TORRES RUIZ YENY (CU)
BLANCO GARCES ELIZABETH (CU)
PENTON ROLL GISELLE (CU)
LOPEZ SAURA PEDRO (CU)
BELLO RIVERO IRALDO (CU)
TORRES RUIZ YENY (CU)
BLANCO GARCES ELIZABETH (CU)
PENTON ROLL GISELLE (CU)
LOPEZ SAURA PEDRO (CU)
| WO1994021282A1 | 1994-09-29 |
| EP0393502A1 | 1990-10-24 | |||
| EP0614981A1 | 1994-09-14 | |||
| EP0621338A2 | 1994-10-26 | |||
| US5073627A | 1991-12-17 |
| 1. | Proteína quimérica recombinants compuesta por una citocina o fragmento de citocina covalentemente unida a la región extracelular de un receptor de citosiaa, o parte de esta, unidas por un péptido de mas de 4 aminoácidos. |
| 2. | Protehia quimérica recombinate denom inada AnTH1, caracterizada por estar compuesta por la citosina lnterleucina2 o un fragmento de esta, covaientemeate unida a ta región extracelular del receptor del interfcrdny humano por un péptido de más de 4 aminoácidos. |
| 3. | Proteína quimérica recombinate de acuerdo a la reivindicación No. 1, caracterizada por conteneur el fragmento de citocina codificante para los 60 aminoácidos de la región Nterminal de la interleucina2 humana, identificada en el listado de secuencia como Secuencias No. 5 y por la región extracelular de un receptor de citocina codificante para la porción extracelular Nterminal de la cadena alfa del receptor de interferónγ humano, identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.7. |
| 4. | Protefaa quitnérica recombinante de acuerdo con las reivindicaciones No. 1 y 2 caracterizada por que et péptido de unión que la compone esta codificado por la secuencia identificada en el listado de como Secuencia No. 6. |
| 5. | Proteins quimérica recombinante de acuerdo con las reivindicaciones No. 1,2 y 3 caracterizada por estar codificada por la secuencia nucleotidica identificada en eI listado de secuencias como Secuencia No.8 y ser et producto de expresión de dicha secuencia. |
| 6. | Proteína quimérica recombinante de acuerdo con las reividicaciones NQ 1, 2, 3 y 4 caracterizada por haber sido producida en un microorganismo recombinante, en células vegetales o en un organismo genéticamente modificado. |
| 7. | Proteína quimérica recombinante de acuerdo con las reivindicaciones No 1, 2, 3 4 y caracterizada por inhibir la actividad biológica de la interleucina2, del interferónγ, o de ambas citocinas en conjungo. |
| 8. | Protetna quimérica reeombinante de acuerdo coa) as reivindicaciones No. 1, 2, 3, 4, 5 y 6 caracterizada porque posee actividad estimuladora del crecimiento de células T, por inhibir tu actividad estimuladora del crecimiento de la interleucina2, por inhibir la actividad antiproliferativa del interferónγ c inhibir la inducción de HLAII por interferónγ. |
| 9. | Proteína quimérica recombinante de acuerdo a la reivindicaciones No 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 caracterizada por. formar parte de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades mediadas por la acción de la interleucina2, del interferónγ o por la acción conjtmta de ambas citocinas. |
| 10. | Proteína quimérica recombinante de acuerdo a la reivindicaciones No 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 y 8 caracterizada por formar parte de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, problemas inflamatorios, rechazo a transplantes o infecciones por microorganismos. |
| 11. | Proteína quimérica recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por formar parte de una composición farmacéutica para el tratamiento de la esclerosis múltiple, el lupus sistémico eritematoso, la miastenia gravis, la diabetes mellitus, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria del intestino, la sepsis, la psoriasis, la ateroesclerosis o los trastornos causados por la isquemia reperfusión. |
| 12. | Cadena de ácido nucleic caracterizada por tener la secuencia. identificada en el listado de secuencias como Secuencia No. 8, y codificar para la proteina quimérica recombinante de las reivindicaciones de la 1 a la 10. |
| 13. | Cadena de ácido nucleic de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por formar parte de una molécula portadora o de un vector para la expresión de la proteína quimérica recombinante de las reivindicaciones de la 1 a la 10. |
| 14. | Cadena de ácido nucleic de acuerdo con las reivindicaciones 11 y 12, caracterizada por formar parte de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades mediadas por la acción de la interleucina2, del interferóny o por la acoión conjunta de ambas citocinas. |
| 15. | Cadena de ácido nucleic de acuerdo con las reivindicaciones 10, 11 y 12, caracterizada por formar parte de una composición farmacéutica para ei tratamiento de enfermedades autoinmunes, problemas inflamatorios, rechazo a transplantes o infecciones por microorganismos. |
La presente invención se relaciona con las ciencias biológicas, la biotecnología y las ciencias médicas, en particular con una droga capaz de inhibir las actividades biológicas de la interleucina-2, (IL-2) y el Interferon gamma (IFN y), dos citocinas que intervienen en la regulación de varias funciones del organismo, las cuales en los estados patológicos están en cantidades elevadas ; evitando a la vez la inactivación del sistema inmune que compromete la vida de los pacientes.
La producción de citocinas por los linfocitos T cooperadores (CD4+) y por los linfocitos T citotoxicos (CD8+) genera un patrón de producción de citocinas que ha sido identificado como Thl y Th2. El patrón Thl está caracterizado por la producción de IL- 2, factor de necrosis tumoral alfa (TNF a) e IFN y, mientras que el patrón Th2 responde a la producción de IL-4, IL-5, IL-6 y otras. Este tipo de respuestas juega un papel importante en la protección del organismo, pero también son promotoras de diversas reacciones inmunopatologicas.
Son varias las situaciones donde reacciones inflamatorias e inmunes descontroladas conllevan a la aparición, desarrollo y perpetuación de enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Existen demostrados ejemplos del papel patológico que desempeñan la IL-2 y el IFN y en algunas de estas enfermedades.
La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune desmielinizante de tipo degenerativa. Para este desarreglo autoinmune esta muy claro el papel patológico del IFN y, por cuanto se ha demostrado en un ensayo clínico utilizando IFN y que este tratamiento produce exacerbación de la enfermedad (Panitch HS. y cols. Exacerbations of multiple sclerosis in patients treated with gamma interferon.. Lancet 1, 893-5, 1987.). También se ha demostrado que tanto los niveles de ARN mensajero y de proteína correspondientes a IL-2 e IFN y se encuentran elevados en pacientes que sufren de dicha enfermedad (Lin J. y cols. IL-2, IFN-gamma, and TNF-alpha mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with multiple sclerosis. Chung Kuo I Hsueh Ko Hsueh Yuan Hsueh Pao 19, 24-8, 1997). La producción de estas dos citocinas por las células de los pacientes se ha sugerido como marcador de las recaídas en la esclerosis múltiple (Philippe J y cols. In vitro TNF-alpha, IL-2 and IFN-gamma production as markers of relapses in multiple sclerosis. Clin Neurol Neurosurg 98, 286-
90, 1996). De igual forma se ha observado que la IL-2 y al IFN y están involucrados en la activación de linfocitos no específicos que llevan a la desmielinización del sistema nervioso central (Martino G. y cols. Proinflammatory cytokines regulate antigen- independent T-cell activation by two separate calcium-signaling pathways in multiple sclerosis patients. Ann Neurol 43, 340-49, 1998). En pacientes con esta enfermedad que no han respondido a la terapia con IFN ß se está realizando un ensayo clínico utilizando un anticuerpo anti-IL-2, conocido como Daclizumab.
El lupus eritematoso es otra enfermedad autoinmune sistémica donde la presencia de niveles elevados de IL-2 e IFN y se ha asociado a las exacerbaciones en esta enfermedad <BR> <BR> (Viallard JF. y cols. Thl (IL-2, interferon-gamma (IFN-gammaJJ and Th2 (IL-10, IL-4J cytokine production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Immunol 115, 189-95, 1999). Por otra parte la ausencia del receptor para IFN y disminuye la producción de auto-anticuerpos en modelos animales de lupus (Haas C. y cols. IFN-gamma receptor deletion prevents autoantibody production and glomerulonephritis in lupus-prone (NZB x NZT) F1 mice.
JImmunol 160, 3713-18, 1998) y la presencia del receptor soluble para IFN y inhibe la aparición de la enfermedad (Ozmen L. y cols. Experimental therapy of systemic lupus <BR> <BR> erythematosus : the treatment of NZB/W mice with mouse soluble interferon (receptor inhibits the onset of glomerunephritis. Eur JImmunol. 25, 6-12, 1995). Recientemente se ha experimentado en un modelo de lupus murino una proteína quimérica que contiene la región extracelular del receptor de IFN y fusionada a la fracción Fc de las inmunoglobulinas (Lawson BR. y cols. Treatment of murine lupus with cDNA encoding IFN-gammaRlFc. J Clin Invest. 106, 207-15, 2000). Sin embargo la eficacia de este tipo de molécula en el lupus eritematoso podría estar limitada por la demostrada disfunción del receptor de Fc en pacientes con lupus eritematoso (Frank MM y cols. Defective reticuloendothelial system Fc-receptor function in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med 300, 518-23, 1979, Dstelbloem HM. y cols. Fcgamma receptor polymorphisms in systemic lupus erythematosus : association with disease and in vivo clearance of immune complexes. Arthritis Rheum 43, 2793-800, 2000).
La miastenia Gravis es considerada una enfermedad autoinmune órgano-especifica mediada por autoanticuerpos anti-receptor de acetil colina y dependiente de células T, caracterizada por debilidad muscular y fatigabilidad. Recientemente se ha demostrado que el IFN y favorece la formación de autoanticuerpos contra el receptor de acetil
colina, mientras que la ausencia del receptor de IFN y disminuye la susceptibilidad a la enfermedad en modelos animales (Zhang GX. y cols. Mice with IFN-gamma receptor deficiency are less susceptible to experimental autoimmune myasthenia gravis. J Immunol 162, 3775-81, 1999). La IL-2 y otras citocinas contribuyen junto al IFN y al desarrollo de la enfermedad (Zhang GX. y cols. Cytokines and the pathogenesis of myasthenia gravis. Muscle Nerve. 20, 543-51, 1997).
En la Diabetes tipo 1 (insulino dependiente) o Diabetes mellitus, las células beta del páncreas son destruidas por un mecanismo autoinmune. Existen evidencias in vitro de que el IFN y puede ser tóxico para las células beta del páncreas (Sternesjo J. y cols..
Effects of prolonged exposure in vitro to interferon gamma and tumor necrosis factor- alpha on nitric oxide and insulin production of ratpancreatic islets. Autoimmunity 20, 185-90, 1995, Dunger A. y cols. Tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma <BR> inhibit insulin secretion and cause DNA damage in unweaned-rát islets. Extent of nitric oxide involvement. Diabetes 45, 183-9, 1996, Baldeon ME. y cols. Interferon-gamma independently activates the MHC class I antigen processing pathway and diminishes glucose responsiveness in pancreatic beta-cell lines. Diabetes 46, 770-8, 1997). Sin embargo otros estudios demuestran que la acción del IFN y sobre las células productoras de insulina en el páncreas es indirecto (Sarventick N. y cols, Loss of pancreatic islet tolerance induced by beta-cell expression of interferon-gamma Nature, 346, 844-7, 1990). Probablemente su acción sea activando a los macrófagos para la producción de IL-1, TNF oc y oxido nítrico que sí actúan directamente sobre las células beta y estimulando la expresión de MHC I en la células beta, lo que favorece su destrucción por los linfocitos citotoxicos (Thomas HE. y cols. IFN-gamma action onpancreatic beta cells causes class 1 MHC upregulation but not diabetes. J Clin Invest, 102, 1249-57, 1998, Thomas HE y cols. Beta cell destruction in the development of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD) mouse. Diabetes Metab Res Rev 16, 251-61, 2000). También se ha mostrado que la ausencia del gen de IFN y demora la aparición de la diabetes, aunque no la previene (Hultgren B. y cols. Genetic absence of gamma- interferon delays but does not prevent diabetes in NOD mice. Diabetes 45, 812-7, 1996). Varios reportes evidencian como la inactivación de la actividad biológica del IFN y es favorable para prevenir la diabetes (Debray-Scahs M. y cosl. Prevention of diabetes in NOD mice treated with antibody to murine IFN gamma. J Autoimmun 4, 237-48, 1991, Moosmayer D. y cols. A bivalent immunoadhesin of the human
interferon-gamma receptor is an effective inhibitor of IFN-gamma activity. JInterferon Cytokine Res 15, 1111-5, 1995, Prudhomme GJ y cols. Prevention of autoimmune diabetes by intramuscular gene therapy with a nonviral vector encoding an interferon- gamma receptorllgGl fusion protein Gene Ther 6, 771-7, 1999). De igual forma se ha visto que la IL-2 como activadora de linfocitos T puede contribuir a esta reacción de destrucción de las células productoras de insulina.
Recientemente se ha iniciado un ensayo clínico para el tratamiento de la Diabetes tipo 1 en niños/adolescentes entre 10 y 21 años de edad con diagnostico reciente de la enfermedad utilizando el anticuerpo anti IL-2 Daclizumab (Riley Hospital for Children.
Project : Prevention of Diabetes Progression Trial (PDPT). www. rileyhospital. org.).
Este estudio ha sido diseñado para prevenir la progresión de la destrucción de las células beta en los niños recién diagnosticados.
El rechazo a transplantes es un proceso complejo en el cual la inmunidad mediada por células y los anticuerpos circulantes juegan un papel importante. Las terapias estándar anti-rechazo utilizan combinaciones de drogas como ciclosporina, rapamicina, azatioprina, esteroides y otros. Sin embargo, aun con esa terapia mas del 50 % de las personas receptoras de riñones rechazan lentamente su injerto en unos 10 años. La enfermedad del injerto contra el huésped es la mayor causa de muerte entre los transplantados con medula ósea. En estas reacciones que impiden los transplantes y que comprometen la vida de los pacientes transplantados se ha demostrado que tanto la IL-2 como el IFN y contribuyen con el desarrollo de las mismas (Hu HZ. y cols. Kinetics of interferon-gamma secretion and its regulatory factors in the early phase of acute graft- versus-host disease. Immunology 98, 379-85, 1999, Nakamura H. y cols. Serum levels <BR> <BR> <BR> of soluble IL-2 receptor, IL-12, IL-18, and IFN-gamma in patients with acute graft- versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation. J Allergy Clin Immunol. 106, 545-50. 2000).
La artritis reumatoide (AR) es un desorden sistémico crónico de etiología desconocida, caracterizado por inflamación, hiperplasia sinovial y destrucción de las articulaciones afectadas. La IL-2 es considerada generalmente una citocina pro-inflamatoria que exacerba los estados de enfermedades de tipo Thl, como la artritis autoinmune.
Estudios recientes han evidenciado que el ARN mensajero de IL-2 esta aumentado durante la fase aguda de la artritis inducida por colágeno en un modelo animal (Thornton S. y cols. Heterogeneous effects of IL-2 on collagen-induced arthritis. J Immunol 165, 1557-63, 2000). Por otro lado se ha observado la exacerbación de la
enfermedad desarrollada en modelos animales asociada a un incremento de IFN y <BR> <BR> <BR> (Tellander AC. y cols. Potent adjuvant effect by anti-CD40 in collagen-induced arthritis. Enhanced disease is accompanied by increasedproduction of collagen type-II reactive IgG2a and IFN-gamma. JAutoimmun 14, 295-302, 2000). Tanto la IL-2 como el IFN y se han visto aumentados significativamente en el tejido sinovial de pacientes con AR (Canete JD y cols. Differential ThllTh2 cytokine patterns in chronic arthritis : interferon gamma is highly expressed in synovium of rheumatoid arthritis compared with seronegative spondyloarthropathies. Ann Rheum Dis 59, 263-8, 2000).
La enfermedad inflamatoria del intestino consiste de dos desordenes gastrointestinales : la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa. Estas enfermedades se caracterizan por una inflamación crónica del intestino. La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria que se extiende alrededor de la línea interna de la pared intestinal y penetra en las capas mas profundas de esta. Esta inflamación se puede desarrollar en cualquier parte del sistema digestivo (esófago, estomago, intestino delgado, intestino grueso, o el ano). La compañía Protein Desig Labs ha anunciado el inicio de ensayos clínicos fase 1/11 en pacientes con enfermedad de Crohn de moderada a severa utilizando un anticuerpo anti IFN y (SMART Anti-Gamma Interferon Antibody) (Fremont, CA. <BR> <BR> <BR> <P>Protein Design Labs Announces Phase I/II Trial of SMART"Anti-Gamma Interferon<BR> <BR> <BR> <BR> Antibody in Crohn's Disease. Protein Design Labs, Inc. (Nasdaq), January 10, 2001).
La colitis ulcerativa esta confinada a la mucosa y submucosa del intestino grueso (el colon o el recto). Recientemente en el Congreso Anual de la Asociación Americana de Gastroenterología se mostró como la disminución de los niveles de IFN y en circulación es un marcador de remisión en un modelo en ratón de colitis (Yaron I.
Annual metting of the American Gastroenterology Association. May 20-23, 2001.
Georgia World Congress Center. Atlanta, Georgia.).
El shock séptico es el resultado de la diseminación de microorganismos de infecciones severas al torrente sanguíneo. Este es causado mas frecuentemente por bacilos Gran- negativos adquiridos en los hospitales y es más usual en los pacientes inmunocomprometidos y con enfermedades crónicas. En un 1/3 de los pacientes es causado por gérmenes Gran-positivos y por Cándida. Tanto en el shock séptico producido por bacterias Gram-negativas como Gram positivas el IFN y y la IL-2 contribuyen a la letalidad de las reacciones inflamatorias en las que participan. El IFN y es un mediador letal en modelos animales de shock séptico (Heremans H. y cols.
Interferon gamma, a mediator of lethal lipopolysaccharide-induced Shwartzman-like shock reactiorcs ire mice. JExp Med 171, 1853-69, 1990, Wysocka M. y cols. Interleukirc- <BR> <BR> <BR> 12 is required for interferon-gamma production and lethality in lipopolysaccharide- induced shock in mice. Eur J Immunol 25, 672-6, 1995, Kuschnaroff LM y cols.
Increased mortality and impaired clonal deletion after staphylococcal enterotoxin B <BR> <BR> <BR> <BR> injection in old mice : relation to cytokines and nitric oxide production. Scand J Immunol 469-78, 1997). Como se ha mostrado para modelos de animales de otras enfermedades, la ausencia del receptor para IFN y en estos animales los hace resistentes al shock endotoxico (Car BD y cols. Interferon gamma receptor deficient mice are resistant to endotoxic shock. Exp Med 179, 1437-44, 1994). De igual forma varios reportes demuestran la participación de la IL-2 en el desarrollo y la letalidad del shock séptico (Micusan W, y cols. Production of human and murine interleukin-2 by toxic shock syndrome toxin-1. Immunology 58, 203-8, 1986, Arad G, y cols. Superantigen antagonist protects against lethal shock and defines a new domain for T-cell activation.
Nat Med. 6, 378-9, 2000, Stevens DL. y cols. Streptococcal toxic shock syndrome associated with necrotizingfasciitis. Annu Rev Med 51, 271-88, 2000). Las células mononucleares cultivadas in vitro con IL-2 segregan citocinas secundarais como la IL- 1, TNF a, IFN y, las que están implicadas en la patofisiologia del shock séptico.
La psoriasis vulgar es una enfermedad de la piel, compleja y multigenica, potencialmente mediada por citocinas pro-inflamatorias producidas por las células T lesionadas. Una expresión crónica inapropiada de estas citocinas lleva a la activación inmune de las células y al daño del tejido. Está caracterizada por una excesiva producción de células de la piel y la generación de vasos sanguíneos probablemente responsables del enrojecimiento y de la placas que se forman como parte de esta enfermedad. El papel patológico del IFN y y la IL-2 ha sido evidenciado para la psoriasis. La mayoría de las células de la epidermis en la psoriasis vulgar producen IL- 2, IFN y y TNF oc definiéndolas como células T citotoxicas. Niveles altos de IFN y e IL-2 y no de IL-4 han sido detectados en los pacientes con psoriasis. Esto puede estar relacionado con un desbalance en las poblaciones de células T que contribuyen a una activación inmune sostenida o crónica de estas células (Schaak JF y cols. T cells involved in psoriasis vulgaris belong to the Thl subset. J Invest Dermatol 102, 145-9, 1994, Austin LM, y cols. The majority of epidermal T cells in Psoriasis vulgaris lesions can produce type 1 cytokines, interferon-gamma, interleukin-2, and tumor necrosis
factor-alpha, defining Tcl (cytotoxic T lymphocyte) and TH1 effector populations : a <BR> <BR> <BR> <BR> type 1 differentiation bias is also measured in circulating blood T cells in psoriatic patients. J Invest Dermatol 113, 752-9, 1999). Un resultado alentador utilizando el Daclizumab para el tratamiento de la psoriasis ha sido mostrado (Krueger JMy cols.
Successful in vivo blockade of CD25 ZiDg-aff nity interleukin 2 receptor) on T cells by administration of humanized anti-Tac antibody to patients with psoriasis. JAm. Acad Dermatol. 43, 448-58, 2000). Recientemente se ha iniciado un nuevo ensayo con esta droga (Fremont, CA. Protein Design Labs Presents Three Humanized Antibodies in Clinical Development for Psoriasis at International Psoriasis Symposium. June 22, 2000. Protein Design Labs, Inc. (PDL) Nasdaq).
Existen otras enfermedades menos estudiadas donde la utilización de un antagonista contra la IL-2 y el IFN r también pueden tener utilidad, estos son los casos de la ateroesclerosis y la isquemia/reperfusión. La ateroesclerosis y la ateroesclerosis post- transplante están caracterizadas por la expansión de la intima arterial como resultado de la infiltración de los leucocitos mononucleares, la proliferación de las células del músculo liso vascular y la acumulación de matriz extracelular así como de la presencia de IFN y (Ross R. Atherosclerosis--an inflamatory disease. N. Engl. J Med 340, 115- 26, 1999, Hansson GKy cols. Immune mechanisms in atherosclerosis. Arteriosclerosis 9, 567-78, 1989, y Libby P y cols. Functions of vascular wall cells related to development of transplantation-associated coronary arteriosclerosis. Transplant. Proc.
21, 3677-84, 1989). Se ha mostrado que el IFN y exógeno aumenta la ateroesclerosis en un modelo animal (Whitman SC y cols. Exogenous interferon-gamma enhances atherosclerosis in apolipoprotein E-l-mice. Am JPathol 157, 1819-24, 2000). Por otro lado se ha demostrado que la neutralización del IFN y a nivel serico, así como la ausencia de su gen disminuye la extensión de la expansión de la intima (Gupta Sy cols. <BR> <BR> <BR> <BR> <P>IFN ypotentiates atherosclerosis in ApoE knock-out mice. J. Clin. Invest. 99, 2752-61,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1997, Nagano Hy cols. Interferon y deficiency prevents coonary arteriosclerosis but<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-57, 1997, Rüisünen-Sokolowski, A. y cols. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon yknockout recipients. Am. J ; Pathol. 152, 359- 65, 1998). Mas recientemente se comprobó que el IFN y promovía acción ateroesclerotica en ausencia de leucocitos (Tellides G y cols. Interferon r elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature 403, 207-11, 2000). La isquemia y
la reperfusión se caracterizan por la interrupción del suministro de sangre en un territorio con la consiguiente anulación del aporte de oxígeno y nutrientes y la reperfusión como la restauración total o parcial del flujo sanguíneo al tejido previamente isquémicoes muy frecuente en la clínica, pudiendo observarse en el shock hipovolémico y séptico, infarto de miocardio, embolia, síndrome compartimental, congelaciones, transplante de órganos, etc. La hipoxia tisular produce, en última instancia, una alteración del metabolismo celular del que se derivan complejas modificaciones bioquímicas y moleculares cada vez mejor conocidas. El daño por reperfusión trae como consecuencia la muerte celular y la disfunción endotelial causada por la restauración del tejido sanguíneo. El IFN y y la IL-2 han sido reportados como mediadores del daño causado a los órganos por la isquemia y la reperfusión (Serrick C y cols. The early release of interleukin-2, tumor necrosis factor-alpha and interferon- gamma after ischemia reperfusion injury in the lung allograft. Transplantation 58, 1158-62, 1994, Marck ARC y cols. IschemialReperfusion-Induced IFN-ganzma Up- <BR> <BR> <BR> <BR> Regulation : Involvement of IL-12 and IL-18. The Journal of Immunology 162, 5506-10,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1999).
Varios autores han descrito antagonistas contra IFN y. La inhibición de la actividad antiviral del IFN y humano por su receptor soluble recombinante se ha descrito en la patente europea EP 0 393 502 Al. También se ha descrito que el receptor soluble recombinante para el IFN y murino inhibe la aparición de la glomerulonefritis en ratones (Ozmen L. y cols. Experimental therapy of systemic lupus erythematosus. the treatment of NZB/W mice with mouse soluble interferon-gamma receptor inhibits the onset of glomerulonephritis. Eur JImmunol. 25, 6-12, 1995). Tres inhibidores de IFN y murino han sido construidos. Estos consisten en proteínas quiméricas formadas por la región extracelular del receptor en ratones para IFN y y dominios constantes de las moléculas de inmunoglobulinas. Estas construcciones neutralizan la actividad antiviral del IFN y de ratón y poseen una vida media en sangre prolongada (Cornelia K. y cols.
Construction, purification, and characterization of new interferon gamma (IFN y) inhibitor protein. J. Biol. Chemestry. 267, 9354-60, 1992 y patente europea EP 0 614 981 A1). El potencial uso de un fragmento de inmunoglobulina o su región Fc fusionada al receptor soluble de IFN y para el uso en humanos en lupus eritematoso podría verse limitada por la demostrada disfunción del receptor para Fc en este trastorno autoinmune (Frank MM y cols. Defective reticuloendothelial system Fc-receptor function in
systemic lupus erythematosus. NEngl JMed 300, 518-23, 1979). Este tipo de inhibidor es monofuncional y por tanto tiene un menor espectro de acción.
En ratones el uso de anticuerpos neutralizantes anti-IFN-y disminuye las manifestaciones de la enfermedad del injerto contra el huésped (Mowat A. y cols.
Antibodies to IFN gamma prevent immunologically mediated intestinal damage in murine graft-versus-host reaction. Immunology 68, 18-23, 1989). En un estudio de aloinjertos de piel, anticuerpos anti-IFN-y inhibieron el rechazo solo si el injerto fue incompatible con los antígenos MHC clase II, sugiriendo que el IFN-y contribuye al rechazo de aloinjerto por la inducción de antígenos MHC clase II (Rosenberg A. y cols. <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Specif c prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> administration of anti-IFN gamma monoclonal antibody. J. Immunol. 144, 4648-50, 1990). Anticuerpos de simple cadena de región variable (scFv) contra IFN y humano expresados en bacteria también han sido obtenidos y probados eficientemente en la neutralización de la actividad biológica del IFN y murino (Froyen G. y cols. Bacterial expression of a single-chain antibody fragment (scFv) that neutralizes the biological activity of human interferon 7. Mol ImmunoL 30, 805-12, 1993). La utilización de anticuerpos en la terapéutica de humanos se enfrenta al problema de las respuestas del hospedero contra las regiones inmunogénicas de estas moléculas heterólogas y en los casos de los quiméricos y humanizados a la perdida de afinidad y especificidad (Merluzzi S y cols. Humanized antibodies as potential drugs for therapeutic use. Adv Clin Path, 4, 77-85, 2000) así como a manifestaciones de toxicidad (Clark My cols.
Antibodies to IFN gamma prevent immunologically mediated intestinal damage in murine graft-versus-host reaction. Immunology 68, 18-23, 2000).
Otras soluciones análogas también han sido descritas. Se han propuesto mezclas de una citocina con su receptor soluble, pero con el propósito de potenciar el efecto de las citocinas. En este caso la citocina y su receptor se producen independientemente y luego son mezclados en una única preparación como se demuestra en la patente americana WO 94/21282.
La ciclosporina A, FK506 y rapamicina son potentes supresores del sistema inmune, especialmente de las células T, utilizados para la prevención del rechazo de transplantes.
Los dos primeros inhiben la transducción de la señal iniciada por el receptor de antígenos de las células T que conduce a la transcripción de genes de activación temprana. Estos incluyen la transcripción del gen que codifica para la IL-2 requerida
para la transición del estado en reposo GO a la fase G1 del ciclo celular. La rapamicina no tiene efecto en la síntesis temprana de citocinas por las células T, pero inhibe la respuesta de estas células a IL-2 requerida para la transición de la fase G1 a la S del ciclo celular (Waldmann T. A. y cols. The IL-2/IL-2 receptor system : a target for rational immune intervention. Immunology Today 14, 264-70, 1993). La rapamicina permite la activación especifica de células T, pero previene la expansión clonal de estas por interferencia con la señalización a través de la cadena beta del receptor de IL-2 (RßIL-2) (Woerly G. y cols. Effect of rapamycin on the expression of the IL-2 receptor (CD25). Clin Exp Immunol 103, 322-7, 1996). La ciclosporina A, ha aumentado significativamente la supervivencia de aloinjertos renales, además aminora las enfermedades autoinmunes. La utilización de estos inmunosupresores ha sido limitada por sus efectos tóxicos que incluyen complicaciones gastrointestinales, hipertrofia de las encías y especialmente nefrotoxicidad dependiente de la dosis e hipertensión.
(Hortelano S. y cols. Potentiation by nitric oxide of cyclosporin A and FK506-induced apoptosis in renal proximal tubule cells. J Am Soc Nephrol 11, 2315-23, 2000, <BR> <BR> <BR> <BR> Tsimaratos M. y cols. Kidney function in cyclosporine-treated paediatric pulmonary transplant recipients. Transplantation 69, 2055-9, 2000).
En modelos animales han sido usados anticuerpos monoclonales que bloquean la interacción de la IL-2 con su receptor para inhibir la enfermedad del injerto contra el huésped y el rechazo de aloinjertos. Estos anticuerpos también fueron usados en roedores para suprimir desórdenes autoinmunes. En ensayos clínicos los anticuerpos contra la cadena alfa del receptor de IL-2 (RodL-2) mejoraron la enfermedad del injerto contra el huésped resistente al tratamiento con esteroides. Sin embargo, estos esfuerzos son limitados por la antigenicidad de estos anticuerpos. Se han ensayado anticuerpos de simple cadena de región variable que inhiben la unión de la IL-2 a la subunidad y del receptor de IL-2 e interfieren con la actividad biológica de la IL-2 ensayada en la línea celular murina CTLL-2 como se describe en la patente europea EP 0 621 338 A2. La creación de anticuerpos humanizados que mejoran este tipo de terapias aun cuenta con inconvenientes como los referidos anteriormente. En este tipo de terapia también se han ensayado anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas o marcados radioactivamente (Waldmann T. A. Genetically engineered monoclonal antibodies armed with radionuclides. Year Immunol. 7, 205-12, 1993). El uso de toxinas fusionadas a anticuerpos anti IL-2 o la IL-2 para eliminar células que expresan el receptor para IL-
2 y contribuyen al desarrollo de estados patogénicos han sido descritos como se plantean en la patente americana WO 92/20701 y en lapatente europea EP 0 369 316 A2. La toxicidad inespecífíca de las inmunotoxinas (Frankel A. E. y cols. Clinical trials of target toxins. Cancer Biology 6, 307-17, 1995) así como su inmunogenicidad (Chen <BR> <BR> <BR> S-E y cols. Design of genetic immunotoxin to eliminate toxin immunogenicity. Gene Therapy 2, 116-23, 1995) ha hecho poco recomendable la utilización de estas drogas.
Anticuerpos anti IL-2 están siendo desarrollados para el tratamiento de la AR (Simon LS. y cols. New and future drug therapies for rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 39 Suppl 1 : 36-42, 2000). Anticuerpos dirigidos contra el RaIL-2 se están empleando para evitar el rechazo a transplantes de riñón (Olyaei AJ y cols. Use of basiliximab and daclizumab in kidney transplantation. Prog Transplant 11, 33-7, 2001) Las limitaciones del uso de anticuerpos en terapias prolongadas han sido descritos anteriormente.
La neutralización de citocinas pro-inflamatorias como el TNF a (Beutler B. y cols.
Passive immunization against cachectinltumor necrosisfactorprotects micefrom lethal effect of endotoxin. Science 229, 869-71, 1989) o IL-1 (Natanson C. y cols. Selected <BR> <BR> <BR> treatment strategies for septic shock based on proposed mechanism of pathogenesis.
Ann. Intern. Med. 120, 771-83, 1994) disminuye la mortalidad en varios modelos animales de sepsis. Sin embargo en ensayos clínicos utilizando antagonistas contra IL-1 (antagonista del receptor de IL-1) (Fischer C. J. y cols. Recombinant human interleukin- 1 receptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome : results from randomized, double-blind, placebo-controlled trial. JAMA 271, 1836-43, 1994) y contra el TNF a (proteína quimérica recombinante : receptor soluble TNF/Fc) (Fischer C. J. y cols. Treatment ofseptic shock with tumor necrosisfactor receptor. Fcfusion protein. N.
Engl J. Med. 334, 1697-1702, 1996) no solo no se han producido mejorías sino que se ha aumentado la mortalidad, producto de una desactivación del sistema inmune. La FDA ha aprobado dos antagonistas contra el TNF a (Lipsky PE. y cols. Infliximab and Methotrexate in the Treatment of Rheumatoid Arthritis. NEngl JMed, 343, 1594-1602, 2000) que han demostrado efectos favorables en el tratamiento de la AR. Uno de ellos es un anticuerpo contra una subunidad del receptor para TNF a (Infliximab). La neutralización del TNF a mas allá de ciertos niveles puede traer una desactivación del sistema inmune como se ha demostrado en un modelo de ratas con AR (Colagiovanni <BR> <BR> <BR> DB. y cols. TNF-alpha blockade by a dimeric TNF type I receptor molecule selectively
inhibits adaptive immune responses. Immunopharmacol Immunotoxicol 22, 627-51, 2000). Se ha observado mas frecuencia de infecciones en los pacientes tratados con Infliximab que los de los grupos controles sin este (grupos placebo) (Schaible TF. Long term safety of infliximab. Can J Gastroenterol 14 Suppl C : 29C-32C, 2000), así como la aparición auto-anticuerpos y el desarrollo de lupus (Markham A. y cols. Infliximab : a review of its use in the management of rheumatoid arthritis. Drugs 59, 1341-59, 2000).
El Etanercept es una proteína quimérica que une el receptor soluble para el TNF a y la porción Fc de las IgGl (Moreland LW y cols, Etanercept therapy in rheumatoid arthritis. A randomized, controlled trial. Ann Intern Med 130, 478-86, 1999). La suspensión del tratamiento provoca la recaída del paciente, por lo que esta droga no cura la enfermedad. Esto implica que el paciente debe ser tratado por tiempos muy largos. Si bien en los estudios a corto plazo no han existido efectos adversos importantes, una terapia prolongada podría generar la aparición de anticuerpos contra la molécula <BR> <BR> <BR> <BR> (Russell E. y cols. Patients receiving etanercept may develop antibodies that interfere with monoclonal antibody laboratory assays. Arthritis Rheum 43, 944-47, 2000). Han sido reportados varios casos de pacientes tratados con Etanercept que han desarrollado anemia aplastica con curso fatal, así como pancitopenia, y síndromes desmielinizantes (Klippel JH, Biologic Therapy for Rheumatoid Arthritis. N. Engl J. Med., 343, 1640-1, 2000).
Hasta el momento ningún antagonista contra IFN y ha sido utilizado en la clínica. El uso de antagonistas de citocinas para prevenir, disminuir o eliminar reacciones inflamatorias y autoinmunes que generan daño al organismo debido a su descontrol temporal o por su cronicidad ha sido explorado para muchas citocinas. Muchas de ellas han sido inefectivas. En unos casos el antagonista se limita a una molécula de citocina y su espectro de acción se ve limitado así como su potencia, ya que las dosis no pueden ser elevadas por la toxicidad que generarían. En los que se ha logrado efectividad para neutralizar a la citocina este efecto ha llegado a ser extremo y ha provocado desactivación de funciones importantes para el organismo (sistema inmune).
La IL-2 interactua con su RaIL-2. Esta subunidad es capaz de internalizar a la IL-2, lo que ha sido demostrado para linfocitos T y B y probablemente es reciclada a la superficie, mientras que las otras dos cadenas de este receptor son degradadas después de internalizadas (Hemar A. y cols. Endocytosis of interleukin 2 receptors in human T lymphocytes : distinct intracellular localization andfate of the receptor alpha, beta, and
gamma chains. J Cell Biol 129, 55-64, 1995). El IFN y es internalizado y degradado, mientras que su receptor es reciclado (Celada A. y cols. Internalization and degradation <BR> <BR> <BR> of receptor-bound interferon-gamma by murine macrophages. Demonstration of receptor recycling. J Immunol 139, 147-53, 1987). Las características de la internalización de la IL-2 por su IL-2R oc, así como la del IFN y por su receptor nos indican un potencial reciclaje al menos de la región extracelular del receptor para IFN y que forma parte del antagonista quimérico IL-260/receptor soluble de IFN y. Esto resultaría en una prolongación de la presencia de esta molécula en circulación y por tanto de su efecto.
La unión o conjugación de dos moléculas frecuentemente conlleva a un significativo decrecimiento o perdida de la actividad biológica de las moléculas en cuestión, debido a los cambios conformacionales que ocurren o a las interferencias espaciales que se producen como resultado de la creación de la nueva molécula (Knusli, C y cols.
Polyethylene glycol (PEG) modification of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) enhances neutrophil priming activity but not colony stinaulating activity. Br J Haematol 82, 654-63, 1992). Algunas alternativas han sido utilizadas como por ejemplo en la patente amaericana US No. 5, 073, 627 donde se describe un péptido de unión para fusionar al factor estimulador de la formación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) con la IL-3. Un problema de este tipo de péptidos es que pueden ser rígidos e inflexibles. Como resultado la proteína no puede moverse para adoptar la conformación precisa que le permita realizar adecuadamente su actividad biológica, por lo que es también una necesidad diseñar y encontrar péptidos capaces de unir dos moléculas y que a la vez permita a cada una de ellas adoptar la adecuada conformación, situación esta que redundara en una molécula biológicamente activa. Teniendo en cuenta lo anteriormente señalado es deseado desarrollar immuno- supresores y anti-inflamtorios más seguros, efectivos y más específicos. Para ello es importante concebir una molécula con mayor versatilidad funcional, que inhiba las actividades o funciones patológicas de las drogas dianas pero que a la vez permita un cierto funcionamiento de eventos importantes para el organismo que faciliten su uso prolongado sin comprometer la vida de los pacientes. Un antagonista que pueda interferir con la acción de dos citocinas simultáneamente y que pueda evitar la inmunoparalización aun no ha sido diseñado.
Descripción detallada de la invención.
La esencia de esta invención consiste en una proteína quimérica recombinante, denominada AnTH1 la cual esta formada por un fragmento de 60 aminoácidos de la región N-terminal de la IL-2 humana fusionado a través de un péptido de 4 aminoácidos al N-terminal de la región extracelular de la cadena alfa del receptor para IFN y que contiene 231 aminoácidos. Esta proteína tiene actividad estimuladora del crecimiento de células T, inhibe la actividad estimuladora del crecimiento de células T inducida por la IL-2, inhibe la inducción de HLA-II por interferón y e inhibe la actividad antiproliferativa del interferón y. La secuencia de ADN correspondiente a los primeros 60 aminoácidos del N-terminal de la IL-2 humana y el peptido de unión (SECUENCIA No. 5) y la secuencia del peptido de unión y el ADN que codifica para los 231 aminoácidos de la región extracelular del RaIFN y (SECUENCIA No. 7) fueron obtenidas por reverso-transcripción del ARN polyA proveniente de células Raji y amplificadas con cebadores específicos por PCR (ver ejemplo 1, SECUENCIA No. 1 y SECUENCIA No. 2, SECUENCIA No. 3, SECUENCIA No. 4). La secuencia de ADN correspondiente al péptido de unión (SECUENCIA No. 6) fue diseñada para tal propósito y añadida a los cebadores utilizados para amplificar la región del receptor soluble de RaIFN y.
En la presente invención tambien se describe el vector utilizado para la producción en E. coli de la proteína recombinante AnTHI, denominado pHu (AnTHl), el cual fue depositado en el Belgian Coordinated Collections of Microoganism (BCCM), con el número de deposito. Este vector se preparó utilizando métodos de la tecnología del ADN recombinante (Sambrook y cols. Molecular Cloning-A laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989). El vector antes referido fue modificado y finalmente contiene un marcador de selección, el promotor del triptófano, la secuencia que codifica para los 60 aminoácidos de la IL-2 humana, el péptido de unión y los 231 aminoácidos de la región extracelular del Ra IFN y (SECUENCIA No. 8). La construcción final del vector obtenido se le denomino pHu (AnTHl), (ver ejemplo 2, Figura. 1).
La presente invención describe ademas la cepa de E. coli transformada con el vector pHu (AnTHl). El vector pHu (AnTHl) se utilizó para transformar la cepa de E. coli W3110P3. La cepa de E. coli W31 1OP3 conteniendo el vector pHu (AnTHl) fue crecida e inducida para la expresión de la proteína quimérica recombinante AnTHl. La cepa logra un alto grado de expresión de la proteína (ver ejemplo 4). Esta proteína puede ser
expresada en otras células hospederas (células de insectos, en células de mamíferos y en celulas vegetales utilizando vectores adecuados para estos fines). La presente invención describe ademas la obtención de la proteína quimerica recombinante con un grado de pureza adecuado para la evaluación de su actividad biológica, mediante un proceso a través del cual se logra una preparación de un 80-90% de pureza de la proteína biológicamente activa. El precipitado celular obtenido del cultivo de la cepa después de la inducción, fue procesado para la extracción de la proteína recombinante. Fueron utilizados procedimientos sucesivos de lavados del precipitado celular utilizando agentes solubilizantes (desnaturalizantes) que permiten extraer la proteína de interés con un mínimo de proteínas contaminantes procedentes de la E. coli. Después de logrado un adecuado grado de pureza (80-90%) utilizando estos procedimientos la preparación conteniendo la proteína AnTHl fue sometida a un proceso de renaturalización para llevar la proteína a su conformación nativa biológicamente activa. Este procedimiento consiste en eliminar lentamente los agentes desnaturalizantes. El proceso se ilustra en el ejemplo 5.
La invención describe la actividad biológica de la proteína recombinante AnTH1. Esta proteína tiene actividad estimuladora del crecimiento de células T (ejemplo 7), es capaz de interferir con la estimulación de la proliferación de las células T producida por la IL-2 humana en la línea celular de ratón CTLL-2 (ejemplo 8), es capaz de inhibir la actividad antiproliferativa del IFN y humano en la línea celular Hep-2 (ejemplo 9) y también inhibe la estimulación por IFN y de la expresión de HLA-II en la línea celular COLO 205 (ejemplo 10). La IL-2 humana a diferencia del IFN y puede actuar también sobre las células murinas.
Esta proteína recombinante puede ser usada en la preparación de una composición farmacéutica útil para ser empleada en el tratamiento de enfermedades donde tanto la IL-2 como el IFN y jueguen un papel patológico. Estas enfermedades pueden ser de tipo autoinmunes como esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, miastenia gravis, diabetes mellitus insulina dependiente, hepatitis activa crónica y hepatitis fulminante ; de tipo autoinmune/inflamatorias como, artritis reumatoide, psoriasis, así como rechazo de órganos, enfermedad del injerto contra el huésped y en las inflamatorias como el shock séptico y también para la ateroesclerosis.
Con esta invención se crea un nuevo método para prevenir, interferir, y/o eliminar las acciones de dos citocinas que tienen funciones patogénicas en diversas enfermedades.
De esta forma se amplían los blancos de acción de una forma más especifica. La utilización de una proteína quimérica capaz de neutralizar o interferir con dos sistemas de señalización de citocinas vinculados con las mismas situaciones patológicas permitirá ampliar el espectro de vías a interferir y por tanto la eficacia. Al poseer cierta actividad estimuladora del crecimiento de células T evitaría una desactivación indeseada del sistema inmune permitiendo un uso mas prolongado en los pacientes y 7890 entidades que así lo requieran. Así la droga sería más segura y eficiente. El objeto de la presente invención es crear un antagonista hetero-dibalente que posibilita interferir con las funciones de la IL-2 y el IFN y humanas, ampliando las posibilidades terapéuticas de la molécula y evitando reacciones adversas.
Depósito de microorganismo : El plasmido pHu (AnTHl), fue depositado bajo el Tratado de Budapest para la protección de Microorganismos en el Belgian Coordinated Collections of Microoganism (BCCM), con el número de acceso LMBP 4535 el 6 de mayo de 2002.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS.
Figura. 1. Construcción genética (plásmido pHu (AnTHl) para la expresión de la proteína quimérica recombinante AnTHl.
Figura. 2. Expresión en E. coli de la proteína quimérica AnTHl. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12.5% en condiciones reductoras. a : patrón de peso molecular; b, c, d : cepa control negativo 0, 8 y 18 horas de inducción; e, f, g : cepa bajo condiciones de inducción 0, 8,18 horas conteniendo plásmido pHu (AnTH1).
Figura. 3. Presencia de la proteína quimérica recombinante AnTH1 en las diferentes etapas del proceso de semipurificación. A : Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12.5% en condiciones reductoras. En la línea a : patrón de peso molecular, b : fermentación, c : extracción con urea 8 M, d : fracciones de la cromatografía de gel filtración mezcladas, e : mezcla de fracciones después de la diálisis. B : "Western blot" utilizando un antisuero anti-AnTHldiluido 1 : 1000 en PBS/leche descremada al 1%,
liberado de anticuerpos anti-E. coli cepa W3110 P3. B : En las líneas a, b, c, d se aplicaron las mismas muestras y en el mismo orden referido que en la electroforesis de la Figura. A (no se aplico patrón de peso molecular).
Figura. 4. Identificación mediante"western blot"de la proteína quimerica AnTH1. Para la identificación fueron utilizados los antisueros anti-IL-2 (A) y anti-AnTHl (B). El factor de dilución para ambos fue 1 : 1000. Se utilizó la preparación de AnTHl obtenida después de la diálisis (línea a), en la línea b se aplicó IL-2.
Figura. 5. Ensayo de unión del IFN y humano marcado con has a la proteína quimérica AnTHl mediante"dot blot". Se aplicó aproximadamente lul de las fracciones eluidas de la cromatografía de gel filtración en membrana de nitrocelulosa. Las tiras se incubaron con IFN y marcado con Il25 (35 µCi/µg) en ausencia (línea a) y presencia (línea b) de un exceso de IFN y humano (100 veces mas).
Figura. 6. Actividad estimuladora del crecimiento de células T de la proteína quimérica recombinante AnTH1. Barra 1 : 2.8 ng/ml de IL-2, barra 2 : 1.5 pg/ml de AnTHI, barra 3 : medio de cultivo.
Figura. 7. Inhibición por la proteína quimérica recombinante AnTHlde la actividad estimuladora del crecimiento de la IL-2 humana sobre la línea celular de ratón CTLL-2 (resultados expresados en unidades internacionales de IL-2).
Figura. 8. Resultados de la inhibición de la actividad antiproliferativa del IFN y humano por la proteína quimérica recombinante AnTH1. Barra 1 : 4 UI/ml de IFNy (4 ng/ml), barra 2 : 4 UI/ml de IFNy + 50, ug/ml AnTH1, barra 3 : 50 g/ml AnTHl Figura. 9. Inhibición de la inducción por IFN y humano de HLA II por la proteína quimerica recombinante AnTHl. Barra 1 : Nivel basal (IFN y = O UI/ml), barra 2 : IFN y 500 UI/ml (0,5 llg/ml), barra 3 : IFN y 500 UI/ml + 1. 5 ug/ml AnTH1.
Figura. 10. Secuencia de amonoacidos de la proteína quimérica recombinante AnTH1.
Señalados los péptidos definidos por espectrometria de masa.
SAPTSSSTKKT"QLQLEHLLLDLQMILNGINNYI, NPKLTRM, aLTFI4Fa5YMP KI< LKH,6LQCLAHMMSR66A6, EMGTADLGPSSVPTPTN VTIESYNMNPI <BR> <BR> <BR> <BR> VYWEYQ, o, IMPQVPVFTVEVK", NYGVKN, 2 SEWIDACINISHHYCNISDHVGD PSNSWVR151VKARVGQKESAYAKS166EEFAVCR173DGKI177GPPK181LDIRKEEK Q190I MIDIFHPSVFVNG DEQEVDYDPETTCYIR220V221YNVYVR227M228NGSEIQYK236IL TQKEDDCDEIQCQLAIPVSSLNSQYCVSAEGVLHVWGVTTEKSKEVCITIFNSSI KG EJEMPLOS : Ejemplo 1.
Aislamiento de los ADN de cadena complementaria que codifican para los primero 60 aminoácidos de la IL-2 humana y la región extracelular de la cadena a del receptor soluble de IFN y (Ra IFN ys) humano.
Para el aislamiento de los ADN complementarios humanos las células Raji (Linfoma de Burkitt, ATCC : CCL-86) y Jurkat (human acute T cell leukemia, ATCC : TIB-152) fueron crecidas en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero fetal bovino en un frasco de 5L con agitación suave a 37 °C en atmósfera de C02 al 5 %. La extracción de ARN total de células Raji y Jurkat fue utilizando el método de Chomczyski (Chomczyski P. y cols. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium <BR> <BR> <BR> <BR> thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-9, 1987).
Posteriormente se procedio a la extracción del ARN-poly A usando un sistema de aislamiento de ARN mensajero comercial (Isolation System Life Technologies Messagemakerr cat. No. 10551-018). Los ADN complementarios codificantes para los primeros 60 aminoácidos de la IL-2 humana y los 231 aminoácidos de la porción aminoterminal extracelular del Ra IFN ys humano fueron aislados por transcripción reversa y amplificación por PCR del ARN poly A proveniente de las células Jurkat y Raji respectivamente. Aproximadamente 1-2 p. g de ARN poly A fue procesado utilizando hexámeros al azar.
Las secuencias de los oligonucleótidos (cebadores) utilizados para amplificar el ADN de cadena complementaria para los primeros 60 aminoácidos de la IL-2 humana se describen en la SECUENCIA Nol (cebador 1) y la SECUENCIA No 2 (cebador reversol). Las secuencias de los cebadores utilizados para amplificar el ADN de cadena complementaria para los 231 aminoácidos de la porción aminoterminal del Ra IFN ys
humano se describen en las SECUENCIA No 3 (cebador 2) y SECUENCIA No 4 (cebador reverso 2).
El ADN amplificado codificante para los primeros 60 aminoácidos de la IL-2 humana y el peptido de unión (SECUENCIA No. 5) fue digerido con la enzima de restricción Nco I (subrayado en la secuencia del cebador 1, SECUENCIA No. 1). Seguidamente se realizó extracción con fenol-cloroformo para eliminar la enzima y tampón, se precipitó y resuspendió en un tampón apropiado y se conservó a-70°C. Ver secuencia del peptido de unión (SECUENCIA No. 6).
El ADN amplificado codificante para el péptido de unión y los 231 aminoácidos de la región del RaIFN y (SECUENCIA No. 7) fue rellenado en los extremos cohesivos con la polimerasa Klenow y purificado como se describe anteriormente. Luego fue digerido con la enzima de restricción BamH I (subrayado en la secuencia del cebador reverso 2), purificado como se describe anteriormente. Ver secuencia del peptido de unión (SECUENCIA No. 6).
Las bandas amplificadas (SECUENCIAS No. 5 y No. 7) fueron mescladas en las proporciones calculadas y en el tampón adecuado para lograr la amplificación de una nueva banda que contiene la secuencia de ADN correspondiente a los primeros 60 aminoacidos de la IL-2 humana unida a la secuencia correspondiente para los 231 aminoácidos de la región extracelular del RaIFN Y humano por la secuencia correspondiente al peptido de unión (SECUENCIA No. 6). La nueva banda fue amplificada por PCR.
El ADN amplificado (SECUENCIA No. 8) fue purificado como se describe anteriormente. El ADN purificado fue digerido con la enzima de restricción Bam HI y procesado para eliminar la enzima y el tampón como se ha descrito. Después el ADN fue nuevamente digerido con la enzima NcoI y purificado como se ha descrito.
Ejemplo 2.
Construcción genética para la expresión de la proteína quimérica recombinante AnTHl.
El vector de expresión contiene el promotor fuerte del triptofano. El vector fue digerido con la enzima BamH I. Seguidamente se realizó extracción con fenol-cloroformo para eliminar enzima y buffer y se precipitó y resuspendió en un buffer apropiado. A
continuación se digirió con la enzima Nco I. El vector fue finalmente separado en un gel como se describe anteriormente. De esta forma el vector contiene el promotor para el triptófano, un sitio Nco I cohesivo libre, un sitio BamH I cohesivo libre, el terminador T4 y el gen de resistencia a la ampicillina.
El ADN correspondiente a la SECUENCIA No. 8 fue ligado con el vector utilizando la enzima T4 ligaza. Las células de E. coli fueron transformadas con la construcción genética. Se identificaron los transformantes que contienen el fragmento de ADN complementario para los primeros 60 aminoácidos de la IL-2 humana, el péptido de unión y los 231 aminoácidos del Ra IFN ys humano en la misma dirección del promotor de triptófano realizando ensayos de restricción con la enzima Nco I y Eco RI.
El plásmido resultante fue denominado pHu (AnTHl) (ver Figura. 1).
Ejemplo 3.
Secuenciación.
La construcción final fue secuenciada. La secuenciación se realizó utilizando el protocolo basado en el procedimiento de Sanger (Sahger F y cols. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-67, 1977). Se comprobó que la construcción tiene bajo el control del promotor del triptófano una parte del gen que codifica para la IL-2 (60 aminoácidos a partir del grupo amino terminal) y a continuación la secuencia de nucleotidos codificante para el péptido de unión (SECUENCIA No 6) unida a la región que codifica para los 231 aminoácidos del aminoterminal del Ra IFN ys. Ver SECUENCIA No. 8.
Ejemplo 4.
Expresión en E. coli de la proteína quimérica recombinante AnTHl.
Se utilizó como hospedero la cepa de Escherichia coli W3110 P3 (protótrofa F-) y el plásmido pHu (AnThl). Para la expresión se inoculó el plásmido en 5 mL de medio LB con ampicillina (50, ug/mL) y L-triptófano (100 ug/mL), se incubó a 37°C durante 6 horas con agitación. Este cultivo fue adicionado a 50 mL de medio LB y se colocó en la zaranda a 100 r. p. m. durante 6 horas a 37°C. Este cultivo se añadió a 500 mL de medio M9 (Na2HP04 33 mM, KH2PO4 2 mM, NaCI 8.5 mM, NH4CL 18 mM, CaCl2 0.1 mM, MgS04 1 mM), enriquecido con hidrolizado de caseína al 0.2%, glucosa 0.4%, ampicillina 50 pg/mL, de forma tal que la densidad óptica (620 nm) inicial del cultivo sea 0.3. Se procede a incubar por 8 horas en las mismas condiciones descritas
anteriormente y finalmente se colecta el sedimento celular por centrifugación (ver Figura. 2).
Ejemplo 5.
Extracción, purificación y renaturalización de la proteína quimérica recombinante AnTHl.
Las células se homogeneizaron con politrón a una concentración de 0.1 g de biomasa húmeda por mL de tampón TE (Tris HCI 10 mM, EDTA 1 mM pH 7.2). Esta suspención es sometida a un proceso de ruptura enzimática con lisozima. El precipitado obtenido en el paso anterior se somete a un lavado celular con diferentes molaridades de urea desde 1M a 8M, en 50 mM de Tris pH 7.2, 1 mM de EDTA. La homogeneización se realiza con politrón. Inicialmente se homogeniza 1 minuto, se deja reposar 3 minutos y seguidamente se vuelve a homogeneizar 1 minuto más. Todo este proceso se realiza a 4°C. Las proteínas solubilizadas con urea, aproximadamente 150 mL, fueron aplicadas a un flujo de 3 mL/minutos a una columna K9/60 (Pharmacia, Suecia), conteniendo resina de Sephadex G-100, que fue previamente equilibrada con 3 volúmenes de 50 mM de Tris HCL pH 9, urea 4M. La elución se realizó en el mismo tampón. Se unieron las fracciones que contenían las proteínas y se dializaron contra 0.1 M de Tris HCl pH 9.
Después se continuó la diálisis contra buffer fosfato salino (PBS) pH 7.4. (ver Figura. 3 y 4).
Ejemplo 6.
Unión de IFN gamma a la proteína quimérica recombinante AnTHl.
Se aplicó 1 microlitro (aproximadamente 1 pg de proteína total) de la proteína quimérica recombinante AnTH1 después de foldeada a tiras de nitrocelulosa. Las tiras fueron incubadas con 10% de leche descremada durante 2h a temperatura ambiente (TA). Las membranas fueros lavadas dos veces con buffer Tris salino (TBS) por 5 minutos. Después de los lavados las tiras son incubadas con IFN gamma marcado con yodo radioactivo (125I-IFN gamma) 35pCi/pg durante lh a TA en presencia o ausencia de un exceso de IFN gamma no marcado. Después las tiras de nitrocelulosa fueron lavadas dos veces con TBS por 5 minutos y seguidamente con TBS + 0,03% Tween 20 por 5 minutos. Al final películas para radiografías fueron expuestas a las tiras para y guardadas a-70°C por 72 h y finalmente reveladas. (Ver Figura. 5).
Ejemplo 7.
Actividad estimuladora del crecimiento de células T de la proteína quimérica recombinante AnTHl.
La actividad biológica de la proteína quimérica recombinante AnTHl fue testada usando la línea celular de linfocitos T murinos dependiente de IL-2. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 conteniendo 1 mM de piruvato, 2 mM de L-glutamina, 40 mM HEPES, 100 U/mL de penicilina, 50 ug/mL de estreptomicina, 50 pM de 2- mercaptoetanol y suero fetal bovino al 10 % suplementado con 8 UI/mL de interleukina-2 humana recombinante con una actividad específica de 1.2 x 107 UI/mg.
Antes de su uso las células fueron lavadas 3 veces, resuspendidas en medio de cultivo completo sin IL-2 e incubadas durante 1 hora a 37°C en atmósfera húmeda de C02.
Entonces las células fueron lavadas, resuspendidas a una densidad de 4 x 105 células/mL y distribuidas en placas de 96 pozos (100 pLI por pozo) que contenían 100 pI de diluciones seriadas 1 : 2 de rhIL-2 o muestras (la proteína quimérica recombinante AnTHI), en medio completo. En este ensayo fue usado como estándar internacional IL- 2010397. Después de 36 horas de incubación a 37°C, se añadió a cada pozo 20 LI de 5 mg/mL de MTT (C18Hl6NsSBr) y las placas fueron incubadas por 4 horas en las mismas condiciones. Por último, fueron añadidos 50 Jul/pozo de solución de 10% SDS, 0.1 N HCI, 50% isopropanol, las placas fueron agitadas por 1 hora a 37°C, y la absorvancia fue leída a 570 nm usando el lector de placas. (ver Figura. 6).
Ejemplo 8.
Inhibición de la actividad de IL-2 de estimular el crecimiento de células T por la proteína quimérica recombinante AnTHl.
La actividad biológica para IL-2 fue testada usando la línea celular de linfocitos T murinos dependiente de IL-2. Las células fueron cultivadas de forma similar que en el experimento anterior. Antes de su uso las células fueron lavadas 3 veces, resuspendidas en medio de cultivo completo sin IL-2 e incubadas durante 1 hora a 37°C en atmósfera húmeda de CO2. Entonces las células fueron lavadas, resuspendidas a una densidad de 4 x 105 células/mL y distribuidas en placas de 96 pozos (100 VLI por pozo) que contenían 100 pil de diluciones seriadas 1 : 2 de rhIL-2 o muestras (rhIL-2 + la proteína quimérica recombinante AnTH1 ó la proteína quimérica recombinante AnTHl sola), en medio completo. En este ensayo fue usado como estándar internacional IL-2010397. Después de 36 horas de incubación a 37°C, se añadió a cada pozo 20 ptl de 5 mg/mL de MTT (Cl8HI6NsSBr) y las placas fueron incubadas por 4 horas en las mismas condiciones.
Por último, fueron añadidos 50 p, l/pozo de solución de 10% SDS, 0.1 N HCI, 50% isopropanol, las placas fueron agitadas por 1 hora a 37°C, y la absorvancia fue leída a 570 nm usando un lector de placas. Los resultados fueron expresados como unidades de rhIL-2, basado en el análisis de los datos de la curva de diluciones estándar de rhIL-2 y las diluciones seriadas de la muestra (ver Figura. 7).
Ejemplo 9.
Inhibición de la actividad antiproliferativa del IFN y por la proteína quimérica recombinante AnTHl.
Se sembraron 2.5 x 103 células/pozo de Hep-2 cultivadas en medio MEM CANE (medio mínimo esencial con aminoácidos no esenciales) suplementado al 10% con suero fetal bovino en placas de 96 pozos. Se incubaron 24 horas a 37°C en incubadora con 5% de CO2. Transcurrido este tiempo, se cambió el medio y se añadieron las muestras a evaluar en diluciones seriadas y sus respectivos controles. Al cabo de las 72 horas de incubación, las células se tiñeron con violeta cristal 0.5% por 2 minutos y se leyeron las placas en el lector de placas. (ver Figura. 8).
Ejemplo 10.
Inhibición de la inducción por IFN y de HLA H por la proteína quimérica recombinante AnTHl.
Este ensayo es un ELISA sobre células descrito por Seeling G. y cols. Development of receptor peptide antagonist to human y-interferon and characterization of its ligand- bound conformation using transferred nuclear overhauser effect spectroscopy. J : Biol.
Chem. 270, 9241-53, 1995. Se utilizó la línea celular Colo 205. Se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos 2.5 x 105 células/pozo en 0.1 mL de RPMI 1640 enriquecido con suero fetal bovino al 10%. Las células fueron incubadas 12 horas a 37°C en incubadora con atmósfera al 5% de CO2. Luego se añadió a los pozos con las células sembradas medio de cultivo en presencia de la proteína quimérica recombinante y de IFN-y en un volumen de 0.1 mL y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, el medio fue removido y los pozos fueron lavados 3 veces con medio de cultivo. A continuación se añadieron alícuotas de 0.2 mL de medio a los pozos y las placas fueron
incubadas por 48 horas a 37°C para permitir la inducción de los antígenos HLA-DR.
Los pozos fueron lavados con PBS y las células fueron fijadas con etanol absoluto por 2 minutos. Se repitió el lavado y las placas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-HLA-DR diluido en PBS al 0.5% de albúmina de suero bovino. Se lavaron los pozos con PBS y se incubaron en las mismas condiciones con el conjugado anti-IgG de ratón-peroxidasa. Se repitieron 3 veces los lavados y se revelaron añadiendo 100 uL/pozo de H202 al 0.15% + o-fenilendiamina 5 mg/mL. La detección de la reacción se realizó con 50 uL/pozo de H2S04 2 M y se midió la absorbancia a 492 nm en el lector de placas. (Figura. 9).
Ejemplo 11.
Analisis por espectrometria de masa Una pequeña cantidad de la proteína quimérica recombinante AnTHl (0. 5 p. g) fue analizada por electroforesis en gel de poliacrilamida y sometida a tinción inversa con Zn-Imidazol (Castellanos-Serra L, y cols. Detection of biomolecules in electrophoresis gels with salts of imidazole and zinc IL a decade of research. Electrophoresis. 2001, 22, 864-7.). La banda correspondiente a la proteína fue cortada del gel e incubada con una solución de ácido cítrico (1%) durante 5 minutos. La banda transparente fue cortada adicionalmente en piezas de 1 mm3 y deshidratadas en solución acuosa de acetonitrilo al 90% sin ácido trifloro acético y secadas completamente a vacio. Las piesas de gel fueron rehidratadas en 20 pL de NH4HC03 50 mM conteniendo 12.5 ng de tripsina modificada, grado para secuencia (Promega, MA, USA). La disgestión en el gel fue toda la noche a 37°C. Después de este proceso se le añadieron 20 gel de NH4HC03 50 mM y se incubó durante 45 minutos.
Los peptidos producto de la digestión fueron extrados utilizando ZipTips C18 de Millipore (USA) como recomiendan los proveedores. Los espectros de ionización por electrospray (ESI-MS) fueron adquiridos utilizando un espectrofotómetro QTOF (Micromass, Manchester, UK). Para obtener la información de la secuencia de los péptidos el espectro ESI-MS/MS fue adquirido como se describe en González, L. y cols.
Differentiating alpha-and beta-aspartic acids by electrospray ionization and low- energy tandem mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, 2092- 2102. La adquisición de los datos y su procesamiento fueron realizados utilizando el software MassLynx system (v 3.5) de Micromass. Las bandas con señales más intensas fueron secuenciadas.
Tabla 1. Analisis de ESI-MS de los péptidos derivados de la proteína AnTHl m/z Abs. # Secuecia peptidicaa) m/z teor. Zb) exp. Terror' 1 T-K 908. 81 908. 83 3 0. 02 2 40M-K44 639.34 639.35 1 0.01 3 45F-K50 685.33 685.33 1 0.00 4 @H-R@@@) 442.87 442.88 3 0. 01 5 67A-K114 1781. 5 1781.54 3 0. 02 6 Q-K114 d), e) 807. 93 807. 95 2 0. 02 7-R 921.14 921. 17 4 0. 03 8 °°S-R 506. 23 506. 23 2 0. 00 9 177I-K181 511. 31 511. 28 1 0. 03 10 Q-R 1225. 2 1225.23 3 0.03 11 V-R227 d) 456. 74 456. 75 2 0. 01 12 228M-K236 d) 535. 24 535. 25 2 0. 01
a) La numeración de los péptidos es de acuerdo a la secuencia dela proteína AnTH1 de la figura 10 b) Estado de la carga de los péptidos individuales. c) Indica la diferencia de masa absoluta entre la masa molecular y experimental de los péptidos detectados. d) Péptidos secuenciados por ESI-MS/MS. e) Peptidos originados por corte no especifico de la tripsina f) Péptido que contiene una cisteina libre.
Ventajas de la solucion propuesta.
La invención logra en una misma molécula reunir la capacidad de interferir con dos sistemas de señalización que afectan mecanismos inmunoreguladores e inflamatorios. El diseño de la proteína quimérica consiste en fusionar un ligando (IL-26o) a través de un péptido de 4 aminoácidos con una región extracelular de receptor (Rα IFN y). Esta combinación debe permitir la unión de la proteína quimérica recombinante a las células que contengan en su superficie al Ra IL-2. Dicha subnunidad fundamentalmente está presente en las células T no activadas y en el receptor de IL-2 de alta afinidad (Ra) 3y IL-2) en las células T activadas (Smith, K A. The interleukin-2 receptor. Annu. Rev.
Cell. Biol. 5, 397-403, 1989 y Strom, T. B. y cols. Interleukin-2 receptor-directed therapies: antibody- or cytokine-based targeting moelcules. Annu. Rev. Med. 44, 343- 50, 1993).
Si la proteína AnTH1 se une al RaIL-2 en las células en reposo, puede internalizar a la proteína dejando al Ra IFN ys en el citoplasma en condiciones de ser reciclado al
medio exterior e interferir con el IFN y que se producirá al ser activadas las células. La interacción del IFN y desde el citoplasma con una región intracelular del receptor de membrana capaz de generar actividad biológica del IFN y ha sido descrita (Szente B. E. y cols. Identification of IFN (receptor binding sites for JAK2 and enhancement of <BR> <BR> <BR> <BR> bindingbyIFNyand itsC-terminalpeptideIFNy (95-133). J. Immunol. 155, 5617-22, 1995). Durante una enfermedad donde sea necesario disminuir la acción de la IL-2 producida por el organismo al añadir la proteína AnTHl, esta se unirá a través de la porción IL-26o a la subunidad alfa en el complejo de alta afinidad (Rapy IL-2) en las células activadas, interferirá con la unión de la IL-2 íntegra (nativa) secretada por las células del sistema inmune e interferirá su actividad biológica. Por otro lado el IFN y ya secretado por las células T activadas puede ser secuestrado por la porción Ra IFN ys de la proteína quimérica impidiendo su unión a su receptor de membrana. De esta forma una reacción autoinmune y/o inflamatoria exacerbada puede ser controlada en dos momento diferentes, durante la activación y en el proceso de propagación de la reacción.
La invención proporciona una proteína quimérica hetero-bivalente que puede interferir con la actividad biológica de la IL-2 y el IFN y. Teniendo en cuenta que la proteína quimérica recombinante AnTHI posee además actividad estimuladora del crecimiento de células T, puede esperarse una menos profunda inactivación del sistema inmune, que la que provocan antagonistas anticitocinas ya probados clínicamente.