木領域

本 于微生物基因發源和基因 領域 休涉及 抗生素

oca ac 的生物合成基因 的 序列分析 基因功能研究及其 。 木背景

ocahac 是一 元素 氨基酸 高度 的 抗 生素 它們作力 家族中十分 的成 最初是在 有新 性的金黃色 葡萄球菌 ehc -Re a Ococc s fne s RSA和有多 性的 球菌 - gRe a enococc s ec F的生 有抑制作用的抗生素的 中 土 品中 的 .A bo. 99857 7 ] 1998 Tok hma研究中心率先 似 酸菌Am co O ssSp. J347-81F4 萬純化到 J347-81F4-A ocahac 和 完成 它們的 、 活性 和 但沒有 。 2003 o- ye q bb 物研究所又 Woc n Sp.WW- 265

ocahac 、 111 、 萬純化和活性 利用 X- ay 等方法 \ .A boL 200356226232 Co gh ． .O Che .2002 67 8699]

家族其他抗生素 也 有一介以 取代的 核心 由多 及脫水氨基酸 的 中心。其中 ocahac 在 上 家族的另一成 相似 不同之她在于多 一介23- 氧 的

大坪相 部分的 替代 未的 。

研究表明 可以很好 抑制 的生 特別是 多 性 的各 致病菌具有 的 作用。 其中 ocahac A 的 C佰 0．003Jg/ 有 性的肺炎槌球菌Pe c - e a e ococc s e moW R P 的 C佰 .0 Ugg/m 比刀古 高出 10-20倍。 同 它 近期 的有刀古 Va comyc 性的 va co yc - e a e cocc ecc V F具有 良好的 C佰 0．0 ugg/ 。 而且 刀古 相比 感染 A 的小鼠具有史 著的 ocahac 1的P 佰分別 0．8、0．62、0．89mg/kg 刀古 素在同 各 下 1．3 mg/kg ocahac 和11作力 家族抗菌活性最好的 西 化合物 在 p 下 比其他 具有史好的水溶性 可能是因力分于中含有一介 二甲 氨基 的緣故[ e em. ef.2 4. 4.\7\-\75] 近期 抗生素的作用 似 也是 50 的2 R』A- 蛋白夏合物 合 通 阻止或促迸 象的 化 aa-R』A -T GTP 合物的 別及 于的GTPa e活性 而抑制細菌休內蛋白 的合成未 活性作用的 [. em． c.20087 2 02 2 0]。 目前其 休的 不是很 但 它們相似的 中心可能是其具有 越活性的 。

作力新一代 感染 物的先 化合物 自 之 就引起 羊 的 。 考慮到它們的溶解度尚 到靜脈注 的要求 不少化羊

化羊 合成改造。 o- ye q bb 物研究所 在 ocahac 上添加 一 些 性水溶性 未提高它們的生物利用度 在 的 上或在 的 氮上 氧化[ ooga c edc a Chem y e e .200414 3743 3746] chae 加成在23- 氧 上添加 或 [TeKhe o efe s.20045 1059- 063] 或 者用化羊 或 去掉23- 氧 得到 ocahac V 再 一步 氧化或添加 .O em.2002 67 8789]。但 方法往往很 在提高水溶性的同 保持原始 良好的抗菌活性。 而 抗生素的化羊 二十多年未人們只完成 部分 和酸性水解 物的合成[neKhe o e . 984 252127 .O em. 996 6 4623 J.O . ef.2003 54421 ne he o e . 99 32 4263 ew eChe e. 2005117 3802 3806 em.Co m .2008 591 593] 百到近 年有 合成大 oody 和 coao 等人才完成 A 、 、 、 A、 G 2270A/ T的 合成 素的 合成 沒有人

AW eW. em. W. .2007 67930-7954]。 且由于 抗生素 的多 多的手 性中心 使得 純利用金合成的方法 改造步驟繁多 成本 高。

而近年未 基因 羊和蛋白 羊的深入研究以及新型生物技木的快速 使 我們利用微生物作力細胞 通 控制未大量合成具有良好生物活性和新型作 用 制的天然 物及其 似物成 可能。 也 我們在微生物休內 得所需要的新型 抗生素提供 各新的思路。

因此我們以微生物未源的 林分于 素的生物合 成基因 微生物羊、 于生物羊、 生物化羊以及有 化羊相 合的方法未研 究其生物合成 生物合成 往及 在此 上 的原理 合 理修 素的生物合成 往 生物利用度史好、 微生物 大量 的新型 。 內容 本 涉及 由 生的具有良好抗菌活性的抗生素- ocahac 的生物合成基因 的 、 、 分析、 功能研究及其 。

本 明中 基因 包含37 基因的 序列或 序列序列1 Q O: 其中有8 基因 oc2 Woc2 Wo Woc22 Woc23 Wocg Woc24 Woc3 5 ocahac 大坪骨架的生物合成 4 基因 oc Woc26 Woc2 和 oc29

的生物合成 6 基因 oc Woc Woc Woc 2 Woc 和 oc 4- - 二甲 -246- 氧 的生物合成 5 細胞色素P45 氧化 基因 7 W oc Woc Woc g ocahac 的氧化 2 基特 基因 oc8 oc36分別 ocahac 的 基化 和自身的 2 基因 oc 7 oc37 0 3 基因 oc5 Woc Wo 4 4 特汞 有夫的基因 o 1 Woc2 Wo Woc4 以及3 功能的基因 oc3 Woc32 Woc3

本 提供 一介銅 前休 的 序列 由序列 2中的氨基酸 序列組成 命名 oc2 其基因的 序列 于序列 1中 38432-38581 她。

本 提供 一介銅 形成的 化 的 序列 由序列3 15 中的氨基酸序列組成 命名 oc23 其基因的 序列 于序列 1中 30980-32875 她。

本 提供 一介銅 形成的 A 氧 的 序列 由序列 4 中的氨基酸序列組成 命名 oc22 其基因的 序列 于序列 1 中 29544-30767 她。

20 本 提供 一介銅 大坪骨架形成的脫水 的 序列 由序 列 5 中的氨基酸序列組成 命名 其基因的 序列 于序列 1 中 26965-29523 她。

本 提供 一介銅 大坪骨架形成的脫水 的 序列 由序 列 6 中的氨基酸序列組成 命名 oc2 其基因的 序列 于序列 1 中 25 25968-26960 她。

本 提供 一介銅 自由基 A 合成 的 序列 由序列7中的氨基 酸序列組成 命名 oc2 其基因的 序列 于序列 1中 36848-37948 她。

本 提供 一介銅 -CoA合成 的 序列 由序列8中的氨基酸序列 組成 命名 oc25 其基因的 序列 于序列 1中 34680-35912 她。

30 本 提供 一介銅 基特 的 序列 由序列9中的氨基酸序列

命名 oc26 其基因的 序列 于序列 1中 35933-36820 她。

本 提供 一介銅 A 依 的氧化 或 基特 的 序列 由序列 10中的氨基酸序列組成命名 oc29其基因的 序列 于序列1中 38714-39976 她。

本 提供 一介銅 - 基特 的 序列 由序列 11 中的氨基酸序 列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 14990-15703 她。

本 提供 一介銅 P- 3 C上的 基特 的 序列 由序列 12中的氨基酸序列組成命名 oc 其基因的 序列 于序列1中 15728-16972 她。

本 提供 一介銅 P- -3- 的 序列 由序列 13中的氨基 酸序列組成 命名 oc 2 其基因的 序列 于序列 1中 16984-17970 她。

本 提供 一介銅 dT P-4- -6- 氧葡萄糖 23-脫水 的 序列 由序 列 14 中的氨基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1 中 17988-19418 她。

本 提供 一介銅 P-6- 氧- -葡萄糖4 C上的氨基特 的 序 列 由序列 15中的氨基酸序列組成 命名 oc14 其基因的 序列 于序列 1中 19424-20560 她。

本 提供 一介銅 基特 的氨基特 的 序列 由序列 16中的氨 基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 11505-12683 她。

本 提供 一介銅 細胞色素P450氧化 的 序列 由序列 17中的 氨基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 12704-13912 她。

本 提供 一介銅 細胞色素P450氧化 的 序列 由序列 18中的 氨基酸序列組成 命名 其基因的 序列 于序列 1中 20591-21703 她。

本 提供 一介銅 細胞色素P450氧化 的 序列 由序列 19中的 氨基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 21696-22934 她。

本 提供 一介銅 細胞色素P450氧化 的 序列 由序列20中的 氨基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 23507-24649 她。

本 提供 一介銅 細胞色素P450氧化 的 序列 由序列21中的 氨基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 24646-25947 她。 本 提供 一介銅 基特 的 序列 由序列22中的氨基酸序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 13909-14532 她。

本 提供 一介銅 基特 的 序列 由序列23中的氨基酸序列組成 命名 oc36 其基因的 序列 于序列 1中 43983-44768 她。

本 提供 一介銅 未 蛋白的 序列 由序列24中的氨基酸序 列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 22956-23480 她。

本 提供 一介銅 磷酸 A C a po e 的 序列 由序列25中的氨基 酸序列 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 44914-45423 她。

本 提供 一介銅 AR 家族的特汞 蛋白的 序列 由序列26中的 氨基酸序列 命名 oc5 其基因的 序列 于序列 1中 10404-11387 她。

本 提供 一介銅 休克蛋白的 序列 由序列27中的氨基酸序列組成 命名 oc33 其基因的 序列 于序列 1中 42031-42456 她。

本 提供 一介銅 h 特汞 于的 序列 由序列28中的氨基酸 序列組成 命名 oc 其基因的 序列 于序列 1中 42565-43173 她。

本 提供 一介銅 R A聚合 CF- 的 于的 序列 由序列 29中的氨基酸序列組成 命名 oc3 其基因的 序列 于序列 1中 8731-9867 她。

本 提供 一介銅 ATP 的 于的 序列 由序列 30中的氨基酸 序列組成 命名 oc4 其基因的 序列 于序列 1中 9968-10387 她。

本 提供 一介銅 GPFA T 家族蛋白的 序列 由 中的氨基 酸序列組成 命名 o 2 其基因的 序列 于序列 1中 8282-8725 她。

本 提供 一介銅 50 休蛋白 18的 序列 由序列32中的氨基酸 序列組成 命名 1 其基因的 序列 于序列 1中 7731-8084 她。

本 提供 一介銅 未知功能蛋白的 序列 由序列33中的氨基酸序列組 成 命名 oc9 其基因的 序列 于序列 1中 14529-14984 她。

本 提供 一介銅 未知功能蛋白的 序列 由序列34中的氨基酸序列組 成 命名 oc24 其基因的 序列 于序列 1中 32902-34683 她。

本 提供 一介銅 未知功能蛋白的 序列 由序列35中的氨基酸序列 命名 oc3 其基因的 序列 于序列 1中 40174-40914 她。

本 提供 一介銅 未知功能蛋白的 序列 由序列36中的氨基酸序列組 成 命名 oc3\ 其基因的 序列 于序列 1中 41001-41408 她。 本 提供 一介銅 未知功能蛋白的 序列 由序列37中的氨基酸序列組 成 命名 oc32 其基因的 序列 于序列 1中 41492-41953 她。

本 提供 一介銅 未知功能蛋白的 序列 由序列38中的氨基酸序列組 成 命名 oc3 其基因的 序列 于序列 1中 43228-43758 她。

在另一 中 基因 包括由 oc 至 oc3 的 基因 或包括由 oc 至 oc 的 基因、 基因和 基因。

在另一 中 的基因 的 序列 Q O: 1中 77 -45423 、 Q O 1中 11505-40916 、 或 Q O 1中 1-44560 所示。

本 提供 本 上 的 素的生物合成基因 的銅 蛋白。較佳 的銅 蛋白的氨基酸序列 Q O:2-38所示。

本 提供 含有上 的 素的生物合成基因 的 休。 較佳 的 休是 。

本 提供丁亞 的含有上 的 休或染色休上整合有上 的 素 的生物合成基因 的 細胞。 較佳 的 細胞是 。

本 提供 素的方法 包括步驟 上 的 細胞 而 以及 中分萬 。

本 提供 上 的 素的生物合成基因 或 部分基因的用途 它們 于在 ．ac o TCC25421相夫基因缺失的 中 而

或者將 基因在 ．ac o TCC25421中 而 素的 似 。

序列1的 序列可 A 原則得到。序列1的 序列或部分 其他合活的 木得到。本 提供 得至少包含部分序列 中 A片段的 的 往。

本 提供 生物合成的微生物休 往 至少其中之一的基因包含 有序列1中的 序列。

本 所提供的 序列或部分 序列 可利用聚合 反 PCR的方法 生物合成基因相似的基因。

包含本及 所提供的

oc n p.WW- 265 基因 中定位 多的 。 至少包含本 明中的部分序列 也包含有 oc n Sp.WW-12651基因 中以前卻近 的 A

本 所提供的 序列或至少部分 序列可以 或 。 往包 括插入、 或缺失 聚合 反 碳 聚合 反 特

不同序列的亞新 接 序列的不同部分或 其他未源的同源序列 定向 化 A Sh g 或 紫外 或化羊 等。

外 土包括 、 胞菌、 大 、 、 酵母、 植物和 等。 包含本 所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多 可能在去除或替代某些氨基 酸之 仍有生物活性甚至有新的生物羊活性 或者提高 量或 化 蛋白功力羊特 或其他致力于得到的性 。 中表 A 木 它們在 中的功能。

包含本 所提供的 序列或至少部分 序列的基因或基因 可以 未 以 得其生物合成 往 也可以 插入、 、 缺失或 而 得新的生物合成 往。 中 生物合成的一介或 步驟而得到新的 似 。包含 A片段或基因可以用未提高 或 衍生物的 本 提供 在基因 微生物中提高 量的 往。 插入、 或缺失 聚合 反 碳 聚合 反 特

不同序列的亞新 接 序列的不同部分或 其他未源的同源序列 定向 化 ASh g 紫外 或化羊 等方法未 新的 抗生素或其他多

。

包含本 所提供的 序列銅 的蛋白可以催化合成 、 化 、 等 可以 其他天然 物的生物合成 往或部分生物合成 往 未 得包含有若 且具有史好生物活性的 。

包含本 所提供的 序列銅 的蛋白可以催化合成 素的大坪骨架 和其拮 似 。

包含本 所提供的 序列銅 的蛋白可以催化合成 4- -二甲 -246- 氧 未 得新 的 基化 。 往 包含的氧化 反 也可有其他 。

忠之 本 所提供的包含 生物合成相夫的所有基因和蛋白 可以 都助人們理解 抗生素的生物合成仇 一步 改造提供 材料和 。 本 所提供的基因及其蛋白 也可以用未 和 可用于 、 此或 此的化合物 或基因、 自。 1 素的化羊 。

2 生物合成基因 的基因 和限制性內 。 A6 的 代表 oc n Sp.WW- 265 基因 45kb的 A 代表限制性內 Sm 休表示 A 的部分 黑色 表示 的採 部分

生物合成基因 的基因組成。

3 提出的 大坪骨架的生物合成 往。

4 提出的 的生物合成 往。

5 提出的 4- -二甲 -246- 氧 的生物合成 往。

6 ocahac 的高 液相 - C- 分析。

A高 液相

7 大坪骨架生物合成相夫的部分基因 基因 中相似基 因同 缺失 的 。

A 生菌 o ces cfMos sATCC254 野生 物的 C- os 同 缺失 物的 C- C oc2\ 物的 C- os 同 缺失 物的 C- oc2 物的 C- 8 生物合成相夫的部分基因 基因 中相似 基因同 缺失 的 。

A 生菌 om ces cfMos sATCC254 野生 物的 C- os同 缺失 物的 C- C oc25 物的 C- os 同 缺失 物的 C- oc 物的 C- 5 9 生物合成基因 中部分P45 氧化 基因 基因 中相似基因同 缺失 的 。

A 生菌 o ces cf os sATCC254 野生 物的 C- osC同 缺失 物的 C- 0 C oc 物的 C- os 同 缺失 物的 C- oc 物的 C- 10 生物合成基因 中部分P450氧化 基因在 生菌 e om ces c os sATCC254 中的 。

15 A 生菌 om ces cf os sATCC254 野生 物的 C- oc 物的 C- C oc 物的 C- 似 A的化羊

20 似 的化羊 。

11: 生物合成基因 中 相夫的基因 基 因 中相似基因同 缺失 的 。

A 生菌 om ces cf os sATCC254 野生 物的 C- 25 osA同 缺失 物的 P C- C ocg 物的 C- 1 ocahac 1 ocahac 11

30 ocahac 11 J347-81F4- 1的去 基化 。

2 A p Y2-61- p Y2-61- C p Y2-61- C A p Y2-61-A C p Y2- C 字母 代表 限制性 ge 4- -二甲 -246- 氧 生物合成基因 cycopep de 大坪骨 架生物合成基因 oxda o P45 氧化 基因 doeacd

生物合成基因 e a ce 基因 eg a o 基因 k ow 3 oc2 2 22 23分別 本 中 的 基因 中的基因 oc2 2 22 23 銅 的蛋白 P表示 素的 。

4 oc25 26 2 29分別 本 中 的 基因 中的基因 oc25 26 27 29 銅 的蛋白 Ado．表示自由基。

5 oc6 0 12 13 14分別 本 中 的 基因 中的基 因 oc6 0 2 3 4 銅 的蛋白。

6 A 5m oc hac 的保留 oc hac 的分于萬于 。 休 方式

以下 合 本 一步 。

． 生物合成基因 中 -二甲 基因片段的

有夫 抗生素生物合成方面的研究早在上世紀70年代 就 但是迄今 于它們在微生物休內 往的研究都 能有效突破。 早期的研究者 完成 Tho epo A o hep de 1 6 yc G 2270A A 0255G 、 oca ac 等的氨基酸前休 C"、 C 、 、 、 5

等 由此 它們部分 可能的生物合成 往 其中的 或 未 于 和 而 或 則是由 多 特化得到 的 它們核心 的氮 六元坪是通 [4+2] 加成反 形成的 .A ． em． c． 979 0 069 988 110 5800 993 5 7557 9937757992 995 7777606 996 5 11363 o . e C e 996 4 1135 . bo. 992 45 1499 200 54 1066 .Chem. oc hem. om . 993 1612 c .Chem.Res. 993 26 116 ne he o efes. 2008496265 6268.]。

同 也 抗生素大多具有相似的氨基酸前休 在一定 又上 它們在微生物休內可能是 相似的生物合成 往得到的。 而微生物休內典型的聚 天然 物的生物合成 往大休上可以分力西 休 往和非 休 往。 Fo 小組 根 抑制 的 抗生素可能是 非 休 往合成的。 研 究者 丁大量的方法未克 抗生素的生物合成基因 如 、 反向 羊、 基因 、 銅 休 往前休 的基因片段 、 非 休 往生物 合成基因的保守序列 、 特 于 中 等方法 但是都沒有成功。 就提示我們 需要 各全新的 往未克 抗生素的生物合成基因 。

抗生素的 基和 休骨架的生物合成基因大都 分布在染色休的同一 上 特 本 明人決定 ocahac 中 氧氨基糖的生物合成基因 未克 于的生物合成基因 。 我們首先 大量微生物未源的天然 氧 的生物合成 往[AWfJmc ob e s e ohe 999 43 1565 157 ems & oo 2004 959 969 oec c obJoo 2000 37 752-762] T ocahac 1中4- -二甲 -246- 氧 可能的生物合成 往 可能存在于 往催化 期的 -二甲基特 的保守序列 性的PCR meh-Fo 5-GCTGAC GTCGCCTGCGG ACC/GGGA/T/C/G G/A/T A/T/C/G A/T/C/GCA-3 meh-Rev2 5-CGCG AACGTG/CTCG/CGGA/G AA CCAC A/T/G/CGG A/T/G/CTC-3 然 以 oc n J p - 2651的 A 模板 PCR 得到 03 kb的PCR p P72 休 序分析 己知的 -二甲基特 基因具有 很高的同源 。 2 生物合成基因 的 序列分析及功能分析

將上 到的 -二甲 基因片段用地高辛 建好的 oc n J W- 26 的基因 共得到6 插入片段互相 的 分別 c Y446-2-47-A C C 染色休 5 kb的 A 2A和 2 2。 限制性 物理 中最左端和最右端的 c Y446-2- 47- C 通 生物 分析 的45560kb的 A

GC含量力733% 共包含 44 放式 ope ead g6ame OR 其中

生物合成相夫的有37 。 各 基因的功能分析 1。 1 生物合成基因 中各基因及銅 蛋白的功能分析

基因 氨基酸 相似蛋白 同 /相 推測功能 蛋白 數目 似 S D

O

o 445 AG 06220 YP 002178248 72/82 p 合成

o 677 CO6280 P 630378 7/68 蛋白

o 367 ORF7 AAZ94395 70/80 氧基 合成蛋白

o 362 OzmD ABA39084 69/77 ACP 氧

o 87 HbmJ AAY28231 6/74 基特這蛋白 noc34 202 AV 691 P 821866 0/65 p 8特汞 于 28 c35 176 s 2670 YP 001070941 61/76 未知蛋白 38 noc36 261 Noca 3743 YP 924930 73/81 基特 11 23 oc 169 va 5092 YP 955869 1/63 ABC磷酸 特 25

oc至 oc5 生物合成的 基因和 基因 oc6至 oc30 oc 至 oc 基因和 基因。

2 O -7)至o -1) 氧基 酸的生物合成基因不屈于 基因 )。 5 3． 生物合成基因

基因銅 蛋白的功能分析 我們初步判定 素的生物合成基因 基因 oc 到 o 共37介 放式 。 其中 1介基因 oc28 銅 素 的前休 7 基因 Woc2 Woc2 Woc21 Woc22 Woc23 Wocg Woc24 Woc3

oc28銅 的前休 形成 大坪骨架 4 基因 W 25 Woc26 Woc2 和 0 W 29 以色 前休 合成 6 基因 Woc6 Woc Woc Woc\2 o 和 oc 4 4- -二甲 -246- 氧 的生物合成 5 細胞色素P450氧化 基因 Woc Woc 5 Woc\6 Woc Woc\g ocahac 的氧化 2 基特 基因 Woc8 Woc3 分別 ocahac 的 基化 和自身的 此 外 有2 基因 oc 7 Woc 7 3 基因 oc5 Woc33 Woc34 4 特汞 15 有夫的基因 oc Woc2 Wo Woc4 以及3 功能的基因 oc3 Woc32 Woc3 o 氧基 生物合成相夫的基因 而基因 oc\ oc3 分別銅 50 休 18蛋白、 GPFA T 家族蛋白及 CF 家族R』A聚合 于 基因可能 前休 的特汞 有夫。所以 生物合成基因 的右側 在o oc 之同。 序列右側的基因 oc3\-3 一些 基因及 20 基因 可能 生菌自身的 和 相夫 所以 生物合成基 因 左側 于 oc3 她。 包含 生物合成基因 的 的 可 一步 休內征安 生物合成基因 的 。

4 大坪骨架的生物合成

25 素的生物合成基因 中共有 8 基因 大坪骨架的生物合成相夫。 其 中 oc 8 銅 素的前休 其 C端拮 n C CeC C C

大坪骨架的氨基酸前休順序完全吻合 而 水氨基酸的 部分 則 前休 的 其在 內特 的。 也 基因水平上征安 素的 大坪骨架 是按照 休 未合成的。 似于細胞 和蛋白 的合成 首先在 休中鋒特汞 逐步形成 素的聚 前休。接 前休 休上水解 再由 oc23銅 的 化脫水 催化其中 上的 上的碳 形成5 接 一分于水 形成 。 然 由 oc22銅 的 A 依 的 氧化 作用 一分于氧 將 特 。 接下未在 oc 或 oc 銅 的脫 水 的催化下 上的 形成 23- 氧 一步 于內 e - de 反 形成 化 氧 六元 。然 再在 o 銅 的 蛋白及一系列脫水 和氧化 的作用下 多 反 形成 化 中心 而 中 最大的一介 。 3所示。

5． 的生物合成

的生物合成 往 4所示。 首先以色 前休 oc 銅 的 adca ade o ymeho e Ado e 型的蛋白的催化 一系列 于內亞 再水解脫 形成 -2- 。接 oc25銅 的 -CoA合成 活化 酸的 將 特 CoA- 。 然 在 oc 6銅 的 基特 的作用下 形成 大坪骨架同的 接。 一步由 oc29銅 的 基特 特 上的 到 4 的碳上 再由基因 中的氧化 作用在4 碳上上一介 最 在一系列相夫 的作用下 大坪骨架同的 接。 其中 4 的 基化可能 在側 大坪骨架 接前或者是 接 。 6． 4- -二甲 -246- 氧 的生物合成

素的生物合成基因 中共有6 基因 的生物合成相夫。

首先一分于磷酸化的 -葡萄糖在 d P- -葡萄糖合成 的作用下 活化 接 由 d P- -葡萄糖-4 6-脫水 催化脫水在4 形成 再由 oc 銅 的2 3-脫水 作用 另一分于水形成34- -6- 氧 中同休 然 在 oc 2銅 的 - 的 催化 3 3 5 的作用 向 化 又在 銅 的 基特 的作用下在3 上一介 再由 14銅 的氨基特 催化在4 上一 介氨基 然 在 銅 的 -二甲基特 的作用下在氨基上加西 最 由 oc 銅 的 基特 特 到 素的大坪骨架上 5所示。 7． 素的

素的生物合成基因 中共有 5 細胞色素 P450氧化 基因 oc oc\5 Woc\6 oc\ Woc\9 可能 生物合成 往中的一系列氧化 相夫。 其中 oc 和 oc\9分別催化 y 的 化和 上的 化 9 Woc\6和 oc\ 分別催化 上的 化和3 上的 化 10 。 在 基因 中 存在一介 蛋白 ocg 是 的 形成 的 11 8． 生物合成基因 的

在 、分析 生物合成基因 的 上 我們 一套快速 其 他 抗生素生物合成基因 的通用方法。 如利用其中 形成相夫的 化脫水 oc23的氨基酸保守序列 PCR 、 、 等 的生物合成基因 同 利用 大坪骨架生物合成相夫的基因序列 基因 的方法克 硫代 素的生物合成基因 。

在此 上 我們 一步分析比較 基因 和生物合成 往的相似 。 如 o hep de的生物合成基因 C 200910053427.7中一共有 15 功能相似的基因 2 其中包含T8 大坪骨架生物合成相夫的基因 4

合成相夫的基因 2 P450氧化 基因以及 1 基因 且 基因的 排列順序和特汞方向也基本相似。 我們首先通 在 生菌的休 中肘部分功能 相似基因的同 缺失初步征安 基因 生物合成的相夫 和其可能的功 能 在此 上我們又將 基因 中的相似基因早入到 同 缺失 中 和 C- 一步征安 相似 基因 大坪骨架、 合成及氧化 的相夫 。 如 os 同 缺失 的 征安 o y 的 化 oc 的 征安 o 功能一致。同 方法我們也征安TWoc g 催化 上 的 化的 ocg 催化 的 形成 。 同 我 2 P450氧化 基因 oc 和 在 生菌休 中的 初步征安 它們可能 的功能分別是 上的 化和3 上的 化。 2 生物合成基因 中功能相似基因的同源 比較

os oc 同一 de es) 相 PO Ve ) osD oc20 183/328 55% 215/328 65% osE oc21 506/885 57% 586/885 66% osF oc22 222/474 46% 253/474 53% osG oc23 411/642 64% 459/642 71% os oc24 304/608 50% 354/608 58% os oc25 55/91 60% 64/91 70%

osJ oc26 120/229 52% 151/229 65%

os oc27 280/357 78% 315/357 88%

os oc28 41/48 85% 45/48 93%

os oc29 296/391 75% 336/391 85%

osO oc30 108/261 41% 145/261 55%

osP oc5 44/266 4% 87/266 70%

osC oe 9 289/406 71% 336/406 82%

osA oc9 88/136 64% 107/136 78%

osB oc7 221/450 49% 266/450 59% 下面 合 休 一步 本 。 理解 于 明本 而不用于限制本 的 。 下列 中 注明 休各 的 方法 通常按照常 各 amb ook等人 于 手冊 ewYOk:Cod p g abo 北o aoy P e 1989或 手冊PaC ca epo yce Ge e c 中 的各 或按照制造 所建 的各 。 除非另外 否則百分比和 。

生菌 oc n Sp.WW- 265 A的提取

將 10 oc n W.wW- 6 ATCC202029 接神到3m T 休

。

中 30C 250 p h 到 。 接神 5 m T 。

中 gC 0．5% 30C 250 pm 25h 到 期前 。

期 乳白色洋油 井有大量 。 將 于4C 0 pm 萬 收集 裂解 西 得到 2．5m 。 向 2．5m 中加入 裂解 溶菌 g/m 至均一 再加入 Achomopep da e至 g/m 。

。 37C水浴 m 。加入0． 蛋白 2 mg/m 裂解 新 、 % 。

的 迅速放入70C水浴 至基本 冰上 即。 加入2．5m 的 Ac溶液 冰上 即 15 m 。 加入15m T 和的 再加入15m 氯 。

仿 2000 pm 4C 萬 2 m 。 破口的 將水相吸 于新的萬心管 。

中 加入等休 的氯仿 24 t混合 1200 pm 4C 萬 。再用破口的 將水相吸 于新的萬心管中 加入2倍休 的元水

有大田的 A 。 將 于新的萬心管中 加入5m 70%的 將 休 傾出 。 再加入 T 溶解添加 a e 活性的 R』a e A至終

。

50 g/m 37C水浴0．5h。 等休 的 和 西 再用等休 的氯仿

24 1的混合 西 向水相中加入0．1倍休 3 的 aAc溶液 2倍休 的元水 有 A 。 70% A 休。 再

5 水 休 台中 于 尚休 的T P 8.0中。 以溶解 可 。 。

在55 C水浴2h 最 保存于4C。 2

生菌 oc n Sp.WW- 265 基因 的

10 首先通 一系列的稀 未 3A 的用量在此 上大量 得到的 A 片段略大 kb 。 休p J446Ge e 992 116 43-49 7109019先用 西 o 序列中同 然 再 多克 她 得西各 接 。

各好的 4 kb的 A片段 接 。 -80C取出包裝 Pomega ackage e x a 放到冰上 恰好融化 立即加入5 上 接 注意不要 15 室溫 22C 。 加入445 hage 上下 。 再加入25 氯仿 上下 使其 休以終止反 萬 使氯仿 于底 。

部 保存于4C。 將 所帶的 .co 392 神在 平板上 接神 。

。

中添加 的 g 溶液和30 20%的 芽糖溶液 37C 250 p 。 再特接500 到5 m 的 中添加5 H 的 g 溶液和 。

20 500 20%的 芽糖溶液 37C 250 pm 至 0.6-0．8。 2．5 包裝 。

加入97．5 phage 和 .Co 392 0.67 22C水浴0．5h 。 。 再加入100 的 37C 水浴75m 平板 Am g/ 37C 至有 。

平板 有 50000 下 加入甘油 18%和Ap amyc

。

25 g/m 2 分裝 于-80C保存。 平板中 10 接神于 中 大 的 小 各 。 e 1

0．7%的 。 合各 A片段的 估算 插入片段的大小 -4 kb 以此 的 3000 C A。 大多 染色休 A的大小 8 b 于插入片段 2 kb 的 而 其效 30 2000 500 CfUng A就足以代表 基因 。 以上 我們建立的

到3000 C A 插入片段 4 kb左右 表明我們建立的 具有良好的

滿足 的需要。 3 生菌 oc n Sp.WW- 265 的 、 物分萬純化 。

首先將300 J -80C 的 oc n s.wW- 6 接神到25m 的神于 中可溶性 2%、 葡萄糖0．5% -Z Ca e 0.3%、 酵母提取物0．2%、 提取 。

物0．5%、 碳酸鈣0．3 32C 250 p 3 。 中取2m 特接到 m 的

。

中葡萄糖2% Y-酵母4121%、 大豆1% 30C 250 pm 4-5 。 然 將 合井 特移到萬心管中 pm 萬 。 上 等 。 休 的 萃取西 合井有 相。 水 g 或 水 a 37C 至 。 將 于氯仿 9 1的混合 中 初步 T C 液 的提取物中是否有 oca ac 存在在 紫外 ocahac 、 111合 黃綠 色 T C 氯仿 90 0 0.1 一步可以用 ceo coO

生物活性 ocahac 可以抑制 ceo coO 0的生 形成 。

在此 上將2 液的 于氯仿/ 的混合 中 100-200

300-400目的 各 /氯仿 :1 m 氯 仿1 m 氯仿/ 99:1 m 氯仿/ 98:2 300m 氯仿/ 97:3 2 m 氯仿/ 95:5 300m 氯仿/ 90:10 2 m。 其中在氯仿/ 95:5的組 。

中 到 黃綠色 的 。 收集 30C 至 C 各 萬純化。

V 22 m

于 Ag e zORA -C185 4.6x25 mm 880975-902 C 24998

07051

相各 V m /m A 0. %TFA C C 收集 C保留 同 的組 P C- oc hac

的[ + ]" 于萬于 m/z 1437.3。 同 我們 似方法 oc p.WW- 265 的 中分萬純化到 oc hac 、 J347-81 4- 等

C- 的[ + ]" 于萬于 依 m/z ． 6 1266．2、 1368．3。 4

CR 素的生物合成基因

PCR 休 包含 8% V/v gC 1.5mM4 d TP .2m

0.2 Taq A聚合 2 及活量模板 oc n Sp.WW- 265 A 首先95°C 6 。 。 。 。 。 5m 6 然 9 C m 63 C m 72C m 10 9 C m 55 C 。 。

m 72C m 20 最 72C m 。 PCR 1．5%

。 低 回收預期大小的 A片段 休p P72的 coRV消化 CA 的2．4kb A片段 接 特化大 5a感受 細胞 在含有 尚抗生素的 。

平板上 37C 至特化于 。 落到 休 中 J 和 coRV 定是否含有預期大小的 A插入片段。 將插入有預期大小 A 片段的 。 5

核酸 于

A 將 的 A 水 至 休 15 沸水浴中加熱交 10 立即 于 中 即。 接 加入 混合物 exa ceo de x x p d TP 混合物 北e g x 2 owe zyme abe ggade Pomega 。

混合均勻 37C水浴 16小 。加入0．8 0．8 TAP 8.0 以終止反 加入2．5 。

4 C 混合均勻 再加入75 的元水 的 A 于-80C 。

40 。 4C 20 pm萬 20 收集 A 的 70% A 其 亞新 于50 T P 8.0中。

2 G A 的 的 A 至以下 1、10'、 10 、10 、10 、10 。 的 A分別至以下 Jg/m g/m g/m g/m ． g/m ． g/m 。 分別 1 度的 A 在 用的 尤 上 7 步驟 反 比 的 A 和 G 的 A的 強度以決定 的 A 。

的 特 中取50 450 得到 10'的稀 倍 再倍比 得到10 、10 、10 、10 、10 。 中分別 300 15cmx 5cm 。

的 平板 阿 5 p 37C 至有 。 合活的稀 比 例 使 平板 1200-1500 。 的比例 均勻 平板 。

37C 。 平板的大小剪取 尤 小心地覆 于平板表面不要 做 好 1 取下 尤 于 紙上 10 百至 合在 尤 上。 原始的平板 于 中4-5h 使 亞新生 作力 平板。 將 尤 于 0.25 aO 1．5 a 和的 紙上 15 不要 特移至中和 1. T . C 1．5 aC p .5 和的 紙上5 。 特移至2x C2 x C 各

aC 175. 9 88.29 p 7.0 和的 紙上自然凡 。 取下 尤 于

。

中 12 C固定45 。 常溫 于 C/ .1% 溶液中 3小 以除去細胞 碎片。 4 o he 的 特 A 在 尚 度的 上 至 尚 萬 做好 。 浸泡于40 m .25 的 C 中 2 m 使 用去萬于水 。 室溫下 中 aO .5 a 5m 。

浸泡 2 m 用去萬于水 。 都比 大 mm的 尤 用去萬于水完全 況 做好 。 向上毛細管特 方法 x C 。

的特 特 8-24h。 2x C略微 12 C烘烤 mn

。

5 和 2 m / cm2至 溫度68C 放入 尤

保溫30 。 將 G 的 A 在沸水浴中交 5 立即 于 中 即。 即 將 A 合 休 的 G 2.5m / cm2混合均勻。

。 。 立即把 A G 加入 保持 溫度64C或68C 16小 。

。 6 室溫下 2x C/ .1% 西 5 。 68C 0． x C/ .1% 西 15 。

7 反 和 的 尤 在 0. 未 0． 5 aCp 7．50.3%v/vTwee 20中平衡 1-5 接若在封閉 封閉 以 10%的 于0. 未 0． 5 aC p 7.5中封閉30 然 在 休中浸泡30 。

尤 西 0. T - C 0．1 aC p g.5中 平衡2-5 最 將 尤 于 m 新 制的 溶液中 T ob e e azo m cho de 70% F 7 mg/m CP 5-b omo-4-cho o-3- doy-pho phae 于水 mg/m 。 溶液中加45 T 35 CP] 于黑 暗中 。 合 用去萬于水 以終止反 。 6

的 得及 物分析

首先在 生菌 e om ces c os s ATCC25421的休 中 基因同 缺失的 。 所用 休 于的 p C 39Ge e 992 1 6 43-49 7109019 將 建好的 于同 缺失的 通 .co -1 5268276和 o ces c os s ATCC25421 同接合特 的方法 早入到 素的 生菌 。

中 30C 4-5 具有Am 性的接合于。 然 將 得的接合于接神到T 。

休 阿 Am 50 g/m 中30C 2-3 。 再 于含有阿

。 。 1 ngm 的 平板上 在42C整合 之友 。將 得的 在30C 10-20 的 不 阿 再 性肺 得到 阿 敏感的 。 A PCR 得 的 。 得的

PCR 在基因 上加以 同 缺失 且內部基因 。 然 和 C- 在 上加以 不再 就得到 基因 同 缺失的 。

在此 上 將 生物合成基因 中功能相似的基因和未自于 p 6212將 于序列 7z 自P omega 得的衍生 的 5 于 到整合 休p T 52Ge e 992 1 6 43-49的相 中 得到 于 的 。 將 建好的 于 的 同接合特 的方法早入到 相 基因同 缺失的 中 阿 性肺 得到 。 所得的 在基因 上 和 C- 基因的功能是一致的 7、 8、 9和 11

10 其中 7 T oc2 和 oc20分別 o 和 o 的脫水 功能。

8 T oc25 o 的 -CoA合成 功能 oc27 o 的自由 基 A 合成 功能。

9 T oc g和 oc7分別 o C和 o 的P45 氧化 功能 oc7 和 o 分別催化 的 化和 上的 化。

15 11 T ocg o A銅 蛋白的 功能。 .c JJ -1和 生菌 e om ces c os sATCC25421及同 缺失 同接合特 的方法如下

含有 尚 的大 菌培 平板上 接神到 中 吸取 。

20 200-300 1 特接到2 m 中 于37C 中 至 0．3-0．4。將 萬 等休 的 西 然 2 m 的 作力大 休細胞。

。

H 于-80C、 20%甘油保存的 o ces c os sATCC25421或同 缺失 的 于 2-3x 9 /m 10倍至500 然 等休 的T 0.05 。

p 8.0 西 于等休 的T 中 50C熱激1 m 于 。

。

25 然 加入等休 的T 37C溫浴3-4 小 萬 于5 中作力

休細胞。 將不同 度的受休細胞 100 等休 的 休細胞混合 百接 在含有 gC 的 W 4 o be ach g/ O g/ g g/ a g/ 2g/ CaC 2g/ Yea ex aC .5 / ypo e g/ Fe 7 0.00 g/ C 7 0.00 g/ z 7 0.00 g/ aga powde 20g/ p 7.2 30 或A - Yea ex aC g/ -aa e .2g/ -ag e .5g/ o be ach5 / aC 。

2.5g/ a g/ aga powde 20g/ p 7.5平板上 3 C 12-16 小 。

水 平板表面以洗去大部分大 然 在每一平板的表面

。

5 g/ 和相 抗生素的元 水。 30C 5 以上 接合于。 生菌 om ces c os s ATCC25421及 的 和 物的分 定方法

o ces c os sATCC25421或 的 于 接神到裝有5 m 于 co e20g/ Co Seep q o 30m/ pepo e5g/ CaC b35g/ 7.0的 。

250m 中 30C 27 pm 24-48小 特接 m 到裝有5 m

G co e3 g/ Co o mea g/ a 3g/ 2x aceeeme 5m/ CaC 3g/ 。

P 7.0的 中 28 C 27 pm 96-120小 。

好的 萬 去上 向 中加入 尚休 的 T m 去除固休 收集有 相 得固休粉末 于 尚休 的T 中。

20 C- V 22 m 于 Ag e zORAX - 5um 4.6x25 mm 880975-902 C 24998 07051 相各 V m /m A 0． % C C C 0． % COO 7

的 得及 物分析

將 生物合成基因 中的 基因和未自于 p 6 的 于 到整合 休p T 52的相 中 得到 于 的 。 將 建好 的 6 中 同接合特 的方法早入到 素的 生菌 Sne om ces c os s ATCC25421中 阿 性肺 得到 。 基因

再參照 6中的 和 方法 上的分析 通 C- 新 生的 素的 似 未征安 基因的功能。

10所示 oc 和 o 的銅 蛋白具有P450氧化 功能 o 16和 oc\ 分別催化 上的 化和3 上的 化。 8

生物合成基因 的

征安我們 到的 生物合成基因 的功能 我們將 5中 得到的包含 生物合成基因 的 C Y446-2-47-C2包括基因 的 基因 oc6- oc30 以及下游的 基因和 基因 oc -37C Y446-2-47- 2包括 合成基因 的全部基因 oc - oc37 各 的

2 通 合特 的方法早入到 e om ces b s 。 首先將 特化到大 T 2567 Z8002 7595187 利用阿伯拉 、 那 。

以及 特化于 。 特化于接神于 中 37C 那 。 2 g/m 、 阿伯拉 10 g/m 、 3 g/ 特接0．2m 到2 m 中37C 至 0．3-0．4 萬 收集 休 等休 的 西 于2m 中 作 力大 休細胞。 同 收集 e om ces b s 于 水 到500 5 800 pm萬 除去上 等休 的T 西 于等休 的T

。 。

中 50C熱激 于 。再 等休 的T 37C 2-5h。萬 收集 于 于0.5- m 中作力 休細胞。將不同 度的受休細胞100 等休 的 。

休細胞混合百接 在含有 m gC 的 平板上 30C 16-2 h 水 平板表面以洗去大部分大 在每一平板的表面

。

10 50 g/m 和阿伯拉 0 g/m 的元 水。 30C 5 以上 接 合于。 表面 于30 3-5 百至 表面 接合于 接合于中特 生物合成基因 的 。

一介接合于于 T 5 g/ 阿伯拉 大 于 。 上 于。 接神活量 于到活合 休生 的 的 5 休 中 30C 15 25 pm 5 。分別 萃取 和 于活量 中 C- 。 萬提取及 方法 3

表明 中可 到 其中特 C Y446-2-47-C2 的接 合于 微量的 而特 C Y446-2-47- 2的接合于可汗

0． mg

20

在本 提及的所有文 都在本 中引用作力參考 就如同每一篇 引 用作力參考那 。 此外 理解 在 本 的上 內容之 本領域 木人 可以 本 各 或修改 等 形式同 于本 要求 限定

25