Die vorliegende Erfindung betrifft einen viralen selbst inaktivierenden (SIN-) Vektor auf Basis des Avian Sarkoma Leukosis Virus (ASLV), virale Partikel, die den erfindungsgemäßen Vektor enthalten, ein Split-Packaging-System, umfassend oder bestehend aus dem SIN- Vektor, einem ersten Helferplasmid, das zur Expression des viralen Fusionsproteins gag-pol dient, und einem zweiten Helferplasmid, das zur Expression des retroviralen Hüllproteins (env) dient, sowie ein Verfahren zur Herstellung des viralen Partikels mittels des Split-Packaging-Systems, insbesondere durch Expression in kultivierten humanen Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung den viralen Partikel zur Verwendung als Medikament, insbesondere zum Transfer eines Transgens in Zellen, sowie die Verwendung des viralen Partikels für die Herstellung des Medikaments. Das erste und zweite Helferplasmid, beispielsweise in einer Verpackungs-Zelllinie enthalten oder transient transfiziert, dienen der Erzeugung von nicht replizierenden (RCR - inkompetenten) viralen Partikeln, die RNA mit einem erfindungsgemäßen SIN-LTR am 3 '-Ende enthalten, wobei die RNA einen therapeutisch wirksamen Abschnitt aufweisen kann, der z.B. als Transgen bezeichnet wird. Dieser 3 ' SIN LTR beinhaltet eine umfangreiche Deletion der U3 Region, welche im Zuge der reversen Transkription in den 5 ' LTR kopiert wird. Für die Expression eines Transgens, das z.B. zur Verwendung für die Gentherapie ein humanes oder heterologes Gen sein kann, enthält der virale SIN- Vektor vorzugsweise eine Expressionskassette, die in 5 ' zum 3 ' SIN LTR angeordnet ist.

Der erfmdungsgemäße Vektor erlaubt auch in humanen Verpackungszellen die Erzeugung viraler Partikel mit hohem Titer und zeichnet sich dadurch aus, dass bei der Transduktion von Zielzellen, insbesondere humaner Zellen, durch Kontaktieren der Zellen extrakorporal, d.h. in vitro, oder mittels Verabreichung eines dazu hergerichteten Partikels an einen Patienten in vivo transduzierte Zellen erzeugt werden, die das Transgen über einen langen Zeitraum stabil bzw. mit geringer Abschwächung exprimieren, wobei die Häufigkeit der Transformation von Zielzellen durch Onkogenaktivierung gering ist. Die Expressionskassette weist in 5 ' vor der Nukleinsäuresequenz, die das Transgen kodiert, einen Promotor auf, und vorzugsweise in 3 ' zu der das Transgen kodierenden Sequenz ein posttranskriptionell regulatorisches Element (PRE), insbesondere ein WPRE (PRE des Waldmurmeltier Hepatitis Virus (WHV)).

Stand der Technik

Hughes (Folia Biologika 50,107-119 (2004)) beschreibt eine Serie von viralen Vektoren auf Basis des Avian Leukosis Virus (ALV), die zur besseren Produktion replikationskompetenter Retroviren (RCR) einen funktionierenden LTR aufweisen. (RCAS: Replication-Competent ASLV LTR with a S^plice Acceptor). Bei diesem System liegen alle Komponenten zur Virusproduktion auf einem Plasmid (wie im Volllängenvirus) und ein mögliches Transgen wird in die 3 ' untranslatierte Region (UTR) eingefügt.

Hu et al. (Molecular Therapy, 1617-1623 (2008)) zeigen, dass ASLV nicht dazu neigt, sich vorzugsweise innerhalb oder in der Nähe von Proto-Onkogenen zu inserieren, und dass die LTRs von ASLV nicht dazu neigen, benachbarte Gene zu aktivieren und kommt daher zu dem Schluß, dass ASLV eine geeignete Basis für virale Vektoren bilden sollte. Es wird angedeutet, dass eine Deletion der Verstärkerregion (enhancer) im LTR oder das Verhindern des Hindurch-Transkribierens über ein Terminationssignal, durch eine verbesserte Polyadenylierung erreicht werden könnte. Hu et al. (Human Gene Therapy 691-700 (2007)) und Mitchell et al. (Plos Biology, e234, 2004) zeigen, dass ASLV nicht dazu neigt, sich vorzugsweise innerhalb oder in der Nähe von Proto-Onkogenen zu inserieren, insbesondere ohne deutliche Präferenz für promoternahe Bereiche. Demzufolge ist die Gefahr zur Insertionsmutagenese im Vergleich zu den klinisch verwendeten Vektorsystemen vom murinen Leukämievirus (MLV) und humanem Immundefϊzienzvirus (HIV) als geringer einzuschätzen. Es wird angedeutet, dass eine Deletion der Verstärkerregion (Enhancer) im LTR oder das Verhindern des Hindurch- Transkribierens über ein Terminationssignal wünschenswert wäre. Aufgrund der Vektorarchitektur (1 Plasmid, replizierend) ist dieses System für klinische Anwendungen i.d.R. nicht geeignet.

Hu et al. zeigen, dass von ASLV abgeleitete virale Vektoren mit intakten LTRs in Säugerzellen nicht replizieren. Die genaue Ursache hierfür ist unklar.

Aufgrund der retroviralen Architektur von 2 LTRs haben Retroviren intrinsisch schwache polyA-Signale. Für lentivirale Vektoren ist bekannt, dass das Hindurch-Transkribieren vom 3' Ende des inserierten viralen Vektors zur unerwünschten Genaktivierung führen kann, so zum Beispiel Zaiss et al. (Journal of Virology 7209-7219 (2002)) und Schambach, Baum et al. (Molecular Therapy 2007, 15(6): 1167-73). Dies ist auch deshalb bedeutsam, weil die U3 Region neben Promotor-/Enhancer-Elementen auch Polyadenylierungsverstärker enthält und so etwaige Deletionen für jede Virus familie neu in puncto residuale Enhanceraktivität und Effizienz der Polyadenylierung zu validieren sind.

Für gammaretrovirale Vektoren schlagen Kraunus et al. (Gene Therapy 568-1578 (2004)) vor, den vollständigen Bereich des Enhancerelements und Promoters der 3' U3 -Region zu deletieren und nur die ersten 22 bp stromaufwärts des Enhancers und die letzten 14 bp stromabwärts zu belassen. Bei ASLV bzw. Rous Sarkoma Virus (RSV) wird die LTR-Region durch eine sehr kurze R-Region verkompliziert, so dass das polyA Signal (AATAAA) in der U3-Region zu liegen kommt. Dies ist für Retroviren sehr ungewöhnlich (sonst in der R- Region lokalisiert) und erschwert die Konstruktion eines SIN Vektors.

Aubert et al. ( The J. of Cell Biology 113, 497-506 (1991) und Flamant et al. (Journal of General Virology 74, 39-46 (1993)) beschreiben Deletionen der U3-Region von ALV von -149 bis -15, relativ zur R-Region bzw. von -149 bis -15, und -98 bis -59, ebenfalls relativ zur R-Region. In allen diesen U3-Regionen sind noch restliche Enhancer-Elemente enthalten (Cullen et al, MCB 1985, 438-47), was problematisch für mögliche klinische Anwendungen ist. Denn diese Enhancerelemente können per Insertionsmutagenese möglicherweise benachbarte Gene fehlregulieren (z.B. Onkogene).

Aufgabe der Erfindung

Der Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein klinisch einsetzbares Split-packaging- System für die Produktion in Säugetierzellen (z.B. humane Zellen, beispielsweise HEK293T) mit einem viralen Vektor und Helferplasmiden bereitzustellen, mit dem der virale Vektor als viraler Partikel verpackt hergestellt werden kann, bei dem das Risiko der Rekombination zu einem replikationskompetenten Retrovirus (RCR) minimiert ist, und auch das Risiko minimiert ist, dass die Insertion des viralen Vektors zur Aktivierung benachbarter Gene der Zielzelle (Insertionsmutagenese) führt. Vorzugsweise soll der virale Vektor, bzw. das System mit Helferplasmiden überdies die Erzeugung viraler Partikel mit hohem Titer erlauben, wobei der virale Vektor eine Expressionskassette enthalten können soll, von welcher ein Transgen und genregulatorische Sequenzen (z.B. shRNA, miRNA etc.) effizient transkribiert und/oder translatiert werden. Vorzugsweise werden diese Vektoren mit klinisch einsetzbaren Hüllproteinen (z.B. RDl 14/TR, MLV amphotropes env, Glykoprotein des vesikulären Stomatitisvirus (VSVg)) pseudotypisiert. All diese Kriterien sind in Kombination angestrebt, da sie für mögliche klinische Anwendungen essentiell sind.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung löst diese Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche und insbesondere mit einem Vektor, der die angestrebten Eigenschaften aufweist. Von einem Plasmid kann eine virale RNA gemäß den Ansprüchen transkribiert werden, die einen viralen Vektor auf Basis von ASLV bereitstellt, deren 3 -U3 -Region eine selbst inaktivierende 3 '-LTR (SIN-LTR) erzeugt bzw. ist, sowie den viralen Partikel, der eine den viralen Vektor kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, insbesondere RNA. Weiterhin stellt die Erfindung ein System mit einem ersten Helferplasmid, das in einer Expressionskassette die kodierende Sequenz für das gag-pro-pol-Fusionsprotein von ASLV kodiert, und mit einem zweiten Helferplasmid bereit, das in einer Expressionskassette ein Hüllprotein (env) kodiert, z.B. env von ASLV, RDl 14/TR, MLV-Amphotrop, VSVg oder MLV-Ecotrop.

Bei Anwesenheit von erstem und zweitem Helferplasmid in einer eukaryotischen Zelle, nachfolgend auch als Verpackungszelle bezeichnet, werden virale Partikel mit hohem Titer erzeugt, deren virale RNA wegen der Deletionen in der während der reversen Transkription zur viralen DNA aus der 3 '-U3 -Region entstehenden 5 '-U3 -Region in einer Zielzelle selbst inaktivierend (SIN) sind, jedoch eine hohe Transkriptionsrate und effiziente Translation des Transgens erlauben, das in einer Expressionskassette in 5 ' vor dem 3 '-SIN-LTR angeordnet ist. In dieser Konfiguration ist die Aktivierung benachbarter genomischer Sequenzen durch die Insertion des viralen Vektors signifikant reduziert. Die Verminderung der Aktivierung benachbarter Sequenzen ist für γ-retro virale Vektoren von Zychlinski et al. (Mol. Ther. 16: 718-725 (2008)) gezeigt worden.

Mutationen, die für virale SIN- Vektoren auf Basis anderer Retroviren, beispielsweise Lentiviren, bekannt sind, welche die Eigenschaften des hohen Titers in Verpackungszellen einerseits, keine Promotoraktivität im LTR, sowie eine effiziente Transkription eines Transgens aus einer Vektor-internen Expressionskassette ohne Hindurch-Transkription in genomische Sequenzen am Insertionsort kombinieren, lassen sich nicht auf die Konstruktion von SIN-LTR- Vektoren auf Basis von ASLV übertragen. Denn die Anordnung funktionaler Elemente in den einzelnen Viren und deren Zusammenwirken mit zellulären Wirtsfaktoren sind nicht miteinander identisch, und die Auswirkungen der Veränderung von Sequenzen auf den Titer, die Verhinderung der Aktivierung benachbarter genomischer Sequenzen am Insertionsort und auf eine Transkription des Transgens aus einer internen Expressionskassette lassen sich nicht vorhersagen.

Der erfindungsgemäße virale Vektor enthält anstelle des Wildtyp-LTRs einen 3 '-LTR, dessen U3- Region über einen großen Abschnitt deletiert ist, sodass die transkriptionelle Aktivität der Promo tor- und Enhancer-Regionen der U3 -Region im Wesentlichen, vorzugsweise vollständig ausgeschaltet bzw. eliminiert ist. Die Eliminierung der Promotor- und Enhancer- Regionen der U3-Region ist z.B. durch Deletion bzw. Ersatz von Nukleotiden dieses Bereichs mittels eines Aktivitätstests bestimmt, wenn die Promotoraktivität der deletierten bzw. ersetzten U3 -Region für ein anschließend funktional in 3' angeordnetes Reportergen auf dem Niveau der Hintergrundaktivität eines promotorlosen Reportergens ist, wie z.B. mit vollständig deletierter U3 -Region. Insbesondere weist erfϊndungsgemäß die U3 -Region von den 229 Nukleotiden der Wildtyp-U3 Region (Seq. ID Nr. 1) von ASLV nur die Nukleotide 1-27 und die Nukleotide 187-229 auf, vorzugsweise nur die Nukleotide 1-27 und 207-229. Diese veränderte 3'- U3 -Region des erfmdungsgemäßen viralen Vektors, bei der von der Wildtyp-U3 Region die Nukleotide 28-186 deletiert sind, und vorzugsweise zusätzlich die Nukleotide 187-202 deletiert sind, weist nach reverser Transkription und Integration in das Genom einer Zielzelle im Wesentlichen keine Promotor- und/oder Enhanceraktivität auf. Die verpackbare virale RNA wird durch einen starken, in 5 ' angeordneten Promotor getrieben, welcher im Zuge der reversen Transkription verloren geht, bzw. nicht in der durch Transkription erzeugten viralen RNA enthalten ist. Dies erlaubt die Erzeugung eines Transkripts, das in Verbindung mit einem ersten und zweiten Helferplasmid zur Erzeugung viraler Partikel mit hohem Titer geeignet ist, die die virale RNA enthalten.

Die Deletion von Promotor- und Enhancer-Regionen kann optional durch eine Insertion mit einer Nukleotidsequenz ersetzt sein, die keine Promo tor- oder Enhanceraktivität aufweist.

Der 3 '-SIN LTR des erfϊndungsgemäß en Vektors kann aus den vorgenannten Abschnitten der deletierten Wildtyp-U3 -Region, einer Wildtyp-R-Region und einer Wildtyp-U5 -Region bestehen. Die erfindungsgemäß U3 -Region mit Deletionen kann optional zwischen den verbleibenden Abschnitten der Wildtyp-U3 -Region zusätzliche Nukleotidsequenzen ohne Promotoraktivität enthalten, die beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt sind, die miRNA, shRNA, Po lyadenylierungs Verstärker (USE), Rekombinaseerkennungssequenzen (z.B. LoxP, Rox, FRT) und Isolatorelemente (z.B. cHS4) umfasst.

Zur Insertion von Nukleotidsequenzen ohne Promotoraktivität in die erfϊndungsgemäße U3- Region weist diese vorzugsweise eine einmalige Schnittstelle für eine Restriktase auf, insbesondere bevorzugt dadurch, dass die Nukleotide 187-190 in der Nummerierung der Wildtyp-U3 Region durch Mutation die Basenfolge CGTA ergeben, wodurch eine sekundäre Schnittstelle für SnaBI mit der Erkennungssequenz TACGTA erzeugt wird.

Als Alternative zur Deletion der Nukleotide 187-202 können auch die Nukleotide 200-206 (TATTTAA) mutiert werden, beispielsweise zur Sequenz TGTCTAA. Es wird vermutet, dass die Nukleotide 200-206 die TATA-Box der Wildtyp-U3 Region bilden, sodass eine Mutation, die die diese TATA-Box verändert, diesen Teil der Promo toraktivität der U3 -Region reduziert bzw. abschafft.

Die erfindungsgemäße deletierte U3-Region weist noch eine Integrase-Angriffsstelle (integrase attachment) auf, insbesondere in Nukleotiden 1-25, sowie ein PolyA-Signal, z.B. an Nukleotiden 223-228, jeweils in der Nummerierung der Nukleotide der Wildtyp-U3 -Region. Es wird vermutet, dass die Beibehaltung der Integrase-Angriffsstelle und des polyA-Signals wichtig für die virale Infektion sind. Überraschenderweise erlaubt der erfindungsgemäße Vektor einerseits eine Produktion viraler Partikel mit hohem Titer in einer Verpackungszelle bzw. Verpackungzelllinie, andererseits nach reverser Transkription und Integration in das Genom in einer Zielzelle eine effiziente Transkription eines Transgens aus einer Expressionskassette von einem internen starken Promotor, ohne dass eine Hindurch- Transkription über die 3 '-SIN-LTR in angrenzende Regionen der Integrationsstelle oder die Aktivierung angrenzender genomischer Sequenzen erfolgt.

In Verpackungszellen erzeugte virale Partikel, die virale RNA mit einer erfmdungsgemäßen 3 '-SIN LTR, bzw. einer erfindungsgemäßen 3 -U3 -Region enthielten, wiesen ohne Aufkonzentration Titer von ca. 1x10 ⁶ infektiöse Partikel /mL auf. Dabei wurde der Titer von dem das gag-pro-pol-Fusionsprotein bzw. das Hüllprotein kodierenden Gen des ersten bzw. zweiten Helferplasmids, bzw. der Verpackungzelllinie beeinflusst, und nicht signifikant von der Art oder dem Ausmaß der Deletion in der U3-Region.

Überraschenderweise war die Expression eines Transgens von einer Expressionskassette bei erfindungsgemäßen viralen Vektoren mit SIN-Deletion etwa um den Faktor 3 höher als in einem Vergleichsvektor, bei dem der 3 '- LTR eine U3-Region mit Wildtyp-Sequenz aufwies. Erfϊndungsgemäß ist weiterhin bevorzugt, dass die kodierenden Sequenzen des ersten und/oder zweiten Helferplasmids kodonoptimiert sind, sodass die viralen Kodons gegen Kodons der Zielzelle ersetzt sind, insbesondere gegen humane Kodons ausgetauscht sind, z.B. in Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer viraler Partikel und viraler Vektoren, die z.B. Verwendung als Medikament oder in der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen finden. Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Helferplasmid enthält eine das gag-pro-pol-Fusionsprotein kodierende Sequenz, in der virale Kodons an den humanen Kodongebrauch angepasst sind. In der Verwendung als Medikament kann der virale Partikel, der den viralen Vektor enthält, zur Verabreichung z.B. an einen Patienten/Menschen oder ein nicht-menschliches Tier hergerichtet sein. Alternativ kann der virale Partikel bzw. der virale Vektor mit Zellen kontaktiert werden, die einem solchen Patienten entstammen, d.h. zur in vitro Transduktion von Zellen, die anschließend, wahlweise mit dem Schritt der Kultivierung und/oder Selektion, als transduzierte Zellen zur Übertragung in einen Patienten hergerichtet bzw. bereitgestellt werden, wobei vorzugsweise der Patient derselbe ist, dem die Zellen entstammen.

Bei der kodon-optimierten kodierenden Sequenz für das gag-pro-pol-Fusionsprotein ist erfϊndungsgemäß die ursprüngliche Verschiebung des Leserahmens um -1 und der Übergang von pro zu pol vom Wildtyp- ASLV beibehalten worden.

Es hat sich gezeigt, dass die Anpassung des Kodongebrauchs von ASLV an den Kodongebrauch der Zielzelle, insbesondere an den humanen Ko dongebrauch, für die kodierenden Bereiche der Helferplasmide eine signifikante Steigerung des Titers viraler Partikel zur Folge haben, wobei z.B. allein die Anpassung des Kodongebrauchs des Fusionsproteins gag-pro-pol an den humanen Kodongebrauch zu einem um den Faktor 50 höheren Titer viraler Partikel in humanen Verpackungszellen führt.

Die Anpassung des Kodongebrauchs an den humanen Kodongebrauch erfolgt vorzugsweise dadurch, dass vorzugsweise die für Homo sapiens optimalen, nicht-limitierten tRNA Pools ausgeschöpft werden; so wurde z.B. das Glycin-Kodon GGT vorzugsweise zu GGC adaptiert. Desweiteren wurden negative RNA-Instabilitätsmotive sowie kryptische Polyadenylierungs- stellen sowie RNA- Sekundär strukturen entfernt, so dass eine stabilere mRNA mit besserer Translatierbarkeit in humanen Zellen generiert wurde. Überdies wurde in der kodierenden Sequenz die natürliche Spleißdonorstelle, die Spleißakzeptorstelle und weitere kryptische Spleiß-signale unwirksam gemacht. Folglich weist ein bevorzugtes Helferplasmid eine inaktive Spleißdonorstelle im gag-pol-Gen auf, z.B. entsprechend Nukleotiden 1501 bis 1502 in Seq. ID Nr. 14. Bevorzugt wird gag von den Nukleotiden 1475 bis 3436 von Seq. ID Nr. 14 kodiert und pol von Nukleotiden 3738 bis 6291 von Seq. ID Nr. 14, da in diesen Abschnitten kryptische RNA-Instabilitätsmotive und Polyadenylierungsstellen sowie RNA- S ekundär strukturen im Wesentlichen entfernt sind, so dass ein hoher Titer viraler Partikel erzeugt werden kann, die eine hohe Transduktionseffϊzienz aufweisen. Schließlich ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass der virale Vektor, bevorzugt zusätzlich das erste Helferplasmid und weiter bevorzugt zusätzlich das zweite Helferplasmid, keine Sequenzhomologien zur Zielzelle aufweisen, und überdies bevorzugt insbesondere keine Sequenzüberlappung haben, z.B. keine zueinander homologen Sequenzabschnitte von mehr als 5 Nukleotiden, vorzugsweise keine zueinander homologen Sequenzabschnitte von mehr als 10 bis 20 Nukleotiden. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit für eine Rekombination in Verpackungszellen und/oder den Zielzellen minimiert, und damit auch die Wahrscheinlichkeit der Generierung von RCR.

Die Erfindung stellt damit eine virale RNA zur Verfügung, die von 5 ' nach 3 ' eine 5 -R- Region und 5'-U5-Region, eine Primerbindungsstelle (PBS), ein Verpackungssignal (Ψ), das im Gegensatz zum Stand der Technik bei gammaretroviralen oder lentiviralen Vektoren ohne einen retroviralen Spleißdonor auskommt, eine Expressionskassette für ein bzw. mit einem Transgen und einer erfindungsgemäß verkürzten (gekennzeichnet als Δ oder d) 3 '-U3 -Region, einer 3 '-R-Region und einem angehängten PoIy A- Abschnitt (PoIy A-Schwanz) aufweist oder daraus besteht, sowie einen Vektor zur Transkription der viralen RNA, der zusätzlich zu einer Nukleinsäuresequenz, die die virale RNA kodiert, in 5 ' vor deren 5 '-R-Region einen eukaryotischen bzw. viralen Promotor aufweist, und bei dem die Nukleinsäuresequenz, die die virale RNA kodiert, in Form von DNA vorliegt, die im 3 '-SIN-LTR einen PoIyA- Abschnitt aufweist.

Weiterhin stellt die Erfindung die Verwendung der viralen RNA und eines die virale RNA enthaltenden viralen Partikel als Medikament und zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung für die Transduktion von Zielzellen, z.B. von somatischen Zellen eines Menschen bereit, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die die virale RNA oder die virale RNA enthaltende virale Partikel umfassen, und die Verwendung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen als Medikament zum Transfer des Transgens in Zellen, insbesondere zur Gentherapie.

Weiterhin betrifft die Erfindung Zellen, die eine integrierte oder nicht- integrierte Nukleinsäuresequenz aufweisen, die durch Kontaktierung mit erfindungsgemäßen viralen Partikeln erzeugt sind und eine erfindungsgemäße U3-Region enthalten, z.B. einen DNA- Abschnitt, der durch reverse Transkription aus einer erfindungsgemäßen viralen RNA entstanden ist. Dies können extrakorporale oder intrakorporale tierische Zellen sein, ausgenommen menschliche Keimzellen.

Die Expressionskassette weist einen Promotor und zumindest eine transkribierbare und/oder translatierbare Sequenz eines Transgens auf, das ein zur Zielzelle homologes oder heterologes Gen sein kann, und vorzugsweise stromabwärts der transkribierbaren Sequenz des Transgens ein PRE oder andere posttranskriptionell regulatorische Nukleinsäureabschnitte oder -module. Die transkribierbare Sequenz kann auch interne Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) in Verbindung mit stromabwärts zu diesen angeordneten, Protein kodierenden Sequenzen aufweisen, sowie andere funktionale Nukleinsäureabschnitte oder enzymkodierende Nukleinsäureabschnitte (z.B. bidirektionale Promotoren, kodierende Sequenzen für 2A- Protease- Schnittstellen oder 2A-Protease-Gene). Weiter optional kann in die deletierte 3'-U3- Region, z.B. in die darin enthaltene Restriktionsschnittstelle, eine Isolatorsequenz eingefügt werden, die eine Wechselwirkung des Transgens mit benachbarten genomischen Sequenzen abschwächt, oder eine Rekombinaseerkennungssequenz eingesetzt sein, z.B. eine Erkennungssequenz aus der Gruppe, die rox, loxP, FRT umfasst. Nach erfolgter reverser Transkription und Kopieren in den 5 '-LTR kann durch Zugabe bzw. Expression von Rekombinase in Zielzellen die Rekombinaseerkennungssequenz aktiviert werden, und z.B. ein zwischen Rekombinaseerkennungssequenzen angeordneter Nukleinsäureabschnitt in der integrierten DNA (z.B. ein Teil der Expressionskassette) umgedreht oder entfernt werden. Andere Sequenzen, die in die 3' U3 Region eingefügt werden können, umfassen beispielsweise micro-RNA-Zielsequenzen, small hairpin RNAs oder Sequenzabschnitte, die den Nachweis der Insertion über PCR erleichtern.

Die im erfϊndungsgemäßen 3 '-SIN-LTR enthaltene deletierte U3-Region erlaubt trotz der Deletion der Enhancer- und Promo torelemente aus der Wildtyp-U3 -Region die Erzeugung von viralen Partikeln mit Titern, die gegenüber den Titern für Vektoren mit Wildtyp-LTR in Verpackungszellen erreicht werden, sodass die häufig bei Deletionen von U3-Regionen beobachteten drastischen Reduktionen des viralen Titers vermieden werden.

Die Transkription von Transgenen, die in der Expressionskassette angeordnet sind, wird durch den Promotor der Expressionskassette kontrolliert, der auch interner Promotor genannt wird. Derzeit wird angenommen, dass die erfindungsgemäß deletierten U3-Regionen ein Po IyA- Signal aufweisen, das ein Hindurch-Transkribieren über die Vektorsequenz hinaus vermeidet, und das korrekte PolyA-Signal nutzt. Diese Annahme wird durch die 3-fach bessere Expression eines Transgens der Expressionskassette eines erfindungsgemäßen Vektors im Vergleich zur Expression des Transgens von einem Vektor mit 3 '-LTR vom Wildtyp gestützt.

Besonders bevorzugt weist die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen viralen Vektors eine vollständige Deletion der für virale Strukturproteine kodierenden Sequenzen einschließlich der Spleißdonorstelle (SD) auf, z.B. eine vollständige Deletion der Sequenzen gag, env, pol und src. Es hat sich gezeigt, dass bei ASLV- Vektoren mit Deletion der die viralen Strukturproteine kodierenden Sequenzen auch die Spleißdonorstelle deletiert wird. Überraschender Weise hat sich gezeigt, dass ein solcher Vektor auf Basis von ASLV die Verpackung der viralen RNA in Verpackungszellen mittels des Split-Packaging-Systems erlaubt. Dies ist insofern unerwartet, als in bekannten retroviralen Vektoren Anteile der kodierenden viralen Sequenzen für die Verpackung erforderlich sind, da im Bereich der die viralen Strukturproteine kodierenden Sequenzen Signale für den RNA-Export, die Wechselwirkung mit dem viralen Nukleocapsid und die reverse Transkription enthalten sind, wie z.B. in HIV. Daher kann der erfindungsgemäße Vektor das Verpackungssignal (Ψ), das in Seq.-ID No. 5 durch die Nukleotide 1042 - 1292 umfasst ist, ohne Abschnitte von Sequenzen enthalten, die virale Strukturproteine kodieren.

Die erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform, in der die Nukleinsäuresequenz des viralen Vektors keinen viralen Spleißdonor aufweist, ist ein bedeutender Unterschied zu bekannten lentiviralen oder γ-retro viralen Vektoren, die den natürlichen viralen Spleißdonor stromabwärts der Primerbindungsstelle aufweisen. Diese bekannten Vektoren benötigen den Spleißdonor zur Erzeugung hoher Titer viraler Partikel. Überraschender Weise hat sich gezeigt, dass der erfindungsgemäße Vektor auch ohne seinen natürlichen oder einen anderen Spleißdonor hohe Titer in Verpackungszellen ergibt. Da der natürliche Spleißdonor von ASLV im gag-Gen liegt, führt dessen vollständige Deletion auch zur Entfernung des Spleißdonors. Weiter bevorzugt ist erfindungsgemäß auch der virale Spleißakzeptor nicht im Vektor enthalten. Der Spleißakzeptor von ASLV liegt im pol-Gen, so dass dessen vollständige Deletion auch zur Entfernung des Spleißakzeptors führt.

Beim erfϊndungsgemäßen Vektor führt die Deletion von Spleißdonor und Spleißakzeptor zur Optimierung der Produktion viraler Partikel in Verpackungszellen und verleiht dem Vektor zusätzlich eine bessere biologische Sicherheit, da die Rekombination zu replikationskompetenten Retroviren erschwert ist. Auch ist bei intragenischen Insertionen des Vektors eine mögliche Interferenz mit zellulären Spleiß Signalen weniger wahrscheinlich.

Besonders bevorzugt weist der Vektor im 5 '-Bereich eine R-Region, eine U5 -Region und das Verpackungssignal in einer Nukleinsäuresequenz auf, die keine viralen Strukturproteine kodiert, und an welche sich z.B. unmittelbar, insbesondere nach der Leaderregion, in 3 ' die Expressionskassette des Transgens anschließt. Es hat sich gezeigt, dass der virale Vektor an seinem 5 '-Ende eine R-Region, U5 -Region und ein Verpackungssignal aufweisen kann, das von den Nukleotiden Nrn. 1042 bis 1292 der Seq.-ID Nr. 5 umfasst ist oder daraus besteht, wobei vorzugsweise in 3 ' angrenzend an diese Sequenz die Expressionskassette mit dem Transgen angeordnet ist.

Für die Zwecke der Erfindung werden die Anordnungen von genetischen Elementen in 5 ' nach 3 ' angegeben, sofern nicht anders beschrieben; Nukleotidsequenzen sind von 5 ' nach 3 ' angegeben.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen

- Figur 1 die schematische Struktur des ASLV- Wildtyps zeigt,

Figur 2 die schematische Struktur eines erfmdungsgemäßen SIN- Vektors und eines den Vektor enthaltenden Plasmids zeigt,

- Figur 3 die schematische Struktur eines ersten Helferplasmids zeigt, Figur 4 die schematische Struktur eines zweiten Helferplasmids zeigt,

Figur 5 einen Vergleich der Wildtyp-U3 -Region (U3) mit der erfindungsgemäß deletierten U3-Region (dU3), der erfindungsgemäß deletierten U3-Region ohne TATA- Box(dU3 no TATA) und mit der erfmdungsgemäß deletierten U3 -Region mit mutierter TATA-Box (dU3 TATAmut) zeigt,

Figur 6 eine Plasmidkarte eines erfindungsgemäßen Vektors zeigt, in dem die Expressionskassette EGFP als Beispiel für ein Transgen kodiert, - Figur 7 eine Plasmidkarte mit erfϊndungsgemäßem Vektor zeigt, in dem die TATA- Box der U3 -Region mutiert ist,

Figur 8 eine Plasmidkarte mit erfϊndungsgemäßem Vektor zeigt, in dessen U3 -Region zusätzlich die TATA-Box deletiert ist,

Figur 9 eine Plasmidkarte für ein erstes Helferplasmid zur Translation des gag-pol-

Fusionsproteins zeigt,

Figur 10 eine Plasmidkarte für ein erstes Helferplasmid zeigt, bei dem die das gag-pol-

Fusionsprotein kodierende Sequenz für eine humane Verpackungs- und/oder Zielzelle kodonoptimiert ist,

Figur 11 grafisch die Höhe der Expression eines Transgens (EGFP) von erfindungsgemäßem Vektor im Vergleich zur Expression von einem viralen Vektor mit Wildtyp-3 '-LTR zeigt,

Figur 12 grafisch die Höhe der Expression eines Transgens (EGFP) von erfindungsgemäßen SIN- Vektoren zeigt,

Figur 13 eine Darstellung der integrierten Struktur eines erfindungsgemäßen Vektors im Vergleich zur Struktur eines lentiviralen bzw. γ-retroviralen SIN- Vektors zeigt,

- Figur 14 schematisch DNA-Nukleinsäurekonstrukte für die Transkription viraler RNA mit Expressionskassetten zeigt, die funktional in 5 ' zu einem Reportergen die auf Promotor- und Enhanceraktivität zu testende Nukleinsäuresequenz enthält und

Figur 15 die Expressionshöhe des Reportergens in Zellen zeigt, die mit viraler RNA von Figur 14 transfiziert sind und die Promo tor-/Enhanceraktivität misst.

Bei der Beschreibung der erfindungsgemäßen SIN-U3 wird die Nummerierung der Nukleotide in Bezug auf die Nukleotidsequenz der Wildtyp-U3 von ASLV vorgenommen, und entsprechend sind Deletionen bzw. Abschnitte der SIN-U3 -Region entsprechend der Nummerierung der Nukleotide der Wildtyp-U3 bezeichnet.

Figur 1 zeigt den schematischen Aufbau des ASLV vom Wildtyp, bei dem die LTRs eine U3- Region, eine R-Region und eine U5 -Region aneinander angrenzend enthalten. Die LTRs sind jeweils identisch, da bei der viralen Replikation die U3 Region des 3 '-LTR an das 5 '-Ende kopiert wird sowie die R und U5 Regionen vom 5 'LTR in den 3 'LTR kopiert werden. Der Transkriptionstart +1 definiert das 5 '-Ende der 5 'R-Region. Figur 2 zeigt den erfϊndungsgemäßen Vektor auf Plasmidebene, an dessen 5 '-Ende ein Promotor vor der R-Region angeordnet ist, um die Transkription ab der 5 '-R-Region zu ermöglichen. Dieser 5 '-Promotor des 5'-LTR ist wegen des Transkriptionstarts bei +1 als erstem Nukleotid der 5 '-R-Region nicht in der viralen RNA enthalten; die virale RNA, die erzeugt wird, besteht aus den Bereichen zwischen dem Nukleotid +1 der 5 ' R-Region und dem 3 '-Ende der 3 '-R-Region plus polyA-Schwanz. Entsprechend enthalten virale Partikel eine virale RNA, die aus dem Abschnitt des Vektors entsteht, der die 5 '-R-Region (einschließlich Nukleotid +1) bis zum 3 '-Ende der 3 '-R-Region umfasst, mit anhängendem PolyA-Schwanz. Der in Figur 2 stromaufwärts der 5 '-R-Region gezeigte Promotor des viralen Vektors, der vorzugsweise aus einem SV40-Enhancer und einer U3 -Region vom Wildtyp des RSV (Rous Sarcoma Virus) besteht, wird nicht Bestandteil der viralen RNA, sondern steuert die effiziente Transkription der viralen RNA von einer Figur 2 entsprechenden DNA- Sequenz. Vorliegend ist der Vektor aus Plasmidebene gezeigt, als eine die virale RNA kodierende DNA-Sequenz, die Bestandteil eines Plasmids sein kann, von dem die virale RNA transkribiert wird.

Wie in Figur 2 angedeutet, enthält der virale Vektor zwischen den LTRs, und entsprechend nach der Leaderregion, eine Expressionskassette, die zumindest einen internen Promotor aufweist, beispielsweise den Promotor von SFFV und EFS (Elongationsfaktor lα), mit einer Nukleotidsequenz, die ein Transgen (Gen) kodiert, vorzugsweise mit einem in 3 ' angeordneten PRE.

Das PRE, das vorzugsweise WPRE ist, der Expressionskassette weist vorzugsweise eine X- ORF Deletion auf und/oder ATG-Mutationen.

Der erfmdungsgemäße Vektor und die erfϊndungsgemäße virale RNA weisen zumindest im 3'-LTR eine U3-Region mit Deletionen auf, die jegliche Promotoraktivität des LTRs ausschalten. In 5 ' vor dem 3 '-SIN-LTR und/oder innerhalb der 3 '-U3-Region kann der erfindungsgemäße virale Vektor homologe und/oder heterologe genetische Elemente enthalten, beispielsweise Sequenzen, die miRNA, shRNA, Po lyadenylierungs Verstärker, Rekombinaseerkennungssequenzen, USE und/oder Isolatoren umfassen. Zwischen den Elementen des 5 '-LTR und des 3 '-LTR, vorzugsweise zwischen den Regionen des 5 '-LTR und der Expressionskassette, weist der erfϊndungsgemäße Vektor vorzugsweise eine Primerbindungsstelle und ein Verpackungsignal (Ψ) auf.

Im Unterschied zu replikationskompetenten Retroviren weist der erfϊndungsgemäße virale Vektor keine Sequenzen auf, die für gag-pol und/oder Hüllproteine kodieren.

Die viralen Proteine, die zur Erzeugung eines viralen Partikels der viralen RNA erforderlich sind, werden von separaten Helferplasmiden kodiert, vorzugsweise einem ersten Helferplasmid, das eine für das gag-pro-pol-Fusionsprotein kodierende Sequenz in einer Expressionskassette zwischen einem Promotor und einer Polyadenylierungssequenz aufweist, wie in Figur 3 gezeigt, und einem zweiten Helferplasmid, das eine das Hüllprotein (env) kodierende Sequenz in einer Expressionskassette enthält, beispielsweise wie in Figur 4 gezeigt zwischen einem Promotor aus CMV (Cytomegalie- Virus) und einer Polyadenylierungsequenz. Zur Pseudotypisierung kann die das Hüllprotein kodierende Sequenz aus einer Sequenz bestehen, die das Hüllprotein von MLV Ecotrop/Amphotrop, VSVg, RDl 14, GALV oder Chimären dieser kodieren, z.B. RDl 14/TR.

Das erste Helferplasmid weist in seiner kodierenden Sequenz vorzugsweise die Leserahmenverschiebung um -1 zwischen dem 3 '-Ende der gag-pro kodierenden Sequenz und dem 5 '-Ende der pol kodierenden Sequenz auf, was in Figur 3 durch die zueinander versetzten Kästen für gag-pro bzw. pol gezeigt ist.

Besonders bevorzugt sind die kodierenden Sequenzen der Helferplasmide an den Kodongebrauch der Zielzelle angepasst, d.h. kodonoptimiert, da sich für die Erfindung gezeigt hat, dass der Titer sich durch diese Kodonoptimierung für das gag-pro-pol- Fusionsprotein, vorzugsweise auch für das Hüllprotein env eine Erhöhung des Titers in Helferzellen um ca. den Faktor 50 ergibt. Daher ermöglicht die Erfindung ein Produktionsverfahren in Titern bzw. Mengen viraler Partikel, wie sie für klinische Anwendungen erforderlich sind, durch Herstellung viraler Partikel, die die erfindungsgemäße virale RNA enthalten, mit erstem und zweitem Helferplasmid, z.B. durch Kultivieren einer Verpackungszelle. Figur 5 zeigt eine Übersicht über die bevorzugten Sequenzen der erfϊndungsgemäßen 3 '-U3- Region des viralen Vektors im Vergleich zur Sequenz der Wildtyp-U3 (Seq.-ID Nr. 1) von ASLV. Die erfϊndungsgemäßen U3-Regionen weisen vorzugsweise eine Deletion der Nukleotide 28-186 der Wildtyp-U3 auf. Die Ausfuhrungsform Seq.-ID Nr. 2, als Delta (d) U3 bezeichnet, besteht vorzugsweise aus den Nukleotiden 1-27 und den Nukleotiden 187-229 der Wildtyp-U3, wobei noch die Nukleotide 187 und 189 zu C bzw. T mutiert sind, sodass sich dort eine Restriktionsschnittstelle für SnaBI (TACGTA) ergibt. Diese deletierte U3-Region, auch als SIN-U3 bezeichnet, weist noch die ursprüngliche TAT A-Bo x auf, die als Nukleotide 200-206 der Wildtyp-U3 identifiziert wurde.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist auch die TATA-Box der SIN-U3 mutiert, sodass die Funktion einer TATA-Box aufgehoben ist. Eine bevorzugte Ausführung einer mutierten TATA-Box ist in Seq.-ID Nr. 3 (dU3 TATAmut) gezeigt, bei der die Nukleotide 201-203 mutiert sind, sodass die Funktion der TATA-Box zerstört ist.

In einer bevorzugteren Ausführungsform umfasst die Deletion in Bezug auf die Wildtyp-U3- Region die Nukleotide 28-205 (dU3 noTATA; Seq.-ID Nr. 4), wobei die Nukleotide 203-204 mutiert sind, um die Erzeugung einer TATA-Box durch die aneinander angrenzenden Abschnitte zu vermeiden, und/oder um eine Schnittstelle an den aneinander angrenzenden Nukleotiden 26-27 und 203-206 herzustellen, beispielsweise durch Mutation der Nukleotide 203-205 zu CGT, um eine singuläre Schnittstelle für das Restriktionsenzym SnaBI (TACGTA) herzustellen.

Erfindungsgemäße virale Vektoren umfassen daher auch Varianten, bei denen im Bereich der Deletion der Nukleotide 28-222, vorzugsweise im Bereich der Nukleotide 28-190 bzw. 28- 206 in Seq. ID Nr. 1 heterologe oder homologe, z.B. in Bezug auf die Zielzelle heterologe oder homologe genetische Elemente inseriert sein können, vorzugsweise mittels einer Restriktionsschnittstelle in den vorgenannten Abschnitten.

Beispiel 1 : Produktion viraler Partikel mit erfindungsgemäßem ASLV-SIN Vektor Als Beispiele für erfmdungsgemäße Vektoren, die für eine erfindungsgemäße virale RNA kodieren, wurden Plasmide konstruiert, die unter der Kontrolle eines Promotors, der aus einem Verstärkungselement aus SV40 (SV40 Enhancer) und dem RSV-Promotor (RSV) und unmittelbar angrenzend an den Promotor die R-Region, die U5 -Region, eine Expressionskassette für ein Transgen und einen 3'-SIN-LTR aus einer erfindungsgemäßen SIN-U3 -Region, einer R-Region und einer U5-Region aufwies. Die Expressionskassette umfasste den U3-Promotor des Spleen-Focus-Forming Virus (SFFV), eine für EGFP kodierende Sequenz als Beispiel für ein Transgen, und ein WPRE (PRE).

Die SIN-U3-Region entsprach der Seq.-ID Nr. 2 für den in Figur 6 gezeigten Vektor, alternativ der Seq.-ID Nr. 3 für den in Figur 7 gezeigten Vektor, bzw. der Seq.-ID Nr. 4 für den in Figur 8 gezeigten Vektor.

Die Sequenz des Vektors von Figur 6 ist Seq.-ID Nr. 5 enthalten. Entsprechend enthält ein erfindungsgemäßer Vektor, bzw. ein Plasmid, das eine erfindungsgemäße RNA kodiert, einen 3 '-SIN-LTR mit einer Sequenz entsprechend Nukleotiden 3282-3452 von Seq.-ID Nr. 5. Die davon transkribierte virale RNA enthält die darin enthaltene erfindungsgemäße 3'-U3-Region.

Die Sequenz des Vektors von Figur 7 ist Seq.-ID Nr. 9 enthalten. Entsprechend enthält ein erfindungsgemäßer Vektor, von dem eine erfmdungsgemäße virale RNA transkribiert wird, einen 3 '-SIN-LTR mit einer Sequenz entsprechend den Nukleotiden 3282 - 3452 von Seq.-ID Nr. 9. Die virale RNA enthält am 3'-SIN-LTR die erfϊndungsgemäße 3'-U3-Region und R- Region, nicht jedoch die U5-Region.

Die Sequenz des Vektors von Figur 8 ist Seq.-ID Nr. 7 enthalten. Entsprechend enthält ein erfindungsgemäßer Vektor, von dem eine erfϊndungsgemäße virale RNA transkribiert wird, einen 3 '-SIN-LTR mit einer Sequenz entsprechend den Nukleotiden 3282 - 3436 von Seq.-ID

Nr. 7.

Weiter bevorzugt enthält ein viraler Vektor, bzw. eine virale RNA eine Wildtyp-R-Region und eine Wildtyp-U5 -Region als 5 '-LTR, und unmittelbar in 5 ' daran angrenzend, in der Form, in der die Nukleotidsequenz für die virale RNA auf einem Plasmid enthalten ist, einen eukaryotischen oder viralen Promotor, vorzugsweise die Verstärkungssequenz aus SV40 in Verbindung mit dem Promotor aus RSV, entsprechend Nukleotiden 452-921 aus Seq.-ID Nr. 9. Die für eGFP kodierende Sequenz der Seq.-ID Nr. 5 ist als Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 6 angegeben, eGFP aus Seq.-ID Nr. 7 als Seq.-ID Nr. 8, und eGFP aus Seq.-ID Nr. 9 als Seq.- ID Nr. 10.

Zur Erzeugung viraler Partikel wurden die Plasmide nach Figuren 6 bis 8 in einer HEK293T- Zellen eingebracht, die mittels transienter Transfektion oder stabiler Integration auch ein erstes Helferplasmid zur Expression des gag-pol-Fusionsproteins von ASLV enthielten. Eine schematische Plasmidkarte ist in Figur 9 gezeigt, die Sequenz ist als Seq.-ID Nr. 11 beigefügt und enthält als kodierende Sequenz das gag-pol-Fusionsprotein bei Nukleotiden 1475-6291. Die von Seq.-ID Nr. 11 kodierte Aminosäuresequenz von gag entspricht Seq.-ID Nr. 12, die von Seq.-ID Nr. 11 kodierte Aminosäuresequenz von pol entspricht Seq.-ID Nr. 13.

Besonders bevorzugt war das erste Helferplasmid mit einer kodierenden Sequenz für das gag- pol-Fusionsprotein versehen, dessen Kodons an den Kodongebrauch der Verpackungszelle, insbesondere von Säugerzellen, wie z.B. menschliche Zellen angepasst waren. Ein solches Plasmid ist schematisch in Figur 10 gezeigt; die Nukleinsäuresequenz ist als Seq.-ID Nr. 14 enthalten. Entsprechend enthält ein bevorzugtes erstes Helferplasmid, bzw. eine menschliche Verpackungszelle in integrierter Form die kodierende Sequenz für das ko donoptimierte gag- Protein entsprechend Nukleotiden 1475-3436 von Seq.-ID Nr. 14, dessen Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 15 entspricht, und/oder die kodierende Sequenz für das ko donoptimierte pol- Protein entsprechend Nukleotiden 3738-6291 von Seq.-ID Nr. 14, dessen Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 16 entspricht, bevorzugt die kodierende Sequenz für das ko donoptimierte gag- pol-Fusionsprotein entsprechend Nukleotiden 1475-6291 der Seq.-ID Nr. 14.

Unter üblichen Kultivierungsbedingungen der Verpackungszellewurden für die erfindungsgemäßen viralen Partikel mit einer der gezeigten SIN-U3 -Regionen von den Vektoren der Seq.-ID Nr. 7, 9 oder 11 jeweils gleiche Titer erhalten, wie für ein Vergleichkonstrukt (nicht gezeigt), bei dem die 3 '- U3-Region dem Wildtyp von ASLV entsprach, nämlich ca. 1 x 10 ⁶ /mL.

Es ist daher für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung viraler Partikel bevorzugt, dass die Verpackungszellen kultivierte humane Zellen sind, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die die viralen Strukturgene, z.B. gag-pol, mit humanem Kodongebrauch kodiert, wobei diese Strukturgene bevorzugt keine aktive Spleißdonor und/oder Spleißakzeptorstelle aufweisen, um ein Spleißen innerhalb der kodierenden Sequenzen zu verhindern und damit eine hohe Expression in den Verpackungszellen zu erreichen.

Zur Kontrolle der Transfektion von Zielzellen mit viraler RNA wurden menschliche HT 1080 Fibroblasten infiziert. Im Anschluss an die Kultivierung nach der Transfektion wurde die Expression des Transgens (EGFP) per FACS bestimmt. Beim Vergleich mit viralen Partikeln, deren 3 '-LTR vom Wildtyp-ASLV war, konnte für die erfindungsgemäßen viralen Vektoren mit 3 'SIN-LTR eine um den Faktor 3 höhere Expression des Transgens gezeigt werden.

Figur 11 zeigt die Expression des beispielhaften Transgens EGFP von einer Expressionskassette entsprechend Figur 7 in Zielzellen, die mit viralem Vektor transduziert waren. Virale Partikel wurden aus dem Überstand von Verpackungszellen (pseudotypisiert mit VSVg) gewonnen, die ein Plasmid enthielten, das erfindungsgemäße virale RNA gemäß Seq.-ID Nr. 5 kodierte (ASLV dU3, helle rechte Balken), bzw. eine virale RNA mit 3 '-U3 vom Wildtyp (ASLV U3, dunkle linke Balken; Wildtyp U3 s. Seq.-ID Nr. 1). Zur Transduktion wurden virale Partikel auf HT1080E-Zellen titriert, 6 Tage kultiviert und anschließend durchflußzytometrisch analysiert. In Experiment 1 war das gag-pol- Fusionsprotein vom Wildtyp (Nukleotide Nr. 1475 bis 6291 Seq.-ID Nr. 11), in Experiment 2 ko donoptimiert (Nukleotide Nr. 1475 bis 6291 in Seq.-ID Nr. 14). Das Ergebnis, dass das erfindungsgemäße virale Partikel mit einer erfindungsgemäßen 3 '-U3-Region gegenüber dem viralen Partikel mit U3 -Region vom Wildtyp eine ca. 3 -fach höhere Expression des Transgens in Zielzellen verursachte. Dies gilt sowohl für die Verwendung des Wildtyp gag/pol (Experiment 1) als auch des ko donoptimierten gag-pol Helferp lasmids (Experiment 2). In beiden Fällen kommt es zu einer etwa 3 -fachen Steigerung der Expression des Transgens in Zielzellen für erfindungsgemäße virale Partikel (dU3) im Vergleich mit den Wildtyp Vergleichspartikeln (U3).

Figur 12 zeigt die Werte der Expression des beispielhaften Transgens EGFP von einer Expressionskassette in Zielzellen, die mit viralem Vektor transduziert waren, die von einem Plasmid nach Seq. ID Nr. 5 (SIN, erfindungsgemäß), Seq. ID Nr. 9 (TATAmut) bzw. Seq. ID Nr. 7 (noTATA) transkribierte virale RNA enthielten. Wie voranstehend beischrieben, wurden virale Partikel in Verpackungszellen erzeugt, die ko donoptimiertes gag-pol- Fusionsprotein und VSVg-Hüllprotein translatierten. HT1080-Zellen wurden mit viralen Partikeln transduziert, 6 Tage kultiviert und dann per FACS analysiert. Die gezeigten Werte machen deutlich, dass die erfindungsgemäße 3'-U3-Region in allen erfϊndungsgemäßen viralen RNAs bzw. viralen Partikeln eine hohe Expressionseffϊzienz des Transgens in Zielzellen ergibt. Die Ergebnisse sind auch in der nachfolgenden Tabelle dargestellt:

Die erfϊndungsgemäß bevorzugte Ausführung des Vektors, z.B. dessen virale RNA, wahlweise in viralen Partikeln enthalten, weist keine kodierenden viralen Sequenzen auf, z.B. keine Sequenzen, die eines der Strukturgene gag, env, src oder pol vollständig oder teilweise umfassen. Daher ist bevorzugt, dass die virale RNA des Vektors, bzw. die transkribierte Nukleinsäuresequenz eines Plasmids, das die virale RNA des Vektors codiert, die 5 -R- Region, die 5 -U5 -Region und der Bereich, der das Verpackungssignal umfasst und sich bis angrenzend an die Expressionskassette des Transgens erstreckt, aus diesen Bereichen besteht, und z.B. auch keine Spleißdonorstelle enthält. Eine bevorzugte Sequenz für die 5 '-R-Region, die 5 '-U5-Region und den Bereich, der das Verpackungssignal umfasst und sich bis angrenzend an die Expressionskassette des Transgens erstreckt, umfasst die Nukleotide Nrn. 922 bis 1292 der Seq.-ID Nr. 5 oder besteht aus dieser Nukleotidsequenz. Diese Nukleotidsequenz kann optional in 3 ' verkürzt sein, z.B. um 140 nt, bevorzugt um 10 bis 56 nt.

In dieser Ausführungsform, in der der Bereich der viralen RNA an ihrem 5 '-Ende, und damit in 5 ' unmittelbar angrenzend an die Expressionskassette des Transgens, aus untranslatierten Sequenzen besteht, insbesondere aus einer R-Region, einer U5-Region und dem Verpackungssignal, sind daher keine Abschnitte von gag, env, src oder pol enthalten.

Diese Ausführungsform ist schematisch in Figur 13 gezeigt, die deutlich macht, dass dieser 5 '-Abschnitt des Vektors, der auch als Leader bezeichnet wird, deutlich kürzer als der 5 '- Bereich von lentiviralen oder γ-retroviralen SIN- Vektoren ist. Während bei lentiviralen und vielen Versionen von γ-retroviralen SIN- Vektoren das Verpackungssignal Ψ mit viralen Strukturgenen überlappt, kann überraschender Weise im erfϊndungsgemäßen alpharetroviralen Vektor das Verpackungssignal ohne kodierende virale Sequenzabschnitte enthalten sein. Daher ist der erfϊndungsgemäße Vektor (alpharetroviral SIN vector) als Gag-Free Leader bezeichnet. Überdies kann im erfϊndungsgemäßen Vektor die virale Spleißdonorstelle entfernt bzw. durch Mutation funktionslos gemacht sein. Dies ist wegen Überlappung mit Verpackungsfunktionen z.B. in lenti- oder γ-retroviralen Vektoren nur unter Minderung des Titers möglich. Weiterhin erlaubt die vollständige Entfernung kodierender viraler Sequenzabschnitte die Kürze des Abschnitts der Vektorsequenz, der in 5 ' vor der Expressionskassette des Transgens angeordnet ist, z.B. von 371 nt. (Nukleotiden, bp). Damit wird im Vergleich zu lentiviralen und γ-retroviralen Vektoren besonders viel Raum für die Aufnahme von Transgensequenzen geschaffen. Die Expressionskassette besteht in diesen Beispielen jeweils aus dem starken internen Promotor von SFFV, der codierenden Sequenz für grün fluoreszierendes Protein (EGFP) als Reportergen und dem wPRE.

Beispiel 2: Langzeitexpression des Transgens in eukaryotischen Zielzellen Als Beispiel für die Verwendung des viralen Vektors als Medikament, z.B. zur Gentherapie, wurden Blutstammzellen mit erfindungsgemäßen viralen Partikeln transduziert. Isolierte Knochenmarkzellen aus Mäusen (Stamm C57BL6) wurden mit erfϊndungsgemäßen viralen Partikeln transduziert, und zum Vergleich mit lentiviralen Partikeln. Als Transgen war jeweils EGFP in derselben Expressionskassette unter der Kontrolle des SFFV-Promotors enthalten. Unter Bedingungen gleicher Effizienz wurden die Zellen vom lentiviralen Vektor zu 39% transfϊziert, und damit um den Faktor 1,6 mehr als durch den erfϊndungsgemäßen Vektor (24%). Dies lässt sich darauf zurückführen, dass lentivirale Partikel auch ruhende, teilungsinaktive Zellen transduzieren können, während die erfϊndungsgemäßen α-retroviralen Partikel Zellen vorzugsweise während der Teilung transduzieren können.

Die transduzierten Blutstammzellen wurden in je 8 letal bestrahlte Mäuse des gleichen Stamms transplantiert. Transduzierte Zellen wurden per FACS aus peripherem Blut identifiziert. Nach 31 Wochen war der Anteil transduzierter, EGFP -positiver Leukozyten für lentivirale Vektoren mit 32,9 +/- 8,9% etwa auf das doppelte des Werts für die erfϊndungsgemäßen Vektoren (16,1 +/-12%) gestiegen. Von beiden Gruppen wurde von den Tieren mit den höchsten Titern EGFP -positiver Zellen Knochenmark entnommen und jeweils in 5 letal bestrahlte Tiere einer zweiten Gruppe transplantiert. 6 Wochen nach dieser Transplantation lag der Anteil EGFP -positiver Leukozyten für die lentiviral transduzierten Stammzellen mit 40,6 +/-5,9 noch etwa 30% über dem Anteil bei erfϊndungsgemäß transduzierten Stammzellen (32,6 +/- 8,1%). Dies zeigt, dass die Geschwindigkeit der epigenetischen Stilllegung der Expression des Transgens für die erfϊndungsgemäßen Vektoren nicht wesentlich höher ist als bei lentiviralen Vektoren.

Beispiel 3: Nachweis geringen Risikos durch Insertionsmutagenese der Vektoren In einem von den Erfindern (Mol. Ther. 1919-1928 (2009)) entwickelten in vitro Test wurde das Risiko der Onkogenaktivierung bei der Transduktion bzw. Transfektion mit dem viralen Vektor überprüft. Eine Onkogenaktivierung, z.B. durch Insertion viraler Sequenzen in der genomischen Nachbarschaft, führt dabei zur Transformation primärer hämatopoetischer Zellen. Kurz gesagt wird in diesem Test untersucht, in welcher Frequenz und in welchem Ausprägungsgrad es zur insertionellen Aktivierung transformationsfördernder zellulärer Proto-Onkogene wie Evil kommt. In diesem Test werden primäre hämatopoetische Zellen der unbehandelten Maus, z.B. Stamm C57BL6, mit viralen Partikeln kontaktiert. Nach dieser Transduktion wird die Transformationshäufigkeit durch Kultivieren unter Bedingungen bestimmt, die die myeloische Differenzierung verursachen, wobei die neuerliche Aussaat von solchen Zellverdünnungen durchgeführt wird, in denen nicht transformierte Zellen wegen der durch die Verdünnung ausgelösten Unterdrückung der verbleibenden Teilungsfähigkeit nicht proliferieren, sondern nur transformierte Zellen proliferieren. In transformierten Zellen ist z.B. die Expression von Proto-Onkogenen durch Insertionsmutagenese hochreguliert. Dieser Test quantifiziert daher die Transformationshäufigkeit im Verhältnis zu transduzierten Zellen. Die Lebensfähigkeit bzw. Stabilität der Transformanten kann als das Ergebnis der Kultivierung von transformierten Zellen nach neuerlichem Aussäen bzw. Replattieren bestimmt werden.

Dabei hat sich gezeigt, dass γ-retrovirale Vektoren und lentivirale Vektoren zu einer Transformationshäufigkeit von ca. IxIO ^"5 bzw. 5xlO ^"6 führen (Mol. Ther. 1919-1928 (2009)). In Parallelansätzen wurde für erfindungsgemäße Vektoren eine Transformationshäufigkeit von ca. 3, 6x10 ⁶ festgestellt, die also noch unter dem für lentivirale Vektoren festgestellten Wert lag. Neben der Transformationshäufigkeit wird in diesem Test die Lebensfähigkeit bzw. Fitness der transformierten Zellen analysiert. Der Wert für diese Fitness lag für 3 von 4 bislang isolierter Zellen, die durch den erfϊndungsgemäßen Vektor transformiert waren, etwa 10-fach niedriger als der Durchschnittswert für lentiviral transformierte Zellen. Diese Ergebnisse zeigen anhand der geringen Transformationshäufϊgkeit und der geringen Fitness transformierter Zellen durch den erfindungsgemäßen α-retroviralen Vektor, dass dieser eine bessere Sicherheit gegen die Onkogenaktivierung bietet, als die bisherigen γ-retroviralen oder lentiviralen Vektoren. Das Risiko der insertionellen Transformation kann durch die Wahl geeigneter interner Promotorsequenzen weiter reduziert werden.

Beispiel 4: Bestimmung von Deletionen der 3 -U3 -Region, die deren Promotor- und Enhanceraktivität eliminieren

Die Deletion bzw. die Ersetzung von Nukleotiden der U3 -Region zur Reduktion bzw. Eliminierung der Promotor- und Enhanceraktivität wird vorzugsweise mit einem Aktivitätstest bestimmt, bei dem die Expression eines Reportergens gemessen wird, das funktional in 3 ' zu der mit Deletionen versehenen U3-Region angeordnet ist. Wenn die Expression eines Reportergens, das in 3 ' funktional zur deletierten bzw. ersetzten U3 -Region angeordnet ist, auf dem Niveau der Hintergrundaktivität des promotorlos exprimierten Reportergens bestimmt wird, ist die Promotoraktivität erfmdungsgemäß eliminiert. Vorzugsweise ist in 3 ' des Reportergens eine Polyadenylierungssequenz angeordnet. Als Hintergrundaktivität des exprimierten Reportergens wird z.B. die Aktivität definiert, die ohne jede U3-Region, bzw. ohne jeden Promotor in 5 ' des Reportergens gemessen wird.

Figur 14 zeigt schematisch die Nukleinsäurekonstrukte ausschnittsweise, mit denen der Aktivitätstest für die erfindungsgemäß deletierte bzw. ersetzte Promotor- und Enhanceraktivität der U3-Region durchgeführt wurde. Das in Figur 13 oben dargestellte Konstrukt zeigt als Reportergen das Luciferasegen aus Renilla (RLuc), das in 3 ' von einer Polyadenylierungssignalsequenz aus SV40 (SV40 pA) und in 5 ' von der auf Promotor- und Enhancersequenz zu testenden Nukleinsäuresequenz flankiert ist, vorliegend dem Wildtyp LTR (U3-R-U5) aus ASLV. Darunter ist ein ansonsten identisches Konstrukt mit Deletion (ΔLTR) gezeigt, dessen U3 -Region teilweise deletiert ist (ΔU3). In diesem Konstrukt sind die Nukleotide 28-186 deletiert. Noch darunter ist ein ansonsten identisches Konstrukt gezeigt, in dem der LTR vollständig durch eine zufällige Sequenz (spacer, vom prokaryotischen ß- Lactamasegen abgeleiteter Platzhalter) ersetzt ist. In 5 ' vor dem viralen Sequenzabschnitt ist ein synthetisches Polyadenylierungssignal (syn pA) angeordnet, In Figur 15 sind die Luciferase- Aktivitäten von 293T-Zellen gezeigt, die mit den Konstrukten aus Figur 13 transfϊziert und unter identischen Bedingungen kultiviert sind. Die Messung der Luciferaseaktivität erfolgte in Zellhomogenaten, die Darstellung zeigt relative Lumineszenzwerte, die auf Gesamtprotein und Transfektionseffizienz normalisiert wurden. Es wird deutlich, dass die erfindungsgemäße Deletion zu ΔU3 (ASLV ΔU3) eine drastische Verringerung (etwa um den Faktor 400) der Promotoraktivität gegenüber dem Wildtyp-LTR (ASLV U3) bewirkt. Die Daten sind nach statistischer Analyse untereinander sehr signifikant (**, P<0,01). Die Ersetzung des LTR durch die willkürliche Sequenz (spacer) führt zu einer ähnlichen Verringerung der Promo toraktivität. Daher kann erfindungsgemäß eine willkürliche Sequenz, die keine bekannte Promotor- und Enhancerfunktion aufweist, als Sequenz mit Hintergrundaktivität verwendet werden. Es wird angenommen, dass die noch gemessene Hintergrundaktivität der Luciferase durch andere Bestandteile des Plasmids verursacht wird, in welchem die Expressionskassette mit dem Reportergen enthalten ist. Vorzugsweise ist das Reportergen auf den Kodongebrauch der transfizierten Zelle angepasst.