Cette prévention de la contamination est, jusqu'à présent, assumée ou non par des conservateurs à efficacité médiocre (Phenoxy-ethanol, Metacresol, Phenol, Esters parahydroxybenzoiques...) ou neurotoxiques et neurocumulatifs (derives mercuriels type Merthiolate...).

La CHLORPHENESINE ou 3p-Chlorphenoxypropane-1,2 diol ou p-chlorphenyl- glycérol éther (PM = 202,6), utilisée seule ou en association avec un autre conservateur compatible, permet de remédier à cet inconvénient.

La présente étude comporte deux étapes: -Determiner une zone de concentrations efficaces de la CHLORPHENESINE.

-Démontrer son efficacité selon les exigences des Pharmacopées Européenne et Britannique.

I/Determination de Concentrations efficaces de la CHLORPHENESINE La concentration efficace de la chlorphénésine est la concentration minimale bactéricide (C. M. B.) et fongicide (C. M. F.) 1.1. Micro-organismes testes: Les micro-organismes utilises dans la détermination de concentration efficace de la chlorphénésine sont référencés A. T. C. C. (American Type Culture Collection) : -Escherichia coli ATCC 8739 -Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 -Staphylococcus aureus ATCC 6538 -Apergillus niger ATCC 16404 -Candida albicans ATCC 10231 1.2. Inoculum: Les micro-organismes testes doivent etre en phase exponentielle de croissance et en milieu liquide type Bouillon Mueller-Hinton (b. M. H.) ou type Bouillon Trypto-Caseine- Soja (b. T. C. S.).

L'inoculum pour la détermination de C. M. B. et C. M. F. doit tre vérifié par:

-Numeration en milieu gélosé type gélose Mueller-Hinton (g. M. H.) ou gélose type T. C. S.

(g. T. C. S.) pour E. coli, Ps. aeruginosa et C. albicans.

-Determination du Nombre Le Plus Probable (N. P. P.) en b. M. H. ou b. T. C. S. selon les tables de Mc GRADY pour S. aureus et A. niger. En effet, ces derniers sont en amas difficilement dissociables et ne peuvent en conséquence tre numerus de façon classique.

1.3. Concentration Minimale Inhibitrice (C. M. I. !-Concentration Minimale Bactéricide (C. M. B.) ou Fongicide (C. M. F.): La détermination de la C. M. I. est réalisée sur plaque à 96 cupules et en milieu nutritif liquide type b. M. H. ou type b. T. C. S.

La chlorphénésine est diluée au maximum de sa solubilité en b. M. H. ou b. T. C. S. à 0,6 % (P/V) à 20-25°C.

Les concentrations finales de Chlorphénésine testées suivent une progression géométrique de raison 2 avec une concentration initiale à 0,0125 microgramme/ml et la plus élevée à 0,400 microgramme/ml.

Un témoin inoculum sans chlorphénésine et la concentration maximale de 0,600 microgramme de chlorphenesine/ml sont également testes.

L'inoculum de micro-organisme, de 1.109à 5.105unités viables par cupule de 100 microlitres, doit tre sous un volume négligeable inférieur ou égal à 5 microlitres.

La plaque, recouverte d'une feuille de cellophane stérile pour éviter l'évaporation, est alors incubée à 30-35°C pour les bactéries et à 20-25°C pour la levure et la moisissure.

La lecture de la C. M. I. est réalisée après 24 h d'incubation pour les bactéries et après 48 h pour la levure et la moisissure.

Après relevé de C. M. I., un repiquage de 100 microlitres de chacune des cupules sans croissance apparente par tube de 10 ml de b. M. H. ou b. T. C. S. permet, après incubation dans les mmes conditions décrites pour la C. M. I., de déterminer la C. M. B. ou la C. M. F.

Les résultats sont récapitulés dans le tableau ci-apres: Tableau N° 1: C. M. I. et C. M. B. ou C. M. F. de la chlorphenesine

Escherichia Pseudomonas Staphylococcus Aspergillus Candidada Coli ATCC aeruginosa aureus niger ATCC albicans ATCC 8739 ATCC 9027 ATCC 6538 16404 10231 C. M. I. 0, 10 0, 20 0, 20 0, 10 0, 20 C. M. B. ou 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 C. M. F I I I I I I I La concentration efficace de la chlorphénésine utilisée comme agent conservateur est donc de 0,400 microgramme/ml. L'incertitude étant d'une à deux dilutions d'écart, la zone de concentrations efficaces de la chlorphénésine est donc l'intervalle 0,100 microgramme /ml-0,600 microgramme/ml; cette dernière concentration étant la solubilité maximale a température ambiante 20-25°C.

II/Efficacite de la chlorphenesine comme agent conservateur selon les exigences des Pharmacopées Européenne et Britannique II. 1. Principe: L'essai consiste en : -la contamination artificielle d'une solution aqueuse contenant 10 % (P/V) d'une substance interférente quelconque: proteine, lipide, glucide à l'aide d'un inoculum de micro- organismes (minimum 1.10/ml), en présence de 0,400 microgramme de chlorphénésine en concentration finale par millilitre.

-le maintien de la préparation inoculée à la température de 20-25°C et a 1'obscurite.

-le prélèvement d'échantillons à partir des contenants, à intervalles de temps déterminés.

-le dénombrement des micro-organismes dans les échantillons ainsi prélevés.

11.2. Critères de la Pharmacopée Européenne:

Réduction Logarythmique/ au Temoin 6 h 24 h 7 jours 14 jours 28 jours Peptone s. aeruginosa ; Non S. aureus 2 3 retrouve C. albicans Pas . niger 2 d'augmentation 11.3. Criteres de la Pharmacopée Britannique: RéductionLogarythmique/ au Témoin Peptone 6 h 24 h 7 jours 14 jours 28 jours Ps. aeruginosa S. aureus; 3 Non retrouve Non retrouve E. coli C. albicans Pas A. niger 2 d'augmentation 11.4.Résultats: Remarque: -Les inoculums de E. coli, Ps. aeruginosa et C. albicans sont vérifiés par numération sur gélose Mueller-Hinton ou gélose T. C. S. Par contre, ceux de S. aureus et A. niger sont appréciés par leur Nombre le Plus Probable selon Mc GRADY en bouillon Mueller Hinton ou en bouillon T. C. S.

-Les éventuels survivants à la chlorphénésine sont dénombrés en tenant compte de la teneur résiduelle de la chlorphénésine qui doit tre, dans le milieu de culture, inférieure ou égale au 1/4 de la C. M. I. de chaque micro-organisme.

Tableau: Activité anti-micro-organisme de la chlorphénésine à 0,40 % P/V soit 0,400 microgramme/ml. Réduction logarythmique/Temoin Peptone à l'instant T.

Red.Iog./ Témoin Peptone T + 6 h T + 24 h T + 7 jours T + 14 jours T + 28 jours E. coli > 3 Non retrouve NR Non retrouve NR Ps. aeruginosa > 3 Non retrouve NR Non retrouve NR S. aureus > 3 Non retrouve NR Non retrouve NR C.albicans > 2, 5 > 6 A. niger >2,5 > 4 1 III/Conclusion: La chlorphénésine est efficace comme agent conservateur.