45%, entre 10 et 40%, entre 10 et 35%, entre 10 et 30%, entre 10 et 25%, entre 10 et 20%, entre 15 et 65%, entre 15 et 60%, entre 15 et 55%, entre 15 et 50%, entre 15 et 45%, entre 15 et 40%, entre 15 et 35%, entre 15 et 30%, entre 15 et 25%, entre 15 et 20%, entre 20 et 65%, entre 20 et 60%, entre 20 et 55%, entre 20 et 50%, entre 20 et 45%, entre 20 et 40%, entre 20 et 35%, entre 20 et 30%, entre 20 et 25%.

L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention peut par ailleurs posséder différents types de glycosylation (N-glycannes de type oligomannose ou complexes biantennés, proportion variable de résidus N-acétylglucosamine (GlcNAc) intercalaires ou de résidus galactose dans le cas des N-glycannes de type complexes biantennés), à condition de posséder un faible teneur en fucose. Ainsi, des N-glycannes de type oligomannose peuvent être obtenus par culture en présence de différents inhibiteurs de glycosylation, tels que les inhibiteurs de a1 ,2-mannosidase I (comme la Deoxymannojirimycine ou « DMM ») ou de α-glucosidase (comme la castanospermine ou « Cs ») ; ou bien par production de l'anticorps dans la lignée CHO Lec 1 . La production dans le lait de chèvres transgéniques conduit également à l'obtention d'anticorps dont le N-glycanne majoritaire est de type oligomannose, avec comme formes minoritaires des formes complexes biantennées fucosylées avec un ou deux galactoses, sans GlcNAc intercalaire et sans sialylation (G1 F ou G2F) (voir WO2007/048077). Des N-glycannes de type complexe biantenné peuvent être obtenus dans la plupart des cellules de mammifères, mais également dans des bactéries, levures ou plantes dont la machinerie de glycosylation a été modifiée. Pour limiter la teneur en fucose, des lignées possédant naturellement une faible activité de l'enzyme FUT8 (1 ,6- fucosyltransférase) responsable de l'ajout du fucose sur le GlcNAc lié au fragment Fc ; telles que la lignée YB2/0, la lignée de cellule embryonnaire de canard EB66®, les lignées d'hépatome de rat rat H4-II-E (DSM ACC3129), H4-ll-Es (DSM ACC3130), ou les lignées NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807), et NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856) peuvent être utilisées. Des lignées mutantes pour d'autres gènes et dont la sous-expression ou la surexpression conduit à une faible teneur en fucose peuvent également être utilisées, comme la lignée CHO Lec13, un mutant de la lignée CHO ayant une synthèse diminuée du GDP-fucose. Il est également possible de sélectionner une lignée d'intérêt et de diminuer ou abolir (notamment par utilisation d'ARN interférents ou par mutation ou délétion du gène exprimant la protéine d'intérêt) l'expression d'une protéine impliquée dans la voie de fucosylation des N-glycannes (notamment FUT8, voir Yamane-Ohnuki et al-2004 ; mais également GMD, un gène impliqué dans le transport du GDP-fucose, voir Kanda et al-2007). Une autre alternative consiste à sélectionner une lignée d'intérêt et à surexprimer une protéine interférant d'une façon ou d'une autre avec la fucosylation des N-glycannes, comme la protéine GnTIII (6(1 ,4)-N-acétylglucosaminetransférase III). En particulier, des anticorps possédant des N-glycannes faiblement fucosylés ont été notamment obtenus par :

• Production dans YB2/0 (voir EP1176195A1 , WO01 /77181 , Shinkawa et al-2003) CHO Lec13 (voir Shields et al-2002), EB66® (Olivier et al-2010), les lignées d'hépatome de rat rat H4-II-E (DSM ACC3129), H4-ll-Es (DSM ACC3130) (voir

WO2012/041768), et les lignées humaines NM-H9D8 (DSM ACC2806), NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807), et NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856) (voir WO2008/028686).

• Production dans une lignée CHO sauvage en présence de petits ARNs interférents dirigés contre FUT8 (Mori et al-2004, Suzuki et al-2007, Cardarelli et al-2009, Cardarelli et al-2010, Herbst et al-2010), ou GMD (gène codant pour le transporteur du GDP-fucose dans le Golgi, voir Imai-Nishiya et al-2007)

• Production dans une lignée CHO dont les deux allèles du gène FUT8 codant pour la 1 ,6-fucosyltransférase ont été délétés (Yamane-Ohnuki et al-2004), ou dont les deux allèles du gène GMD codant pour le transporteur du GDP-fucose dans le Golgi ont été délétés (Kanda et al-2007), • Production dans une lignée CHO dans laquelle le gène codant pour l'enzyme GnTIII (6(1 ,4)-N-acétylglucosaminetransférase III) a été surexprimé par transgénèse (Umana et al-1999). Outre une faible fucosylation, les N-glycannes obtenus sont caractérisés par une forte teneur en GlcNAc intercalaire.

Production dans des plantes (N. benthamiana) transgéniques, avec une forte diminution des teneurs en résidus 61 ,2-xylose et a1 ,3-fucose grâce à l'utilisation de petits ARNs interférents (Forthal et al-2010).

Les N-glycannes de type oligomannose ont une demi-vie réduite in vivo par rapport aux N-glycannes de type complexe biantenné. Par conséquent, avantageusement, les anticorps selon l'invention possèdent sur leurs sites de N-glycosylation du fragment Fc des structures glycanniques de type complexe biantenné, avec une faible teneur en fucose, comme défini ci-dessus.

En particulier, l'anticorps monoclonal selon l'invention peut posséder une teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 60% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 65% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 70% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 75% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 80% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 60%, à 65%, à 70%, à 75% ou à 80% et une teneur en formes G0F+G1 F inférieure à 50%. Les formes G0, G1 , G0F et G1 F sont telles que définies ci-dessous :

G0 G0F G1 G1 F

■ GlcNAc O Mannose Galactose Fucose

De telles compositions d'anticorps peuvent notamment être obtenues par production dans YB2/0, dans CHO Lec13, dans des lignées CHO sauvages cultivées en présence de petits ARNs interférents dirigés contre FUT8 ou GMD, dans des lignées CHO dont les deux allèles du gène FUT8 codant pour la 1 ,6-fucosyltransférase ou les deux allèles du gène GMD codant pour le transporteur du GDP-fucose dans le Golgi ont été délétés.

Cependant, dans un autre mode de réalisation, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention possède une forte teneur en N-glycannes de type oligomannose.

Par « N-glycannes de type oligomannose », on entend des N-glycannes dont le cœur pentasaccharidique, constitué de deux résidus N-acétylglucosamine (GlcNAc) (l'un d'eux étant lié au résidu Asn297 du fragment Fc de l'anticorps) et trois résidus mannose, est complété par un à six mannoses additionnels fixés aux résidus mannose terminaux du cœur pentasaccharidique. Les N-glycannes de type oligomannose ne sont pas fucosylés. Par « teneur en N-glycannes de type oligomannose », on entend le pourcentage de formes oligomannose au sein des N-glycannes attachés au résidu Asn297 du fragment Fc de chaque chaîne lourde de chaque anticorps. Par « forte teneur en N-glycannes de type oligomannose », on entend une teneur en N-glycannes de type oligomannose supérieure ou égale à 30%, avantageusement supérieure ou égale à 35%, supérieure ou égale à 40%, supérieure ou égale à 45%, supérieure ou égale à 50%, supérieure ou égale à 55%, supérieure ou égale à 60%, supérieure ou égale à 65%, supérieure ou égale à 70%, supérieure ou égale à 75%, supérieure ou égale à 80%, supérieure ou égale à 85%, supérieure ou égale à 90%, voire supérieure ou égale à 95%.

En sus ou alternativement à une faible teneur en fucose, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention possède une forte teneur en galactose.

Par « teneur en galactose » ou « taux de galactosylation » de l'anticorps, on entend un pourcentage calculé à partir d'un chromatogramme d'analyse des N-glycannes libérés de l'anticorps, selon la formule suivante : teneur en galactose =

de Gai) x (% surface relative)

∑Y _{= 1} (nombre de A) x (% surface relative)

dans laquelle :

« n » représente le nombre de pics N-glycannes analysés sur un chromatogramme, par exemple d'un spectre de chromatographie en phase liquide à haute performance en phase normale (NP HPLC), « nombre de Gai » représente le nombre de galactoses sur l'antenne du glycanne correspondant au pic,

« nombre de A » représente le nombre d'antennes N-acétyl-glucosamine de la forme glycannique correspondant au pic, et

- « % surface relative » correspond au pourcentage de l'aire sous le pic correspondant.

Par « forte teneur en galactose », on entend une teneur en galactose supérieure ou égale à 30%, avantageusement supérieure ou égale à 50%, avantageusement supérieure ou égale à 55%, supérieure ou égale à 60%, supérieure ou égale à 65%, supérieure ou égale à 70%, supérieure ou égale à 75%, supérieure ou égale à 80%, supérieure ou égale à 85%, supérieure ou égale à 90%, supérieure ou égale à 95%, voire égale à 100%.

La présente invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain (SEQ ID NO : 130), ou un fragment fonctionnel ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce que :

a) il possède une affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a) améliorée par rapport à des anticorps dirigés contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain, produits dans la lignée cellulaire CHO ; et

b) les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

L'affinité du fragment Fc d'un anticorps pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a) peut être mesurée par plusieurs méthodes, dont la résonance plasmonique de surface (RPS, notamment à l'aide d'un appareil type BIAcore 2000 - Pharmacia Biosensor, Upsala, Suède) et l'analyse Scatchard. Huit gènes codant pour les FcyR ont été identifiés chez l'homme, mais seulement cinq codent pour des récepteurs exprimés (FcyRIa, FcyRIla, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIb). Tous sont des récepteurs activateurs des cellules effectrices, hormis le FcyRIIb qui lui est un récepteur inhibiteur de l'activation des cellules immunitaires. Les récepteurs FcyRIa sont caractérisés par une forte affinité pour les immunoglobulines (Kd de 5.10 ^"7 à 10 ^"10 M) tandis que les récepteurs FcyRIla, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIb sont caractéristiques des récepteurs de faible affinité (Kd inférieure à 10 ^"7 M). Les anticorps selon l'invention ont une affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a) améliorée par rapport à des anticorps dirigés contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain produits dans la lignée cellulaire CHO. Dans le cadre de cette comparaison, il est de préférence fait référence à une lignée CHO sauvage produisant en conditions normales des anticorps dont le fragment Fc est très fortement fucosylé (au moins 80%, de préférence au moins 90% d'oligosaccharides attachés au fragment Fc sont fucosylés), telle que l'une des lignées CHO-K-1 (ATCC® CCL-61™), CHO Pro-5 (ATCC® CRL-1781™), CHO dhfr- (ATCC® CRL-9096™), CHO-DP12 (ATCC® CRL-12444™ ou ATCC® CRL-12445™), CHO DUKX-B11 (ATCC CRL-9010), et CHO DG-44 (Urlaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983). Les anticorps selon l'invention qui ont une affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a) améliorée par rapport à des anticorps dirigés contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain produits dans la lignée cellulaire CHO (telle que définie ci-dessus) ont l'avantage que cette affinité améliorée leur permet de ne pas être déplacés ou d'être moins déplacés du récepteur FcyRIIIa (CD16a) par des anticorps IgG polyclonaux, notamment les IgG présents dans le sérum sanguin. De tels anticorps ont avantageusement une forte affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a), c'est-à-dire une affinité au moins égale à 2x10 ⁶ M ^"1 , au moins égale à 2x10 ⁷ M ^"1 , 2x10 ⁸ M ^"1 ou 2x10 ⁹ M ^{" 1} , telle que déterminée par l'analyse Scatchard ou la technologie BIAcore (Label-free surface plasmon résonance based technology).

Une forte affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a), significativement améliorée par rapport à des anticorps produits dans la lignée cellulaire CHO, peut être obtenue de différentes façons décrites ci-dessus pour l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention défini par sa capacité à entrer en compétition pour la liaison à l'ectodomaine de CD303 avec les anticorps particuliers développés par les inventeurs et par le fait que les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine. En particulier, une forte affinité pour le récepteur FcyRIIIa (CD16a), significativement améliorée par rapport à des anticorps produits dans la lignée cellulaire CHO, peut être obtenue par :

· La présence de mutations dans le fragment Fc augmentant la liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a), tel que décrit précédemment (notamment les mutations augmentant la liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a) décrites dans telles que décrites dans WO00/42072, Shields et al-2001 , Lazar et al-2006, WO2004/029207, WO2004/063351 , WO2004/074455) ; et/ou

· Le contrôle de la glycosylation de l'anticorps, notamment :

o Faible teneur en fucose, au sein de formes complexes biantennées et/ou via une forte teneur en N-glycannes de type oligomannose, tel que décrit précédemment, et/ou

o Forte teneur en galactose, tel que décrit précédemment. Un tel anticorps selon l'invention peut par ailleurs posséder toute caractéristique ou combinaison de caractéristique décrite ci-dessus pour l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention défini par sa capacité à entrer en compétition pour la liaison à l'ectodomaine de CD303 avec les anticorps particuliers développés par les inventeurs et par le fait que les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

Acides nucléiques, vecteurs, cellules hôtes, animaux non-humains transgéniques et plantes transgéniques

La présente invention concerne également un acide nucléique (encore appelé séquence nucléique ou nucléotidique) codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère d'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention tel que décrit ci- dessus.

Toutes les séquences nucléiques différentes, du fait de la dégénérescence du code génétique, codant pour une séquence d'acides aminés particulière sont dans la portée de l'invention.

En particulier, la séquence d'un acide nucléique selon l'invention peut avoir été optimisée pour favoriser son expression dans une cellule hôte, un animal non-humain transgénique ou une plante transgénique d'intérêt. En effet, il existe en général plusieurs combinaisons de trois nucléotides codant le même acide-aminé (sauf pour la méthionine et le tryptophane), appelés codons synonymes. Cependant, certaines de ces combinaisons sont en général utilisées préférentiellement par une cellule ou un organisme donné (on parle alors de biais d'usage du code génétique). Cette préférence dépend notamment de l'organisme producteur ou dont est issue la cellule. Par conséquent, lorsqu'une protéine dérivée d'un ou plusieurs organismes est produite dans un organisme hétérologue ou dans une cellule d'un tel organisme hétérologue, il peut être utile de modifier la séquence nucléique codant pour la protéine de façon à utiliser principalement les codons préférés de l'organisme hétérologue. Des données sont disponibles dans la littérature concernant l'usage des codons préféré par différentes espèces et l'homme du métier sait comment optimiser l'expression d'une protéine donnée dans un organisme ou une cellule d'un organisme hétérologue.

Un acide nucléique selon l'invention comprend avantageusement au moins une des séquences SEQ ID NO : 86 à 95 (anticorps chimériques), telles que décrites dans le Tableau 12 ci-dessous, qui codent pour les séquences d'acides aminés des régions VH et VL des anticorps selon l'invention et ont été optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus. Anticorps VH VL

CAG GTCCAG CTG CAG C AGTCTG G G G CT GATATCCAGATGACACAGACTACAT GAG CTG GTG AG G CCTG G G GTCTCAGTG CCTCCCTGTCTG CCTCTCTG G GAG A AAGA I I I CCTGCAAGGGTTCTGGCTACA CAG AGTC ACCATCAGTTG CAG G G CA CATTCACTG ATTATTCTATG CACTG G GT AGTCAGGACATTAGCAATTA I I I AA G AAG C AG AGTC ATG CAAAG AGTCTAG AG ACTG GTATCAG C AG AAACCAG ATG G TG G ATTG G AGTTATTAGTACTTACTATG AACTGTTAAACTCCTGATCTACTAC GTGATTCTAACTATAACCAGAAGTTCAA ACATCAAGATTACACTCAGGAGTCC

122A2

G G G CAAG G CCAC AATG ACTGTAG AC AAA CATC AAG GTTCAGTG G CAGTG G GT TCCTCCACCACAGCCTATATGGAACTTG CTGGAACAGATTATTCTCTCACCAT CCAGACTGACATCTGAGGATTCTGCCAT TAGCAACCTGGACCAAGAAGATATT CTATTACTGTGCAAGAAATGGTAA I I I C GCCACTTAC I I I I GCCAACAGGGTA TATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAA ATACGCTTCCTTGGACGTTCGGTGG CCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ I D AG G C ACCAAG CTG G AAATC AAA NO :86) (SEQ ID NO :91 )

CAG ATCCATTTG GTG CAGTCTG G ACCTG CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAG ACCTG AAG AAG CCTG GAG AGACAGTCAA CAATC ATGTCTG C ATCTCC AG G G G A G ATCTCCTG CAAG G CTTCTG GTTATACC G AAG GTCACCATAACCTG C AGTG CC TTC ACAG ACTATTCAATG CACTG G GTG A AGCTCAAGTGTAA I I I ACATTCACT AGCAGGCTCCAGGAAAGGG I I I AAAGTG G GTTCCAG C AG AAG CC AG G CACTTC GATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGT TCCCAAACTCTGGA I I I ATAGCACA GAACCAACATATGCAGATGACTTCAAGG TCCTACCTG G CTTCTG G AGTCCCTG

102E9

GACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAAGTTC CTCG CTTC AGTG G CAGTG G ATCTG TG CC AG CACTG CCTTTTTG C AG ATCAAC GGACCTCTTACTCTCTCACAATCAG AACCTCAAAAATGAGGACACGTCTACAT CCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGC

A l I I CTGTACTAGAAATGGTTACTACGT C ACTTATT ACTG C CAG C AG AG G AG A GGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGT AGTTACCCGTTCACGTTCGGAGGG CAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA GGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ (SEQ ID NO :87) I D NO :92) Anticorps VH VL

CAG GTCCAG CTG CAG C AGTCTG G G G CT GATCTCCAGATGACACAGACTCCAT GAG CTG GTG G G G CCTG G G GTCTCAGTG CCTCCCTGTCTG CCTCTCTG G GAG A AAGA I I I CCTGCAAGGGTTCTGGCTACA CAG AGTC ACC ATC AGTTG CAG G G CA CATTCACTG ATTATTCTATG CACTG G GT AGTCAGGACATTAACAATTA I I I AA AAAGCAGAGTCATGCAAAGAGTCTAGAG GCTGGTATCAGGAGAAACCAGATG TG G ATTG G AGTTATTAGTCCTTACTATG GAAC I I I I AAACTCCTGATCTACTA GTGATACTAACTACAACCAGAAGTTCAA CACATCAAGATTACACTCAGGAGTC

104C12

GGGCAAGGCCACAATGACTGTAGACAAA CCATCAAG GTTCAGTG G CAGTG G G TCCTC CAG C AC AG C CTATATG G AACTTG TCTGGAACAGATTATTCTCTCACCG CCAGTCTGACATCTGAGGATTCTGCCAT TTCGCAACCTGGAACAGGAAGATAT CTA I I I CTGTGCAAGAAATGATGATTAC TGGCACTTAC I I I I GCCAACAGGGT TACAGG I I I G CTTACTG G G G CC AAG G G A AAAACGCTTCCGTGGACGTTCGGTG CTCTG GTCACTGTCTCTG C (SEQ I D GAG G C ACCAAG CTG G AAATCAG NO :88) (SEQ ID NO :93)

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTG CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAG AGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAA CAATC ATGTCTG C ATCTCC AG G G G A G ATCTCCTG C AAG G CTTCTG GTTATACC G AAG GTCACCATAACCTG C AGTG CC TTC ACAG ACTCTTCAATG CACTG G GTG C AGCTCAAGTGTA I I I I ACATGCACT AGCAGGCTCCAAACAAGGG I I I AAAGTG G GTTCCAG C AG AAG CC AG G CACTTC GATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGT TCCCAAACTCTGGA I I I ATAGCACA GGGCCAACGTATGCAGATGA I I I CAAGG TCC AACCTG G CTTCTG G AGTCCCTG

1 14D1 1

GACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTC CTCG CTTC AGTG G CAGTG G ATCTG TGCCAGAACTGCCTA I I I GCAGATCAAC GGACCTCTTACTCTCTCACAATCAG AACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACAT CCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGC

A l I I CTGTGCTAGAAATGGATACTACGT CACTTATTACTG CCAG C AAAG G AG A G G G GTACTATG CTCTG G ACTACTG G G G AGTTACCCGTACACGTTCGGAGGG TCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA GGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ (SEQ ID NO :89) I D NO :94) Anticorps VH VL

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTG CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAG AG CTG AAG AAG CCTG G AG AG ACAGTCAA CAATC ATGTCTG C ATCTCC AG G G G A G ATCTCCTG C AAG G CTTCTG GTTATACC G AAG GTCACCATG ACCTG C AGTG CC TTC ACAG ACTATTCAATG CACTG G GTG A AGTTCAAGTGTAA I I I ACATGCACT AGCAGGCTCCAGGAAAGGG I I I AAAGTG G GTTCCAG C AG AAG CC AG G CACTTC G ATG G G CTG G ATAAAC ACTG AG ACTG GT TCCCAAACTCTGGA I I I ATAGCACA GAG CCAAC ATATG C AG ATG ACTTC AAG G TCC AACCTG G CTTCTG G AGTCCCTG

104E10

GACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTC CTCG CTTC AGTG G CAGTG G ATCTG TGCCACCACTGCCTA I I I GCAGATCAAC GGACATCTTACTCTCTCACAATCAG AACTTCAAAAATGAGGACACGGCTACAT CCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGC

A l I I CTGTGCTAGAAATGGTTACTACGT CACTTATTACTG CCAG C AAAG G AG A G G G AT ATT ATG CTATG G ACTACTG G G GT AGTTACCCGTACACGTTCGGAGGG CAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA GGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ (SEQ ID NO :90) ID NO :95)

Tableau 12. Séquences nucleotidiques préférées, optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus codant pour les régions VH et VL des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention. Un acide nucléique selon l'invention peut aussi avantageusement comprendre au moins une des séquences SEQ ID NO : 181 à 187 (anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 122A2), telles que décrites dans le Tableau 13 ci-dessous, qui codent pour les séquences d'acides aminés des régions VH et VL d'anticorps humanisés selon l'invention et ont été optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus.

122A2 - VH de

chaîne lourde Séquence

humanisée

122A2-VHha caggtccagctgcagcagtctggcgccgaagtggtcaagcctggcgcctccgtgaagatc agct gcaagggcagcggctacaccttcaccgactacagcatgcactgggtcaagcaggcccacg cca agagcctggaatggatcggcgtgatcagcacctactacggcgacagcaactacaaccaga agt tcaagggcaaagtcaccatgaccgtggacaagagcagctccaccgcctacatggaactga gca ggctgaccagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccagaaacggcaacttctacgtga tgg actactggggccagggcaccctggtcaccgtgtcatct (SEQ ID NO : 181 )

122A2-VHhb caggtccagctgcagcagtctggcgccgaagtggtcaagcctggcgcctccgtgaagatc agct gcaagggcagcggctacaccttcaccgactacagcatgcactgggtccgacaggcccacg cca agagcctggaatggatcggcgtgatcagcacctactacggcgacagcaactacaaccaga agt tcaagggcaaagtcaccatgaccgtggacaccagcagctccaccgcctacatggaactga gca ggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccagaaacggcaacttctacgtga tgg actactggggccagggcaccctggtcaccgtgtcatct (SEQ ID NO : 182)

122A2-VHhc caggtccagctgcagcagtctggcgccgaagtggtcaagcctggcgcctccgtgaagatc agct gcaagggcagcggctacaccttcaccgactacagcatgcactgggtccgacaggcccctg gac agggcctggaatggatcggcgtgatcagcacctactacggcgacagcaactacaaccaga agt tcaagggcaaagtcaccatgaccgtggacaagagcagctccaccgcctacatggaactga gca ggctgaccagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccagaaacggcaacttctacgtga tgg actactggggccagggcaccctggtcaccgtgtcatct (SEQ ID NO : 183)

122A2 - VL de

chaîne légère Séquence

humanisée

122A2-VKha gacatccagatgacccagagcaccagcagcctgagcgcctctctgggcgacagagtgacc atc acctgtcaggccagccaggacatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccgac ggc accgtgaagctgctgatctactacaccagcaggctgcacaccggcgtgcccagcagattc tctg gctctggcagcggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaccaggaagatattg cca cctactactgccagcagggcaacaccctgccctggacattcggcggaggcaccaagctgg aaa tcaag (SEQ ID NO : 184)

122A2-VKhb gacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgcctctgtgggcgacagagtgacc atc acctgtcaggccagccaggacatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccgac ggc accgtgaagctgctgatctactacaccagcaggctgcacaccggcgtgcccagcagattc tctg gctctggcagcggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaccaggaagatattg cca cctactactgccagcagggcaacaccctgccctggacattcggcggaggcaccaagctgg aaa tcaag (SEQ ID NO : 185)

122A2-VKhc gacatccagatgacccagagcaccagcagcctgagcgcctctctgggcgacagagtgacc atc acctgtcaggccagccaggacatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccgac ggc accgtgaagctgctgatctactacaccagcaacctgcacaccggcgtgcccagcagattc agc ggctctggctctggcaccgactacagcctgaccatctccaacctccagcaggaagatatt gcca cctactactgccagcagggcaacaccctgccctggacattcggcggaggcaccaagctgg aaa tcaag (SEQ ID NO : 186)

122A2-VKhd gacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgcctctgtgggcgacagagtgacc atc acctgtcaggccagccaggacatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccgac ggc accgtgaagctgctgatctactacaccagcaacctgcacaccggcgtgcccagcagattc agc ggctctggctctggcaccgactacagcctgaccatctccaacctccagcaggaagatatt gcca cctactactgccagcagggcaacaccctgccctggacattcggcggaggcaccaagctgg aaa tcaag (SEQ ID NO : 187)

Tableau 13. Séquences nucleotidiques préférées pour des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 122A2, optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus codant pour les régions VH et VL des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention.

Un acide nucléique selon l'invention peut aussi avantageusement comprendre au moins une des séquences SEQ ID NO : 188 à 193 (anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 102E9), telles que décrites dans le Tableau 14 ci-dessous, qui codent pour les séquences d'acides aminés des régions VH et VL d'anticorps humanisés selon l'invention et ont été optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus.

102E9 - VH de

chaîne lourde Séquence

humanisée

102E9-VHha cagatccatctggtgcagagcggccctgagctgaagaaacccggcgagagcgtgaagatc agc tgcaaggccagcggctacaccttcaccgactacagcatgcactgggtcaagcaggcccca ggc cagggcctgaagtggatgggctggatcaacaccgagacaggcgagcccacctacgccgac gac ttcaagggcagattcgtgttcagcctggacaccagcgtgtccaccgcctacctgcagatc aaca gcctgaagaacgaggacacctccacctactactgcacccggaacggctactacgtggggt act acgccatggactactggggccagggcacctccgtgaccgtgtcatct (SEQ ID NO : 188)

102E9-VHhb cagatccatctggtgcagagcggccctgagctgaagaaacccggcgagagcgtgaagatc agc tgcaaggccagcggctacaccttcaccgactacagcatgcactgggtccgacaggcccct gga cagggcctgaagtggatgggctggatcaacaccgagacaggcgagcccacctacgcccag gac ttcaagggcagattcgtgttcagcctggacaccagcgtgtccaccgcctacctgcagatc aaca gcctgaagaacgaggacacctccacctactactgcacccggaacggctactacgtggggt act acgccatggactactggggccagggcacctccgtgaccgtgtcatct (SEQ ID NO : 189)

102E9-VHhc cagatccatctggtgcagagcggcagcgagctgaagaaacccggcgagagcgtgaagatc agc tgcaaggccagcggctacaccttcaccgactacagcatgcactgggtccgacaggcccct gga cagggcctgaagtggatgggctggatcaacaccgagacaggcgagcccacctacgcccag gac ttcaagggcagattcgtgttcagcctggacaccagcgtgtccaccgcctacctgcagatc aaca gcctgaagaacgaggacacctccacctactactgcacccggaacggctactacgtggggt act acgccatggactactggggccagggcacctccgtgaccgtgtcatct (SEQ ID NO : 190)

102E9 - VL de Séquence chaîne légère

humanisée

102E9-VKha cagatccagctgacccagagccctagcttcctgagcgcctctcctggcgagagagtgacc atca cctgtagcgccagcagctccgtgatctacatccactggttccagcagaagcccggcaagg cccc taagctgtggatctacagcaccagctacctggccagcggcgtgccaagcagattcagcgg ctct ggctctggcaccgagtacaccctgaccatcagctccatggaagccgaggacttcgccacc tact actgccagcagaggcggagctaccccttcaccttcggcggaggcaccaagctggaaatca ag

(SEQ ID NO : 191 )

102E9-VKhb cagatccagctgacccagagccctagcttcctgagcgcctctcctggcgagagagtgacc atca cctgtagcgccagcagctccgtgatctacatccactggttccagcagaagcccggcaccg cccc taagctgtggatctacagcaccagctacctggccagcggcgtgccaagcagattcagcgg ctct ggcagcggcacctcctacaccctgaccatcagcaggatggaagccgaggacttcgccacc tac tactgccagcagaggcggagctaccccttcaccttcggcggaggcaccaagctggaaatc aag

(SEQ ID NO : 192)

102E9-VKhc cagatccagctgacccagagccctagcttcctgagcgcctctcctggcgacagagtgacc atca cctgtagcgccagcagctccgtgatctacatccactggttccagcagaagcccggcaagg cccc taagctgtggatctacagcaccagctacctggccagcggcgtgccaagcagattcagcgg ctct ggctctggcaccgagtacaccctgaccatcagctccatgcaggccgaggacttcgccacc tact actgccagcagaggcggagctaccccttcaccttcggcggaggcaccaagctggaaatca ag

(SEQ ID NO : 193)

Tableau 14. Séquences nucleotidiques préférées pour des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps 102E9, optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus codant pour les régions VH et VL des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention.

Les séquences nucléiques codant pour les régions constantes de chaîne lourde ou légère préférées ont également été optimisées pour une expression dans des cellules de l'espèce Rattus norvegicus et sont de préférence celles décrites dans le Tableau 15 ci- dessous.

GCCTCCACCAAGGGCCCATCCGTGTTCCCCCTGGCCCCATCCAGCAAGTCT

Région ACCTCCG G AG G C ACAG CCG CCCTG G G CTGTCTG GTG AAG G ACTACTTCCC constante de CGAGCCAGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGAGCCCTGACATCCGGCGTGC chaîne lourde ACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACTCTCTGTCTTCCG humaine TG GTG ACCGTG CC ATCCAG CTCCCTG G G AACCC AG ACATACATCTG CAACG préférée TG AACC ACAAG CCTAG CAAC ACC AAG GTG G AC AAG AAG GTG GAG CCT AAG

AG CTGTG ACAAG AC ACAC ACATG CCCTCCTTGTCCAG CCCCTG AG CTG CTG GGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATG ATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGA GGATCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACA ACG CTAAG ACCAAG CCCAG AG AG G AG CAGTACAACAG CACATACAG AGTG GTGTCTGTG CTG ACCGTG CTG CACCAG G ACTG G CTG AACG G G AAG G AGTA CAAGTG C AAG GTGTCC AACAAG G CCCTG CCTG CCCCTATCG AG AAG ACCAT CTCTAAG G CTAAG G G G C AG CCCCG G G AG CCACAG GTGTACACCCTG CC AC CCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTG AAGGGATTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCA GCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGATGGATC CTTCTTCCTGTACTCC AAG CTG ACCGTG G AC AAG AG CAG GTG G C AG CAG G G AAACGTGTTCTCTTGTTCCGTG ATG CACG AG G CTCTG CAC AACCACTACA CCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCAGGCAAG (SEQ ID NO :96)

CG AACTGTG G CTG CACCAAGTGTCTTCATCTTTCCTCCG AGTG ATG AG CAG

Région CTG AAG AG CG G G ACAG CTTCTGTG GTGTGTCTG CTG AATAACTTCTACCC constante de AAG AG AAG C AAAG GTCCAGTG G AAG GTG G ACAACG CCCTG C AGTCTG G CA chaîne légère ACTC ACAG G AGTCTGTC ACTG AG CAG G ATTCCAAG G ACAG CACTTAC AG CC humaine TGTCCAGCACCCTCACTCTGTCCAAAGCCGACTACGAAAAGCATAAGGTGT préférée ATG CTTGTG AG GTG ACCCACCAG G G ACTG AG C AG CCCTGTG ACG AAGTCC

TTCAACCGGGGCGAGTGC (SEQ I D NO :97)

Tableau 1 5. Séquences nucléotidiques préférées codant pour les régions constantes de chaîne lourde ou légère humaine préférées.

Ainsi, un acide nucléique codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère d'un anticorps selon l'invention comprend de préférence (ou est essentiellement constitué de, ou est constitué de) au moins une des séquences nucléiques décrites dans le Tableau 16 ci-dessous, constituées de la fusion de 5' en 3' :

• De l'une des séquences SEQ I D NO :86 à 90 codant pour la région VH des anticorps chimériques préférés selon l'invention et de la séquence SEQ Dl NO :96 codant pour la région constante préférée de chaîne lourde humaine (voir SEQ I D NO :98 à 102) ;

• De l'une des séquences SEQ I D NO :91 à 95 codant pour la région VL des anticorps chimériques préférés selon l'invention et de la séquence SEQ Dl NO :97 codant pour la région constante préférée de chaîne légère humaine (voir SEQ ID NO : 103 à 107) ; De l'une des séquences SEQ ID NO : 181 à 183 codant pour la région VH des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2 préférés selon l'invention et de la séquence SEQ Dl NO :96 codant pour la région constante préférée de chaîne lourde humaine (voir SEQ ID NO : 194 à 196) ;

De l'une des séquences SEQ ID NO : 184 à 187 codant pour la région VL des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2 préférés selon l'invention et de la séquence SEQ Dl NO :97 codant pour la région constante préférée de chaîne légère humaine (voir SEQ ID NO : 197 à 200) ;

De l'une des séquences SEQ ID NO : 188 à 190 codant pour la région VH des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9 préférés selon l'invention et de la séquence SEQ Dl NO :96 codant pour la région constante préférée de chaîne lourde humaine (voir SEQ ID NO :201 à 203) ;

De l'une des séquences SEQ ID NO : 191 à 193 codant pour la région VL des anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9 préférés selon l'invention et de la séquence SEQ Dl NO :97 codant pour la région constante préférée de chaîne légère humaine (voir SEQ ID NO :204 à 206).

Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ ID NO : 86-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 91 -SEQ ID NO:97

122A2

(SEQ ID NO:98) (SEQ ID NO: 103)

Fusion SEQ ID NO : 87-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 92-SEQ ID NO:97

102E9

(SEQ ID NO:99) (SEQ ID NO: 104)

Fusion SEQ ID NO : 88-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 93-SEQ ID NO:97

104C12

(SEQ ID NO: 100) (SEQ ID NO: 105)

Fusion SEQ ID NO : 89-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 94-SEQ ID NO:97

1 14D1 1

(SEQ ID NO: 101 ) (SEQ ID NO: 106)

Fusion SEQ ID NO : 90-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 95-SEQ ID NO:97

104E10

(SEQ ID NO: 102) (SEQ ID NO: 107) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps humanisés

Fusion SEQID NO : 184-SEQID NO:97

122A2H5

(SEQID NO:197)

Fusion SEQID NO : 185-SEQID NO:97

122A2H9

Fusion SEQID NO : 181-SEQID NO:96 (SEQID NO:198)

(SEQID NO:194) Fusion SEQID NO : 186-SEQID NO:97

122A2H13

(SEQID NO:199)

Fusion SEQID NO : 187-SEQID NO:97

122A2H17

(SEQID NO:200)

Fusion SEQID NO : 184-SEQID NO:97

122A2H6

(SEQID NO:197)

Fusion SEQID NO : 185-SEQID NO:97

122A2H10

Fusion SEQID NO : 182-SEQID NO:96 (SEQID NO:198)

(SEQID NO:195) Fusion SEQID NO : 186-SEQID NO:97

122A2H1

(SEQID NO:199)

Fusion SEQID NO : 187-SEQID NO:97

122A2H18

(SEQID NO:200)

Fusion SEQID NO : 184-SEQID NO:97

122A2H7

(SEQID NO:197)

Fusion SEQID NO : 185-SEQID NO:97

122A2H11

Fusion SEQID NO : 183-SEQID NO:96 (SEQID NO:198)

(SEQID NO:196) Fusion SEQID NO : 186-SEQID NO:97

122A2H15

(SEQID NO:199)

Fusion SEQID NO : 187-SEQID NO:97

122A2H19

(SEQID NO:200)

Fusion SEQID NO : 191 -SEQID NO:97

102E9H5

(SEQID NO:204)

Fusion SEQID NO : 188-SEQID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 192-SEQ ID NO:97

102E9H9

(SEQID NO:201) (SEQID NO:205)

Fusion SEQ ID NO : 193-SEQ ID NO:97

102E9H13

(SEQID NO:206) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps humanisés

Fusion SEQ ID NO : 191 -SEQ ID NO:97

102E9H6

(SEQ ID NO:204)

Fusion SEQ ID NO : 189-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 192-SEQ ID NO:97

102E9H10

(SEQ ID NO:202) (SEQ ID NO:205)

Fusion SEQ ID NO : 193-SEQ ID NO:97

102E9H1

(SEQ ID NO:206)

Fusion SEQ ID NO : 191 -SEQ ID NO:97

102E9H7

(SEQ ID NO:204)

Fusion SEQ ID NO : 190-SEQ ID NO:96 Fusion SEQ ID NO : 192-SEQ ID NO:97

102E9H11

(SEQ ID NO:203) (SEQ ID NO:205)

Fusion SEQ ID NO : 193-SEQ ID NO:97

102E9H15

(SEQ ID NO:206)

Tableau 16. Séquences nucléotidiques préférées des chaînes lourdes et lég anticorps selon l'invention.

Un acide nucléique codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère de l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention comprend avantageusement une séquence nucléique codant pour le peptide signal hétérologue MB7 (MRWSWIFLLLLSITSANA, SEQ ID NO :65), et notamment la séquence nucléique SEQ ID NO : 108 ( ATG AG GTG GTCCTG G ATCTTCCTG CTG CTG CTG AG C ATC ACC AG CG CCAACG CC ) . En effet, ce peptide a été montré comme permettant d'améliorer l'expression et la sécrétion de protéines recombinantes dans des lignées cellulaires eucaryotes supérieures (voir WO2011 /114063).

Ainsi, un acide nucléique codant pour la chaîne lourde des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention comprend avantageusement (ou est essentiellement constitué de, ou est constitué de) une séquence nucléique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 109 à 113 (anticorps chimériques), SEQ ID NO :207 à 209 (anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2) et SEQ ID NO :214 à 216 (anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9), constituées de la fusion de 5' en 3' entre la séquence nucléique codant pour le peptide signal MB7 (SEQ ID NO : 108) et une des séquences nucléiques codant pour la région VH des anticorps selon l'invention (SEQ ID NO : 86 à 90 pour les anticorps chimériques, SEQ I D NO : 181 à 183 pour les anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2, et SEQ ID NO : 188 à 190 pour les anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9). De plus ou de manière alternative, un acide nucléique codant pour la chaîne légère des anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention comprend avantageusement (ou est essentiellement constitué de, ou est constitué de) une séquence nucléique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 114 à 118, (anticorps chimériques), SEQ ID NO :210 à 213 (anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2) et SEQ ID NO :217 à 219 (anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9), constituées de la fusion de 5' en 3' entre la séquence nucléique codant pour le peptide signal MB7 (SEQ ID NO : 108) et une des séquences d'acides aminés de la région VL des anticorps selon l'invention (SEQ ID NO : 91 à 95 pour les anticorps chimériques, SEQ ID NO : 184 à 187 pour les anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2, et SEQ ID NO : 191 à 193 pour les anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9).

En ajoutant les régions constantes de chaîne lourde et de chaîne légère préférées, on obtient des séquences d'acides aminés complètes préférées des anticorps selon l'invention, tel que décrit dans le Tableau 17 ci-dessous.

Ainsi, un acide nucléique codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère d'un anticorps chimérique ou humanisé, d'un fragment fonctionnel ou d'un dérivé de celui-ci selon l'invention comprend avantageusement au moins une des séquences décrites dans le Tableau 17 ci-dessous (ou est essentiellement constitué, ou est constitué de telles séquences).

Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : 91 -

122A2 86-SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:119) (SEQ ID NO:124)

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : 92-

102E9 87-SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:120) (SEQ ID NO:125)

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : 93-

104C12 88-SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:121 ) (SEQ ID NO:126)

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : 94-

114D11 89-SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:122) (SEQ ID NO:127) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : 95-

104E10 90-SEQID NO:96 SEQID NO:97

(SEQID NO:123) (SEQID NO:128)

Anticorps humanisés

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H5 184-SEQID NO:97

(SEQID NO:210)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H9 185-SEQID NO:97

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

(SEQID NO:211)

181 -SEQID NO:96

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : (SEQID NO:207)

122A2H13 186-SEQID NO:97

(SEQID NO:212)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H17 187-SEQID NO:97

(SEQID NO:213)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H6 184-SEQID NO:97

(SEQID NO:210)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H10 185-SEQID NO:97

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

(SEQID NO:211)

182-SEQID NO:96

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : (SEQID NO:208)

122A2H1 186-SEQID NO:97

(SEQID NO:212)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H18 187-SEQID NO:97

(SEQID NO:213) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps humanisés

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H7 184-SEQID NO:97

(SEQID NO:210)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H11 185-SEQID NO:97

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

(SEQID NO:211)

183-SEQID NO:96

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : (SEQID NO:209)

122A2H15 186-SEQID NO:97

(SEQID NO:212)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

122A2H19 187-SEQID NO:97

(SEQID NO:213)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

102E9H5 191 -SEQID NO:97

(SEQID NO:217)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

102E9H9 188-SEQID NO:96 192-SEQID NO:97

(SEQID NO:214) (SEQID NO:218)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

102E9H13 193-SEQID NO:97

(SEQID NO:219)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

102E9H6 191 -SEQID NO:97

(SEQID NO:217)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO : Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

102E9H10 189-SEQID NO:96 192-SEQID NO:97

(SEQID NO:215) (SEQID NO:218)

Fusion SEQID NO :108-SEQID NO :

102E9H14 193-SEQID NO:97

(SEQID NO:219) Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère

Anticorps chimériques

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO :

102E9H7 191 -SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:217)

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO : Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO :

102E9H11 190-SEQ ID NO:96 192-SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:216) (SEQ ID NO:218)

Fusion SEQ ID NO :108-SEQ ID NO :

102E9H15 193-SEQ ID NO:97

(SEQ ID NO:219)

Tableau 17. Séquences nucléiques codant pour les chaînes lourdes et lég anticorps selon l'invention, avec le peptide signal MB7.

La présente invention concerne également un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention. Un tel vecteur comprend les éléments nécessaires à l'expression de ladite séquence nucléique, et notamment un promoteur, un codon d'initiation de la transcription, des séquences de terminaison, et des séquences de régulation de la transcription appropriées. Ces éléments varient en fonction de l'hôte servant pour l'expression et sont choisis aisément par l'homme du métier au vu de ses connaissances générales. En particulier, pour un vecteur destiné à une expression dans des cellules eucaryotes, le vecteur comprend avantageusement une « séquence de Kozak », c'est-à- dire une séquence conservée que l'on trouve sur les ARN messagers eucaryotes au niveau du site de démarrage de la traduction, autour du codon de démarrage AUG (généralement GCCGCC(A/G)CCATGG, le codon d'initiation de la traduction étant souligné). Le vecteur peut notamment être plasmidique ou viral. Il est utilisé pour cloner ou exprimer les acides nucléiques selon l'invention.

Des exemples de vecteurs préférés susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention incluent :

• Un vecteur tel que décrit dans WO2013/061010 (particulièrement préféré), comprenant au moins une unité de transcription comprenant les éléments régulateurs suivants : l'enhancer du virus hCMVie ledit enhancer ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 220, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 220 et possédant essentiellement des propriétés d'activation de la transcription, et la région promotrice de la cycline dépendante des kinases 9 (CDK9), ladite région promotrice ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 221 , ou un acide nucléotidique présentant au moins 70% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 221 et possédant essentiellement une activité promotrice.

Avantageusement, l'unité de transcription comprise dans le vecteur comprend en outre au moins un des deux éléments additionnels suivants :

o une région 5' non traduite (5' UTR) située en aval de la région promotrice, en particulier choisie parmi :

^■ région R du Long Terminal Repeat (LTR) du virus HTLV-1 ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 222, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence

SEQ ID NO : 222,

^■ région 5' UTR du gène NF-κΒ Repressing Factor (NRF) ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 223, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 223,

^■ région 5' UTR du gène eukaryotic Initiation Factor 4GI (elF4GI) ayant la séquence nucléotidique SEQ IDNO : 224, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 224,

les susdits acides nucléotidiques possédant au moins 70%> d'identité de séquence avec les susdites séquences SEQ ID NO: 222, 223, 224 ayant essentiellement des propriétés de stabilisation des ARNm et de facilitateur de la traduction,

o un intron situé en aval de la région promotrice et en amont du site d'initiation de la traduction, en particulier choisi parmi :

^■ intron du gène Elongation Factor la (EFla) ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 225, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 225,

■ intron murin ROSA ayant la séquence nucléotidique SEQ IDNO : 226, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 226,

^■ intron 5'LTR du virus HTLV-1 ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 227, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 227, ^■ intron pcinéo ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 228, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 228,

^■ intron du gène ubiquitine ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 229, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 229,

^■ intron humain ROSA ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO :

230, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 230.

Avantageusement, l'unité de transcription comprise dans le vecteur comprend l'enhancer du virus hCMVie, la région promotrice de CDK9, la région 5 ' UTR du gène elF4GI et l'intron du gène EFla, et possède la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 231 (vecteur « HKgenEFss »).

Un vecteur tel que décrit dans WO2013/117871 , comprenant au moins une unité de transcription comprenant les éléments régulateurs suivants :

o l'enhancer du virus hCMVie, ledit enhancer ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 232, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 232 et possédant essentiellement des propriétés d'activation de la transcription, o la région promotrice de la β-actine, ladite région promotrice ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 233, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 233 et possédant essentiellement une activité promotrice, et

o un acide nucléotidique situé en aval de ladite région promotrice et en amont du site d'initiation de la traduction, ledit acide nucléotidique comprenant au moins l'une des régions 5' non traduite (5' UTR) choisies parmi les suivantes :

^■ la région régulatrice R du 5' Long Terminal Repeat (LTR) du virus HTLV-1 ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 234, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70%> d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 234,

^■ la région 5' UTR du gène NF-κΒ Repressing Factor (NRF) ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 235, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70%> d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 235, ^■ la région 5' UTR du gène eukaryotic Initiation Factor 4GI (elF4GI) ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 236, ou un acide nucléotidique présentant au moins 70%> d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 236,

les susdits acides nucléotidiques ayant au moins 70%> d'identité de séquence avec l'une des séquences représentées par SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 235 ou SEQ ID NO : 236 ayant essentiellement des propriétés de stabilisation des ARNm et de facilitateur de la traduction.

L'unité de transcription comprise dans le vecteur peut comprendre en outre un intron, en particulier choisi parmi les suivants :

o intron du gène Elongation Factor la (EFla) ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 237, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 237 , o intron murin ROSA ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO :

238, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 238,

o intron humain ROSA ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO :

239, ou un acide nucléotidique ayant au moins 70%> d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 239,

ledit intron étant situé :

(i) en aval de la région 5' UTR et en amont du site d'initiation de la traduction, ou

(ii) en aval du promoteur et en amont de la région 5 'UTR, ou

(iii) après le site d'initiation de la traduction et à l'intérieure d'une séquence codante, ou

(iv) entre le codon stop de la séquence codante et le signal de polyadénylation.

Avantageusement, l'unité de transcription comprise dans le vecteur comprend l'enhancer du virus hCMVie, la région promotrice de la β-actine, la région 5 'UTR du virus HTLV-1 (Ul) et la région 5' UTR du gène elF4GI (U3), et possède la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 240.

La présente invention concerne également une cellule hôte, un animal non-humain transgénique ou une plante transgénique comprenant au moins un acide nucléique selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. La cellule hôte peut être d'origine procaryote ou eucaryote, et peut notamment être choisie parmi les cellules bactériennes, les cellules d'insecte, de plantes, de levure ou de mammifères. L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut alors être produit en cultivant la cellule hôte dans des conditions appropriées. Une cellule hôte selon l'invention peut notamment être obtenue par transformation d'une lignée cellulaire par le(s) vecteur(s) d'expression des chaînes lourde et légère d'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention, et séparation des différents clones cellulaires obtenus. La lignée cellulaire transformée est de préférence d'origine eucaryote, et peut notamment être choisie parmi les cellules d'insecte, de plantes, de levure ou de mammifères. Des lignées cellulaires appropriées pour la production d'anticorps incluent notamment les lignées choisies parmi : SP2/0 ; YB2/0 ; IR983F ; le myélome humain Namalwa ; PERC6 ; les lignées CHO, notamment CHO-K-1 , CHO-Lec10, CHO-Led , CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, CHO-DP12, CHO DUKX-B11 , CHO DG-44, ou lignée CHO délétée pour les deux allèles codant pour le gène FUT8 et/ou le gène GMD ; Wil-2; Jurkat; Vero; Molt -4; COS-7; 293-HEK; BHK; K6H6; NSO; SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, lignée de cellule de canard embryonnaire EB66® (Valneva) ; les lignées d'hépatome de rat H4-II-E (DSM ACC3129), et H4-ll-Es (DSM ACC3130) (voir WO2012/041768), NM-H9D8 (DSM ACC2806), NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807), et NM H9D8- E6Q12 (DSM ACC 2856) (voir WO2008/028686).

Un animal non-humain transgénique selon l'invention peut être obtenu par injection directe du ou des gène(s) d'intérêt (ici, les gènes réarrangés codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps) dans un œuf fertilisé (Gordon et al-1980). Un animal non-humain transgénique peut également être obtenu par introduction du ou des gène(s) d'intérêt (ici, les gènes réarrangés codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps) dans une cellule souche embryonnaire et préparation de l'animal par une méthode d'agrégation de chimère ou une méthode d'injection de chimère (voir Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). Un animal non-humain transgénique peut également être obtenu par une technique de clonage dans laquelle un noyau, dans lequel le ou les gène(s) d'intérêt (ici, les gènes réarrangés codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps) a été introduit, est transplanté dans un œuf énucléé (Ryan et al-1997; Cibelli et al-1998, WO00/26357). Un animal non humain transgénique produisant un anticorps d'intérêt peut être préparé par les méthodes ci-dessus. L'anticorps peut alors être accumulé dans l'animal transgénique et récolté, notamment à partir du lait ou des œufs de l'animal. Pour la production d'anticorps dans le lait d'animaux non humains transgéniques, des procédés de préparation sont notamment décrits dans WO90/04036, WO95/17085, WO01 /26455, WO2004/050847, WO2005/033281 , WO2007/048077. Des procédés de purification de protéines d'intérêt à partir du lait sont également connus (voir WO01 /26455, WO2007/106078). The animaux non humains transgéniques d'intérêt incluent notamment la souris, le lapin, le rat, la chèvre, les bovins (notamment la vache), et les volailles (notamment le poulet).

Une plante transgénique selon l'invention peut être choisie parmi toute plante permettant la production d'anticorps. De nombreux anticorps ont déjà été produits dans des plantes transgéniques et les technologies nécessaires à l'obtention d'une plante transgénique exprimant un anticorps d'intérêt et à la récupération de l'anticorps sont bien connues de l'homme du métier (voir Stoger et al-2002, Fisher et al-2003, Ma et al-2003, Schillberg et al-2005). Il est également possible d'influencer la glycosylation obtenue dans les plantes pour obtenir une glycosylation proche de celle des anticorps humains naturels (sans xylose), mais avec en outre une faible fucosylation, par exemple à l'aide de petits ARNs interférents (Forthal et al-2010).

Utilisations thérapeutiques des anticorps

La présente invention concerne également un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament.

Dans un premier mode de réalisation, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des tumeurs hématopoïétiques exprimant l'antigène CD303. Il s'agit notamment des néoplasmes de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques (BPDCN), de phénotype CD4+, CD11 c-, Lin-, CD303+, CD304+, CD56+.

Dans un deuxième mode de réalisation, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des maladies inflammatoires, notamment des maladies autoimmunes. L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des maladies impliquant les pDC, et plus particulièrement des maladies impliquant une sécrétion d'IFN-α par les pDC. En particulier, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des maladies suivantes, pour lesquelles un rôle des pDC a été établi (voir Wollenberg et al- 2002 et Cao-2014) : la dermatite atopique, la dermatite de contact, le psoriasis, le lupus érythémateux disséminé, la dermatomyosite, le syndrome de Sjôgren, le diabète de type 1 b, la thrombocytopénie (ou thrombopénie) autoimmune (notamment le purpura thrombopénique idiopathique ou PTI), la sclérodermie systémique (encore appelée sclérodermie systémique progressive ou sclérose systémique), la polyarthrite rhumatoïde.

La présente invention concerne également :

• l'utilisation d 'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des tumeurs hématopoïétiques exprimant l'antigène CD303, et notamment des néoplasmes de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques (BPDCN), de phénotype CD4+, CD1 1 c-, Lin-, CD303+, CD304+, CD56+.

• l'utilisation d 'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies inflammatoires, notamment des maladies autoimmunes, et en particulier des maladies mentionnées ci-dessus.

La présente invention concerne également :

· l'utilisation d 'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention dans le traitement ou la prévention des tumeurs hématopoïétiques exprimant l'antigène CD303, et notamment des néoplasmes de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques (BPDCN), de phénotype CD4+, CD1 1 c-, Lin-, CD303+, CD304+, CD56+.

· l'utilisation d 'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention dans le traitement ou la prévention des maladies inflammatoires, notamment des maladies autoimmunes, et en particulier des maladies mentionnées ci-dessus. La présente invention concerne également :

• une méthode de traitement ou de prévention chez un patient d 'une tumeur hématopoïétique exprimant l'antigène CD303, et notamment d 'un néoplasme de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques (BPDCN), de phénotype CD4+, CD1 1 c-, Lin-, CD303+, CD304+, CD56+, comprenant l'administration audit patient d 'une quantité efficace d 'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention.

• une méthode de traitement ou de prévention chez un patient d 'une maladie inflammatoire, notamment d'une maladie autoimmune, et en particulier d 'une des maladies mentionnées ci-dessus, comprenant l'administration audit patient d 'une quantité efficace d 'un anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui- ci selon l'invention. Par « traitement », on entend une amélioration constatée au niveau clinique ou biochimique de la pathologie du patient.

Par « prévention », on entend le fait d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité des manifestations cliniques ou biochimiques associées à la maladie.

L'homme du métier sait, sur la base de ses connaissances générales, déterminer quelles sont les manifestations cliniques ou biochimiques associées à une maladie donnée et qui sont susceptibles d'être améliorées (traitement) ou bien empêchées, retardées ou diminuées en intensité (prévention). Dans le cadre des tumeurs hématopoïétiques exprimant l'antigène CD303, et notamment des néoplasmes de cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques (BPDCN), un paramètre biologique d'intérêt peut être le nombre de blastes. Dans le cadre des maladies inflammatoires, un paramètre biologique d'intérêt peut être le nombre de pDC ou la quantité présente localement ou de façon systémique de molécules contribuant à l'inflammation (cytokines inflammatoires et notamment l'INFa).

Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention.

EXEMPLES Exemple 1 : Obtention et structure de 5 anticorps chimériques et d'un anticorps humanisé de l'art antérieur

5 anticorps monoclonaux chimériques, avec des régions variables murines et des régions constantes humaines de type lgG1 ont été générés et leurs structures caractérisées. De plus, l'anticorps humanisé BIIB059, dont les séquences sont décrites dans la demande WO201 /09339, a été reproduit pour comparaison avec les anticorps chimériques selon l'invention.

Matériels et méthodes

Séquençage des chaînes lourdes et légères à partir d'hvbridomes murins

Les ARN totaux de chaque hybridome ont été extraits à l'aide du kit Macherey nagel ; Nucleospin RNAII (purification sur colonne).

Les ARNm ont été convertis en ADNc et les chaînes lourdes et légères de l'anticorps ont été amplifiées à l'aide du kit Generacer (invitrogen) et clonées dans un vecteur M13. Des bactéries ont ensuite été transformées par le vecteur M13 et des clones positifs pour les séquences M13 ont été séquencés.

Détermination des segments VH, DH, JH des chaines lourdes et des segments VL et JL des chaines légères La partie variable, les segments V et J utilisés par les chaines lourdes et légères et les séquences des CDR des chaines lourdes et légères ont été déterminés en utilisant l'outil Domaine Gapalign d'IMGT (voir Ehrenmann et al-2010 et Ehrenmann et al-201 1 ) disponible à l'adresse suivante : http: //www.imgt.org/3Dstructure- DB/cgi/DomainGapAlign.cgi. Construction de vecteurs d'expression pour les anticorps chimériques

Les séquences des régions variables VH et VL des 5 anticorps murins ont été optimisées pour un usage préférentiel des codons de l'espèce Rattus norvegicus. Une séquence codant pour le peptide signal hétérologue MB7 a en outre été introduite en 5' de la séquence codant pour la région variable VH ou VL de chaque anticorps.

Les séquences des parties constantes humaines ont été extraites du vecteur CHK622-21 d'expression d'un anticorps humain anti-Rhésus D (T125) par digestion Apal/Ascl pour la chaîne H (lgG1 m1 .17) et Dralll/Xbal pour la chaîne Kappa.

Enfin, les parties variable et constante d'une même chaîne ont été introduites en simultané dans le vecteur générique HKgenEFss par ligation avec la KAPA T4 ligase, générant les vecteurs HKBDCA-2-122A2, HKBDCA-2-102E9, HKBDCA-2-104C12, HKBDCA-2- 1 14D1 1 , et HKBDCA-2-104E10 (voir Figures 1A à 1 E).

Production des anticorps chimériques

Les vecteurs HKBDCA-2-122A2, HKBDCA-2-102E9, HKBDCA-2-104C12, HKBDCA-2-1 14D1 1 , et HKBDCA-2-104E10 (voir Figures 1A à 1 E) ont été transfectés dans des cellules de la lignée YB2/0, et un clone producteur de chaque anticorps a été sélectionné pour la production des anticorps chimériques.

Production d'un anticorps correspondant à l'anticorps BIIB059 décrit dans

WO2014/09339

Sur la base des séquences décrites dans cette demande de brevet, les séquences de la chaîne lourde (H) et de la chaîne légère (K) ont été synthétisées en ajoutant une séquence de Kozak et des sites de restrictions de part et d'autre des deux séquences H et K, pour permettre un clonage par digestion/ligation.

Le vecteur d'expression utilisé, pour produire l'anticorps humanisé BIIB059, est un vecteur bicistronique, HKgenEFss, de 10835 pb, qui permet de produire l'anticorps de façon optimale dans la lignée CHO (Figure 1 F). Le clonage des chaînes lourdes et légères est effectué en 2 étapes séquentielles. La première étape consiste à insérer par digestion/ligation la chaîne H entre les sites de clonage Nhel/Ascl pour aboutir à un vecteur intermédiaire ne contenant que cette chaîne. Au cours de la seconde étape, la chaîne K est insérée, par la même technique, entre les sites de clonage Spel/Xbal. L'enzyme de ligation est la KAPA T4 DNA Ligase (Kapa Biosystems). Cependant, une étape de déphosphorylation avant l'insertion de la chaîne K est nécessaire pour éviter que le plasmide linéarisé ne se referme sur lui-même, dû aux sites de restrictions Spel/Xbal qui génèrent des extrémités franches.

La production de l'anticorps humanisé BIIB059 est faite par transfection transitoire à partir de la lignée CHO, afin de respecter les conditions de la demande WO2014/09339.

Cette lignée est cultivée dans du milieu ProCH04, supplémenté de 4 mM de Glutamine.

Au sein du laboratoire, la lignée est entretenue à 2-3x10 ⁵ cellules/ml, tous les 2 jours.

Les solutions utilisées pour la transfection sont le tampon OptiPRO et l'agent de transfection Freestyle Max Reagent.

Une fois produit, l'anticorps BIIB059 a été purifié par chromatographie d'affinité.

Résultats

Les données concernant les segments VH, DH, JH des chaînes lourdes et des segments VL et JL des chaînes légères des 5 anticorps sont présentées au Tableau 2 présenté ci- dessus. On note que :

· Les 2 anticorps de la famille 1 (122A2 et 104C12) partagent l'utilisation du même segment VH (IGHV1 S137*01 ), ainsi que l'utilisation de segments VL (IGKV10- 96*01 /IGKV10-96*02) et JL (IGKJ1*01 /IGKJ1*02) de la même famille, comme illustré dans le Tableau 18 ci-dessous. Ces deux anticorps ont donc une structure proche.

· Les 3 anticorps de la famille 2 (102E9, 114D11 et 104E10) partagent l'utilisation des mêmes segments VH, JH, VL et JL, comme illustré dans le Tableau 18 ci- dessous. Ces trois anticorps ont donc une structure proche. Famille 1

Anticorps VH JH VL JL

122A2 IGHV1 S137*01 IGHJ2*02 IGKV10-96*01 IGKJ1*01

104C12 IGHV1 S137*01 IGHJ3*01 IGKV10-96*02 IGKJ1*02

Famille 2

Anticorps VH JH VL JL

102E9 IGHV9-2-1*01 IGHJ4*01 IGKV4-57*01 IGKJ1*02

1 14D1 1 IGHV9-2-1*01 IGHJ4*01 IGKV4-57*01 IGKJ1*02

104E10 IGHV9-2-1*01 IGHJ4*01 IGKV4-57*01 IGKJ1*02

Tableau 18. Segments VH, JH, VL et JL utilisés par les différents anticorps. Les segments identiques au sein d'une même famille sont en gras.

Par ailleurs, les données concernant les séquences d'acides aminés des CDRs et des régions variables des 5 anticorps sont présentées au Tableau 3 présenté ci-dessus. On note que :

• Les 2 anticorps de la famille 1 (122A2 et 104C12) possèdent les mêmes séquences de CDR1 -H et de CDR2-L, et ont par ailleurs des séquences de CDR2-H, CDR1 -L et CDR3-L extrêmement proches (1 seul ou 2 acides aminés de différence). Même les séquences de CDR3-H présentent une forte homologie (5/1 1 acides aminés communs), comme illustré dans le Tableau 19 ci-dessous. Cela confirme que ces deux anticorps ont une structure très proche.

• Les 3 anticorps de la famille 2 (102E9, 1 14D1 1 et 104E10) possèdent les mêmes séquences de CDR2-L, et ont par ailleurs des séquences de CDR1 -H, CDR2-H, CDR1 -L et CDR3-L extrêmement proches (1 seul acide aminé de différence). Même les séquences de CDR3-H présentent une forte homologie (12/14 acides aminés communs), comme illustré dans le Tableau 19 ci-dessous. Cela confirme que ces trois anticorps ont une structure vraiment très proche.

Famille 1

Anticorps CDR1 -H CDR2-H CDR3-H CDR1 -L CDR2-L CDR3-L

122A2 GYTFTDYS ISTYYGDS ARNGNFYVMDY QDISNY YTS QQGNTLPWT

104C12 GYTFTDYS ISPYYGDT ARNDDYYRFAY QDINNY YTS QQGKTLPWT Famille 2

Anticorps CDR1 -H CDR2-H CDR3-H CDR1 -L CDR2-L CDR3-L

102E9 GYTFTDYS INTETGEP TRNGYYVGYYAMDY SSVIY STS QQRRSYPFT

114D11 GYTFTDSS INTETGGP ARNGYYVGYYALDY SSVFY STS QQRRSYPYT

104E10 GYTFTDYS INTETGEP ARNGYYVGYYAMDY SSVIY STS QQRRSYPYT

Tableau 19. Homologie de séquence entre les CDRs des anticorps d'une même famille.

Les acides aminés identiques au sein d'une même famille sont en gras. Les données concernant les séquences d'acides aminés des régions constantes des 5 anticorps sont présentées au Tableau 9 présenté ci-dessus.

De plus, les séquences d'acides nucléiques des régions variables VH et VL et des régions constantes de chaque anticorps sont présentées aux Tableaux 12 et 15 présentés ci- dessus.

Enfin, les cartes des vecteurs d'expression des 5 anticorps sont présentées sur les Figures 1A à 1 E.

Conclusions

5 anticorps monoclonaux chimériques, avec des régions variables murines et des régions constantes humaines de type lgG1 , et dirigés contre l'antigène CD303 ont été générés et leurs structures caractérisées. Il s'avère que deux anticorps (122A2 et 104C12) ont des structures proches et forment une sous-famille d'anticorps (famille 1 ), et que les trois autres anticorps (102E9, 114D11 et 104E10) sont également très proches sur le plan structural et forment une autre sous-famille d'anticorps (famille 2).

Un anticorps humanisé ayant les séquences de l'anticorps BIIB059 décrit dans la demande WO2014/09339 a également été produit dans la lignée CHO (comme dans la demande WO2014/09339).

Ces anticorps ont ensuite été caractérisés au niveau de leurs propriétés biologiques (voir Exemple 2).

Exemple 2 : Propriétés biologiques des 5 anticorps chimériques et d'un anticorps correspondant à l'anticorps BIIB059 décrit dans la demande WO2014/09339

Les 5 anticorps monoclonaux chimériques, avec des régions variables murines et des régions constantes humaines de type lgG1 , et dirigés contre l'antigène CD303 générés à l'Exemple 1 ont été testés pour différentes propriétés biologiques. Dans certains cas, ces propriétés ont été comparées à celles d'un anticorps correspondant à l'anticorps BIIB059 décrit dans la demande WO201 /09339 (mêmes séquences et même lignée de production).

Matériels et méthodes Anticorps testés

Les anticorps testés sont ceux préparés tel que décrit à l'Exemple 1. Liaison à l'antigène

Liaison aux cellules CD303+ (Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303, CAL- 1, et CAL- 1 surexprimant CD303)

Différents types de cellules exprimant CD303 à différentes densités antigéniques ont été utilisés :

1. des cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303, qui expriment environ 25000-35000 molécules CD303/cellule ;

2. des cellules CAL-1 , telles que décrites dans Maeda T et al., Int J Hematol. 2005 Feb ; 81 (2) : 148-54), qui expriment environ 3000-6000 molécules CD303/cellule ;

3. des cellules CAL-1 transfectées par un vecteur d'expression de CD303, sélectionnées pour leur forte expression de CD303, environ 40000-50000 molécules CD303/cellule.

Les cellules exprimant CD303 et les anticorps sont préparés dans du diluant (PBS + 1% SVF).

1 x 10 ⁵ cellules sont incubées à 4°C pendant 30 minutes avec 100 μί d'anticorps (anti- CD303 ou contrôle négatif) à différentes concentrations (0-40 μg/mL, concentration finale).

Après lavage avec le diluant, les anticorps sont visualisés par ajout d'un fragment F(ab') ₂ d'IgG de chèvre anti-souris couplé à la phycoérythrine (PE) (100 μί à une dilution de 1 :100 dans le diluant) pendant 45 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées et analysées par cytométrie en flux (FC500, Beckman Coulter).

Liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a)

Les cellules NK ont été isolées des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), puis incubées avec des concentrations variables des anticorps testés (0 à 100 μg/ml) simultanément incubées avec l'anticorps murin couplé à la phycoérythrine (3G8- PE, Beckman Coulter) à Ι ΟμΙ/test. Après lavage, la fixation de 3G8-PE au CD16 exprimé par les cellules NK a été évaluée par cytométrie de flux. Les valeurs de fluorescence moyenne (MFI) sont exprimées en pourcentage, 100 % étant la valeur obtenue avec l'anticorps 3G8-PE seul, et 0% la valeur obtenue en l'absence de 3G8-PE.

Les valeurs IC50 (concentration d'anticorps anti-CD303 requise pour induire une inhibition de fixation de 3G8 de 50%) sont calculées à l'aide du logiciel PRISM.

ADCC

Des cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303 (35000 cellules/puits) sont incubées dans une plaque 96 puits à fond plat avec des cellules NK et des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD303 pendant 4 heures à 37° C. Après incubation, le surnageant est collecté. La lyse des cellules cibles induite par les anticorps anti-CD303 est mesurée de façon chromogénique en quantifiant l'enzyme intracellulaires lactate déshydrogénase (LDH) relarguée dans le surnageant par les cellules cibles lysées (Roche Diagnostics - Cytotoxicity Détection Kit LDH).

Le pourcentage de lyse est calculé selon la formule suivante :

% lyse = [(ER - SR) / (100 - SR)] - [(NC - SR) / (100 - SR)] Où ER et SR représentent respectivement les relargages expérimental (ER) et spontané (SR) de LDH, et NC représente la cytotoxicité naturelle des cellules NK.

Les résultats (% lyse) sont exprimés en fonction du facteur de dilution de l'anticorps. Pour chaque anticorps, la valeur d'« activité 50% » correspond au facteur de dilution de l'anticorps nécessaire pour induire 50% de la valeur plateau obtenue pour cet anticorps. Cette valeur a été calculée avec le logiciel PRISM.

Inhibition de la sécrétion d'IFN-a Préparation des cellules

Des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir du sang périphérique de donneurs sains par gradient de densité sur ficoll. Les pDC sont purifiées par déplétion négative (Miltenyi Biotec - Plasmacytoid Dendritic Cell isolation kit, human). Les cellules sont comptées et resuspendues à 2 x 10 ⁵ cellules/ml dans un diluant (RPMI 1640 + 10% sérum de veau fœtal(SVF)).

Sécrétion d'IFN-a par les pDC purifiées

205 μί/ρυι ^' ΐ de cette suspension sont ensuite transférés dans une plaque de culture 24 puits à fond plat. 50 μΙ_ de CPG ODN à 10 μΜ, 50 μΙ_ d'IL-3 à 100 ng/mL, 50 μί d'anticorps à 100 μg/mL et 100 il de diluant sont ajoutés. La plaque est ensuite incubée sur la nuit à 37° C, 7% C0 ₂ .

Dosage du taux d'IFN-a

Les surnageants de culture de chaque puit sont collectés et dosés par cytométrie en flux en utilisant le kit Human IFN-α Flowcytomix (Bender Medsystems BMS216FF + Basic kit BMS8420FF).

Le pourcentage d'inhibition de chaque échantillon est évalué par rapport au contrôle négatif (pDC CPG-activées sans anticorps monoclonal anti-CD303).

Les échantillons conduisant à moins de 20% d'inhibition sont considérés non-inhibiteurs, ceux conduisant à une inhibition entre 20 et 75% sont considérés faiblement inhibiteurs, ceux conduisant à une inhibition supérieure à 75% sont considérés fortement inhibiteurs.

Inhibition de la sécrétion de TNF-a

Préparation des cellules

Des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir du sang périphérique de donneurs sains par gradient de densité sur ficoll. Les pDC sont purifiées par déplétion négative (Miltenyi Biotec - Plasmacytoid Dendritic Cell isolation kit, human). Les cellules sont comptées et resuspendues à 2 x 10 ⁵ cellules/ml dans un diluant (RPMI 1640 + 10% sérum de veau fœtal(SVF)).

Sécrétion de TNF-a par les pDC purifiées

205 μί/ρυι ^' ΐ de cette suspension sont ensuite transférés dans une plaque de culture 24 puits à fond plat.

50 μί de CPG ODN à 10 μΜ, 50 μί d'IL-3 à 100 ng/mL, 50 μί d'anticorps à 100 μg/mL et 100 il de diluant sont ajoutés. La plaque est ensuite incubée sur la nuit à 37° C, 7% C0 ₂ .

Dosage du taux du TNF-a

Les surnageants de culture de chaque puit sont collectés et dosés par cytométrie en flux en utilisant le kit Human IFN-α Flowcytomix (Bender Medsystems BMS216FF + Basic kit BMS8420FF).

Le pourcentage d'inhibition de chaque échantillon est évalué par rapport au contrôle négatif (pDC CPG-activées sans anticorps monoclonal anti-CD303).

Les échantillons conduisant à moins de 20% d'inhibition sont considérés non-inhibiteurs, ceux conduisant à une inhibition entre 20 et 75% sont considérés faiblement inhibiteurs, ceux conduisant à une inhibition supérieure à 75% sont considérés fortement inhibiteurs. Mesure de l'activité complément (CDC)

Des cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303 sont incubées avec des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD303 (0 to 5000 ng/ml) et en présence de sérum de jeunes lapins comme source de (dilution au 1 /10).

Après 2h d'incubation à 37°C, la quantité d'enzyme intracellulaires lactate déshydrogénase (LDH) relarguée dans le surnageant par les cellules cibles lysées est mesurée avec le kit « Cytotoxicity Détection LDH » (Roche Diagnostics réf 11644793001 ).

Résultats Liaison à l'antigène

Liaison aux cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303

Les résultats des tests de liaison des anticorps selon l'invention à leur antigène CD303 sur les cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303 sont présentés à la Figure 2A et dans le Tableau 20 ci-dessous.

Tableau 20. Liaison des anticorps selon l'invention à leur antigène CD303 sur les cellules Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303. Bmax : Liaison maximale exprimée en intensité moyenne de fluorescence (MFI). EC50 ( g/mL) : concentration d'anticorps en μg/mL permettant d'obtenir 50% de la liaison maximale obtenue pour cet anticorps. Ces résultats de Kd relatifs et les valeurs de Bmax calculés après modélisation de la courbe dose réponse, permettent de classer les anticorps en 2 groupes :Un premier groupe qui contient les anticorps 104C12 (Bmax : MFI= 27.7; Kd=0.17 μg/ml) and 122A2 (Bmax : MFI= 26.2 Kd=0.13 μg/ml) qui sont comparables et présentent une meilleure affinité relative que les anticorps du deuxième groupe : 114D11 (Bmax : MFI= 24.7; Kd=3.9 Mg/ml), 104E10 (Bmax : MFI= 23.7; Kd= 6 Mg/ml) et 102E9 (Bmax : MFI= 24.9; Kd=3.8 Mg/ml).

Ces résultats montrent que l'ensemble des anticorps chimériques générés lient efficacement l'antigène CD303 exprimé à la surface des cellules Jurkat, pour lequel ils sont spécifiques. Liaison aux cellules CAL- 1

Les résultats des tests de liaison des anticorps chimériques selon l'invention à leur antigène CD303 sur les cellules CAL-1 sont présentés à la Figure 2B et dans le Tableau 21 ci-dessous.

Tableau 21. Liaison des anticorps chimériques selon l'invention à leur antigène CD303 sur les cellules CAL-1 . Bmax : Liaison maximale exprimée en intensité moyenne de fluorescence (MFI). EC50 (Mg/mL) : concentration d'anticorps en μg/mL permettant d'obtenir 50% de la liaison maximale obtenue pour cet anticorps. Ces résultats de Kd relatifs et les valeurs de Bmax calculés après modélisation de la courbe dose réponse, permettent de classer les anticorps en 2 groupes : Un premier groupe qui contient les anticorps 104C12 (Bmax : MFI= 29.02 Kd=0.34 μg/ml) and 122A2 (Bmax : MFI= 25.2 Kd=0.20 μg/ml) qui sont comparables et présentent une meilleure affinité relative que les anticorps du deuxième groupe : 1 14D1 1 (Bmax : MFI=30.1 ; Kd=1 .7 Mg/ml), 104E10 (Bmax : MFI=29.2 ; Kd= 1 .93 Mg/ml) et 102E9 (Bmax : MFI=30.47 ; Kd=1 .81 g/ml).

Ces résultats corrèlent notamment avec les résultats de liaison aux cellules Jurkat- CD303.

Dans une autre expérience, la liaison aux cellules CAL-1 des anticorps chimériques 122A2 et 102E9 et de l'anticorps humanisé BIIB059 a été testée. Les résultats sont représentés sur la Figure 2C et dans le Tableau 22 ci-dessous.

l'anticorps humanisé BIIB059 à leur antigène CD303 sur les cellules CAL-1 . Bmax Liaison maximale exprimée en intensité moyenne de fluorescence (MFI). EC50 (Mg/mL) concentration d'anticorps en μ /mL permettant d'obtenir 50% de la liaison maximale obtenue pour cet anticorps.

Ces données montrent que les deux anticorps chimériques selon l'invention, 122A2 et 102E9 (et en particulier l'anticorps chimérique 122A2), se lient plus fortement que l'anticorps humanisé BIIB059 à l'antigène CD303 à la surface des cellules CAL-1 .

Liaison aux cellules CAL- 1 surexprimant l'antigène CD303

Les résultats des tests de liaison des anticorps chimériques 122A2 et 102E9 selon l'invention et de l'anticorps humanisé BIIB059 à leur antigène CD303 sur des cellules CAL-1 transfectées par un vecteur d'expression de CD303 et exprimant environ 40000- 50000 molécules CD303/cellule (soit environ 10 fois plus que les cellules CAL-1 sauvages) sont présentés à la Figure 2D et dans le Tableau 23 ci-dessous.

l'anticorps humanisé BIIB059 à leur antigène CD303 sur des cellules CAL-1 transfectées par un vecteur d'expression de CD303 et exprimant environ 40000-50000 molécules CD303/cellule (soir environ 10 fois plus que les cellules CAL-1 sauvages). Bmax : Liaison maximale exprimée en intensité moyenne de fluorescence (MFI). EC50 ^g/mL) : concentration d'anticorps en μg/mL permettant d'obtenir 50% de la liaison maximale obtenue pour cet anticorps.

Ces données montrent là encore que les deux anticorps chimériques selon l'invention, 122A2 et 102E9 (et en particulier l'anticorps chimérique 122A2), se lient plus fortement que l'anticorps humanisé BIIB059 à l'antigène CD303 à la surface des cellules CAL-1 transfectées par un vecteur d'expression de CD303 et exprimant environ 40000-50000 molécules CD303/cellule.

Liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a)

Les résultats des tests de liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a) des 5 anticorps chimériques selon l'invention sont présentés sur la Figure 3A, et montrent que les anticorps chimériques selon l'invention sont tous capables de lier efficacement le CD16a, avec une affinité de liaison optimisée. Ils possèdent une valeur d'IC50 inférieure à celle de l'anticorps produit dans les cellules CHO (Rituxan) dans une gamme de 18,08 à 45,02 g/ml, voire inférieure à 18 g/ml, comme illustré dans le Tableau 24 ci- dessous.

Tableau 24. Valeurs d'IC50 (concentration d'anticorps anti-CD303 requise pour induire une inhibition de fixation de 3G8 de 50%) du contrôle Rituxan et des anticorps chimériques de l'invention.

Les résultats des tests de liaison au récepteur FcyRIIIa (CD16a) des 2 anticorps chimériques selon l'invention, 122A2 et 102E9, et de l'anticorps humanisé BIIB059 sont présentés sur la Figure 3B et dans le Tableau 25 ci-dessous, et montrent que les 2 anticorps chimériques selon l'invention 122A2 et 102E9 se lient bien plus fortement au récepteur FcyRIIIa (CD16a) que les anticorps Rituxan et BIIB059.

Tableau 25. Valeurs d'IC50 (concentration d'anticorps anti-CD303 requise pour induire une inhibition de fixation de 3G8 de 50%) du contrôle Rituxan, des anticorps chimériques de l'invention 122A2 et 102E9 et de l'anticorps humanisé BIIB059.

ADCC

Les résultats des tests ADCC des 5 anticorps chimériques selon l'invention sur des cellules cibles Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303 sont présentés sur la Figure 4A et dans le Tableau 26 ci-dessous. 104C12 122A2 114D11 102E9 104E10

Emax (%

41 ,81 42,35 37,44 38,92 40,54 lyse)

EC50

0,2143 0,1592 3,612 3,424 8,280 (ng/mL)

Tableau 26. ADCC induite par les anticorps selon l'invention sur des cellules cibles Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303. Emax : lyse maximale obtenue avec cet anticorps, exprimée en pourcentage de lyse. EC50 (ng/mL) : concentration d'anticorps en ng/mL permettant d'obtenir 50% de la lyse maximale obtenue pour cet anticorps.

Ces résultats montrent que les cinq anticorps chimériques anti-CD303 induisent la lyse de la cellule Jurkat-CD303 (Emax environ 40%). Les valeurs d'EC50 pour 104C12 (EC50 : 0.21 ng/ml), 122A2 (EC50 : 0.16 ng/ml), 1 14D1 1 (EC50 : 3.6 ng/ml), 102E9 (EC50 : 3.4 ng/ml) et 104E10 (EC50 : 8.3 ng/ml) suggèrent que les anticorps ayant une forte affinité sont plus efficaces en ADCC que les anticorps de plus faible affinité.

Les résultats des tests ADCC d'un anticorps non pertinent (anticorps anti-anticorps inhibiteurs du facteur VIII, Anti Id FVIII), des 2 anticorps chimériques selon l'invention 122A2 et 102E9, et de l'anticorps humanisé BIIB059 sur des cellules cibles CAL-1 sont présentés sur la Figure 4B et dans le Tableau 27 ci-dessous.

Tableau 27. ADCC induite par les anticorps selon l'invention sur des cellules cibles Jurkat chaîne Fc Gamma-CD303. Emax : lyse maximale obtenue avec cet anticorps, exprimée en pourcentage de lyse. EC50 (ng/mL) : concentration d'anticorps en ng/mL permettant d'obtenir 50% de la lyse maximale obtenue pour cet anticorps. Nd : non détectable.

Ces résultats montrent que, contrairement à l'anticorps humanisé BIIB059, les 2 anticorps chimériques selon l'invention 122A2 et 102E9 sont capables d'induire une lyse des cellules CAL-1 exprimant très faiblement l'antigène CD303. De plus, la réponse ADCC plus forte de l'anticorps chimérique selon l'invention 122A2 par rapport à l'anticorps chimérique selon l'invention 102E9 suggère également que les anticorps ayant une forte affinité sont plus efficaces en ADCC que les anticorps de plus faible affinité.

Inhibition de la sécrétion d ' I FN-a Les résultats des tests d 'inhibition de la sécrétion d ' I FN-α par des pDC activées sont présentés sur la Figure 5.

Ces résultats montrent que les cinq anticorps chimériques anti-CD303 induisent l'inhibition de I FN-α sécrétée par les pDC activées par CpG et ceci aux deux concentrations testées (10 et 0.1 μg/ml). A la concentration de 0.1 μg/ml, les dosages d ' I FN-α montrent un avantage pour les anticorps 104C12 et 122A2 comparé aux 3 autres anticorps (1 14D1 1 , 102E9, 104E10).

Inhibition de la sécrétion de TNF-a

Les résultats des tests d 'inhibition de la sécrétion de TNF-α par des pDC activées sont présentés sur la Figure 6.

Ces résultats montrent que les cinq anticorps chimériques anti-CD303 à 10 μg/ml induisent l'inhibition du TFN-α sécrétée par les pDC activées par CpG.

Activité complément (CDC)

Les résultats des tests de CDC sont présentés sur la Figure 7, et montrent que les 5 anticorps chimériques possèdent bien une activité CDC. Exemple 3. Préparation et caractérisation d'anticorps humanisés dérivés des anticorps chimériques 122A2 et 102E9

Matériels et méthodes

Définition de séquences humanisées

Un travail d 'humanisation in silico, faisant appel à la base de données IMGT. org et à la modélisation, a été mené pour définir différentes séquences des parties variables des chaînes lourdes et légères contenant des « acides aminées humains » en lieu et place de leurs homologues murins.

Pour chaque domaine VH ou VL, le gène humain codant pour un domaine VH ou VL ayant la séquence d 'acides aminés la plus proche de celle de la séquence murine de l'anticorps chimérique d 'origine a été déterminé. Les gènes VH et VL humains les plus proches déterminés pour les anticorps chimériques 122A2 et 102E9 sont mentionnés dans le Tableau 28 ci-dessous :

Tableau 28. Gènes VH et VL humains les plus proches des séquences murines de l'anticorps chimérique d'origine (nomenclature IMGT).

Pour chaque domaine VH et VL, sur la base d'un alignement entre la séquence murine d'acides aminés de l'anticorps chimérique d'origine et de la séquence d'acides aminés du gène humain le plus proche, les différentes positions de mutations entre les deux séquences d'acides aminés (murine/humaine) ont été déterminées, et plusieurs séquences murines incorporant un nombre variable de mutations pour remplacer un acide aminé murin par un acide aminé humain ont été générées.

Ainsi, pour chacun des anticorps 122A2 et 102E9, 3 versions de chaque partie variable chaîne lourde (Hha, Hhb et Hhc) et légère (Kha, Khb et Khc) ont été déterminées. Une quatrième version de la partie variable chaîne légère (Khd) est ajoutée, pour ce qui concerne l'anticorps 122A2. Ces différentes séquences comprennent des nombres variables de mutations par rapport aux régions VH et VL de l'anticorps chimérique d'origine, comme décrit dans le Tableau 29 ci-dessous :

Anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2

Nombre de mutations par

Mutations* rapport à

l'anticorps chimérique

Hha L12V/R14K/V17A/S45A/A76V/T85S/A92S/E97D/S99T

** 11

/I101V/S123L

122A2

L12V/R14K/V17A/K43R/S45A/A76V/K82T/T85S/A92S

VH Hhb /T95R/E97D/S99T/I101V/S123L 14 humanisés

L12V/R14K/V17A/K43R/S45A/H46P/A47G/K48Q/S49

Hhc G/A76V/T85S/A92S/E97D/S99T/I101V/S123L 16

Kha

** T7S / S22T/ R24Q/ S69T/ F103 Y 5

122A2 Khb T7S/T8P/L15V/S22T/R24Q/S69T/F103Y 7

VL

humanisés Khc T7S/S22T/R24Q/R66N/S69T/D95Q/F103Y 7

Khd T7S/T8P/L15V/S22T/R24Q/R66N/S69T/D95Q/F103Y 9 Anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 102E9

Nombre de mutations par

Mutations* rapport à l'anticorps chimérique

Hha D1 1 E/T18S/K48Q/A77V/E81 D/S82T/A84V/F88Y

** 10

/N93S/F103Y

102E9 D1 1 E/T18S/K43R/K48Q/D69Q/A77V/E81 D/S82T

VH

Hhb 12 humanisés /A84V/F88Y/N93S/F103Y

P9S/D1 1 E/T18S/K43R/K48Q/D69Q/A77V/E81 D/

Hhc 13

S82T/A84V/F88Y/N93S/F103Y

V3Q/A9S/I10F/M1 1 L/K18R/T48K/S49A/A74S/S8

Kha 12

6E/S88T/R93S/A99F

102E9

Khb V3Q/A9S/I10F/M1 1 L/K18R/S49A/A74S/S88T/A9

VL ** 9

9F

humanisés

V3Q/A9S/I10F/M1 1 L/E17D/K18R/T48K/S49A/A7

Khc 14

4S/S86E/S88T/R93S/E95Q/A99F

Tableau 29. Mutations des séquences d'acides aminés des régions VH et VL des anticorps humanisés dérivés des anticorps chimériques 122A2 et 102E9, par rapport aux régions VH et VL de l'anticorps chimérique d'origine. Pour chaque domaine VH ou VL, la séquence avec le nombre minimal de mutations par rapport aux régions VH et VL de l'anticorps chimérique d'origine est indiquée par un **. Les mutations additionnelles des autres séquences par rapport à la séquence indiquée par un ** sont soulignées. **La position des résidus d'acides aminés correspond à la numérotation unique IMGT.

Préparation des vecteurs d'expression

Les différentes séquences ont été synthétisées sous forme d'ADN double brin linéaire, appelé « String », avec une optimisation de codons pour Rattus norvegicus.

La construction des vecteurs d'expression codant pour les anticorps anti-CD303 humanisés est réalisée par recombinaison homologue, grâce au kit In-Fusion® HD Cloning (Clontech® Laboratories). Le vecteur d'expression choisit pour chacune des chaînes lourdes et légères d'Ig est le vecteur commercial pCEP4 (Invitrogen). Il a l'avantage d'être hautement productif lorsqu'il est utilisé en association avec la lignée cellulaire humaine HEK-293 FreeStyle, lignée utilisée pour produire rapidement des quantités suffisantes d'anticorps pour réaliser certains tests. pCEP4 est monocistronique, a une taille de 10186 pb et possède tous les éléments nécessaires pour permettre l'expression des gènes d 'intérêts, c'est-à-dire un gène de résistance à l'ampicilline, une origine de réplication (pUC origin), un promoteur CMV et un poly A de SV40 (voir Figure 8A). Les séquences d 'intérêts sont clonées entre les sites de restriction Nhel et Xhol, et en aval du promoteur (voir Figures 8B-8N). Dans un premier temps, une digestion par ces enzymes est réalisée afin d 'ouvrir le vecteur au niveau souhaité. Une purification à l'aide du kit Nucleospin Plasmid (Machrey Nagel) est alors nécessaire pour purifier le vecteur linéarisé, réduit à 10163 pb.

En parallèle de la synthèse des parties variables, les parties constantes de la chaîne lourde et de la chaîne légère ont été préparées par amplification par PCR, en utilisant comme matrice le vecteur CHK622-21 , et contenant les parties constantes des chaînes H et K optimisées pour Rattus norvegicus. Cette PCR a été effectuée à l'aide d 'une ADN polymérase haute-fidélité, la Herculase II Fusion (Agitent Technologies) et d 'amorces définies de façon à ajouter, aux parties constantes, des sites de restriction pour le clonage à leurs extrémités 3', ainsi que 1 5 pb complémentaires au vecteur pour permettre le clonage par recombinaison. Une fois la PCR réalisée, un gel de vérification est fait pour vérifier si les fragments d 'intérêts ont bien été amplifiés et également, pour ensuite les récupérer depuis le gel de purification (1 ,25% d'agarose low). Les échantillons sont migrés dans le gel de purification, avec un faible voltage pour permettre une bonne séparation des fragments d'ADN.

Une fois la préparation de tous les éléments géniques effectuée, leur assemblage peut se faire par l'intermédiaire du kit de Ιη-Fusion®. Ainsi, le mélange, c'est-à-dire ; le vecteur linéarisé (0,5 μΐ), le « string » (1 μΐ) à une concentration initiale de 50 ng/μΐ et la partie constante de la chaîne lourde ou légère (1 μΐ) complété à 10 μΐ avec de l'eau stérile, est ajouté dans le tube du kit contenant le produit lyophilisé composé notamment de l'enzyme PCR de haute-fidélité CloneAmp™ HiFi. Le mélange est ensuite incubé pendant 1 5 minutes à 37° C, puis 1 5 minutes à 50° C. En parallèle, une ligation avec seulement le vecteur linéarisé, sans les parties variables et constantes, est réalisée et servira de témoin négatif à la manipulation.

Les vecteurs ont ensuite été clonés dans des bactéries E.coli NEB 5-alpha hautement compétentes, et les séquences de différents clones de chaque vecteur vérifiées par séquençage. Lorsque le clone est déclaré conforme en séquence, une culture bactérienne de 300 ml du clone sélectionné est réalisée pour purifier le vecteur d 'intérêt qu'il contient, à l'aide du kit NucleoBond Xtra EF (Macherey Nagel). Les plasmides obtenus sont stériles et en quantités suffisantes pour réaliser les co- transfections dans la lignée de production. Production des anticorps dans HEK-293 FreeStyle

La production des anticorps est réalisée par co-transfection transitoire à partir de la lignée HEK-293 FreeStyle (Human Embryonic Kidney). Cette dernière est une lignée cellulaire immortalisée qui a la capacité de proliférer en suspension et en absence de sérum. Cette lignée HEK, cultivée dans du milieu Freestyle F17 Expression Médium (Life Technologies), supplémenté de 8 mM de Glutamine, permet également une productivité plus importante et rapide de protéines recombinantes.

Lors des co-transfections, les témoins utilisés pour valider les expériences sont le témoin de croissance, qui correspond à une culture de cellules HEK n'ayant pas subi de transfection, et une lignée que l'on a transfectée avec un vecteur, le pMAX, codant pour une protéine fluorescente, la GFP, qui va permettre de déterminer environ 24h après, le taux de transfection. Le tampon utilisé, pour diluer l'ADN, l'agent de transfection et les cellules, est l'OptiMEM® (Life Technologies). Le polyethylenimine (PEI ) est l'agent de transfection (ADT), qui va permettre d 'introduire les vecteurs dans les cellules. Un ratio de ½ entre ADN/ADT et un ratio de 1 /3 du vecteur comportant la chaîne H par rapport à la chaîne K, sont respectés. Après mise en contact du complexe ADN/ADT avec les cellules, ces dernières sont ensuite cultivées sous agitation à 37° C, avec 8% de C0 ₂ .

A l'issue d'une production de 7 jours après la co-transfection, les cultures cellulaires sont centrifugées pendant 1 5 minutes à 3000 g. Le surnageant clarifié, contenant les anticorps produits, est récupéré et dosé à l'aide d 'un kit commercial, le FastElysa (RD- Biotech), afin d 'estimer de façon précise la quantité d 'anticorps de chaque surnageant pour permettre de réaliser par la suite les études d 'affinité des anticorps humanisés vis- à-vis de la protéine CD303. Production de certains dérivés humanisés de l'anticorps chimérique 122A2 par des clones YB2/0 transfectés de façon stable par un vecteur d 'expression

Des clones YB2/0 ont été transfectés de façon stable par un vecteur d 'expression comprenant des séquences nucléiques codant pour les anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H7, 122A2H9 et 122A2H10 dérivés de l'anticorps chimérique 122A2. Les anticorps ont ensuite été produits et leur quantité dosée dans le surnageant.

A partir des vecteurs monocistroniques utilisés pour la transfection transitoire dans la lignée HEK, les chaînes légères (122A2H5 : pCEP4_Kha_122A2 ; 122A2H9 : pCEP4_Khb_122A2 ; 122A2H10 : pCEP4_Khb_122A2 ; 122A2H7 : pCEP4_Kha_122A2) ont été introduites par digestion Spel -Xbal dans le vecteur HKgenEFss pour obtenir un vecteur intermédiaire. Puis, sur ces vecteurs intermédiaires, une digestion Nhel -Ascl a été réalisée pour introduire la chaîne lourde (122A2H5 : pCEP4_Hha_122A2 ; 122A2H9 : pCEP4_Hha_122A2 ; 122A2H10 : pCEP4_Hhb_122A2 ; 122A2H7 : pCEP4_Hhc_122A2).

Caractérisation de la liaison à l'antigène des anticorps produits, par la technique ELISA

L'étude de la capacité de liaison des différents anticorps produits dans HEK-293 FreeStyle est réalisée par la méthode immuno-enzymatique ELISA.

Cette technique permet de mettre en évidence et de visualiser par une approche colorimétrique l'interaction antigène-anticorps. Le principe de ELISA est dans un premier temps de coater sur une plaque MaxiSorp l'antigène, qui correspond ici à l'ectodomaine CD303, pour une quantité de 10 ng par puits. Ce dernier a été acheté auprès du fournisseur Mybiosource. Dans un second temps, les différents anticorps produits, contenus dans le surnageant, sont tous dilués à la même concentration, et mis en contact avec l'antigène pour permettre leur liaison à l'antigène. Une troisième étape consiste à ajouter les anticorps secondaires anti-anticorps humain couplés à l'enzyme HRP, nécessaire pour détecter de façon amplifiée la fixation des anticorps anti-CD303 à l'antigène. Enfin, la révélation se fait à partir d'une solution contenant le substrat pour l'enzyme (le TMB ou 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine). L'apparition d'une coloration du substrat indique la formation du complexe antigène anticorps. L'intensité de cette coloration est proportionnelle à la quantité d'enzyme présente et donc à la quantité d'anticorps testés liés à l'antigène. La réaction est stoppée par l'ajout de H ₂ S0 ₄ (acide). Ces couleurs sont lues à l'aide d'un spectrophotomètre qui effectue une lecture à une longueur d'onde de 450 nm.

Caractérisation de la liaison à l'antigène des anticorps produits, par cytométrie en flux

Dans le but de valider les résultats obtenus en ELISA, les différents anticorps produits dans HEK-293 FreeStyle sont évalués en cytométrie en flux. La cytométrie en flux permet de vérifier que dans un contexte cellulaire, l'anticorps recombinant est capable de se fixer à son antigène, et donc valider les résultats obtenus par la méthode ELISA. La lignée utilisée pour réaliser cette technique est une lignée cellulaire leucémique de cellules dendritiques plasmacytoïdes obtenues à partir d'un patient atteint du BPDCN, CAL-1. Les anticorps produits ont été testés en surnageant, mais également sous formes purifiées par chromatographie d'affinité avec de la protéine A sepharose (non développé ici).

Pour le marquage cellulaire, les cellules et les anticorps sont pré-dilués avec du PBS- SVF 1%. Dans un volume réactionnel de 100 μΐ, 1x10 ⁵ cellules sont incubées à 4°C pendant 30 minutes avec les anticorps anti-CD303 à tester, à deux concentrations : à 0,1 μ /ml ou 1 μ /ml. Cette incubation est suivie de plusieurs lavages. Les complexes cellules/anticorps ainsi formés sont ensuite mis en contact pendant 30 minutes, à 4° C avec l'anticorps secondaire dilué au 1 /50 ^eme , un F(ab')2 anti-Fc d'IgG humain et couplé à un fluorochrome, la phycoérythrine. Les cellules sont enfin lavées et étudiées par cytométrie en flux (FC500, Beckman Coulter), en mesurant notamment l'intensité de fluorescence moyenne (MFI ou Mean of fluorescence intensity). Différents contrôles négatifs sont utilisés afin d'éliminer d'éventuelles fixations aspécifiques tels que : les cellules seules ou directement en contact avec l'anticorps secondaire, ou le remplacement de l'anticorps testé par un anticorps chimérique non pertinent (anti- idiotype du facteur VIII). Enfin d'autres témoins, tels que l'utilisation du surnageant (« mock »), permettent de montrer que celui-ci n'influe pas l'affinité des anticorps vis- à-vis de l'antigène membranaire.

Inhibition de la sécrétion d'IFN-a

Préparation des cellules

Des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir du sang périphérique de donneurs sains par gradient de densité sur ficoll. 10 ⁷ cellules / puits (200 μΐ) sont transférés à une plaque de culture 24 puits à fond plat, en présence de CpG ODN 2216-1 (Invivogen) à 1 μΜ et d'IL-3 (réf: 1 30-093-909, Miltenyi Biotec) à 10 ng/ml. Les anticorps anti-CD303 ou non pertinent ont été ajoutés à différentes concentrations (0 à 1 μg/ml) dans du milieu RPMI 10% SVF. La plaque a été ensuite incubée pendant une nuit à 37 C avec 7% de C0 ₂ .

Dosage du taux d'IFN-a

ELISA en utilisant le kit Human IFN-α moduleSet (Ref: BMS216 ST, eBiosciences).

Les surnageants de culture de chaque puit sont collectés et dosés par ELISA en utilisant le kit Human IFN-α moduleSet (Ref: BMS216MST, eBiosciences).

Induction de la sécrétion d'IL-2 par des cellules Jurkat-CD16

Ce test évalue la capacité des anticorps anti-CD303 à se fixer sur le récepteur CD16 (Fc gamma RIII) exprimé sur les cellules Jurkat CD16 et à induire la sécrétion d'IL2.

Ce test consiste à mettre en contact en plaque de 96 puits : les anticorps anti-CD303, les cellules cibles exprimant CD303, les cellules Jurkat CD16 et du phorbol myristate acétate (PMA).

Après une nuit d'incubation à 37° C, on centrifuge les plaques et on dose dans le surnageant la quantité d'IL2 sécrétée. Résultats

Co-transfection des vecteurs produits dans une lignée HEK 293F

A partir des vecteurs exprimant les séquences des chaînes lourdes et légères humanisées, différentes combinaisons chaîne lourde (H)/chaîne légère (L ou K), ont été réalisées par co-transfection transitoire dans la lignée HEK-293F, afin de produire différentes versions représentatives des deux anticorps candidats. De cette manière, ont été produits (voir Tableau 30 ci-dessous) :

1. des anticorps hybrides (une des deux chaînes de l'Ig est humanisée, l'autre est chimérique), et

2. des anticorps humanisés.

Dérivés de l'anticorps chimérique 122A2

122A2-H 122A2-Hha 122A2-Hhb 122A2-Hhc

122A2 122A2H1 122A2H2 122A2H3

122A2-K

(chimérique) (hybride) (hybride) (hybride)

122A2H4 122A2H5 122A2H6 122A2H7

122A2-Kha

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé)

122A2H8 122A2H9 122A2H10 122A2H11

122A2-Khb

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé)

122A2H12 122A2H13 122A2H1 122A2H15

122A2-Khc

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé)

122A2H16 122A2H17 122A2H18 122A2H19

122A2-Khd

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé)

Dérivés de 'anticorps chimérique 102E9

102E9-H 102E9-Hha 102E9-Hhb 102E9-Hhc

102E9 102E9H1 102E9H2 102E9H3

102E9-K

(chimérique) (hybride) (hybride) (hybride)

102E9H4 102E9H5 102E9H6 102E9H7

102E9-Kha

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé)

102E9H8 102E9H9 102E9H10 102E9H11

102E9-Khb

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé)

102E9H12 102E9H13 102E9H1 102E9H15

102E9-Khc

(hybride) (humanisé) (humanisé) (humanisé) Tableau 30. Noms des anticorps hybrides ou humanisés dérivés des anticorps chimériques 122A2 et 102E9, en fonction des chaines lourdes et légères humanisées utilisées. Au cours des différentes co-transfections transitoires effectuées, pour produire l'ensemble des 36 molécules, l'efficacité de transfection a pu être déterminée à J+1 à l'aide du vecteur pMAX.

Lors de la sortie de production à J+7, les surnageants, contenant les protéines produites, sont récupérés, centrifugés, filtrés et finalement dosés pour en connaitre le titre en IgG produites (voir Tableaux 31 et 32 ci-dessous). Les concentrations ainsi obtenues varient en fonction du type de chaîne H et de chaîne K, c'est-à-dire chimérique ou humanisée que possèdent les différentes versions d'anticorps produits.

Chaîne Chaîne Concentration

Anticorps

lourde légère à J+7 (Mg/ml)

Anticorps chimérique d'origine

122A2 H K 0,75

Anticorps hybrid es

122A2H1 Hha K 0,13

122A2H2 Hhb K 0,42

122A2H3 Hhc K 0,67

122A2H4 H Kha 1 ,18

122A2H8 H Khb 1 ,17

122A2H12 H Khc 1 ,41

122A2H16 H Khd 1 ,33

Anticorps humani sés

122A2H5 Hha Kha 5,37

122A2H9 Hha Khb 4,41

122A2H13 Hha Khc 6,40

122A2H17 Hha Khd 7,75

122A2H6 Hhb Kha 43,57

122A2H10 Hhb Khb 69,28

122A2H1 Hhb Khc 55,20

122A2H18 Hhb Khd 69,40

122A2H7 Hhc Kha 50,80

122A2H11 Hhc Khb 44,76

122A2H15 Hhc Khc 31 ,96 122A2H19 Hhc Khd 19,15

Tableau31. Concentrations en μ /ml à J+7 des différents surnageants, contenant les anticorps produits (anticorps chimérique 122A2 et dérivés hybrides ou humanisés de cet anticorps), déterminées à l'aide du kit FastElysa.

Tableau 32. Concentrations en μg/ml à J+7 des différents surnageants, contenant les anticorps produits (anticorps chimérique 102E9 et dérivés hybrides ou humanisés de cet anticorps), déterminées à l'aide du kit FastElysa.

On peut constater que la concentration en anticorps est dépendante des combinaisons réalisées mais également du type de chaîne H et ou K (humanisée ou chimérique). Dans ce contexte, la productivité des anticorps chimériques 122A2 et 102E9, ainsi que celle de la plupart des hybrides (combinaison d'une chaîne H ou K chimérique et d'une chaîne H ou K humanisée, comme indiqué précédemment), est beaucoup moins élevée que le restant des molécules. Cette observation serait liée à l'expression des chaînes H et K chimériques qui seraient défavorables à une bonne expression cellulaire.

Comme ce qui différencie les anticorps chimériques des humanisés, ce sont les acides aminés qui ont été mutés, les variations de productivité sont uniquement sous la dépendance de quelques acides aminés.

Ainsi, pour les anticorps dérivés de 102E9, les anticorps hybrides possédant la chaîne lourde ou légère chimérique ainsi que les anticorps humanisés avec la chaîne lourde Hhc (102E9H7, 102E9H11 et 102E9H15) ont tous une productivité plus faible.

Dans le cas des anticorps dérivés de 122A2, ce sont les chaînes K chimérique et H humanisée Hha qui conduisent à une productivité plus faible. L'anticorps chimérique 122A2 se trouve avoir la plus faible productivité lorsqu'il est comparé à certains de ses dérivés hybrides et humanisés. De façon fortuite, l'humanisation a permis d'augmenter le titre volumique jusqu'à un facteur 100, dans le cas du 122A2H10 (Hhb, Khb).

Enfin, on remarque que les anticorps humanisés 122A2 se produisent globalement mieux que les anticorps 102E9 humanisés. Cela confirme que l'expression des anticorps d'un même isotype est très dépendante de leur séquence primaire et principalement de leurs parties variables.

Caractérisation de la liaison à l'antigène des anticorps produits, par la technique ELISA

Les tests ELISA ont été effectués à partir des surnageants de culture récoltés après production. Ils sont tout d'abord tous dilués à la même concentration, afin que tous les échantillons soient dans les mêmes conditions. De plus, les dilutions initiales se font à l'aide d'un surnageant, centrifugé et filtré, provenant de cultures cellulaires utilisées comme témoins de croissance lors des transfections. Ces cultures n'expriment pas d'anticorps, on parle donc de « mock ». Les échantillons sont ensuite dilués, sur la plaque MaxiSorp 96 puits, au demi à l'aide du tampon contenant du PBS, de la BSA 4% et du Tween 0.05 %.

Tous les anticorps produits, qu'ils soient dérivés de 122A2 ou 102E9, donnent un signal coloré dont l'intensité est quantifiable lors de la lecture par spectrophotométrie. Ceci peut être interprété comme étant la capacité des différents anticorps à se lier spécifiquement à l'ectodomaine de CD303. Il existe cependant des différences d'affinité vis-à-vis de l'antigène qui se traduisent par des différences de DO ₄₅₀ .

Ainsi, il a été possible, pour chaque anticorps produit, de représenter sous forme de graphique, la DO ₄₅₀ en fonction de la concentration en anticorps. Cela se traduit par une courbe biphasique avec une phase exponentielle jusqu'à atteindre un plateau. Cette représentation graphique a permis de classer les anticorps testés et l'anticorps chimérique duquel ils sont dérivés en fonction de leur affinité pour l'antigène CD303.

Dans le cas des anticorps dérivés de 102E9, la gamme d'anticorps déposés dans chaque puits va de 1 ,25 ng/ml à 20 ng/ml. La saturation du signal de DO ₄₅₀ apparaît à partir d'une concentration d'environ 10 ng/ml d'anticorps. La Figure 9 présente les résultats obtenus pour les différents anticorps humanisés. La concentration de 5 ng/ml permet de classer les anticorps humanisés (Figure 10).

Aucun des anticorps humanisés ne se lie aussi bien que l'anticorps chimérique à l'antigène CD303. Néanmoins, tous les anticorps humanisés conservent une capacité raisonnable à se lier à l'antigène CD303. L'anticorps humanisé 102E9H10 a la meilleure capacité de liaison vis-à-vis de l'antigène CD303 parmi tous les anticorps humanisés. Elle ne représente qu'une perte de liaison d'environ 20% par rapport à l'anticorps chimérique d'origine 102E9 (Figure 10). Trois autres anticorps humanisés 102E9H6, 102E9H7 et 102E9H9 ont également une capacité de liaison proche de l'anticorps chimérique de référence. Ils ont respectivement une capacité de liaison à l'ectodomaine CD303 de 73% (102E9H6), 76% (102E9H7) et 71% (102E9H9).

Dans le cas des anticorps dérivés de 122A2, les concentrations d'anticorps testés vont de 1 ,75 à 10 ng/ml. Les témoins utilisés sont les mêmes que précédemment : le surnageant seul (mock) et l'anticorps chimérique, ici 122A2. La Figure 1 1 présente les résultats obtenus pour les différents anticorps humanisés. La concentration de 5 ng/ml permet de classer les anticorps humanisés (Figure 12).

Tous les anticorps testés sont capables de se lier à l'ectodomaine CD303. L'échantillon témoin négatif « surnageant » a une DO ₄₅₀ proche de zéro. Il n'y a donc pas de liaison aspécifique dû au surnageant. De plus, un effet dose réponse est également observé pour tous les échantillons testés. L'allure de la majorité des courbes représentant les différents anticorps humanisés est proche de celle de l'anticorps chimérique 122A2. Enfin, plusieurs anticorps humanisés de 122A2 (122A2H5, 122A2H6, 122A2H7, 122A2H9, 122A2H10, 122A2H11 , 122A2H1 et 122A2H15) apparaissent avoir une capacité de liaison à l'ectodomaine CD303 au moins égale (122A2H11 et 122A2H15) et parfois significativement supérieure (122A2H5, 122A2H6, 122A2H7, 122A2H9, 122A2H10, et 122A2H1 ) à celle de l'anticorps chimérique. Caractérisation de la liaison à l'antigène des anticorps produits par cytometrie en flux

La fixation des anticorps a également été étudiée en cytométrie en flux pour valider les résultats obtenus par la technique ELISA.

Pour l'anticorps 102E9, les anticorps humanisés 102E9H10, 102E9H6, 102E9H7, 102E9H9 et l'anticorps chimérique 102E9 ont été sélectionnés pour être caractérisés par cette technique.

Pour l'anticorps 122A2, les anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H6, 122A2H9, 122A2H7, 122A2H10, 122A2H1 , 122A2H17, 122A2H15, les anticorps hybrides 122A2H8, 122A2H3 et l'anticorps 122A2 chimérique en surnageant ont été sélectionnés pour la caractérisation. Le 122A2H8 représente le meilleur anticorps hybride avec une affinité supérieure à celle de l'anticorps chimérique, tandis que le 122A2H3 présente une affinité beaucoup plus faible que celle de l'anticorps parental. Les anticorps humanisés choisis comptent parmi ceux qui ont une meilleure affinité vis-à-vis de la protéine cible par rapport à l'anticorps chimérique d'origine.

Dans le cas de l'anticorps 102E9, il y a peu de différences entre les anticorps humanisés et le chimérique (non illustré ici).

Dans le cas de l'anticorps 122A2, les résultats sont présentés sur la Figure 13 (qui représente la moyenne de fluorescence pour chaque anticorps testé, à une concentration de 0,1 μg/ml), et montrent que certains anticorps humanisés (testés en surnageant) montrent une affinité meilleure par rapport à l'anticorps chimérique 122A2. C'est le cas notamment des anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H9, 102E9H7, et 122A2H10. Les autres anticorps humanisés précédemment identifiés en ELISA comme ayant une capacité de liaison au moins égale à celle de l'anticorps chimérique et testés en cytométrie en flux (122A2H14 et 122A2H1 5) ont dans le test de cytométrie une liaison (MFI) légèrement plus faible que celle de l'anticorps chimérique, mais qui reste proche de celle de l'anticorps chimérique. En conséquence, les résultats obtenus en cytométrie en flux confortent ceux précédemment obtenus par la méthode ELISA.

Les mêmes anticorps ont été évalués sous forme purifiés et ils montrent les mêmes résultats. Inhibition de la sécrétion d'IFN-a

Les CpG induisent la sécrétion d"IFN-a des pDC contenues dans les PBMC. Dans cette expérience (Figure 14) les inhibitions de sécrétion d"IFN-a médiées par divers anticorps anti-CD303 (122A2 chimérique et 4 anticorps 122A2 humanisés) ont été comparées. Les valeurs d'IC50 (Tableau 33 ci-dessous) ont été de :

· 0,95 ng/ml pour l'anticorps chimérique ch.122A2, 0,81 ng/ml pour l'anticorps humanisé h122A2H5,

0,86 ng/ml pour l'anticorps humanisé M 22A2H7,

0,91 ng/ml pour l'anticorps humanisé M 22A2H9, et

0,94 ng/ml pour l'anticorps humanisé h122A2H10.

Tableau 33. Concentrations inhibitrices à 50% (IC50) de la sécrétion d"IFN-a des pDC contenues dans les PBMC. na : non applicable.

Ces résultats montrent que les quatre anticorps 122A2 mAb humanisés testés sont capables d'inhiber la sécrétion d"IFN-a, avec une IC50 inférieure ou égale à celle de l'anticorps chimérique.

Production par des clones YB2/0 transfectés de façon stable par un vecteur d'expression d'anticorps humanisés dérivés de l'anticorps chimérique 122A2

Les anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H7, 122A2H9 et 122A2H10, dérivés de l'anticorps chimérique 122A2, sont apparus particulièrement intéressants en termes de productivité et de liaison à l'antigène. Ils ont donc été sélectionnés pour produire des clones YB2/0 transfectés de façon stable par un vecteur d'expression de ces anticorps. Les cartes des vecteurs HKgenEFss exprimant les anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H7, 122A2H9 et 122A2H10 sont représentées sur les Figure 15A à 15D.

Les données de dosage du surnageant des 4 clones ainsi obtenus sont présentées dans le Tableau 34 ci-dessous, et montrent que ces 4 anticorps humanisés peuvent être produits avec une productivité satisfaisante, celui ayant la meilleure productivité étant l'anticorps 122A2H9. Anticorps Dosage surnageant ^g/ml)

122A2H5 17,96

122A2H7 19,8

122A2H9 20,47

122A2H10 19,32

Tableau 34. Dosage de l'anticorps humanisé produit dans le surnageant des clones stables YB2/0 exprimant les anticorps humanisés 122A2H5, 122A2H7, 122A2H9 et 122A2H10, dérivés de l'anticorps chimérique 122A2.

Induction de la sécrétion d'IL-2 par des cellules Jurkat-CD16 La capacité de l'anticorps humanisé 122A2H9, dérivé de l'anticorps chimérique 122A2 et produit par des clones stables YB2/0 à se lier au récepteur CD16 et à induire la sécrétion d'IL-2 par des cellules Jurkat-CD16 a été testée et comparée à celle de l'anticorps chimérique 122A2.

Un exemple de résultat obtenu est présenté sur la Figure 16. De plus, les résultats de plusieurs expériences sont présentés dans le Tableau 35 ci-dessous, exprimés en ng/ml (50%) dans le tableau 1 , cette valeur représentant la quantité d'anticorps requise pour atteindre 50% du plateau de l'anticorps chimérique. Une valeur plus faible indique une meilleure activité.

Tableau 35. Quantité d'anticorps requise pour atteindre 50% du plateau de l'anticorps chimérique, exprimée soit en ng/ml (partie haute du tableau), soit en rapport entre les deux anticorps, les valeurs de l'anticorps chimérique ch122A2 étant arbitrairement fixées à 1 de façon à niveler les écarts inter expériences.

Ces résultats montrent que, malgré une séquence de fragment Fc identique à celle de l'anticorps chimérique, l'anticorps humanisé 122A2H9 induit une sécrétion d'IL-2 par les cellules Jurkat-CD16 légèrement supérieure à celle de l'anticorps chimérique. Conclusions

Afin d'optimiser la tolérance immunogénique des anticorps, une humanisation a été réalisée sur deux des cinq anticorps chimériques générés par les inventeurs, avec l'objectif de conserver une affinité similaire ou non significativement différente vis-à- vis de l'antigène CD303. Pour cela, plusieurs chaînes lourdes et légères humanisées ont été testées en combinaison pour chacun des anticorps d'origine, et transfectées dans des cellules HEK-293F.

Suite au dosage des échantillons, il a été constaté que la concentration en anticorps est dépendante de la séquence d'acides aminés d'origine (les anticorps humanisés dérivés de 122A2 se produisent mieux que les anticorps humanisés dérivés de 102E9), des combinaisons réalisées, et également du type de chaîne H et ou K (humanisée ou chimérique). Ces données confirment globalement que l'expression des anticorps d'un même isotype est très dépendante de leur séquence primaire et principalement de leurs parties variables. De plus, de nombreux anticorps humanisés, dérivés de l'un ou l'autre des deux anticorps chimériques d'origine, se produisent mieux que l'anticorps chimérique d'origine.

Les anticorps ainsi produits ont été caractérisés par la méthode ELISA. Dans la mesure où les anticorps testés étaient proches les uns des autres, il était difficile d'identifier les anticorps humanisés qui ont les mêmes caractéristiques de liaison à l'antigène que l'anticorps chimérique d'origines. Là où les anticorps ont été testés sur plusieurs concentrations, les analyses ont été focalisées sur les concentrations où on observe une réelle différence de DO ₄₅₀ entre les différents anticorps. Ainsi, la concentration à 5 ng/ml a permis de montrer que le meilleur anticorps humanisé de 102E9, le 102E9H10, a une capacité de liaison à l'ectodomaine de CD303 est de 80% de celle du chimérique. De cette manière, 4 anticorps humanisés (102E9H10, 102E9H6, 102E9H7 et 102E9H9) ont été mis en évidence et choisis pour être validés en cytométrie en flux, en tant que anticorps humanisés d'intérêts.

Dans le cas des anticorps humanisés dérivés de 122A2, plusieurs anticorps sont clairement mis en évidence dès le premier test en ELISA comme ayant une capacité de liaison à l'ectodomaine CD303 au moins égale (122A2H11 et 122A2H15) voire supérieure (122A2H5, 122A2H6, 122A2H7, 122A2H9, 122A2H10, et 122A2H1 ) à celle du chimérique. Ces résultats obtenus à partir des surnageants ont été complétés par une méthode orthogonale utilisant la cytométrie en flux.

Au total, les résultats présentés ci-dessus montrent que, pour chacun des anticorps chimériques 122A2 et 102E9, il a été possible de générer des anticorps humanisés (donc avec une immunogénicité réduite chez l'homme), qui peuvent être produits avec une meilleure productivité que l'anticorps chimérique d'origine, et qui ont une capacité de liaison à l'antigène CD303 qui est :

• Au moins proche de celle de l'anticorps chimérique pour les dérivés de l'anticorps chimérique 102E9 (au moins 80% pour l'anticorps 102E9H10, au moins 70% pour les anticorps 102E9H6, 102E9H7 et 102E9H9).

• Au moins égale (122A2H11 et 122A2H15), voire supérieure (122A2H5, 122A2H6, 122A2H7, 122A2H9, 122A2H10, et 122A2H1 ) à celle de l'anticorps chimérique pour les dérivés de l'anticorps chimérique 122A2.

De plus, des anticorps humanisés dérivés de 122A2 sont capables d'inhiber la sécrétion d'IFN-α, aussi bien que l'anticorps chimérique 122A2.

Pour certains anticorps humanisés dérivés de 122A2, des clones YB2/0 stablement transfectés ont pu être obtenus, qui produisent l'anticorps avec une productivité satisfaisante. Ces anticorps ont une forte capacité à se lier au récepteur CD16 et à induire la sécrétion d'IL62 par les cellules Jurkat-CD16. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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