【명세서】

【발명의 명칭】

항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체 【기술분야】

항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 【배경 기술】

뉴로필린 (Neuropilin; Nrp)은 뉴런에서 활성을 띠는 단백질 수용체로서. Nrpl과 Nrp2의 두 가지 종류가 있다. Νι·ρ1은 약 923개의 아미노산으로 구성되며, Nrp2는 약 926개의 아미노산으로 구성되고. 공통적으로 유사한 도메인 구조를 갖고 있으며 . 전체적으로 44 의 아미노산 상동성을 갖는다고 알려져 있다.

이 중에서 Nrpl은 처음에 축삭 유도를 조절하기 위해 플렉신 보조- 수용체와 작용하는, 세마포린 3A 리간드에 결합하는 수용체이다. Nrpl은 혈관 내피 성장인자 (VEGF)에 결합하여 혈관 발생을 매개한다. Nrpl은 다양한 종류의 인간 종양 세포주 및 인간 종양 (교모세포종, 성상세포종. 신경교종, 신경아세포종. 고환암. 대장암, 혹색종, 췌장암. 폐암. 유방암. 식도암 및 전립선암 등)에서 발현되며. VEGF 및 세마포린의 암세포의 증식, 생존 및 이동에 미치는 영향에 관여한다. 또한, Nrpl 발현 정도에 따라 암 진행 정도가 증가하거나. 암환자의 예후가 좋지 않은 것으로 알려져 있다.

한편. c-Met 은 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK (Receptor Tyrosine Kinase)로써 . 그 리간드인 HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scattering Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 많은 종류의 암세포에 과 발현되어 암 발생. 암 전이 암세포 이동, 암세포 침투. 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. 또한. HGF/SF를 통한 c-Met signaling은 거의 모든 종류의 epithelial tumor의 cell- cell contact를 약화시켜 scattering을 야기하는 대표적인 암 전이 초기단계의 단백질이다.

따라서 . Nrpl와 C— Met을 동시에 표적한다면, 암세포의 성장과 전이를 보다 효과적으로 억제할 수 있을 것이며 , 이러한 이유로 Nrpl와 c-Met을 동시에 표적하는 약물의 개발이 요구된다.

【발명의 내용】

【해결하려는 과제】

일 예는 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체를 제공한다.

상기 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 "EEPSQ' '를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

다른 예는 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

다른 예는 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는. c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대, 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다.

상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체. 약학적 조성물. 또는 방법은 c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대. 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병 . 예컨대 암 또는 암 전이의 예방 및 /또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 항암제에 대하여 저항성을 갖는 암일 수 있다.

다른 예는 상기 항 -c— Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 항암제 저항성 극복을 위한 약학적 조성물을 제공한다.

다른 예는 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는. 항암제 저항성 극복 방법을 제공한다. 다른 예는 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 항암제 저항성 극복을 위한 용도를 에공한다. 【과제의 해결 수단】

c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK (Receptor Tyrosine Kinase)로서, 세포 성장, 암 발 , 암 전이 그리고 신생 혈관 형성 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. Nrpl역시 세포성장, 암 전이 , 신생 혈관 형성 등에 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 명세서에서는 C— Met 과 Nrpl을 동시에 표적 하여, 항암 및 /또는 암의 항전이 효과가 증진됨을 제안한다.

또한. 암 세포 성장에 관여하는 c-Met과 Nrpl을 동시에 타겟함으로서. 기존의 항암제에 대하여 선척적 저항성 (innate resistance) 및 /또는 획득 저항성 (acquired resistance)를 보이는 암에서 저항성을 극복할 수 있음을 제안한다.

우선, 일 예는 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 -c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체를 제공한다. 상기 이중 특이 항체는 c-Met과 Nrpl을 동시에 인지하고 결합하여 기능을 저해함으로써 상승된 항암 효과 및 /또는 암 전이 저해 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에서 "항체 "라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 생체 내에서 생성된 것. 재조합적으로 생성된 것. 또는 인공적으로 합성된 것일 수 있으며 , 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 항체는 동물 항체. 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함한다. 한편. "상보성 결정 영역 (Complementarity-determining regions. CDR)' '라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 ^■ 의미한다. "항원 결합 단편"은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편. 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc . Fab. Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

하기하는 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 설명에서, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgGl, IgG2, IgG3. IgG4), Ig , 등)으로부터 유래한 것일 수 있고. 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 및 /또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 이중 특이 항체의 하나의 표적인 "c-Met"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236.2), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP— 001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것. 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP— 032617.2). 래트 _C - Met (예컨대, NP— 113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 돌면, GenBank Aceession Number NM_000245.2에 제공된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236.2에 제공된 아미노산 서열을 갖는 단백질. 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이. 암세포 이동, 암세포 침투. 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 판여한다.

본 발명에서 제공되는 이중 특이 항체의 또 다른 표적인 "Nrpl"은 혈관 내피 성장인자 (VEGF)에 결합하여 혈관 발생을 매개하며. 다양한 종류의 인간 종양 세포주 및 인간 종양 (교모세포종. 성상세포종, 신경교종, 신경아세포종, 고환암， 대장암, 혹색종, 췌장암, 폐암, 유방암. 식도암 및 전립선암 등)에서 발현되며 , VEGF 및 세마포린의 암세포의 증식 , 생존 및 이동에 미치는 영향에 관여한다. Nrpl은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며， 예컨대, 인간 유래의 Human Nrpl (아미노산 서열: NCBI Accession # NP— 001019799.1: 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열: NCBI Accession # NM_001024628.2; 등), 마우스 유래의 Mouse Nrpl (아미노산 서열: Accession # NP— 032763.2; 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열: NCBI Accession # NM_008737.2; 등) 등일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 이중 특이 항체에 포함된 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 (예컨대, 암세포) 표면에 발현된 Nrpl에 결합 후 내재화 (internalizing)되는 특성을 갖는다. 하기 실시예에서는 본 발명의 항- Nrpl 항체가 암세포 표면에 발현된 Nrpl에 결합된 후, 세포 안으로 내재화됨을 확인하였다. 세포 표면의 Nrpl에 결합하여 해당 부위의 하위 신호전달을 차단하는 기존의 항체와 달리. 본 명세서에서 제공되는 항체는 세포 표면의 Nrpl에 결합하여 세포 내로 들어가기 때문에, 세포 표면에 존재하는 Ni-pl의 절대적인 양을 감소시킬 수 있고. Nrpl과 관련된 모든 신호전달을 차단할 수 있어 . 기존의 항체보다 더 큰 치료효과를 기대할 수 있다.

상기 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2). 및 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드. (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄 (Heavy chain) 상보성 결정 부위 (complementarity determining region, CDR) , 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역 :

서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1). 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄 (Light chain) 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위의 조합 ; 또는

상기 증쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다:

[서열번호 139]

Xaal Tyr Xaa2 Met Ser (Xaal은 Ser 또는 Gly, Xaa2는 Tyr 또는 Ala) [서열번호 140]

Xaa3 lie Ser Pro Gly Ser Xaa4 Xaa5 Xaa6 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Xaa7 Gly (Xaa3은 Ala 또는 Gly. Xaa4는 Gly 또는 Ser, Xaa5는 Ser 또는 Asn, Xaa6은 Thr 또는 Lys. Xaa7은 Gin 또는 Lys)

[서열번호 141]

Arg Lys Xaa8 Xaa9 Phe Asp Tyr (Xaa8은 Thr, Lys. 또는 Tyr. Xaa9는 Arg. Ser , 또는 Met)

[서열번호 142]

XaalO Gly Xaall Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn Xaal2 Val Xaal3 (XaalO은 Ser 또는 Thr, Xaall은 Pro 또는 Ser, Xaal2는 Ser 또는 Asp, Xaal3은 Ser 또는 Tyr)

[서열번호 143]

Xaal4 Xaal5 Xaal6 Xaal7 Arg Pro Ser (Xaal4는 Ser 또는 Ala, Xaal5는 Asp 또는 Asn, Xaal6은 Asn 또는 Ser, Xaal7은 Asn 또는 Lys)

[서열변호 144]

XaalS Xaal9 Trp Xaa20 Xaa21 Ser Leu Xaa22 Xaa23 Tyr Val (Xaal8은

Ala 또는 Gly, Xaal9는 Ala 또는 Ser, Xaa20은 Asp 또는 Val, Xaa21은 Ser 또는 Ala, Xaa22는 Asn 또는 Ser Xaa23은 Gly 또는 Ala).

보다 구체적으로, 상기 항— Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 110 또는 121의 아미노산 서열을 포함하는 플리펩타이드 (CDR- HI). 서열번호 111, 116, 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 112. 117 또는 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 ^' 이상을 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위; 및 /또는

서열번호 113. 118, 또는 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 114, 119, 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 115, 120, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR— L3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 . 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위

를 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 【표 1】

일 예에서. 상기 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 127, 129, 또는 131의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 ;

서열번호 128. 130, 또는 132의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는

이들의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서. 상기 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 110 (CDR-H1), 111 (CDR-H2), 112 (CDR-H3). 113 (CDR-L1),

114 (CDR-L2), 및 115 (CDR-L3)의 아미노산 서열을 포함하거나,

서열번호 110 (CDR-H1), 116 (CDR-H2), 117 (CDR-H3), 118 (CDR-L1),

119 (CDR-L2), 및 120 (CDR-L3)의 아미노산 서열을 포함하거나,

서열번호 121 (CDR-H1). 122 (CDR-H2), 123 (CDR-H3). 124 (CDR-L1),

125 (CDR-L2), 및 126 (CDR— L3)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 127의 중쇄 가변영역 및 서열번호 128의 경쇄 가변영역을 포함하거나 _,

서열번호 129의 증쇄 가변영역 및 서열번호 130의 경쇄 가변영역을 포함하거나.

서열번호 131의 중쇄 가변영역 및 서열번호 132의 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 -c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 ^' 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동 (internalization) 및 분해 (degradat ion)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

HGFCHepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위. 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우. 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인 (plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도머 1인 ( inimunoglobulir like fold shared by p 1 e ί ns and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며 . C— Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서. HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 증에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 기의 아미노산 서열을 포함하는 영역은 c— Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프 (loop) 부위에 해당하며 , 본 발명에서 제안되는 항 -c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다. 용어, "에피토프 (epitope)' '는 항원 결정 부위 (antigenic determinant )로서. 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 (서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위. 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인 (서열번호 79) 내의 106번째부 ^' 터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 기의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며. 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 증 가장 바칼으로 위치한 부위에 해당하며 . 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다. 따라서, 항 -c-Met 항체는 서열번호 서열번호 기의 아미노산 서열 중 서열번호 73( EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며 , 예컨대， 서열번호 71 , 서열번호 72 , 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면， 상기 항 -c-Met 항체는.

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 . 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 , 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR ) , 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 , 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 , 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열. 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역. 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 I 내지 일반식 VI으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 I

Xaa厂 Xaa ₂ -Tyr— Tyr-Met-Ser (서열번호 4 ) . 일반식 Π

Arg-Asn-Xaa ₃ -Xaa ₄ -Asn-Gly-Xaa ₅ -Thr (서열번호 5),

일반식 m

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa ₆ -Tyr (서열번호 6),

일반식 IV

Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8 ^_ Gly-Asn-Xaa9-Xaaio-Asn-Tyr- Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 V

Trp-Xaan-Ser-Xaai2-Arg-Val-Xaai3 (서열번호 8)

일반식 VI

Xaai ₄ -Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa ₁₅ -Pro-Xaa ₁₆ -Thr (서열번호 9)

상기 일반식 I에서 . 33 ₁ 은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa ₂ 는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Π에서 , Xaa ₃ 은 Asn 또는 Lys이며 , Xaa ₄ 는 Ala 또는 Val이고. Xaa ₅ 는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 m에서. Xaa ₆ 은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 IV에서. Xaa ₇ 은 His, Arg, Gin 또는 Lys이고, Xaa ₈ 은 Ser 또는 Trp이고. Xaa ₉ 은 His 또는 Gin이며, Xaa ₁₀ 는 Lys 또는 Asn이고.

상기 일반식 V에서, Xaa _n 은 Ala 또는 Gly이며, Xaa _ir & Thr 또는 Lys이고. 33 ₁₃ 는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 VI에서 , 33 ₁₄ 은 Gly. Ala 또는 Gin이고, 33 ₁₅ 는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며 , Xaai ₆ 는 Leu, Tyr , Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR— H2는 서열번호 2. 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35. 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15. 서열번호 16, 서열번호 37. 서열번호 86. 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 증쇄 가변 영역; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30. 서열번호 31. 서열번호 32. 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR- L1). 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아마노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14. 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

이에. 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여. 상기 항 -c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실. 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 , 상기 항체는 서열번호 100. 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 1이의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면. 항 -c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 증쇄 가변 영역: 서열번호 109. 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21. 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역. 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서. 항 -c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위 (extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제 2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 -c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제 2011-0047698호 및 제 2013-0037189호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 항 -c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 증쇄 가변 영역을 제외한 부위. 예컨대 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), I M. 등)으로부터 유래하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 -c-Met 항체는,

. 서;열번호 62의 아미노산 서열 (이 증에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임). 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 증에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임)， 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 증에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열 , 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항 -c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번케부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체:

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터

460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터

462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터

461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며 , 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름. 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티던 (histkline)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여. 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 증 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치 (kabat number i rig에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린 (Ser)이 트립토판 (Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여 , 일 구체예에 따른 항체의 활성 (예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

이하, 상기 항 -c-Met 항체와 항 -Nrpl 항체에 공통된 설명을 기재한다. 원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반웅이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반웅을 억제하고자 키메릭 항체 (chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항 -아이소타입 (anti- isotype) 반웅의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항- 아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항 -이디오타입 (anti- idiotypic) 반웅에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체 (humanized ant i body)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 증 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격 ( framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식 (grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조 (crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에 , 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스 -인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다ᅳ.

완전한 항체는 2개의 전장 (ful l length) 경쇄 및 2개의 전장 증쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변' 영역은 감마 ), 뮤 ( μ ), 알파 ( α ). 델타 ( δ ) 및 엡실론 ( ε ) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마 1( γ 1), 감마 2( γ2). 감마 3 3), 감마 4( γ4). 알파 1( α 1) 및 알파 2( α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파 ( κ ) 및 람다 ( λ ) 타입을 가진다.

용어. "증쇄 (heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V _H 및 3개의 불변 영역 도메인 C _H1 , C _H2 및 C _H3 과 힌지 (hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄 (light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 및 불변 영역 도메인 C _L 을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어. "CDR(complementarity determining region)' '은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1. CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서. 용어 , "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반웅을 하는 것을 의미한다.

용어. "항원 결합 단편' '은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv) ₂ , scFv-Fc . Fab, Fab' 또는 F(ab') ₂ 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (( )을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 증쇄 C _H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab') ₂ ^' 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 ^' 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv( two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv( single— chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 증쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이를 수 있다. scFv-Fc는 단쇄 Fv와 불변 영역이 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결되어 있는 구조이다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 아미노산 길이와 종류를 적껄하게 선택할 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab') ₂ 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역 (hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이쎄 존재하며 , 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 (flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화 (chiiner izat ion) 과정을 거치게 되면. 동물 유래의 IgGl 힌지는 인간 IgGl 힌지로 치환되지만. 동물 유래 IgGl 힌지는 인간 IgGl 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합 (disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성 (rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서 , 힌지 영역의 변형 (modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시 ¾ 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실. 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

상기 항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또한, 상기 항체는 다이설파이드 -결합 Fvs(sdFV) 또는 항- 이디오타입 (항ᅳ Id) 항체일 수 있다.

본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 단편은. 각각의 항원, 즉 Nrpl 또는 c-Met을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 , 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면. 항체의 결합 친화도 및 /또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실. 삽입 및 /또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 결사슬 치환체의 상대적 유사성 . 예컨대. 소수성, 친수성 , 전하 . 크기 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 아미노산 결사슬 치환체의 크기 . 모양 및 종류에 대한 분석에 의하예 아르기닌. 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌 , 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며 ; 페닐알라닌. 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서， 이러한 고려 사항에 기초하여 , 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서. 아미노산의 소수성 인텍스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인엑스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5): 발린 (+4.2): 루이신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인 /시스타인 (+2.5): 메티오닌 ( + 1.9); 알라닌 ( + 1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (ᅳ 0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9): 타이로신 (- 1.3)； 프를린 (-1.6): 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5)； 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 _± 2 이내. 보다 바람직하게는 土 1 이내, 보다 더 바람직하게는 土 0.5 이내의 소수성 인텍스 차이를 나타내는 아미노산 간 치환을 수행한다.

한편. 유사한 친수성 값 (hydrophilidty value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 예컨대. 각각의 아미노산 잔기에 다음과 같은 친수성 값이 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0): 아스팔테이트 (+3.0士 1); 글루타메이트 (+3.0±1)； 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4): 프를린 (-0.5±1)； 알라닌 (ᅳ0.5)； 히스티딘 (- 0.5)； 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8)； 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 치환은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser. Ala/Gly. Ala/Thr, Ser/Asn. Ala/Val , Ser/Gly. Thr/Phe, Ala/Pro. Lys/Arg. Asp/Asn. Leu/I le, Leu/Val, Ala/Glu 및 /또는 Asp/Gly 간의 치환을 포함할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면. 본 명세서에 기재된 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은. 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에 . 61% 이상의 상동성, 70% 이상의 상동성, 80% 이상의 상동성 . 9 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미할 수 있다. 서열비교를 위한 정렬 (alignment) 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며 , 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www. ncbi.nlni.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help. html에서 확인할 수 있다.

일 예에서 , 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단, 예컨대 C 말단에 연결된 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다.

이 때, 상기 항 -c-Met/항— Nrpl 이중 특이 항체에 있어서. 항— c— Met 항체는 c-Met 단백질이 세포 내로 이동하고 분해되는 것을 매개하는 역할을 하므로. 이러한 역할을 은전히 수행하기 위하여 완전한 항체 구조 (예컨대, IgG 형 항체)를 갖는 것이 유리할 수 있다. 항 -Nrpl 항체는 Nrpl에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하고. 완전한 항체 구조를 갖지 않고 예컨대 scFv와 같은 항원 결합 단편 형태로도 internalization 기능이 가능므로. Nrpl를 인식하는 항원 결합 단편의 형태로 포함되어도 무방할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서 , 상기 항— c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 c-Met에 대한 완전한 형태의 항 - _C -Met 항체 (예컨대 IgG형 항체) 및 상기 항 -c-Met 항체의 C 말단 (예컨대, 항 -c-Met 항체의 증쇄의 C 말단)에 연결된 항 -Nrpl 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 또는 scFv— Fc)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체에 있어서, 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커, 예컨대. 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 -c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개, 2 내지 50개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 15개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며. 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는. 예컨대. Gly, Asn 및 /또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 /또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서. 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대. 상기 펩타이드.링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개 , 2 내지 50개 , 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서. 상기 펩타이드ᅳ 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

구체예에서. 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 항 -c-Met항체

(예컨대, IgG 형태의 항체). 및 상기 항 -c-Met 항체의 C 말단에 연결된 항- Nrpl 항체의 scFv, (scFv) ₂ , scFv-Fc , Fab. Fab ^* 또는 F(ab') ₂ , 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 _C -Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 증쇄는 N 말단 쪽에 앞서 설명한 항 -c-Met 항체의 중쇄를. C 말단 쪽에 항 -Nrpl 항체의 scFv, (scFv) ₂ , scFv-Fc. Fab. Fab' 또는 F(ab') ₂ 를, 링커를 통하거나 통하지 않고 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 145 내지 147 증에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체의 경쇄는 앞서 설명한 항 -c-Met 항체의 경쇄와 같을 수 있으며, 예컨대. 서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열. 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체는 각각 단일항체인 경우와 유사한 c-Met 또는 Nrpl에 대한 결합 친화도를 유지할 수 있다. 예컨대, 표면플라즈몬공명 (SPR; 예컨대, Biacore)으로 측정시 , 상기 상기 항 -c- Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 c-Met에 대한 친화도 (Kd)는 약 0.001 내지 50nM, 0.001 내지 30nM, 0.001 내지 ΙΟηΜ, 0.001 내지 InM. 또는 0.001 내지 0.5 nM일 수 있고, Nrpl에 대한 친화도 (1(d)는 약 0.001 내지 ΙΟΟηΜ, 0.001 내지 70nM, 0.001 내지 50nM, 0.001 내지 40nM, 0.001 내지 30nM. 0.001 내지 ΙΟπΜ, 또는 0.001 내지 InM일 수 있다.

상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 항 -c-Met 항체의 세포 내재화

(internalization.) 및 분해 (degradation) 활성에 의하여 , c— Met 및 Nrpl의 활성 저해뿐 아니라 c-Met 및 Nrpl를 분해시켜 총량 (total level)을 감소시킴으로써 보다 근본적인 차단을 가능하게 한다. 따라서 , 상기 항 -C- Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 항암제 (예컨대 . 젬시타빈 등) 및 /또는 c-Met 표적 치료제 (예컨대, 항 -c-Met 항체) 및 /또는 Nrpl 표적 치료제 (예컨대, 항- Nrpl 항체)에 대하여 저항성이 생긴 환자에 적용시에도 유효한 효과를 얻을 수 있다.

또한, 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 따라서 , 상기 항 -c- Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는, c— Met 저해제와 Nrpl 저해제의 단독 투여시는 물론이고 병용투여시와 비교하여도, 현저하게 상승된 항암 및 /또는 암 전이 저해 효과를 갖는다. 이와 같은 상승된 효과에 의하여, 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는, c-Met 저해제와 Nrpl 저해제의 단독 투여 또는 병용 투여와 비교하여 , 낮은 투여량에서도 우수한 효과를 발휘할 수 있어서. 높은 투여량에 따른 부작용을 감소시킬 수 있다.

따라서 , 본 발명의 다른 예는 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대, 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및 /또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 상기 이중 특이 항체 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항 -c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대 . 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대 , 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대 . 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 c— Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대, 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어. "예방 "은 본 발명의 조성물의 투여에 의하여 질병의 발생을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며 . "치료 "는 질병의 발전의 억제. 증상의 경감. 개선, 및 /또는 병인의 제거 (예컨대 . 종양의 경우 종양세포 또는 종양조직의 제거 )를 의미할 수 있다. ' 상기 c-Met 및 /또는 Nrpl의 과생산 (예컨대 , 과발현) 및 /또는 비정상적 활성화와 관련된 질병은, 예컨대. 암 또는 암전이일 수 있다.

따라서. 상기 항— c-Met /항ᅳ Nrpl 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 암전이의 예방 및 /또는 치료용 약학적 조성물이 제공한다. 또한. 상기 항ᅳ c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 암 또는 암전이의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암 또는 암전이의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암 또는 암전이의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 암은 Nrpl 및 /또는 c-Met의 과발현 및 /또는 비정상적인 활성화와 관련된 것일 수 있다. 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고. 예컨대. 이에 제한되지 않지만, 폐암 (예컨대 , 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암 등), 복막암, 피부암, 흑색종 (예컨대, 피부 또는 안구내 혹색종 등). 직장암. 항문부근암. 식도암. 위암. 소장암. 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암. 만성 또는 급성 백혈병. 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암. 교아종 (또는 교모세포종). 성상세포종, 신경교종 , 신경아세포종 , 고환암 . 경부암 . 난소암 . 간암 . 방광암 , 유방암 , 결장암. 대장암ᅳ 자궁내막 또는 자궁암, 침¾암, 신장암. 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 항 -cᅳ Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체는 c-Met과 Nrpl를 동시에 저해함으로써, 항암제. 예컨대. ¾시타빈 (gemc abine) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항암제 및 /또는 c-Met 표적 치료제 (예컨대. 항 -c-Met 항체) 및 /또는 Nrpl 표적 치료제 (예컨대. 항 -Nrpl 항체)에 대하여 저항성이 있거나 저항성이 생긴 암에 대해서도 항암 효과를 발휘할 수 있다.

따라서, 상기 암은 기존의 항암제. 예컨대, 젬시타빈 (gemcitabine) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항암제 및 /또는 c-Met 표적 치료제 (예컨대. 항 -c-Met 항체) 및 /또는 Nrpl 표적 치료제 (예컨대. 항 -Nrpl 항체)에 대하여 선천적 저항성 (innate resistance) 또는 획득 저항성 (acquired resistance)이 생긴 암일 수 있다.

또한, 다른 예는 상기 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체를 포함하는 항암제 저항성 극복을 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 -C- Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 항암제 저항성 극복이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 항암제 저항성 극복 방법을 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이 , 상기 항암제 저항성은 젬시타빈 (gemcitabine) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항암제 및 /또는 c-Met 표적 치료제 (예컨대. 항 -c-Met 항체) 및 /또는 Nrpl 표적 치료제 (예컨대, 항 -Nrpl 항체)에 대하여 선천적 저항성 (innate resistance) 또는 획득 저항성 (acquired resistance)일 수 있다.

상기 약학적 조성물 또는 방법에 있어서, 상기 항 - _C -Met/항ᅳ Nrpl 이중 특이 항체는 약학적으로 허용되는 담체. 희석제, 및 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제와 함께 제공될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비를, 만니를, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슴. 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스. 폴리비닐피롤리돈, 셀롤로스, 물. 시럽. 메틸 샐를로스. 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제. 윤활제. 습윤제， 감미저 1 , 향미제, 유화제, 현탁제. 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물, 상기 항 - _C -Met /항 -Nrpl 이증 특이 항체는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입 , 피하 주입 , 근육 주입 , 복강 주입. 내피 투여 . 국소 투여. 비내 투여 , 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시. 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물. 상기 항 -Nrpl 항체 또는 이의 항원 결합 단편. 또는 상기 항 Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 적절한 투여량은 제제화 방법 . 투여 방식 , 환자의 연령, 체중. 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간. 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0 .0001 내지 100 nig/kg 범위 내일 . 수 있다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나. 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 용어 "약학적 유효량 "은 상기 유효성분 (즉, 상기 항 -C- Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체)이 소망하는 효과, 즉 암을 예방 및 /또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며， 제제화 방법, 투여 방식 , 환자의 연령, 체중, 성. 병적 상태. 음식 , 투여 시간. 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액. 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제. 산제. 분말제. 과립제. 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 대상 또는 상기 예방 및 /또는 치료 방법의 투여 대상 환자는 인간. 원숭이 등의 영장류 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 상기 포유류로부터 분리된 세포 또는 조직 또는 이의 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 . 기존의 항암제에 대하여 저항성이 생긴 암환자일 수 있다.

【발명의 효과】

^' 본 발명에서 제공되는 항 -c-Met/항 -Nrpl 항체는 다음과 ^ᅵ 같은 이점을 갖는다:

1 . c-Met 저해제와 Nrpl 저해제 단독 투여 및 병용 투여 시보다 효능 증진 및 투여 농도 감소.

2. 암 성장 억제뿐 아니라 암 전이 억제에도 효능을 가짐.

3. 기존의 항암제에 대하여 저항성을 가지는 암에도 항암 효과를 발휘함.

4. 암 이외의 Nrpl 및 /또는 c-Met의 과발현 또는 비정상적 활성화가 관여하는 다른 질병에의 웅용 가능함.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 항 -c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 구조의 일 예를 보여주는 모식도이다.

도 2는 항 -Nrpl scFv 항체 단편의 생산을 위한 파지미드 백터의 일 ^• 예를 보여주는 구성도이다.

도 3은 정제된 각 항 -Nrpl scFv 항체 단편의 쿠마시 염색 결과를 보여준다.

도 4은 3종의 항 -Nrpl scFv 항체 단편들의 Nrpl에 대한 결합력을 보여주는 ELISA 결과이다.

도 5는 3종의 항 -Nrpl scFv 항체 단편들의 농도에 따른 Nrpl에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다.

도 6은 항 -c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 위암 세포주 MKN45에 대한 세포 증식 저해 효과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 항 _c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 신장암 세포주 786-0에 대한 세포 이동 저해 효과를 보여주는 형광 이미지이다.

도 8은 도 7의 형광 세기를 정량화하여 보여주는 그래프이다.

도 9는 항 -c-Met /항— Nrpl 이중 특이 항체의 신장암 세포주 786— 0에 대한 invas ion 저해 효과를 보여주는 형광 이미지이다.

도 10은 도 9의 형광 세기를 정량화하여 보여주는 그래프이다.

도 11은 항 -c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 c-Met 항체 저항성 신장암 세포주 786-0에 대한 세포 증식 저해 효과를 보여주는 그래프이다.

도 12는 잼시타빈 저항성 MKN45 세포주에서의 Nrpl 발현량을 보여주는 면역블라팅 결과이다.

도 13은 항 -c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체의 MKN45 세포주 (왼쪽) 및 젬시타빈 저항성 MKN45 세포주 (오른쪽)에 대한 세포 증식 저해 효과를 보여주는 그래프이다.

도 14는 항 -c-Met /항 -Nrpl 이중 특이 항체 처리에 따른 젬시타빈 저항성 MKN45 세포주에서의 c— Met 및 Nrpl 수준 변화를 보여주는 면역블라팅 결과이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며 , 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 참고예 1: 항 -c-Met 항체의 제작

1.1. c-Met에 대한마우스 항체 'AbF46'의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여 ,

5마리의 마우스에 한 마리당 100 /_zg의 인간의 c-Met /Fc 융합 단백질 (R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트 (Freund ' s adjuvant)를 혼합하여 4- 6 주된 BALB/c 마우스 (Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 /g을 동량의 불완전 프로인드 어주번트 (incomplete Freund' s adjuvant)과 흔합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅 (boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 /g의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 흔합물을 BALB/c 마우스 (Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고. 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장 (spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지 (DMEM, GIBC0. Invitrogen)와 흔합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 X 10 ⁸ 개와 골수종세포 (Sp2/0) 1 X 10 ⁸ 개를 흔합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지 (DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜 (PEG) (1 nie )을 처리하고. 37 °C에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지 (DMEM) 1 111 을 첨가하였다. 이후 배양배지 (DMEM) 10 ^을 1분 동안 첨가하고, 37 ^° C의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 inC로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지 (HAT 배지 )에 l~2xl0 ⁵ /m ⁽ i 정도로 재현탁시키고. -웰 (well) 플레이트에 0.1 ^씩 분주한 후 37°C 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1. 1.3. c-Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1 . 1 .2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반웅하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met /Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met /Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ( 2 씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반웅하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1. 1 . 2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 씩을 가하여 1 시간 동안 반웅시킨 후 인산 완층용액- 트원 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반웅하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG—호스래디쉬 퍼옥시다제 (goat ant i -mouse IgG- HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반웅시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액 (opD)을 가하여 반응시키고 _, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여 . 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 C— Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석 ( l im i t i ng d i l ut i on)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제 2011-0047698 참조) . 1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지 (DMEM) 배지 50 m l서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ιιι(' PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 . 상기 세포 침전물을 배양 배지 (DMEM) 배지 50 nie에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37 ^° C 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후. 원심분리하여 , 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 . 4 ^° C에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼 (Protein G agarose co 1 iimn； Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기 (GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ιιι(! 내지 300 nie로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 웅집용 필터 (Am icon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c-Met에 대한 키메릭 항체 chAbF46의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응 (inii inogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여 , 상기 참고예 1.1.4에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터. 항원 결합에 관련된 변이 영역 (variable region)을 제외한 불변 영역 (constant region)을 인간 IgGl 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequenceᅳ VH- NheI_CH-TGA-XhoI' (서열번호 38)로. 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI -signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA—XhoI' (서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO™ Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOpt iVEC™-T0P0 TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편 (서열번호 38)을, pcDNA™3.3-T0P0 TA Cloning Kit (Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편 (서열번호 39)을 각각 EcoRKNEB, R0101S)과 XhoKNEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써. 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 백터 및 경쇄를 포함하는 백터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 백터는 각각 Qiagen Max i prep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle™ MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며. FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5xl0 ⁵ cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 lxl0 ⁶ cells/nil이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle™ MAX reagent (invitrogen^ 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입 (transfection)을 진행 하였으며 , 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=l:l 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고 (A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle™ MAX reagent 100/ 와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후. 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ^° C. 80% humidity, 8% C0 ₂ , 130 rpni incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼 (GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/niin의 유속으로 홀려준 후. IgG el ut ion buffer (Thermo Scientific. 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하. chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46으로부터 인간화항체 huAbF46의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화 (Heavy chain humanizat ion)

Hl-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://醫 w.ncbi .nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선 (germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2. CDR— H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-기의 골격 (framework)에 도입되도톡 디자인하였다. 이때, 30번 (S→T), 48번 (V→L), 73번 (D→N), 78번 (Tᅳ L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, HI은 추가로 83번 (R→K)과 84번 (A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 Hl-heavy (서열번호 40)와 H3-heavy (서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격 ( framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에. 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR— HI, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화 (Light chain humanization)

HI一 light (서열번호 43) 및 H2-light (서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여 . Ig Blast (http://www.ncbi .nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 , 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, Hl-light는 36번 (Y→H), 46번 (L→M), 49번 (Y→I) 3개의 아미노산을 back- utation 하였으며. H2— light는 49번 아미노산 (Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light (서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast

(http://而 w.ncbi .nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2— 40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며， 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3- light는 36번 (Y→H), 46번 →¾ , 49번 (Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light (서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격 (framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vkl subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR— L3를 도입하였다. 이때, H4— light는 36번 (Y→H), 46번 →¾1), 49번 (Υ—Γ) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO™ Ant i body Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 _P 0ptiVEC™-T0P0 TA Cloning Kit에 상기 증쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편 (Hl-heavy; 서열번호 47, H3-heavy: 서열번호 48. H4_heavy; 서열번호 49)을 pcDNA™3.3-T0P0 TA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편 (H1- light; 서열번호 50. H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4- light; 서열번호 53)을 각각 EcoRKNEB, R0101S)과 XhoKNEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 백터를 구축하였다.

상기 구축된 백터는 각각 Qiagen Max i prep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며 , 임시발현은 Freestyle™ MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Mediimi를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5xl0 ⁵ cells/ml의 농도로 준비한 후， 24시간이 지난 뒤 cell수가 lxl0 ⁶ cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle™ MAX reagent (invitrogen^ 사용한 liposomal ιᅳ eagent법으로 형질도입 (transfection)을 진행 하였으며 , 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=l:l 의 비율로 DNA를 준비하여 Opt i Pro™ SFM (invtrogen) 2nil과 mix하고 (A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle™ MAX reagent 100/ 와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 흔합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ^° C, 80% humidity, 8% C0 ₂ . 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고. AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼 (GE healthcare. 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 nil/min의 유속으로 홀려준 후, IgG el Lit ion buffer (Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편 . 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light (서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46항체의 scFv라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv'를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커 -VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS' (서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며 . 이를 발현시키기 위한 백터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 백터로부터 발현된 결과물을 분석하여 , c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙 (affinity maturation)을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙 (affinity niaturat ion)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위 (complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat r inibering'에 의하여 정의하였으며， 각각의 CDR은 하기 표 2와 같다.

【표 2】

CDR-L2 WASTRVS(서열번호 11 ⁾

CDR-L3 QQSYSAPU (서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 ( 25¾ A . 25% G , 25% C . 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여 , 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형 (wi l d-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게 (33% G . 33% C , 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46항체의 라이브러리 제작 및 c-Met에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1. 5. 1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 , 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고. 이를 증복 확장 중합효소연쇄반응 (over l ap ext ens i on PCR) 방법을 통하여 . 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의

CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며, 각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 7과 같으며 . 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 증에서. L3-1 . L3-2. L3-3. L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

【표 3】

1.7. 선별된 항체의 IgG로의 변환

선별된 4종의 항체의 증쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI- si gnal sequence-VH-Nhel-CH-XhoI' (서열번호 38)로 구성되며 , 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역 (hinge region)은 인간 IgGl의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지 (서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도톡 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며 . 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO™ Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOpt iVEC™-T0P0 TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편 (서열번호 38)을, pcDNA™3.3-T0P0 TA Cloning Kit (Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 껄편 (L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58. L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 껄편 : 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편 : 서열번호 60, L3- 5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRKNEB. R0101S)과 XhoKNEB. R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 백터를 구축하였다ᅳ

상기 구축된 백터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며. 임시발현은 Freestyle™ MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며 , FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5xl0 ⁵ cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 lxl0 ⁶ cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle™ MAX reagent ( invi ti'ogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입 (transfection)을 진행 하였으며 , 15ml ibe에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=l:l 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고 (A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle™ MAX reagent 와 OptiPro™

SFM 2ml을 mix(B)한 후. (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 흔합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ^° C, 80% humidity. 8% C0 ₂ . 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml 을 취하고, AKTA Prime (GE heal thcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime 에 Protein A 컬럼 (GE healthcare. 17-0405— 03)을 설치하고 배양액을 5 nil/min 의 유속으로 홀려준 후. IgG el Lit ion buffer (Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buf fer 로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체 (이하. huAbF46-H4-Al( L3-l 유래) . huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래) , huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래) , 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다. 1.8. 불변영역 및 /또는 힌지영역이 치환된 huAbF46-H4-Al의 제조 상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서. c-Met 과의 결합친화도가 가장 높고. Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-Al을 대상으로. 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-Al의 중쇄 가변영역 , U6-HC7 힌지 및 인간의 IgGl 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4— A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 (kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46ᅳ H4- A1(U6-HC7 )으로; huAbF46-H4— A1의 중쇄 가변영역. 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgGl 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46_H4-Al의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 hiiAbF46-H4- Al( IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-Al의 중쇄 가변영역 , 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-Al의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46ᅳ H4- Al( IgG2 Fc )로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (hi st i dine )을 모두 티로신 ( tyros ine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해. huAbF46-H4-Al의 중쇄 가변영역 , U6- HC7힌지 및 인간의 IgGl 불변영역으로 이루어진 폴리펩타이드 (서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 63) . huAbF46-H4-Al의 중쇄 가변영역 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgGl 불변영역으로 이루어진 폴리펩타이드 (서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 65) , huAbF46-H4-Al의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩타이드 (서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 67) , 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-Al의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩타이드 (서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO™ Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOpt iVEC™-T0P0 TA Cloning Kit 에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을, pcDNA™3.3-T0P0 TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여 , 상기 항체의 발현을 위한 백터를 구축하였다.

상기 구축된 백터는 각각 Qiagen Max i prep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle™ MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며 , FreeStyle™ 293 Expression Medium 를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5xl0 ⁵ cells/i 의 농도로 준비한 후， 24시간이 지난 뒤 cell 수가 lxl0 ⁶ cel ls/ml 이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle™ MAX reagent ( invi trogen)을 사용한 lipos에 lal reagent 법으로 형질도입 ( transfect ion)을 진행 하였으며 , 15ml tube 에 증쇄 DNA: 경쇄 DNA=l:l 의 비율로 DNA 를 준비하여 Opt i Pro™ SFM (invtrogen) 2ml 과 mix 하고 (A), 또 다른 15ml tube 에 Freestyle™ MAX reagent ^' 100/ 와 Opt i Pro™ SFM 2ml 을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix 하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 흔합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ^° C, 80% humidity, 8% C0 ₂ , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다. 상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼 (GE healthcare, 17— 0405-03)을 설치하고 배양액을 5 nil/min의 유속으로 홀려준 후, IgG elution buffer (Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체0111/1 464¼-/1 6- 7). huAbF46-H4-Al(IgG2 hinge), huAbF46-H4-Al( IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 -c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-Al(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 항 -c-Met 항체 SAIT301로 명명하였다. 참고예 2. 항 -Nrpl항체 제조

2.1. 환자 유래 세포를 이용한 내재화 (internalizing) 항체 동정 항 -Nrpl 항체 단편 동정 위한 세포 패닝 (cell panning l 필요한 세포를 선별하기 위해 사업단 (삼성서울병원 난치암연구사업단)에서 보유하고 있는 환자 유래 세포들 중. Nrpl의 발현수준이 높은 세포들을 FACS( Fluorescence Activated Cell Sorting) 방법으로 선별하였다. 이들 중 가장 많이 표면에 Nrpl을 발현하는 131 세포 (Nat ionar Cancer Institute (NCI) 기관에서 얻은 환자 유래 세포)를 세포 패닝에 이용하였다.

기존에 제작된 합성 scFv 항체 단편 파지 라이브러리 (Yang et al . , Mol . Cells, 27:225- 235, 2009)를 이용하여 인간 Nrpl에 결합하는 scFv 항체 단편을 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 동정하였다. 대장균 숙주 ER2537 (New England Biolab) 내에 도입되어 있는 파지미드 (phagemid) 백터를 파지 (phage) 형태로 회수하기 위해 4개의 하위 라이브러리 샘플을 각 400m (！의 배양배지 (SB/암피실린 / 글루코오스)에서 2시간 동안 배양하였다. 0.D 600에서 흡광도가 0.5-0.7 정도되면 5000 g에서 20분동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 400 ηι(의 2차 배양배지 (SB/암피실린) 내에 부유시킨 다음. 10 ¹² pfu(plaque forming unit)의 헬퍼 파지 (VCSM13; Stratagene)를 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 그 다음, 카나마이신 항생제 (헬퍼 파지 내 도입된 항생제 유전자)를 70 //g/nie 첨가한 후 30 ^° C에서 밤샘 배양을 하여 파지 라이브러리가 숙주 세포 외로 분비될 수 있도록 하였다. 이어 원심분리를 통해 얻은 배양물을 PEG(polyethylene glycol) 용액을 이용해 파지 형태만 침전시켜 파지 라이브러리를 얻었다.

이렇게 얻어진 파지 라이브러리와 Nrpl 발현이 높은 환자 유래 세포 인 131 세포 (4 X 10 ⁶ 개)를 섞어 총 5 lii NBA(neurobasal medium)에 넣고, 4 ^° C의 회전기에 고정시킨 후 1-2시간 동안 360도로 회전시켰다. 그 다음 131 세포에 결합하지 않은 파지입자들을 제거하기 위해 300 g에서 5분간 원심분리하여 세포를 분리시킨 후 다시 5 me NBA를 넣는 세척 과정을 진행하였다. 이 과정을 4차례 반복하였고. 마지막 과정에서는 미리 37 ^° C의 인큐베이터에 둔 NBA 5 nie를 사용하여 131 세포와 파지들을 T 플라스크에 넣어 37 ^° C에서 30분간 배양시켜 세포 표면에 붙은 파지입자들이 내재화 (internalization)을 통해 세포 안으로 들어가게 유도하였다.

다음 15 m 튜브 (conical tube)에 옮긴 후 300 g에서 5분간 원심분리시켜 세포를 분리시킨 후, 이 과정을 차가운 PBS( Phosphate buffered saline) 5 πι 을 넣는 세척 과정을 6번 반복하여 수행하고, 세포 패닝 회차가 거듭될수록 이 과정의 횟수를 증가시켰다. 이후, 0.1 Μ 글리신 (ρΗ 2.2) 5 me를 넣고, 상온에서 5분간 두어 세포 표면에 있는 파지입자들을 세포 표면으로부터 분리시켰다. 이후. 300 g에서 5분간 원심분리시켜 세포만 분리시켜 0.5 m 100 mM TEA를 넣고, 이를 e-튜브에 옮겨 상온에서 15분간 두었다. 다음으로, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 세포 찌꺼기를 분리하여 세포 안에 있는 파지 입자들이 있는 상층액을 따서 1 in. 2M TrisCpH 8)와 섞어 중화시킨 후, 미리 키워놓은 ER2537이 들어있는 8.5 m(의 배양 배지 (SB)에 넣고, 37 ^° C에서 120 rpm으로 배양시켜 파지입자들을 대장균 숙주인 ER2537에 감염시켰다. 이후, 3.000 rpm으로 15분간 원심분리시켜 가라앉은 ER2537을 배양배지 (SB) 500 ^로 섞은 후. 15 cm 배양배지에 도말하여 배양 후 5 의 SB 배양배지 (50% 글리세를)를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관 (- 80 ^° C)하였다. 이어 반복되는 세포 패닝 회차를 진행하기 위해 보관된 전 회차 파지 용액 중 1 m ⁽ '를 취해 파지 입자 증폭 작업을 수행하였다. 숙주세포인 ER2537에 배양 후 헬퍼 파지를 넣어 희수된 파지입자들은 PEG 침전을 통해 분리하였고, 이를 다음 회차 패닝 때도 동일하게 사용하였다. 3회차 패닝을 수행하였다. 회차가 거듭될수록 패닝 전 대비 후의 파지입자의 비율이 증가됨을 확인하였고, 이는 세포 패닝을 거쳐 내재화된 파지입자들이 증폭됨을 의미하며 , 이의 결과를 표 4에 나타내었다.

【표 4】

2.2. 항 -Nrpl scFv후보 선별을 위한 ELISA 및 서열 분석

3회차 세포 패닝에서 회수된 파지 입자들을 숙주세포 (ER2537) 감염을 통해 배양배지에서 콜로니로 확인하였다. 이 콜로니들을 취하여 200 ιΛ SB/암피실린 배양배지가 담긴 96-웰 플레이트에 접종 후 37 ^° C 2-3시간 동안 배양하였다.

그 다음. scFv-pm 단백질 발현 유도를 위해 각 웰에 최종농도 1 niM의 IPTGdsopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하고 30 ^° C에서 밤샘 배양하였다. 배양한 플레이트는 3.000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 배양세포 주변세포질 (periplasm) 내에 있는 파지입자를 회수하기 위해 각 웰 당 40 ^의 TES 용액 (20% w/v 수크로오스, 50 mM Tris. 1 niM EDTA. pH 8.0)을 넣고, 4C에서 30분 동안 정치함으로써 세포를 용해시켰다. 이후 60 / 의 0.2X TES 용액을 처리하여 4 ^° C에서 30분 동안 두어 삼투압으로 세포를 분해시킨 다음, 플레이트를 3,000 rpm 15분간 원심분리시켜 상층액의 scFv-pm 단백질을 얻었다.

미리 준비한 인간 Nrpl 단백질이 코팅된 96—웰 플레이트에 얻은 상층액 중 25 '를 각 해당 웰에 첨가한 후 1시간 동안 실온에서 결합시킨 다음, TBST와 증류수를 이용해 6번 세척하였다. 이후. scFv-pm 의 HA tag에 결합할 수 있는 HRP가 결합된 항 -HA 항체를 이용해 1시간 동안 실은에서 결합시킨 후, 다시 TBST(0.1¾ Tween20)와 증류수를 이용해 6번 세척하였다. TMB 용액을 이용한 발색반웅을 유도한 후 H ₂ S0 ₄ 용액으로 발색반응을 멈추고, 0.D 450 體에서 그 값을 측정하였다.

총 분석된 클론 수는 384개였고, 이 증 41개의 클론 (결합능배수 > 2)이 인간 Nrpl에 대한 높은 결합능을 보였다. 대조군으로는 BSA 용액이 사용되었으며 . 이 41개 클론 중 재확인 ELISA를 통해서 결합능이 높은 10개의 클론들을 선택하였다. 이후, 10개의 클론들로부터 파지미드를 회수한 다음 DNA 서열분석을 진행하였고, 총 6개의 다른 서열을 지닌 클론들을 선별하였다. 1C08과 동일한 서열인 3H10올 제외하고는 각 다른 서열을 지닌 클론들이 선별되었고. 최종적으로 3H10, 1A03 및 4F12 클론을 항 -Nrpl scFv 후보로 선택하였다. 상기 선택된 3H10, 1A03 및 4F12 클론의 CDR 아미노산 서열. 가변영역 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 DNA 서열을 표 5 및 표 6에 나타내었다.

【표 5】 항 -Nrpl scFv의 CDR 아미노산 서

【표 6】

항 -Nrpl scFv의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영

2.3. 항 -Nrpl scFv생산 및 Nrpl 결합능 확인

파지미드의 기본 구성은 도 2에서 확인할 수 있으며 , 위의 실시예에서 사용된 숙주세포 ER2537의 경우 phage ρΙΠ 앞에 위치한 전사억제 코돈 ( amber codon(UAG) )을 억제하기 때문에 scFv 단독 발현이 불가능하다. 따라서 비억제 숙주 (non-suppressor strain)인 발현균주 (TOP10F '； Thermo Fi sher Scientific)를 이용하여 파지미드를 발현균주 내로 형질도입 하였다. 이후. DNA 서열분석을 통해 각 파지미드가 돌연변이 없이 도입된 발현균주를 확인하였고, 이 발현균주를 콜로니로 취한 다음 LB/암피실린 배양배지 3 에 접종 후 37°C에서 밤^ 배양하였다. 이후, 밤¾ 배양시킨 배양액 3 niC은 400 mi 배양배지 (SB/암피실린)로 옮겨 0.D 600에서 0.5-0.7이 될 때까지 배양하였고, 최종 농도 1 mM IPTG를 첨가하여 30°C에서 밤샘 배양하였다. 배양액은 원심분리 후 TES 용액 40 m(i을 이용하여 발현숙주를 용해시킨 후, 0.2X TES 60 ιιιί을 투입해 세포주변질 내 파지입자를 회수하였고. 회수한 상층액은 0.45 iM 필터를 통해 여과하였다. 여과된 용액 내에 존재하는 scFv 단백질은 His-tag 정제를 위해 Ni-NTA bead(Qiagen)l nit'이 첨가되어 상온에서 1시간 결합되었고, 이후 중력 컬럼 (gravity column, Bio-rad)에 패킹되어 200 ηιΜ 이미다졸 용액을 통해 회수하였다. 각 클론의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색 (coomassie blue staining)을 통해 scFv 해당 크기인 약 28 kDa을 확인하였다 (도 3).

정제된 scFv를 이용해 ELISA를 진행하여 표적 Nrpl에 대한 결합능이 존재하는지 확인하였다. ELISM3번 반복)로 200 ng Nrpl 단백질을 코팅한 96웰과 대조군인 BSA 200 ng을 코팅한 96웰에 각 클론 당 5 ^g/mC 수준으로 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후, 0.1% TBST를 이용해 3회 세척한 다음 HRP가 결합된 HA 항체를 1시간 동안 처리하고, 다시 한 번 세척한 후 TMB 용액으로 5분간 정치시켰다. 그리고, 2M 황산용액으로 발색반응을 정지시킨 후 0D 값을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이 . Nrpl에 결합하지 않는 12B scFv (비교항체: 아미노산 서열: 서열번호 151; 코딩 DNA 서열: 서열번호 152)에 비해 1A03, 3H10 및 4F12 scFv는 Ni ^' pl에 대한 특이적인 결합능을 보였다.

다음으로, 인간 Nrpl에 대한 각 항체 단편의 농도에 따른 결합능을 측정하기 위하여. 각각 200 ng의 Nrpl 또는 BSA가 코팅된 96웰에 각 scFv를 2.000 ng/me, 1,000 ng/mt, 500 ng/ni . 250 ng/nif, 125 ng/mt. 62.5 ng/mi, 31.25 ng/me, 또는 15.62 ng/mi 농도로 처리하여 0D 값 (460nm) 변화를 분석하였다. 상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 나타난 바와 같이 , Nrpl에 대한 결합능에 있어 , 12B scFv의 경우에는 농도 변화에 따른 0D 값의 변화가 없는 반면, 3H10 및 4F12 scFv의 경우에는 고농도로 갈수록 BSA 대비 Nrpl에 결합한 scFv가 증가함을 0D 값 변화를 통해 확인할 수 있었다.

3종의 scFv 항체 단편의 Nrpl 단백질에 대한 결합능의 세기를 수치 화를 통해 정확하게 알아보고자 표면 플라스몬 공명 (SPR, surface plasmon resonance) 장비인 biacore T100을 이용해 ka와 kd 값을 통한 최종적인 KD 값을 얻었다. KD 값은 kd 값을 ka 값으로 나눈 값으로 낮을수록 해당 물질에 대한 결합능이 크다. 분석 결과. 4F12 scFv의 경우 KD(M) 값이 73.60 X 10 ^{" 9} 로 가장 낮았고. 이어 1A03 scFv는 89.40 X 10— ⁹ 의 KD(M) 값을 나타냈으며. 3H10 scFv는 295.4 X 1(Γ ⁹ 의 D(M) 값을 나타내었다. 실시예 1: 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 -c— Met 항체 SAIT3()1의 Fc의 c-말단에 상기 참고예 2.2에서 준비된 3종의 항 -Nrpl 항체의 scFv (3H10, 1A03 또는 4F12)를 융합한 이중 특이 항체를 제작하였다. 그 제작 과정은 아래와 같다. 우선, 상기 이중 특이 항체 클로닝에 이용된 SAIT301 항체의 중쇄 부분은 다음과 같이 제작하였다. 항— c-Met 항체의 중쇄 코딩 염기서열은 서열번호 67의 position 1396부터의 C-terminal 쪽 서열을 삭제하고, 그 대신 ggcggtggtggttccggaggcggcggatcc을 압입하여 합성하였다 (바이오니아).

이후, Iiwitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOpt i VEC™-T0P0 TA Cloning vectoiᅳ에 상기 DNA ¾편을 ligate하였다.

한편. 3종의 항— Nrpl scFv의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 펩타이드 링커 (G ₄ S) ₂ 로 연결된 항 -Nrpl scFv를 제작하였다 (바이오니아에 의뢰하여 합성; N-terminal BamHI 제한 효소 인식부위 및 C-terniinal Xhol 제한 효소 인식 부위 포함 형태) .

그 후, BamHI 제한 효소와 Xhol 제한 효소를 사용하여 상기 제작된 항- Nrpl scFv을 앞서 준비된 SAIT301 부분이 포함되어 있는 백터에 클로닝하여 , 상기 이중 특이 항체의 중쇄를 포함하는 발현 백텅를 구축하였다.

상기 구축된 이중 특이 항체의 중쇄 (항 -c-Met 항체의 중쇄의 C 말단과 항 -Nrpl scFv (3H10, 1A03 또는 4F12)의 N 말단이 (G ₄ S) ₂ 링커로 연결됨)의 아미노산 서열을 서열번호 142 내지 144에 각각 나타내고, 이들을 코딩하는

DNA 서열을 서열번호 145 내지 147에 각각 나타내었다.

또한. 항 -c-Met 항체의 경쇄 코딩 염기서열은 서열번호 69의 염기서열을 갖도록 합성하였다 (바이오니아). Invitrogen 사의 OptiCHO™ Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA™3.3-T0P()

TA Cloning vector (Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 이중 특이 항체의 경쇄 (서열번호 68)를 발현하는 백터를 구축하였다.

상기 구축된 중쇄 발현 백터와 경쇄 발현 백터는 각각 Qiagen Max i prep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며 , 임시발현은 FreestyleTM MAX

293 Expression System ( invi trogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293F cell 이며. FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를

5xl0 ⁵ cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 lxl0 ⁶ cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent

( invitrogen)을 용한 liposomal reagent법으로 형질도입 (transfect ion)을 ^; 진행 하였으며. 15ml tube에 중쇄 DM: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM ( invtrogen) 2ml과 mix하고 (A) . 또 다른 15ml tube에

FreestyleTM MAX reagent 100// ('와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후. 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ^° C, 80% humidity, 8% C0 ₂ , 130 rpm incLibator에서 4일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA

Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE healthcare. 11-0034-95)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 홀려준 후, IgG e hit ion buffer (Thermo Scientific,

21004)로 용출시킨 다음, 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하였다.

상기 제작된 항 -c-Met 항체 SAIT3()1의 cᅳ말단에 3종의 항 -Nrpl scFv가 각각 융합된 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체를 아래의 표 7에 정리하였다.

【표 7】 이증항체 항 -c-Met 항체 항" "Nrpl scFv 증쇄 경쇄

MN02 1A03 서열번호 145

麵: 서열번호 148)

03 3H10 서열번호 146

SAIT301 서열번호 68

(DNA: 서열번호 149)

N04 4F12 서열번호 147

(DNA: 서열번호 150) 실시예 2: 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 c-Met 및 Nrpl에 대한 결합 친화도

상기 실시예 1 에서 제작된 3종의 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 c-Met에 대한 친화도를 Biacore TIOO(GE)을 사용하여 각각 확인하였다. 인간 Fab 결합제 (#28-9583-25. GE Healthcare)를 CM5 칩 (#BR- 1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90 120 RU의 이중 특이 항체 MA01를 포획하고, 다양한 농도의 _C -Met -Fc(#358-MT/CF. R&D Systems)를 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 lOmM Glycine-HCKpH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다 (regenerated). 친화도를 측정하기 위하여 , 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation softvvare(GE Healthcare, Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

또한, 상기 실시예 1에서 제작된 3종의 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 Nrpl에 대한 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 각각 확인하였다. Anti-histidine antibody (R&D Systems)를 CM5 칩 (#BR- 1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. C-terminal hi st idine-tagged human Nrpl (R&D Systems)를 포획하고, 다양한 농도의 이중 특이 항체를 상기 포획된 항원 (Nrpl)에 주입하였다. 여기에 lOniM Glycine-HCl (pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다 (regenerated). 친화도를 측정하기 위하여 . 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation soft war e(GE Healthcare. Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 8에 나타내었다:

【표 8】

이중항체 KD against c-Met KD against Nrpl KD against Nrpl ,

(nM) (nM) scFv. ( iiM )

MN02 0.08 22.31 138.5 MN03 0.09 11.43 67.21

MN04 0.05 0.38 0.62

표 8에서, "KD against c-Met' '은 이중항체의 c-Met에 대한 결합 친화도. "KD against Nrpl"는 이중항체의 Nrpl에 대한 결합친화도. " KD against Nrpl, scFv,' '는 항 -Nrpl scFv의 Nrpl에 대한 결합친화도를 각각 나타낸다.

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이 , 항 -c-Met/항 -Ni-pl 이중 특이 항체는 단일 항체에서와 유사한 수준으로 c-Met 및 Nrpl에 대한 결합력을 유지하는 것을 확인할 수 있다. 실시예 3: 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 암세포 성장 저해 효과 상기 실시예 1에서 제작된 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 암세포 사멸 효과를 위암 세포주 MKN45를 대상으로 시험하였다.

구체적으로, MKN45 세포 (JCRB0254) 5000개를 배지 (GIBCO RPMI 1640, lOOul/well)를 포함하는 각 웰에 분주하고， 여기에 상기 실시예 1에서 제작된 3종의 이중 특이 항체를 각각 60nM(l treatment for 5 days)의 양으로 5일동안 처리하였다. 세포수 변화는 CellTiter Glo (CTG) assay 를 통해 측정하였다. 구체적으로, 5일동안 인큐베이팅 후 CTG 용액 (Pr에 iega) 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가한 후. 실온에서 30분간 인큐베이팅하였다. 상기 얻어진 발광 신호를 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer , Walt ham, Massachusetts, USA)를 사용하여 기록하였다.

비교를 위하여, 항체 무처리군 (control), 상기 참고예 1에서 제작된 항 -c-Met 항체 SAIT301 단독 처리군 (60nM), 항 -Nrpl 항체 단독 처리군 (1A: 참고예 2.2의 1A03 클론의 6개 CDR 을 포함하는 IgG 항체: 3H: 참고예 2.2의 3H10 클론의 6개 CDR 을 포함하는 IgG 항체; 4F: 참고예 2.2의 4F12 클론의 6개 CDR 을 포함하는 IgG 항체; 각각 60nM)). 및 참고예 1에서 제작된 항 _c- Met 항체 SAIT301와 항 -Nrpl 항체 (1A, 3H, 4F)의 병용 처리군 (각각 60nM))에 대해서도 상기와 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이 , 항- c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체들은 항 -c-Met 항체 단독 투여 및 항 -Nrpl 항체 단독 투여시는 물론 이들의 병용 투여시보다 우수한 항암 세포 성장 저해 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다. 실시예 4: 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체에 의한 암세포 전이 억제 실시예 1에서 제작된 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체가 암세포 움직임 (motility)에 주는 영향을 관찰하였다. 상기 이중특이항체의 VEGF+HGF 처리에 의한 암세포 이동 (migration)에 대한 억제 효과를 시험하였다. 시험을 위하여 참고예 1에서 제작된 항 - _C -Met 항체 SAIT30H1 저항성을 가지는 신장암 세포주 786-0 (ATCC)를 사용하였다 (SAIT301 단독 처리시 항암효과 없음). 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체에 의해 VEGF 및 HGF에 의해 유도된 세포 이동이 억제되는지 여부를 확인하기 위해. Oris Migration System(Platypus Thechnologies)을 이용한 세포 이동 어세이 (niigrat ion assay)를 수행하였다.

구체적으로, 신장암 세포주 786—0 (ATCC)를 각 웰당 5으000개의 양으로 stopper가 장착된 96-well plate에 접종하였다. 24시간 동안 배양 후. 상기 stopper를 제거하고, HGF 0.1 ug( microgram) /ml 및 VEGF 0.1 ug/ml가 첨가된 RPMI 배지 (10% FBS 포함: GIBC0)에서 상기 실시예 1에서 제작된 각각의 이중 특이 항체 (각각 60nM)로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 상기 세포들을 Hoechst 33.342 (bisbenzimide; Life Technologies)로 처리하여 가시화시켰다. 세포 이동 (cell niigrat ion)은 Hoechst 33342로 염색된 핵을 갖는 세포 수를 세어서 측정하였다. 세포 수 측정은 InCell Analyzer 6000 (GE Healthcares)를 사용하여 수행하고, 얻어진 결과는 VEGF+HGF만 처리한 군 (100«에 대한 상대값으로 변환시켰다.

비교를 위하여 , 항체 무처리군 (vehicle만 처리. HGF만 처리, VEGF만 처리 . 및 VEGF+HGF만 처리), 상기 참고예 1에서 제작된 항 -c-Met 항체 SAIT301 단독 처리군 (60nM), 및 상기 참고예 2.2에서 제작된 클론의 6개 CDR3을 포함하는 항 -Nrpl 항체 각각의 단독 처리군 (60nM)에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 가시화 결과 (형광 이미지)를 도 7에 나타내고， 도 7의 형광 세기를 정량화한 그래프를 도 8에 나타내었다. 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 항 -c-Met/항— Nrpl 이중 특이 항체는 SAIT301와 항 -Nrpl 항체를 ^■ 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여, VEGF+HGF에 의한 세포 이동 (migration) 억제에 있어서 우수한 상승 효과를 보였다.

또한, 이중 항체의 암전이 저해 효과를 시험하기 위하여 , 신장암 세포주 786-0에 대한 항체의 Invasion 저해 정도를 시험하였다.

항체 처리에 의한 invasion 저해 효과를 확인하기 위하여. BioCoat Growth Factor Reduced MATRIGEL Invasion Chamber (BD science. Cat#. 354483)를 사용하였다. 상기 버는 상부 챔버와 하부 챔버로 나뉘어져 있으며. 상부 챔버는 제조자 설명서 (manufacturer's manual)에 따라서 콜라겐으로 코팅하여 사용하였다.

신장암 세포주 786-0 (ATCC: 10 ⁵ cells/well)를 상부 챔버에 접종하고. 하부 챔버는 실시예 1에서 제작된 각각의 이중 특이 항체 (각각 60nM)로 처리한 후, 37 ^° C에서 배양하였다. 이 때 하부 버에는 VEGF 또는 HGF를 각각 0.1 ug/ml의 양으로 첨가하였다. 24시간 후. 상부 챔버의 콜라겐 층을 뚫고 하부 버로 이동한 세포를 calcein AM (BD)로 염색한 후 형광 현미경 (ZEISS)으로 관찰하고, 형광 세기를 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer)로 정량화하였다.

비교를 위하여, 항체 무처리군 (VEGF+HGF만 처리), 상기 참고예 1에서 제작된 항 -c-Met 항체 SAIT301 단독 처리군 (60nM), 및 상기 참고예 2.2에서 제작된 클론의 6개 CDR3을 포함하는 항 -Nrpl 항체 각각의 단독 처리군 (60nM)에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 형광 이미지를 도 9에 나타내고, 형광 세기를 정량화한 그래프를 도 10에 나타내었다. 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 항 -C- Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체들은 항 -c-Met 항체 단독 투여 및 항 -Nrpl 항체 단독 투여시는 물론 이들의 병용 투여시보다 우수한 암세포 invasion 저해 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다. 실시예 5: 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체에 의한 항 -c-Met 항체 저항성 극복 시험

항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체의 c-Met 표적 치료제에 대한 저항성 극복 가능성을 확인하기 위하여. 참고예 1에서 제작된 항 -c-Met 항체 SAIT3()1에 저항성을 가지는 신장암 세포주 786-0를 사용하였다 (SAIT301 단독 처리시 항암효과 없음). 실시예 3을 참조하여, 상기 세포 5000개에 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체를 각각 60nM의 농도로 처리하고 3일 이후에 CellTiter Glo assay를 통해 세포수 변화를 측정하였다.

비교를 위하여, 항체 무처리군 (Cont 로 표시), 상기 참고예 1 에서 제작된 항 -c-Met 항체 SAIT301 단독 처리군 (60nM: S301 로 표시), 상기 참고예 2.2 에서 얻어진 4F12 클론의 6 개 CDR 을 포함하는 항 -Nrpl 항체 단독 처리군 (60nM; 4F 로 표시), 및 SAIT301 와 항 -Nrpl 항체의 병용 투여군 (각각 60nM; S+4F로 표시 )에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 보여지는 바와 같이, 항 -c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체는 SAIT301와 4F12를 각각 단독으로 처리한 경우 및 이를 병용 투여한 경우와 비교하여. 신장암 세포에서의 c-Met 치료제에 대한 저항성 극복 효과가 우수함을 확인할 수 있다. 실시예 5: 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체에 의한 항암제 저항성 극복 시험

항 -c-Met/항 -Nrpl 이증 특이 항체의 항암제 (젬시타빈)에 대한 저항성 극복 가능성을 확인하기 위하여 . 위암 세포주 MKN45에 젬시타빈을 반복 투여하여 젬시타빈 저항성 MKN45 ('MIiN45-Gem Re'로 표시)를 준비하였다.

구체적으로. 상기 MKN45-Gem Re 세포는 다음의 과정으로 준비하였다. MICN45 세포 (ATCC)를 잼시타빈 (Eli Lilly)에 3개월 동안 노출시켰다. 이 때, 젬시타빈은 10 내지 lOOuM 농도 범위에서 농도를 증가시키면서 처리하였다 ( i vitro) . 상기 처리된 세포들이 젬시타빈에 대하여 지속적인 저항성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 , 상기 세포에 젬시타빈을 2주간 처리하여 배양한 군과 처리하지 않고 2주간 배양한 군에서의 세포 생존률을 측정하여 , 상기 세포들이 젬시타빈 처리 여부와 무관한 동등한 정도의 세포 생존률을 보이는 것을 확인하였다.

MKN45 세포 (ATCC; 저항성 없음; 'parental'로 표시). 및 상기 준비된 젬시타빈 저항성 세포주 MKN45-Gem Re를 각각 2xl0 ⁵ cells/niL의 농도로 60隱 plates 에서 배양하고, 24시간 이후에 lysis buffer (Roche)를 통하여 세포 단백질을 추출하였다. 추출한 세포 단백질 20ug을 웨스턴블랏 젤에 로딩하여 웨스턴블랏을 진행한 뒤 . 항 -c-Met 항체 (abeam), 항 -Nrpl 항체 (Cell signaling), 항 -p-Akt 항체 (Cell signaling), 및 항 -GAPDH 항체 (Cell signaling)를 각각 사용하여 각각의 단백질을 검출하였다.

상기 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 젬시타빈 저항성이 유도된 경우, Nrpl 발현 수준이 증가한 것을 확인할 수 있다.

실시예 3을 참조하여. MKN45와 MKN45-Gem Re 세포를 각각 5000개씩 준비하고, 여기에 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체를 각각 0.2. 1, 또는 5 ug/niL의 농도로 처리하고 3일 이후에 CellTiter Glo assay를 통해 세포수 변화를 측정하였다.

비교를 위하여 , 상기 참고예 1에서 제작된 항 - _c _Met 항체 SAIT301 단독 처리군에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보여지는 바와 같이 , 항 -c— Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체는 SAIT301 단독 처리시보다 MKN45와 M1(N45-Gem Re 세포 모두에서 세포 증식 저해 효과가 우수하게 나타났으며 , 이는 항 -c-Met/항— Nrpl 이중 특이 항체가 항암제 저항성 극복 효과가 우수함을 보여주는 것이라고 할 수 았다.

' 잼시타빈 저항성 MKN45 세포주에 항 -c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체 처리시 c-Met 및 Nrpl 총량 변화를 시험하였다.

상기 준비된 MKN45-Gem Re 세포를 2xl0 ⁵ cells/mL의 농도로 60隱 plates 에서 배양하고. 24시간 이후에 상기 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체를 각각 5ug/mL의 농도로 24시간 동안 처리한 후, 상기 세포에 lysis buffer (Roche)를 처리하여 세포 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 20ug을 웨스턴블랏 젤에 로딩하여 웨스턴블랏을 진행한 뒤, 항 -c-Met 항체 (abeam), 항 -Nrpl 항체 (Cell signaling), 및 항 -GAPDH 항체 (Cell signaling)를 사용하여 각각의 단백질을 검출하였다.

비교를 위하여, 상기 이중 특이 항체 대신에, PBS를 처리한 군, 참고예 1에서 제작된 SAIT301 항체를 처리한 군 및 참고예 2.2에서 제작된 클론의 6개의 CDR을 포함하는 각각의 항 -Nrpl 항체를 처리한 군에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다. 상기 얻어진 웨스턴블랏 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타난 바와 같이 . MKN45-Gem Re 세포에 항— c-Met/항 -Nrpl 이중 특이 항체 처리시, 항 c-Met 항체 및 항 Nrpl 항체를 처리한 경우와 비교하여, c-Met 과 Nprl의 총량이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있으며, 이는 상기 이중항체가 항원의 internalization 및 degradation 효과를 가짐을 보여주는 것이다.