Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestätigung von amplifizierten Nukleinsäure-Zielsequenzen (Zielsequenz), vorzugsweise aus humanen Proben, während einer Vervielfältigungsreaktion in einem kollektiven und kontinuierlichen Reaktionsansatz als Eintopfverfahren, worin die Bestätigung des Zielsequenzamplifikats über das Matrizenamplifikat erhalten wird. Dabei wird die Matrizensequenz mittels der 5 ^' -Spaltprodukte der mindestens einen Zielsequenz-spezifischen FEN-Sonde amplifiziert und optional markiert. Das 5 ^' -Spaltprodukte der mindestens einen Zielsequenz-spezifischen FEN-Sonde wird nur dann erhalten, wenn die FEN-Sonde mit ihrer Zielsequenz-spezifischen 3 ^' -Sequenz an einen komplementären Sequenzabschnitt der mindestens einen Zielsequenz hybridisiert. Die Detektion der erhaltenen Vielzahl an Matrizenamplifikaten erfolgt distinkt und bevorzugt mittels elektrophoretischer Verfahren.

Nukleinsäureamplifikationstechnologien (NAT), allen voran die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), sind heute wesentlicher Bestandteil der molekulargenetischen Diagnostik. Dabei sind auch mehrere Parameter gleichzeitig in so genannten Multiplex-Verfahren nachweisbar. Zur Erhöhung der Spezifität und insbesondere zur Qualitätssicherung des molekularen Nukleinsäurenachweises von Krankheitserregern wird ein Bestätigungstest für die Amplifikationsprodukte gefordert (MIQ-1 201 1 , Rili-BÄK-B3 2013). Hierfür werden beispielsweise in homogenen Testverfahren (so genannte Eintopfverfahren oder -reaktionen wie z. B. die Echtzeit-PCR) vielfach DNA-Sonden verwendet, welche mit einem DNA- Halbstrang des DNA-Amplifikats sequenzspezifisch hybridisieren und mit einem Fluorophorpaar, welches über FRET (Förster Resonanz Energie Transfer) wechselwirkt, markiert sind. Der FRET wird durch die sequenzspezifische Hybridisierung moduliert oder aufgehoben, sodass ein mittels Echtzeit-Thermocycler messbares Signal entsteht. Ein bevorzugtes Sondenformat sind so genannte Hydrolysesonden, welche nach der Hybridisierung durch die intrinsische Nukleaseaktivität der Taq DNA Polymerase gespalten werden, wodurch das Fluorophorpaar getrennt wird.

Alternativ zu homogenen Tests können als Bestätigungstest der NAT nachgeschaltete Verfahrensschritte wie Hybridisierung der DNA-Amplifikate an immobilisierten Sonden (z. B. Reverse-Line-Blot, DNA-Chip, DNA-Bead-Assay), Southern-Hybridisierung, DNA- Sequenzierung oder Nested-PCR durchgeführt werden. Diese Strategien erfordern jedoch zusätzliche Prozessierungsschritte für den Bestätigungstest, welche in Bezug auf Zeit und Kosten aufwendiger sind und die Gefahr einer Kontamination beinhalten.

Eine Kontamination der Amplifikate erfolgt beim Entnehmen eines Aliquots aus dem PCR- Reaktionsansatz und/oder beim Überführen dieses Aliquots in einen neuen Reaktionsansatz für das nachgeschaltete Verfahren zur Bestätigung der Amplifikate. Eine Kontamination umfasst insbesondere die Verunreinigung des Amplifikats mit Fremd-DNA oder Amplifikaten aus parallel prozessierten Proben (Kreuzkontamination). Eine Kontamination hat enorme Auswirkungen auf die Qualität des Bestätigungstests. Unter Berücksichtigung des hochsensiblen Anwendungsbereichs solcher Bestätigungstests, wie Diagnostik, Tumordiagnostik, Diagnostik von schwerwiegenden Infektionserregern und deren Resistenzen, entscheidet ein Bestätigungstest über die Diagnose und die daraus resultierende Therapie eines Patienten. Fehldiagnosen führen zu falschen Therapien, Folgeschäden beim Patienten sowie erhöhte Kosten für das Gesundheitssystem.

Daher ist ein verlässlicher Bestätigungstest wesentlich. Dieser sollte einfach und robust sei, sodass Fehlerraten möglichst reduziert werden. Die Bestätigung von NAT-Amplifikaten mittels Fluoreszenzfarbstoffen, welche doppelsträngige DNA sequenzunspezifisch binden (z. B. SYBR Green I), oder ausschließlich über die Größenbestimmung der primären Amplifikate durch nachgeschaltete DNA-Elektrophoresen (Flachgel- oder Kapillargelelektrophorese) sind keine anerkannte Verfahren gemäß der genannten Richtlinien.

Ein Nachteil homogener Testverfahren ist die relativ geringe Multiplexfähigkeit der Echtzeit- Thermocycler, welche zurzeit nur über 3-6 verschiedene Detektionskanäle verfügen.

Im Gegensatz dazu können mittels moderner Kapillargelelektrophoreseautomaten wie dem Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific Inc.- Applied Biosystems Div., Foster City, US-CA) durch Längenunterschiede der Amplifikate und 5 verschiedene Detektionskanäle gleichzeitig deutlich mehr als 50 Parameter aufgelöst werden. Die zu analysierenden DNA-Amplifikate müssen dabei eine kovalent gebundene Fluoreszenzmarkierung tragen, welche meist während der PCR über 5'-fluoreszenzmarkierte Primer eingeführt wird. Ein PCR-Bestätigungstest gelingt für diese Kapillargelelektrophoreseautomaten nur durch mehrstufige Verfahren, welche der PCR oder Multiplex-PCR nachgeschaltet sind, wie z. B dem SNaPshot ^® Multiplex System, einer enzymatischen Einzelbasenverlängerung unmarkierter Sondenprimer mittels fluoreszenzmarkierter 2', 3'-Didesoxyribonukleosid-Triphosphaten (Thermo Fisher Scientific Inc- Applied Biosystems Div., Foster City, US-CA).

Daher war es Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Bestätigungstests für NAT, welche die besonderen Multiplex-Fähigkeiten von automatischen kapillargelelektrophoretischen Verfahren für diagnostische Tests, die an die Durchführung entsprechender Bestätigungstests gebunden sind, zu erschließen und/oder zu vereinfachen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen kontinuierlichen und kollektiven Reaktionsansatz für die Amplifikation von Zielsequenzen, insbesondere aus humanen Proben wie Blut, Plasma, Knochen und/oder Gewebe, und gleichzeitig für den darauf folgenden Bestätigungstest bereitzustellen. Es ist ebenfalls das Ziel ein Verfahren, insbesondere ein Eintopfverfahren, zur Amplifikation und Bestätigung der jeweiligen Zielsequenz unter Verwendung des vorgenannten Reaktionsansatzes bereitzustellen. Dabei sollen Zwischenschritte zur weiteren Prozessierung der erhaltenen Amplifikate, wie Aufreinigung und/oder zusätzliche Sondenhybridisierungen in getrennten Gefäßen vermieden werden. Somit ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung das Risiko der Kontamination mit Fremd-DNA, RNA, Proteine, Peptide und/oder Chemikalien zu vermeiden und ferner ein vereinfachtes und schnelleres Verfahren bereitzustellen. Es soll ein Verfahren bereitgestellt werden, dass die vorgenannten Nachteile und Risiken aus dem Stand der Technik vermeidet und gleichzeitig die Vorteile und Potentiale bestehender Multiplex-Nachweisverfahren kombiniert. Daher ist eine weitere Aufgabe die Bereitstellung eines Verfahrens zur Amplifikation mindestens einer Zielsequenz, insbesondere aus einer humanen Probe eines Patienten, und eine kontinuierlich folgende Bestätigung der mindestens einen Zielsequenz und Detektion mittels eines elektrophoretischen Verfahrens, wie Flachgel-Elektrophorese oder Kapillargel-Elektrophorese. Somit ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens, das mit einem kontinuierlichen Reaktionsansatz und dem daraus erhaltenen Amplifikaten variablen Detektionsverfahren, insbesondere mit einer flüssigen Phase, ohne Prozessierungsschritte zugeführt werden kann. Es soll ein Verfahren für die Diagnostik, insbesondere Humandiagnostik zur Verfügung gestellt werden, das eine geringere Fehlerrate bei der Bestätigung des jeweiligen Amplifikats aufweist, da das Risiko Kontamination verringert bis zu verhindert wird. Es soll auch ein Bestätigungsverfahren mit hoher Sensitivität für Proben mit geringer Qualität und/oder sehr geringer verwertbarer DNA-Menge bereitgestellt werden. Der Reaktionsansatz, das Multiplex-Kit und das Bestätigungsverfahren sollen einfach und ortsunabhängig (Point-of-Need) bei gleich hoher Qualität verwendet und durchgeführt werden können. Ein wesentliches Ziel ist es einen Bestätigungstest bereitzustellen, der die Anforderungen mindestens der Richtlinie MIQ-1 201 1 für Nukleinsäuren-Amplifikations- Techniken und/oder die Richtlinie der Bundesärztekammer B3 (Rili BÄK-B3) für den direkten Nachweis und Charakterisierung von Infektionserreger erfüllt sowie auch jeweils die Anforderungen der jeweiligen Novellierungen der Richtlinie erfüllt.

Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das durch den erfindungsgemäßen Bestätigungstest (synonym = Bestätigungsverfahren) gekennzeichnet ist, in dem eine homogene PCR oder Multiplex-PCR ohne zusätzliche Pipettierschritte (Eintopfverfahren) durchgeführt wird. Die wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung sind, dass ein Eintopfverfahren zur Bestätigung von Zielsequenzen bereitgestellt wird und das erfindungsgemäße homogene Testformat die Möglichkeit zur Quantifizierung der Ausgangsnukleinsäuren bereitstellt, wie nachfolgend beschrieben. Dadurch ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass Proben mit nur sehr geringem Anteil an verwertbarem DNA-Ausgangsmaterial und/oder degradierten DNA-Ausgangsmaterialien dennoch als Zielsequenz verwendet und erfindungsgemäß bestätigt und detektiert werden können.

Die bevorzugt verwendeten Sonden sind so genannte Hydrolysesonden, welche direkt im PCR Reaktionsgemisch enthalten sind und nach der Hybridisierung an die Zielsequenz durch die intrinsische Nukleaseaktivität der Taq DNA Polymerase gespalten werden. Dadurch können z. B. in der HIV-Diagnostik die Viruslast des Patienten sowie nach Medikation der Therapieerfolg ermittelt werden. Das erfindungsgemäße Bestätigungsverfahren hat den besonderen Vorteil, dass erfindungsgemäße FEN-Sonden, welche am Ende der Vervielfältigungsreaktion, insbesondere PCR ggf. noch im Überschuss vorliegen, nicht reaktiv sind. Damit behindern diese überschüssigen FEN-Sonden die Bestätigung und Detektion der erhaltenen Matrizenamplifikate nicht.

Das erfindungsgemäße Bestätigungsverfahren hat somit den Vorteil durch die exponentielle Signalverstärkung sensitiver zu sein und erlaubt einen höheren Multiplex-Grad.

Des Weiteren kann der Bestätigungstest als standardisierte universelle Reaktionsschritte unabhängig von der zu amplifizierenden Zielnukleinsäure konzipiert werden. Letzteres erlaubt die Ausarbeitung eines testunabhängigen Entwicklungswerkzeugs bestehend aus universellen PCRs und/oder universellen Primerverlängerungsreaktion. Die Reaktionsprodukte (synonym = Amplifikate, Matrizenamplifikate) des Bestätigungstests sind kompatibel mit den Standardverfahrensschritten zum Nachweis mittels Kapillargelelektrophorese. Im Falle des Qiagen ModaPlex Systems wird im Besonderen ein homogener Bestätigungstest für PCR- oder Multiplex-PCR für eine quantitative Echtzeitdetektion in Kombination mit einer hochauflösenden Kapillargelelektrophorese vorgestellt.

Die erfindungsgemäße Lösung wird im Folgenden beschrieben. Ausgewählte Ausführungsbespiele zeigen Wege zur Erzielung der erfindungsgemäßen Lösung und erläutern das Grundprinzip und Funktionsweise der vorliegenden Erfindung, wobei die hier präsentierten Beispiele nicht beschränkend auszulegen sind.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Bestätigung, insbesondere ein Bestätigungsverfahren, mindestens einer amplifizierten Nukleinsäure-Zielsequenz, insbesondere DNA und/oder cDNA, welche nachfolgend kurz als Zielsequenz bezeichnet wird, während einer Vervielfältigungsreaktion in einem kollektiven und kontinuierlichen Reaktionsansatz enthaltend ein Reaktionsgemisch umfassend

mindestens eine nachzuweisende Zielsequenz,

mindestens zwei Zielsequenz-spezifische Primer (P1 , P2, P _1-n ), die zur Amplifikation der mindestens einen Zielsequenz geeignet sind,

- mindestens eine Zielsequenz-spezifische, insbesondere intermolekulare, markierte und/oder unmarkierte, FLAP-Endonukleasesonde (FEN-Sonde FEN1 , FEN _1-n ), wobei die mindestens eine, insbesondere einzelsträngige, FEN-Sonde umfasst

• eine Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz, insbesondere DNA 3 ^' -Sequenz, welche komplementär zu einem Sequenzabschnitt der mindestens einen Zielsequenz innerhalb einer Region ist, die von dem mindesten ersten Primer (P1 ) und dem mindestens zweiten Primer (P2) auf der Zielsequenz begrenzt wird, insbesondere hybridisieren P1 und P2 mit der Zielsequenz (siehe Fig. 1 )

• am 3'-Ende der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz eine Schutzgruppe, insbesondere als Polymeraseblocker, vorzugsweise fehlt die 3 ^' -OH-Gruppe, und · eine Zielsequenz-unspezifischen 5'-Sequenz, insbesondere DNA 5 ^' -Sequenz, die optional eine Fluoreszenzmarkierung aufweist und

mindestens eine artifizielle Matrizensequenz, insbesondere artifizielle Nukleinsäuresequenz,

das Bestätigungsverfahren umfasst je Zyklus der Vervielfältigungsreaktion die Schritte Hybridisierung der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz der mindestens einen FEN- Sonde (FEN _1-n ) an eine komplementäre Sequenz der mindestens einen nachzuweisenden Zielsequenz,

Spaltung der mindestens einen FEN-Sonde (FEN _1-n ),

- Erhalt von mindestens einem freien 5 ^' -Spaltprodukt (Si _-n ) umfassend jeweils die Zielsequenz-unspezifische 5'-Sequenz,

Hybridisierung des mindestens einen 5 ^' -Spaltprodukts (Si _-n ) der mindestens einen FEN- Sonde an eine komplementäre Sequenz der mindestens einen artifiziellen Matrizensequenz, insbesondere an die Matrizensequenz eines denaturierten Doppelstrangs, insbesondere eines Einzelstrangs,

insbesondere Elongation des an der vorzugsweise einzelsträngigen artifiziellen

Matrizensequenz mindestens eines hybridisierten 5 ^' -Spaltprodukts (S1 )

Amplifikation der mindestens einen artifiziellen Matrizensequenz mit dem mindestens einen 5 ^' -Spaltprodukt (Si _-n ) der mindestens einen FEN-Sonde, und

- optional Markierung der mindestens einen artifiziellen Matrizensequenz während der Amplifikation durch das mindestens eine 5 ^' -Spaltprodukt der mindestens einen FEN- Sonde, und

insbesondere Erhalt mindestens eines optional markierten artifiziellen Matrizensequenzamplifikats (synonym = artifizielles Matrizenamplifikat, Matrizen- amplifikat) und

insbesondere Detektion des mindestens einen optional markierten Matrizensequenzamplifikats, vorzugsweise wird das optional markierte Matrizensequenz- amplifikat in einer Flüssigphase detektiert, besonders bevorzugt mittels eines elektrophoretischen Verfahrens.

Das vorbeschriebene Verfahren mit dem kontinuierlichen und kollektiven Reaktionsansatz für die Amplifikation der Zielsequenz und Bestätigung der erhaltenen Zielsequenzamplifikate mittels einer Amplifikation und optional Markierung einer Matrizensequenz kann synonym als Eintopfverfahren bezeichnet werden, da die vorgenannten Reaktionen ohne Prozessierungsschritte und ohne zeitliche oder räumliche Trennung erfolgen. Der Fachmann versteht, dass alle weiteren Komponenten, wie z. B. Puffersystem, Nukleotide, Salze, etc., die für eine erfolgreiche PCR erforderlich sind, ebenfalls im Reaktionsgemisch enthalten sind. Nach Erhalt des optional markierten Matrizensequenzamplifikats kann die Detektion mit dem gewünschten Verfahren und Gerät jederzeit und ortsunabhängig durchgeführt werden. Eine Zielsequenz ist eine Nukleinsäure-Sequenz innerhalb einer Probe (synonym = Untersuchungsgut), die im Rahmen einer Analytik oder Diagnostik z. B. dem spezifischen Nachweis eines Individuums (Forensik, Genealogie), einer Art (z. B. Krankheitserreger, genetisch veränderter Organismus), einer Krankheit oder eines anderen biologischen Merkmals dient. Die Probe umfasst alle denkbaren Ausgangsmaterialien mit biologischem Anteil wie z. B. pflanzliche, tierische und menschliche Flüssigkeiten, extrazelluläre Kreislaufflüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma, Serum und/oder Lymphe, Verdauungssäfte, insbesondere Speichel, Magensaft, Saft der Pankreas und/oder Galle, Sekrete und Exkrete, insbesondere Schweiß, Urin, Kot, Ejakulat, Vaginalsekrete, Tränenflüssigkeit, Nasensekret und/oder Muttermilch und/oder weitere Flüssigkeiten oder Absonderungen, insbesondere Fruchtwasser, Ohrenschmalz, Hirnwasser und/oder Eiter und Gewebe, Nägel, Haare und/oder Knochenbestandteile, Nahrungsmittel, Umweltisolate etc., und/oder synthetische Nukleinsäuren (z. B. Barcode-Sequenzen und andere gezielte DNA-Markierung von anderen Artikeln), und kann eine oder mehrere Zielsequenzen umfassen. Probe umfasst ebenfalls Biopsie- und Abstrichmaterial. Vorzugsweise ist die Probe eine humane Probe.

In dem vorgenannten Verfahren ist die Zielsequenz bevorzugt eine DNA, insbesondere natürliche DNA und/oder cDNA (english complementary DNA, deutsch komplementäre DNS), die mittels einer Reversen Transkriptase aus RNA, wie mRNA oder ncRNA, synthetisiert wurde. Insbesondere in der medizinischen Diagnostik werden aus Proben verwertbare Ribonukleinsäuren zu cDNA umgeschrieben, um diese anschließend der Analytik, insbesondere dem erfindungsgemäßen Verfahren, als Zielsequenz zuzuführen.

Dabei wird erfindungsgemäß die Zielsequenz in einer Vervielfältigungsreaktion vervielfältigt (synonym = amplifiziert), vorzugsweise in einer Vervielfältigungsreaktion einer Polymerase- kettenreaktion (PCR) oder einer isothermalen Nukleinsäureamplifikationstechnologie (iNAT). Die PCR ist dem Fachmann bekannt. Unter Nukleinsäureamplifikationstechnologien (NAT) werden enzymatische Verfahren zur in-vitro Vervielfältigung von Nukleinsäuren, insbesondere von erfindungsgemäßen Zielsequenzen, bezeichnet. Diese können thermische Zyklen erfordern (z. B. PCR) oder isothermal (iNAT) verlaufen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestätigung beider Varianten eingesetzt werden. Weitere Ausführungsformen der vorgenannten Verfahren iNAT sind LAMP (loop-mediated isothermal amplification), HDA (helicase-dependent amplification), RPA (recombinase Polymerase amplification), SIBA (Strand Invasion Based Amplification), RCA (rolling circle amplification). Erfindungsgemäß sind Flap-Endonukleasesonden, kurz als FEN-Sonden bezeichnet, Moleküle umfassend eine, insbesondere einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, welche mindestens zwei funktionelle Bereiche aufweist. Die beiden funktionellen Bereiche sind eine 5'-Sequenz, die nicht komplementär zu einem Sequenzabschnitt der mindestens Zielsequenz ist (kurz Zielsequenz-unspezifische 5'-Sequenz genannt) und eine 3 ^' -Sequenz, die komplementär zu einem Sequenzabschnitt der mindestens Zielsequenz ist (kurz Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz genannt) ist. Der Sequenzabschnitt liegt innerhalb einer Region, die von dem mindesten ersten Primer (P1 ) und dem mindestens zweiten Primer (P2) auf der Zielsequenz begrenzt wird. Diese FEN-Sonden (FEN _1-n ) hybridisieren mit der Zielsequenz unter Ausbildung eines durch eine FEN abspaltbaren 5'-Flaps, der durch die Zielsequenz-unspezifischen 5'- Sequenz dargestellt wird. Der Begriff Flap bezeichnet gabelförmig ungepaarte Strukturen innerhalb oder am Ende (3' oder 5') einer DNA-Doppelhelix. Diese Strukturen erkennt die Flap Endonuklease (FEN) als Substrat, wie es in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt ist. Das 3'-OH-Ende der FEN-Sonde ist erfindungsgemäß durch einen so genannten Polymeraseblocker gegen die Verlängerung durch eine DNA Polymerase geschützt. Durch Einwirkung einer FEN (Flap Endonukleasen) wird die FEN-Sonde gespalten, wobei ein freies 5 ^' -Spaltprodukt erhalten wird.

FEN1 steht kurz für eine FEN-Sonde und FEN1 und FEN2 steht kurz für zwei FEN-Sonden. Entsprechend steht S1 für ein 5 ^' -Spaltprodukt und S1 und S2 stehen für zwei 5 ^' -Spaltprodukt. Die Bezeichnung FEN _1-n steht für mindestens eine bis variabel viele FEN-Sonden bzw. S für entsprechend viele 5 ^' -Spaltprodukte (Si _-n ) der jeweiligen FEN-Sonde, wobei n gleich eine ganze Zahl ist. Insbesondere ist n eine ganze Zahl und vorzugsweise gleich 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 (FEN1 -10 entspricht zehn, insbesondere verschiedene, FEN-Sonden) usw. bis kleiner gleich 50 FEN-Sonden. Die höchst mögliche Anzahl der FEN-Sonden in einem erfindungsgemäßen Reaktionsgemisch ist abhängig von dem zur Detektion verwendeten Verfahren. Die Anzahl der Detektionskanäle in dem verwendeten Gerät und die maximale distinkte Auflösung unterschiedlicher, insbesondere artifizieller und optional markierter Matrizenamplifikate limitiert die maximal verwendbare Anzahl der erfindungsgemäßen FEN- Sonden.

Bevorzugt werden für den Bestätigungstest umfassend eine Detektion mittels des ModaPlex- Systems (Qiagen) größer gleich 5 bis kleiner gleich 50, kleiner gleich 45, 40, 35 und kleiner gleich 30 FEN-Sonde im erfindungsgemäßen Reaktionsgemisch eingesetzt. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen der FEN-Sonden und Kombinationen mit dem mindestens einen weiteren Primeren (M1 ) gelten für das ModaPlex-System entsprechend. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungstest können bis zu 1000, vorzugsweise kleiner gleich 950, kleiner gleich 900, kleiner gleich 850 und kleiner gleich 800 unterschiedliche FEN-Sonden (FEN _1-n ) eingesetzt werden. Bedingt durch die Trennleistung eines geeigneten Geräts für Sequenzen in einem Bereich von 70 bis 350 Basenpaaren und in Kombination mit mindestens vier Kanälen kann die vorgenannte Anzahl von FEN-Sonden kombiniert werden. Ein geeignetes Gerät ist der Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer.

Die Schutzgruppe hat die Funktion eines Polymeraseblockers, wobei die Schutzgruppe das 3'-Ende eines Oligonukleotids gegen eine Verlängerung durch eine DNA Polymerase schützt. Dabei wird eine Erkennungsreaktion zwischen dem 3 ^' -Ende der 3'-Sequenz der mindestens einen FEN-Sonde und einer Polymerase verhindert, sodass das 3 ^' -Ende nicht als Primer fungiert. Dies kann erfindungsgemäß erreicht werden durch das Fehlen der 3'-OH-Gruppe (3'-Didesoxynukleotid), durch chemische Modifikation der 3'-OH-Gruppe umfassend 3'-Phosphat, 3'-Spacer C3 (3'-Hydroxypropylphosphat), Amino, A-Alkyl, 3'-invertiertes Nukleotid, u. a. m. und/oder durch zusätzliche Nukleotide, welche nicht mit der Zielsequenz paaren.

Flap Endonukleasen (FEN) sind struktur- und strangspezifische Endonukleasen, welche die einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenz von einem gabelförmig ungepaarten 5'-Ende (5'-Flap) einer DNA-Doppelhelix abspalten (Lyamichev et al. 1993). FEN kommen bei allen Lebewesen vor und lösen in Verbindung mit weiteren Enzymen insbesondere während der DNA-Replikation die sogenannten Okazaki-Fragmente (RNA-DNA-Hybride) am zurückbleibenden Strang der Replikationsgabel auf (DNA-Reparaturfunktion). Eubakterielle FEN bilden zusammen mit einer DNA-Polymerase vom Typ Pol 1 (syonym = Pol A) eine Proteineinheit (z. B. Pol 1 von Escherichia coli, Thermus aquaticus, T. thermophilus, Aquifex spp.). Archaebakterielle (z. B. Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus spp., Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermoautotrophicum) und eukaryotische FEN (z. B. Homo sapiens) stellen eigenständige Proteine dar. Die im Reaktionsgemisch enthaltende artifizielle Matrizensequenz (syonym auch Matrizensequenz oder Matrize genannt) ist eine Nukleinsäuresequenz, die bioinformatisch mit der minimalen Vorgabe entworfen wird, dass sie mit allen spezifischen Primer- und Sondenbindungsstellen der Zielsequenzen, welche im Multiplex verwendet werden, keine Übereinstimmung besitzt. Also weist die artifizielle Matrizensequenz keine komplementären Sequenzen zu den spezifischen Primer- und Sondenbindungsstellen der Zielsequenzen auf. Insbesondere darf sie für keinen Zielsequenz-spezifischen Primer des Multiplexes als DNA- Matrize fungieren. Die Enden der artifizielle Matrizensequenz oder ihres Gegenstrangs tragen Bindungsstellen für unterschiedliche 5'-Spaltprodukte mindestens einer FEN-Sonde, vorzugsweise zweier FEN-Sonden, oder für mindestens ein 5'-Spaltprodukt einer FEN-Sonde sowie eines zusätzlichen artifiziellen Primers (M1 ). Das 5'-Spaltprodukt einer FEN-Sonde besitzt ein freies 3'-OH-Ende und hat die Funktion eines Primers, welcher komplementär zur 5'^3'-Sequenz einer artifiziellen Matrizensequenz oder zum Gegenstrang der artifiziellen Matrizensequenz ist und ein wesentlicher Bestandteil des erfindungsgemäßen Bestätigungstest ist. Unter einem weiteren Primer (M1 ) (in den Beispielen als WB127 bezeichnet) wird ein Primer bezeichnet, welcher keine Kreuzhybridisierung mit allen Zielsequenzen des Multiplexes zeigt, komplementär zu einem Sequenzabschnitt eines Gegenstrang der artifiziellen Matrizensequenz ist und mit dem Gegenstrang mindestens einer artifiziellen Matrizensequenz eine durch DNA Polymerase verlängerbare DNA-Doppelhelix ausbildet.

Multiplex beschreibt die Vervielfältigung und die Bestätigung mehrerer Zielsequenzen in einem Reaktionsansatz. Beispiele für Multiplex-Verfahren sind der genetische Fingerabdruck des Menschen durch Genotypisierung von 20 und mehr Short Tandem Repeats, die Differentialdiagnostik von verschiedenen somatischen Mutationen bei Tumoren, die Abklärung organspezifischer Infektionen (z. B. Lunge, Darm, sexuell übertragbare Infektionen) durch Nachweis spezifischer Erregergruppen und/oder die Amplifikation von Nukleinsäurebibliotheken (Panels). Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise ein Multiplex-Verfahren, welches für jede gewünschte Art - gleich oder analog zu den genannten Beispielen - eines Nachweises eingesetzt werden kann.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst die Schutzgruppe am 3 ^' -Ende der 3'-Sequenz der mindestens einen, insbesondere einzelsträngigen, FEN-Sonde anstelle einer 3 ^' -OH-Gruppe eine Nukleinsäuresequenz, insbesondere eine DNA-Sequenz größer gleich 1 Base bis kleiner gleich 5 Basen, welche zur Zielsequenz nicht komplementär ist. Vorzugsweise umfasst die Sequenz 1 , 2, 3, 4 oder 5 Basen. Besonders bevorzugt sind 1 oder 2 Basen.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst das Reaktionsgemisch ferner mindestens ein zur Spaltung der mindestens einen FEN-Sonde geeignetes Enzym, welches ausgewählt wird aus einer FEN als intrinsischer Bestandteil einer DNA Polymerase oder/oder als ein von einer Polymerase getrennt vorliegendes Enzym. Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Reaktionsgemisch mindestens eine Polymerase mit intrinsischer Endonukleaseaktivität, welche ausgewählt wird aus eubakteriellen FEN, die zusammen mit einer DNA Polymerase vom Typ Pol 1 (synonym = Pol A) eine Proteineinheit bilden. Daher hat diese Polymerase eine ihr innewohnenden, also intrinsische, FEN-Aktivität. Solche FEN sind in den Spezies z. B. Escherichia coli, Thermus aquaticus, T. thermophilus und/oder Aquifex spp. zu finden, dessen Polymerasen jeweils erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird im Sinne der Erfindung eine Taq DNA Polymerase mit intrinsischer FEN-Aktivität aus Thermus aquaticus eingesetzt. Alternativ kann das Reaktionsgemisch erfindungsgemäß eine Polymerase und eine getrennt vorliegende FEN umfassen, wobei die FEN vorzugsweise ausgewählt wird aus archaebakteriellen FEN und/oder eukaryotischen FEN. In nachfolgenden Spezies Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus spp., Methanocaldococcus jannaschii, Methano- thermobacter thermoautotrophicum und/oder Homo sapiens ist die FEN ein eigenständiges Protein, welches erfindungsgemäß eingesetzt werden kann. Vorzugsweise in Kombination mit einer Polymerase. Besonders bevorzugt werden thermostabile DNA Polymerasen und thermostabile FEN verwendet.

In einer weiteren Ausführungsform ist es denkbar, dass eine Polymerase mit intrinsischer FEN- Aktivität eingesetzt wird und zusätzlich eine getrennte FEN hinzugefügt wird. Dies ist dann vorteilhaft, wenn die Polymerase eine hervorragende Aktivität aufweist, aber ihre FEN-Aktivität nicht verlässlich ist, zu gering ist und/oder sonstige ungünstige biochemische Merkmale (z. B. Flap-Substratspezifität, pH-, Salzionen- und Temperaturoptimum) besitzt. Dann ist eine Kombination der mindestens einen geeigneten Polymerase, mit oder ohne intrinsische FEN- Aktivität, mit mindestens einer oder mehr FEN vorzuziehen. Die Kombination der vorgenannten Enzyme ist abhängig von der zu untersuchenden Probe und/oder den weiteren Komponenten des erfindungsgemäßen Reaktionsgemisches im Einzelfall anzupassen.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst das vorgenannte Reaktionsgemisch ferner mindestens ein FEN-Verstärker-Oligonukleotid (z. B. Can_ENH1 , Can_ENH2, Can_ENH3 und/oder Can_ENH4), insbesondere zur Steigerung der intrinsischen FEN-Aktivität einer Polymerase, vorzugsweise der Taq DNA Polymerase. Bevorzugt wird durch die Zugabe der FEN-Verstärker-Oligonukleotide (ENH _1-n ) die intrinsische FEN-Aktivität einer Polymerase, vorzugsweise der Taq DNA Polymerase, zumindest quantitativ und optional qualitativ gesteigert. Das mindestens eine FEN-Verstärker-Oligonukleotid (ENH _1-n ) überlappt mit seiner Sequenz am 3 ^" -Ende um mindestens eine Base mit der Zielsequenz- spezifischen 3'-Sequenz an der 5 ^' -Bindungsstelle der mindestens einen FEN-Sonde, wie es auch in Fig. 1 dargestellt ist. In ENH _1-n ist n eine ganze Zahl. Vorzugsweise größer gleich 1 bis kleiner gleich 50. Insbesondere ist n eine ganze Zahl und vorzugsweise gleich 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10. Beispiele für erfindungsgemäße FEN-Verstärker-Oligonukleotide sind Can_ENH1 , Can_ENH2, Can_ENH3 und/oder Can_ENH4.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Reaktionsgemisch mindestens eine FEN-Sonde (FEN1 ) und mindestens ein FEN-Verstärker-Oligonukleotid (z. B. Can_ENH1 , Can_ENH2, Can_ENH3 und/oder Can_ENH4). Ein erfindungsgemäßes Beispiel ist in Tabelle 2 dargestellt. Überraschenderweise wurde bereits durch die Kombination von nur einer FEN-Sonde, z. B. Can_FEN2, und nur einem FEN-Verstärker-Oligonukleotid, z. B. Can_ENH2, im Bestätigungstest mit einem elektrophoretischen Detektionsverfahren ein 5-fach stärkeres Signal (4954 RFU) im Vergleich zu einem Bestätigungstest mit nur einer FEN-Sonde oder zwei FEN-Sonden, z. B. Can_FEN2 und Can_FEN1 (900/931 RFU) erzielt. Entsprechend ist ein Unterschied im Qiagen ModaPlex-System deutlich. Während mit nur einer oder zwei FEN-Sonden kein Signal detektierbar ist, führte die vorgenannte Kombination zu einem deutlichen C _t -Wert von 26,36.

Somit resultiert im erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahren die Zugabe des mindestens einen FEN-Verstärker-Oligonukleotids (z. B. Can_ENH1 , Can_ENH2, Can_ENH3 und/oder, Can_ENH4) überraschend in einer mindestens 5-fachen Verstärkung des Signals des mindestens einen erhaltenen Matrizensequenzamplifikats.

Ein FEN-Verstärker-Oligonukleotid (ENH _1-n ) hybridisiert mit der Zielsequenz unmittelbar stromaufwärts der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz einer FEN-Sonde. Dabei überlappt das 3'-Ende des FEN-Verstärker-Oligonukleotids mit dem Anteil der FEN-Sonde, welcher mit der Zielsequenz exakt zur Doppelhelix gepaart ist, um mindestens ein Nukleotid. Die mit der FEN- Sonde überlappende 3'-Sequenz des FEN-Verstärker-Oligonukleotids muss dabei mit der Zielsequenz nicht zwingend hybridisieren, sondern kann einen ungepaarten 3'-Flap ausbilden (Kaiser et al. 1999). Diese Anordnung führt zu einer deutlichen Erhöhung der Spaltaktivität der intrinsischen FEN einer Polymerase, vorzugsweise der Taq DNA Polymerase. Für andere FEN- Enzyme sind andere strukturelle Eigenschaften der FEN-Verstärker-Oligonukleotide denkbar.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst das erfindungsgemäße und vorbeschriebene Reaktionsgemisch ferner mindestens zwei FEN- Sonden (FEN1 und FEN2), die jeweils eine Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst das 5 ^' -Ende der Zielsequenz-unspezifischen 5'-Sequenz der mindestens einen FEN-Sonde eine Fluoreszenzmarkierung. Vorzugsweise ist das Fluorophor oder der Fluoreszenzfarbstoff kovalent an das 5 ^' -Ende der Zielsequenz-unspezifischen 5'-Sequenz gebunden. Bei Verwendung von mindestens zwei FEN-Sonden kann eine FEN-Sonde oder beide FEN-Sonden eine Fluoreszenzmarkierung aufweisen. Der Vorteil der Fluoreszenzmarkierung der FEN-Sonde ist, dass während der Amplifikation der Matrizensequenz mit den Fluoreszenz-markierten 5 ^' -Spaltprodukten (S1 , S2, Si _-n ) die Fluoreszenzmarkierung auf die Matrizensequenz überführt wird und damit eine Detektion über ein Fluoreszenzsignal, vorzugsweise in einem elektrophoretischen Verfahren, möglich ist. Bei Kombination von markierten und unmarkierten FEN-Sonden kann erfindungsgemäß eine distinkte Detektion der erhaltenen artifiziellen Matrizenamplifikate, insbesondere bei mindestens zwei oder mehr, über die Größe und/oder die Markierung der Matrizenamplifikate erfolgen.

Somit ist erfindungsgemäß ein Reaktionsgemisch bevorzugt, welches umfasst

mindestens eine nachzuweisende Zielsequenz,

mindestens zwei Zielsequenz-spezifische Primer (P1 , P2, P _1-n ), die zur Amplifikation der mindestens einen Zielsequenz geeignet sind,

mindestens zwei erfindungsgemäße FEN-Sonden, die mit ihren jeweiligen sequenzspezifischen 3 ^' -Sequenzen komplementär zu einem unterschiedlichen Sequenzabschnitte der mindestens einen Zielsequenz sind, wie es beispielhaft in Fig. 1 gezeigt ist, und mindestens eine artifizielle Matrizensequenz,

wobei die mindestens zwei FEN-Sonden markiert, beide unmarkiert oder nur eine markiert ist.

Folglich hybridisieren im erfindungsgemäßen Bestätigungstest die mindestens zwei FEN- Sonden an ihre jeweiligen an der Zielsequenz komplementären Sequenzen. Durch Spaltung der FEN-Sonden werden mindestens zwei 5 ^' -Spaltprodukte (S1 , S2, Si _-n ) erhalten, die als Primer zur Amplifikation der mindestens einen artifiziellen Matrizensequenz dienen. Dadurch wird ein verstärkt messbares Signal gemessen, dass den Nachweis der amplifizierte Zielsequenz anzeigt.

Die Detektion des Signals erfolgt durch Messung der erhaltenen Matrizenamplifikate anhand ihrer Größe und/oder anhand eines emittierenden Fluoreszenzsignals. Das Fluoreszenzsignal wird während der Amplifikation durch die 5 ^' -Spaltprodukte (Si _-n ), welche das Fluorophor tragen, auf das mindestens eine Matrizenamplifikat übertragen. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst das Reaktionsgemisch mindestens zwei artifizielle Matrizensequenzen, welche sich in der Sequenz, und/oder Sequenzlänge unterscheiden und welche jeweils komplementäre Sequenzen zu mindestens einem 5 ^' -Spaltprodukt (Si _-n ) der jeweiligen FEN-Sonde oder zu mindestens einem weiteren Primer (M1 ) umfassen. Nach Amplifikation können sich die Matrizenamplifikate in der Sequenz, Sequenzlänge und/oder Konformation sowie optional in der Markierung unterscheiden.

Während des elektrophoretischen Nachweises umfasst die Konformation der amplifizierten artifiziellen Matrizensequenz je nach chemischen Laufbedingungen (nativ oder denaturierend) lineare einzelsträngige, linear doppelsträngige oder dreidimensionale Strukturen der Matrizensequenz. Zum Beispiel kann die direkte Abfolge von mehr als 4 Purin- oder Pyrimidindesoxyribonukleotiden in der artifiziellen Matrizensequenz nach deren Amplifikation unter nativen elektrophoretischen Laufbedingungen zu einer gebogenen Konformation der Doppelhelix und damit zu einem von der Sequenzlänge deutlich abweichenden Laufverhalten führen (Stellwagen 2009). Des Weiteren kann das Laufverhalten von Amplifikaten in der Kapillargelelektrophorese durch Verwendung so genannter Mobilitätswandler (englisch mobility modifier) verändert werden. Hierbei werden bevorzugt während der Synthese der FEN-Sonde und/oder des mindestens einen weiteren Primers (M1 ) zusätzlich Hexaethylenglykolbausteine und/oder andere Nicht-Nukleotidbausteine am 5'-Ende der Nukleotidsequenz eingebracht (Grossmann et at. 1994).

Durch die Variation der Sequenz und/oder Sequenzlänge, insbesondere und/oder Konformation, der eingesetzten artifiziellen Matrizensequenzen sowie der Verwendung von Mobilitätswandlern wird die Trennleistung der elektrophoretischen Verfahren erhöht, da z. B. eine dreidimensionale Konformation ein von einer linearen Struktur abweichendes Laufverhalten in einer Gelelektrophorese aufweist. Die Trennleistung und die Anzahl der Fluoreszenzkanäle definiert die mögliche Anzahl an Molekülen, die gleichzeitig distinkt aufgetrennt und detektiert werden können.

Durch sorgfältigen Entwurf und Validierung lassen sich somit Gruppen von artifiziellen Matrizensequenzen generieren, welche jeweils auf ein spezifisches elektrophoretisches Verfahren abgestimmt sind und anschließend universell für verschiedene Multiplex- Amplifikations- und Bestätigungsverfahren genutzt werden können. So kann z. B. für das Qiagen ModaPlex System je Detektionskanal eine Gruppe von Matrizensequenzen entworfen werden, welche zwischen den internen Standards von 1 10 Basenpaaren (=bp), 249 bp und 306 bp elektrophoretisch mit idealen Abständen von ca. 10 bp zwischen den Signalen wandern.

Somit umfasst das erfindungsgemäße Reaktionsgemisch in einer Ausführungsform

- mindestens eine nachzuweisende Zielsequenz,

mindestens zwei Zielsequenz-spezifische Primer (P1 , P2, P _1-n ), die zur Amplifikation der mindestens einen Zielsequenz geeignet sind,

mindestens zwei erfindungsgemäße FEN-Sonden (FEN1 , FEN2, FEN _1-n ), die mit ihren jeweiligen sequenz-spezifischen 3 ^' -Sequenzen komplementär zu einem unterschiedlichen Sequenzabschnitte der mindestens einen Zielsequenz sind, wie es beispielhaft in Fig. 1 gezeigt ist, und

mindestens zwei artifizielle Matrizensequenzen, welche jeweils komplementäre Sequenzen zu mindestens einem 5 ^' -Spaltprodukt (S1 , S2, Si _-n ) der jeweiligen FEN-Sonde (FEN1 und FEN2) umfassen oder

- mindestens zwei artifizielle Matrizensequenzen, welche jeweils eine komplementäre Sequenzen zu mindestens einem weiteren Primer (M1 ) und zu einer der zwei FEN- Sonden (FEN1 , FEN2, FEN _1-n ) umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst die funktionale Sequenzlänge der mindestens einen markierten FEN-Sonde (FEN _1-n )

nach Alternative a), insbesondere zur Verwendung in Kombination mit einer Kapillargelelektrophorese, vorzugsweise mit dem Sequenzautomat der Firma Applied Biosystems (Applied Biosystem ^® 3500 Genetic Analyzer), größer gleich 20 Basen bis kleiner gleich 60 Basen, größer gleich 25 Basen bis kleiner gleich 57 Basen, größer gleich 25 Basen bis kleiner gleich 55 Basen, größer gleich 25 Basen bis kleiner gleich 53 Basen, größer gleich 30 Basen bis kleiner gleich 50 Basen, größer gleich 35 Basen bis kleiner gleich 50 Basen, oder

nach Alternative b), insbesondere zur Verwendung in Kombination mit einer Kapillargelelektrophorese und einer simultanen quantitativen PCR, vorzugsweise mit dem ModaPlex-System der Firm Qiagen (Qiagen ModaPlex System), größer gleich 20 Basen bis kleiner gleich 100 Basen, größer gleich 25 Basen bis kleiner gleich 57 Basen, größer gleich 25 Basen bis kleiner gleich 55 Basen, größer gleich 25 Basen bis kleiner gleich 53 Basen, größer gleich 30 Basen bis kleiner gleich 50 Basen, größer gleich 35 Basen bis kleiner gleich 50 Basen,

welche jeweils im Bestätigungstest, insbesondere während der Amplifikation der Matrizensequenz, ein fluoreszierendes Signal auf das Matrizenamplifikat übertragen, sodass in den vorgenannten Kapillargelelektrophoresen ein Fluoreszenzsignal der Matrizenamplifikate gemessen wird. Vorzugsweise ist das Fluoreszenzsignal am 5 ^' -Ende der Zielsequenz- unspezifischen 5'-Sequenz der mindestens einen FEN-Sonde lokalisiert. Nach Alternative a) können bis zu 1000, vorzugsweise kleiner gleich 950, kleiner gleich 900, kleiner gleich 850 und kleiner gleich 800 unterschiedliche FEN-Sonden eingesetzt werden. Nach Alternative b) können kleiner gleich 70, vorzugsweise kleiner gleich 60, 55, 50, 45, 40 bis kleiner gleich 30 unterschiedliche FEN-Sonden eingesetzt werden. Das Fluoreszenzsignal ist ein Fluorophor, welches Licht einer bestimmten Wellenlänge von größer gleich 400 nm bis kleiner gleich 800 nm emittiert. Die Fluoresenzfarben bzw. Fluorophore werden bevorzugt ausgewählt aus 6FAM, BTG, BTY, BTO für Blau (440-490 nm) Grün (490-540 nm), Gelb (540-600 nm), Orange (600-630) und Rot (630-800 nm). Weitere Fuoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann bekannt und können in Kombination mit der erfindungsgemäßen FEN-Sonde frei gewählt werden. Unter Berücksichtigung des verwendeten Detektionsverfahrens sind gerätespezifische Beschränkungen beim Design der FEN-Sonden zu berücksichtigen. Fluoreszenzfarbstoffe umfassen Uranin, Rhodamine, Fluorescein, DAPI, Cumarine, Allophycocyanin, 7-Aminoactinomycin, Indocyaningrün / ICG, Calcein, Cumarin, Cyanine, Chinin-Hydrogensulfat, Ethidiumbromid, Fluorescein arsenical helix binder, GFP - Green Fluorescent Protein, Quadraine (Quadratsäurefarbstoffe) auf Basis von N,N-Dialkylanilinen, 1 ,3,2-Dioxaborine (Komplexe von Borsäurederivaten mit 1 ,3-Dicarbonylverbindungen), SYBR Green I, Syto® Green, Syto® Red, Syto® Orange, Safranin, Stilben und Rhodamin. Weitere geeignete Fluoreszenzfarbstoffe bzw. Fluorophore kennt der Fachmann und wählt diese aus den verfügbaren Fluorophoren von aktuellen Anbietern aus, wie biomers.net GmbH, Atto-tec GmbH, Dyomics GmbH und Themo Fischer Scientific - Molecular Probes. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens umfasst das Reaktionsgemisch, insbesondere zur Steigerung der Amplifikation, zumindest quantitativ und optional qualitativ, der mindestens einen artifiziellen Matrizensequenz,

mindestens eine erfindungsgemäße FEN-Sonde, in der vorbeschriebenen Art, und mindestens einen weiteren Primer (M1 ),

- mindestens eine erfindungsgemäße FEN-Sonde (siehe oben), mindestens ein FEN- Verstärker-Oligonukleotid (z. B. Can_ENH1 , Can_ENH2, Can_ENH3 und/oder Can_ENH4), wie oben bereits beschrieben, und mindestens einen weiteren Primer (M1 ), oder

mindestens zwei erfindungsgemäße FEN-Sonden, wie oben beschrieben, mindestens ein FEN-Verstärker-Oligonukleotid (ENH1 -n) und mindestens einen weiteren Primer (M1 ), oder

mindestens zwei erfindungsgemäße FEN-Sonden, mindestens zwei FEN-Verstärker- Oligonukleotide (ENH1 -n) und mindestens einen weiteren Primer (M1 ),

wobei der mindestens weitere Primer (M1 ) komplementär zu einem Sequenzabschnitt des Gegenstrangs der mindestens einen artifizielle Matrizensequenz ist und

die mindestens zweite FEN-Sonde eine von der ersten FEN-Sonde abweichende Zielsequenzspezifische 3'-Sequenz aufweist, welche komplementär zu einer Sequenz innerhalb einer Region der mindestens einen Zielsequenz ist, die von dem mindesten ersten Primer (P1 ) und dem mindestens zweiten Primer (P2) begrenzt wird und dessen Spaltprodukt (S2) sich vom Spaltprodukt (S1 ) der ersten FEN-Sonde unterscheidet und komplementär zu einem Sequenzabschnitt des Gegenstrangs der mindestens einen artifizielle Matrizensequenz ist. Das erste Spaltprodukt (S1 ) ist entsprechend komplementär zur 3 ^' -Sequenz in (3— >5 ^" ) der Matrizensequenz. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist in Fig. 1 gezeigt.

Überraschenderweise wurde in der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass jede der vorgenannten Kombinationen zu einer signifikanten Verstärkung des Signals des mindestens einen erhaltenen Matrizenamplifikats führt, jeweils im Vergleich zum Signal, welches mit einem Reaktionsgemisch mit einer oder zwei FEN-Sonden im erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahren erhalten wird (siehe Tabelle 2 und 3). In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorbeschriebenen Alternative a) führt im Reaktionsgemisch die Kombination des mindestens einen FEN-Verstärker-Oligonukleotids und eines weiteren Primers (M1 ) im erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahren zu einer signifikanten Verstärkung des Detektionssignals, vorzugsweise zu mindestens einem 30-fach verstärkten Signal, des mindestens einen erhaltenen, insbesondere markierten, Matrizensequenzamplifikats im Vergleich zur Verwendung von einer oder zwei FEN-Sonden (Tabelle 2, 900 bzw. 931 RFU).

Die mit den vorgenannten Ausführungsformen erzielten Signale sind in Tabelle 2 und 3 gezeigt. Die Kombination aus einer FEN-Sonde und einem weiterem Primer (M1 ) zeigt mit einem Wert von 5900 RFU (Tabelle 2) im Vergleich zum Bestätigungstest mit nur einer oder zwei FEN- Sonden (900/931 RFU) eine signifikante Verstärkung des Signals, ein mehr als 6-fach stärkeres Signal. Bei Bestimmung der C _t -Werte wird mit dieser Ausführungsform ebenfalls ein deutliches Signal detektiert (Tabelle 3, C _t -Wert: n.b./27,62). Die Kombination aus einer FEN-Sonde, einem FEN-Verstärker-Oligonukleotid (ENH _1-n ) und einem weiterem Primer (M1 ) führt mit einem Wert von 42130 RFU zu einer weiteren Steigerung des Signals des Matrizenamplifikats (Tabelle 2) im Vergleich zum Bestätigungstest mit nur einer oder zwei FEN-Sonden (900/931 RFU) um mehr als das 46-fache. Bei Bestimmung der Ct-Werte wird mit dieser Ausführungsform ebenfalls ein deutliches Signal detektiert (Tabelle 3, C _t -Wert: n. b./24,62), das allerdings keinen wesentlichen Unterscheid zur vorgenannten Kombination (FEN-Sonde+M1 ) zeigt. Ähnliche Werte werden mit der Kombination von zwei FEN-Sonden (FEN1 und FEN2), einem FEN- Verstärker-Oligonukleotid und einem weiteren Primer (M1 ) erzielt (30747 RFU/ C _t -Wert 25,15). Eine Kombination aus zwei FEN-Sonden und zwei FEN-Verstärker-Oligonukleotiden führt mit Werten von 651 1 bzw. 3500 RFU zu einer bis zu 7-fachen Verstärkung des Signals des, vorzugsweise Fluoreszenz-markierten, Matrizenamplifikats, welches in einer Kapillargelelektrophorese detektiert wird.

Alle vorgenannten Ausführungsformen weisen die Ausführbarkeit des Bestätigungstest nach, der in einem kollektiven und kontinuierlichen Reaktionsansatz für die Amplifikation der Zielsequenz und der Amplifikation und optional Markierung der Matrizensequenz (Eintopfverfahren) stattfindet. Abhängig von der Kombination der FEN-Sonde(n) mit einem oder mehr FEN-Verstärker-Oligonukleotiden (ENH _1-n ) und/oder eines weiteren Primers (M1 ) wird eine signifikante Steigerung des Signals erzielt. Diese überraschenden Ergebnisse belegen die erfinderische Lösung zur gestellten Aufgabe. Diese Ausführungsformen, insbesondere die Kombination mit mindestens einem FEN-Verstärker und/oder einem weiteren Primer (M1 ), bieten variable Lösungen für einen kontinuierlichen Reaktionsansatz für die Amplifikation und Bestätigungstest von Zielsequenzen, insbesondere aus humanen Proben wie Blut, Plasma, Serum, Knochen und/oder Gewebe und reduziert das das Risiko der Kontamination mit Fremd- DNA, RNA, Proteine, Peptide und/oder Chemikalien. Dabei hat das Signal eine hervorragende Qualität und Stärke, sodass ein vereinfachtes und verbessertes Eintopf-Diagnostikverfahren einschließlich des Bestätigungstests bereitgestellt wird. Insbesondere ein Diagnostikverfahren, welches die Anforderungen gemäß Richtlinie MIQ-1 201 1 für Nukleinsäure-Amplifikations- Techniken und/oder die Richtlinie der Bundesärztekammer B3 (Rili BÄK-B3) für den direkten Nachweis und Charakterisierung von Infektionserregern erfüllt sowie auch jeweils die Anforderungen der jeweiligen Novellierungen der Richtlinie erfüllt. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens hybridisieren die Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz der mindestens ersten und/oder der mindestens zweiten FEN-Sonde an ihre jeweils komplementäre, insbesondere einzelsträngige, Zielsequenz desselben Moleküls oder an zwei unterschiedlichen Zielsequenzmolekülen, sodass Komplexe gemäß Fig. 1 erhalten werden, worin beide FEN-Sonden am selben Zielsequenzmolekül hybridisieren oder zwei unterschiedliche Anordnungen. In einer ersten Anordnung hybridisiert die erste Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz an ein erstes Zielsequenzmolekül und in der zweiten Anordnung hybridisiert die zweite Zielsequenzspezifische 3'-Sequenz an ein zweites Zielsequenzmolekül. Vorzugsweise sind die zwei Zielsequenzmoleküle unterschiedlich und besonders bevorzugt sind es mindestens zwei unterschiedliche Zielsequenzen in einer Probe, insbesondere in einer humanen Probe gemäß obiger Definition.

Der wesentliche Unterschied des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens ist, dass die Bestätigung der mindestens einen amplifizierten Zielsequenz das mindestens eine optional markierte artifizielle Matrizensequenzamplifikat ist, welches durch das 5 ^' -Spaltprodukt (S1 , Si _-n ) der mindestens einen FEN-Sonde amplifiziert oder amplifiziert und markiert wurde.

Das erhaltene optional markierte (insbesondere mit Fluoreszenz markierte) artifizielle Matrizensequenzamplifikat kann jederzeit und ortsunabhängig detektiert werden, sodass es bis zur Detektion gelagert werden kann. Kann das vorgenannte artifizielle Matrizensequenzamplifikat nachgewiesen werden, war das Bestätigungsverfahren erfolgreich. Somit kann das erfindungsgemäße Bestätigungsverfahren am Point-of-Need durchgeführt und die Detektion an einem Ort mit den entsprechenden Ressourcen (z .B. Verfügbarkeit eines ModaPlex-Systems, Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer oder eines anderen Geräts) erfolgen.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung mindestens ein optional markiertes (insbesondere mit Fluoreszenz markiertes) artifizielles Matrizensequenzamplifikat, insbesondere erhalten oder erhältlich in einem erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahren. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens wird das mindestens eine optional markierte Matrizensequenzamplifikat mittels eines elektrophoretischen Verfahrens detektiert, welches vorzugsweise ausgewählt wird aus Flachgel-Elektrophorese oder Kapillargel-Elektrophorese. Bevorzugt wird für die Flachgel-Elektrophorese ein Agarosegel oder Acrylamidgel verwendet. Als Kapillar-Gelelektrophoresen sind Geräteautomaten mit Glaskapillaren (z. B. Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyzer, Qiagen QIAxcel Advanced Instrument, Advanced Analytical Fragment Analyzer™ Automated CE System) oder mikrofluidischen Chips (z. B: Agilent 2100 Bioanalyzer, Caliper Life Sciences LabChip ^® , Shimatsu MultiNA Microchip Electrophoresis System, Bio-Rad Laboratories Experion™ Automated Electrophoresis Station) zu nennen. In einer besonderen Ausführungsform (Qiagen ModaPlex System) erfolgt während der Detektion des Signals gleichzeitig eine Quantifizierung des Signals, insbesondere der optional markierten Matrizensequenzamplifikate. Bei mindestens zwei optional markierten Matrizensequenzamplifikaten werden alle distinkt mittels des elektrophoretischen Verfahrens detektiert.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahrens, welches vorzugsweise ein Multiplex-Verfahren ist, umfasst das Reaktionsgemisch

• mindestens zwei oder mehr nachzuweisende Zielsequenzen, vorzugsweise unterschiedliche in einer, insbesondere humanen, Probe enthaltende Zielsequenzen,

• eine Kombination aus mindestens zwei oder mehr FEN-Sonden (FEN 1 , FEN2, FEN _1-n ), welche sich in ihrer Sequenz, Sequenzlänge und/oder Markierung untereinander unterscheiden, die jeweils insbesondere komplementär zu den unterschiedlichen Zielsequenzen sind und

• mindestens zwei oder mehr unterschiedliche artifizielle Matrizensequenzen, welche jeweils eine komplementäre Sequenz zu den mindestens zwei 5 ^' -Spaltprodukten (S1 , S2, Si _-n ) der mindestens zwei FEN-Sonden umfasst, insbesondere ist jede ein Nachweis für jeweils eine Zielsequenz und

wobei im Bestätigungsverfahren je Zyklus der Vervielfältigungsreaktion

mindestens zwei oder mehr unterschiedliche optional markierte artifizielle Matrizensequenzamplifikate erhalten werden,

jede amplifizierte Zielsequenz durch jeweils mindestens ein optional markiertes artifizielles Matrizensequenzamplifikat bestätigt wird und

die mindestens zwei oder mehr optional markierten artifiziellen Matrizensequenzamplifikate in einem elektrophoretischen Verfahren distinkt detektiert und quantifiziert werden. Bei zwei oder mehr nachzuweisende Zielsequenzen, werden zwei oder mehr FEN-Sonden (FEN 1 , FEN2, FEN _1-n ) eingesetzt, welche sich zumindest in der 3 ^' -Sequenz zueinander unterscheiden. Ferner unterscheiden sich die 5 ^' -Enden der FEN-Sonden ebenfalls zueinander. Entsprechend unterscheiden sich die zwei oder mehr artifizielle Matrizensequenzen, vorzugsweise unterscheiden sich diese in der Länge bzw. in ihrem elektrophoretischen Laufverhalten um größer gleich 5, größer gleich 6, größer gleich 7, größer gleich 8, größer gleich 9 oder größer gleich 10 Basenpaare. Die Anzahl der unterschiedlichen Zielsequenzen, FEN-Sonden und/oder weiterer Primer sowie der entsprechenden Anzahl der unterschiedlichen artifiziellen Matrizensequenzamplifikate bestimmt den Multiplex-Grad des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorzugsweise werden mindestens 5, besonders bevorzugt größer gleich 10, größer gleich 1 1 , 12, 13, 14, 15, bis kleiner gleich 1000, kleiner gleich 900, 85, 800, 750, 700, 650, 600 und kleiner gleich 500, insbesondere 400, 300, 200, 100, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, unterschiedliche artifizielle Matrizensequenzamplifikate bestätigt und distinkt detektiert. Diese können eine variable Anzahl an Zielsequenzen in einer Probe, insbesondere einer Probe mit unbekannter Anzahl unterschiedlicher Zielsequenzen, nachweisen. Abhängig von der erfindungsgemäßen Kombination unterschiedlicher FEN-Sonden mit unterschiedlichen artifiziellen Matrizenamplifikaten, wird der Multiplex-Grad bestimmt. Nach der vorbeschriebenen Alternative a) können bis zu 1000, vorzugsweise kleiner gleich 950, kleiner gleich 900, kleiner gleich 850 und kleiner gleich 800 unterschiedliche FEN-Sonden mit entsprechend gleich vielen unterschiedlichen artifiziellen Matrizensequenzen eingesetzt werden. Nach Alternative b) können kleiner 70, vorzugsweise kleiner gleich 60, 55, 50, 45, 40 bis kleiner gleich 30 unterschiedliche FEN-Sonden mit entsprechend gleich vielen unterschiedliche artifiziellen Matrizensequenzen eingesetzt werden. Die bevorzugten Ausführungsformen der FEN-Sonden sowie der Kombinationen aus FEN- Sonde(n), FEN-Verstärker-Oligonukleotiden (ENH _1-n ) und/oder weiterer Primer (M1 ) gelten hier entsprechend. Ebenfalls gelten hier die bevorzugten Ausführungen zu den Fluoreszenzfarbstoffen und FEN-Enzymen, Polymerasen mit oder ohne intrinsische FEN- Aktivität entsprechend und können im Multiplex-Verfahren gemäß spezifischer Anforderungen im Einzelfall kombiniert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch, vorzugsweise flüssiges Gemisch in einem geeigneten Puffer, umfassend mindestens zwei oder mehr (FEN1 , FEN2 FEN _1-n ) untereinander unterschiedliche Zielsequenz-spezifischen FLAP-Endonukleasesonde (synonym = FEN-Sonden-Gemisch), wobei jede FEN-Sonde jeweils umfasst

• eine Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz, welche komplementär zu einem Sequenzabschnitt der mindestens einen Zielsequenz innerhalb einer Region ist, die von dem mindesten ersten Primer (P1 ) und dem mindestens zweiten Primer (P2) auf der Zielsequenz begrenzt wird, wobei die mindestens zwei FEN-Sonden sich zumindest in der 3 ^' -Sequenz und/oder 3 ^' -Sequenzlänge zueinander unterscheiden, • am 3 ^' -Ende der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz eine Schutzgruppe insbesondere als Polymeraseblocker, und

• eine Zielsequenz-unspezifischen 5'-Sequenz. Die FEN-Sonden im vorgenannten Gemisch können markiert, unmarkiert oder als Gemisch aus markierten und unmarkierten FEN-Sonden vorliegen. Die Markierung ist vorzugsweise am jeweiligen 5 ^' -Ende der Zielsequenz-unspezifischen 5'-Sequenz angeordnet und umfasst eine Fluoreszenzmarkierung, insbesondere ein Fluorophor. Geeignete Fluorophore und Floreszenzfarbstoffe wurden bereits oben beschrieben und können in dem Gemisch aus zwei oder mehr FEN-Sonden (FEN1 , FEN2, FEN _1-n ) kombiniert werden. Das FEN-Sonden-Gemisch kann eine geeignete Kombination unterschiedlicher erfindungsgemäße Ausführungsformen der FEN-Sonden umfassen. Die Ausführungsformen wurden oben beschrieben. Damit wird die distinkte Bestätigung einer beliebigen Anzahl von Zielsequenzen und distinkte Detektion der entsprechenden Anzahl von Matrizenamplifikaten gewährleistet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch, vorzugsweise flüssiges Gemisch in einem geeigneten Puffer, umfassend mindestens zwei oder mehr unterschiedliche artifizielle Matrizensequenzen (synonym = Matrizengemisch), welche sich zumindest in der Sequenzlänge, vorzugsweise um größer gleich 5, größer gleich 6, größer gleich 7, größer gleich 8, größer gleich 9 oder größer gleich 10 Basenpaare und/oder der Sequenz und optional der Markierung zueinander unterscheiden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Multiplex-Kit, insbesondere zur Verwendung im erfindungsgemäßen Bestätigungsverfahren, umfassend eine Kombination aus - mindestens einer (FEN1 ) oder mehr FEN-Sonden (FEN _1-n ), welche sich in ihrer Sequenz, Sequenzlänge und/oder Markierung untereinander unterscheiden, und jede FEN-Sonde jeweils umfasst

• eine Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz, welche komplementär zu einem Sequenzabschnitt mindestens einer Zielsequenz innerhalb einer Region ist, die von mindestens einem ersten Primer (P1 ) und mindestens einem zweiten Primer (P2) auf der Zielsequenz begrenzt wird,

• am 3'-Ende der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz eine Schutzgruppe, insbesondere als Polymeraseblocker, vorzugsweise fehlt die 3 ^' -OH-Gruppe, und

• eine Zielsequenz-unspezifische 5'-Sequenz, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes FEN-Sonden-Gemisch, und mindestens eine oder mehr unterschiedliche artifizielle Matrizensequenzen, welche sich in ihrer Sequenz und/oder Sequenzlänge, insbesondere und/oder Konformation, unterscheiden und welche jeweils komplementäre Sequenzen zu mindestens einem 5 ^' -Spaltprodukt (S1 , Si _-n ) der mindestens einen FEN-Sonde oder zu mindestens einem weiteren Primer umfassen, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Matrizengemisch.

In einer weiteren Ausführung umfasst das Multiplex-Kit mindestens zwei FEN-Sonden (FEN1 und FEN2, FEN _1-n ), und/oder mindestens einen weiteren Primer (M1 ). In einer weiteren Ausführung des Multiplex-Kits weist die mindestens eine FEN-Sonde eine Fluoreszenzmarkierung der erfindungsgemäß beschriebenen Art auf.

Insbesondere umfasst das erfindungsgemäße Multiplex-Kit, vorzugsweise in räumlich getrennter Anordnung oder als gebrauchsfertiges Gemisch, Puffersystem, Nukleotide, Salze etc. und alle weiteren für eine erfolgreiche PCR erforderlichen Komponenten. Diese sind dem Fachmann bekannt und/oder werden vom Gerätehersteller der zur Amplifikation und/oder Detektion eingesetzten Geräte vorgeben. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Multiplex- Kit gebrauchsfertig für die Diagnostik einer, insbesondere humanen, Probe bereitgestellt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung umfassend eine Kombination aus mindestens zwei unterschiedlichen Zielsequenz-spezifischen Flap- Endonukleasesonde (FEN-Sonde FEN1 , FEN2, FEN _1-n ), wobei jede FEN-Sonde jeweils umfasst

• eine Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz, welche komplementär zu einem Sequenzabschnitt der mindestens einen Zielsequenz innerhalb einer Region ist, die von dem mindesten ersten Primer (P1 ) und dem mindestens zweiten Primer (P2) auf der Zielsequenz begrenzt wird, wobei die mindestens zwei FEN-Sonden sich zumindest in der 3 ^' -Sequenz und/oder 3 ^' -Sequenzlänge zueinander unterscheiden,

• am 3 ^' -Ende der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz eine Schutzgruppe insbesondere als Polymeraseblocker, und

• eine Zielsequenz-unspezifische 5'-Sequenz, und

mindestens zwei artifizielle Matrizensequenzen, welche sich zumindest in der Sequenzlänge um mindestens 10 Basenpaare und/oder der Sequenz und optional der Markierung zueinander unterscheiden, wobei jedes der 5 ^' -Spaltprodukte (Si _-n ) der FEN-Sonden eine komplementäre Sequenz zu jeweils einem Sequenzabschnitt einer artifizielle Matrizensequenz oder ihres Gegenstrangs aufweist. Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein flüssiges Gemisch umfassend

einen PCR-Puffer, insbesondere mit einem geeigneten pH-Wert,

- Nukleotide,

mindestens eine (FEN 1 ) oder mehrere FEN-Sonden (FEN _1-n ), welche sich in ihrer Sequenz, Sequenzlänge und/oder Markierung untereinander unterscheiden, und jede FEN-Sonde umfasst

• eine Zielsequenz-spezifische 3'-Sequenz, welche komplementär zu einem Sequenzabschnitt mindestens einer Zielsequenz innerhalb einer Region ist, die von mindestens einem ersten Primer (P1 ) und mindestens einem zweiten Primer (P2) auf der Zielsequenz begrenzt wird,

• am 3'-Ende der Zielsequenz-spezifischen 3'-Sequenz eine Schutzgruppe, insbesondere als Polymeraseblocker, vorzugsweise fehlt die 3 ^' -OH-Gruppe, und · eine Zielsequenz-unspezifischen 5'-Sequenz, und

mindestens eine oder mehr unterschiedliche artifizielle Matrizensequenzen, welche sich in ihrer Sequenz und/oder Sequenzlänge unterscheiden und welche jeweils komplementäre Sequenzen zu mindestens einem 5 ^' -Spaltprodukt (S1 , Si _-n ) der mindestens einen FEN- Sonde oder zu mindestens einem weiteren Primer umfassen, und

- optional Zusätze und Additive, die dem Fachmann bekannt sind.

Das erfindungsgemäße Bestätigungsverfahren sowie das erfindungsgemäße Multiplex-Kit ist bevorzugt ein Verfahren und/oder Kit zur Diagnose und Bestätigung der Diagnose von Bakterien, Parasiten, Pilzen und/oder Viren. Insbesondere zum Nachweise von Chlamydia, Streptokokkus, Legionella, Listeria, MRSA, Mykobakterium, Salmonella, Toxoplasma, Candida, Hepatitis, HIV, Influenza, Varizella-Zoster, Parvovirus und/oder Enteroviren.

Mit dem Qiagen ModaPlex Systems (Qiagen Mansfield Inc., Mansfield, US-MA) wurde vor kurzem ein DNA-Analyseautomat vorgestellt (US7445893, US7081339, US7674582, US8182995; Hlousek et al. 2012), welcher die Eigenschaften einer quantitativen Echtzeit-PCR und einer Kapillargelelektrophorese in einem Instrument vereint. Die Analyse der PCR- Amplifikate erfolgt jedoch in Echtzeit, indem mehrfach aus dem PCR-Ansatz in Abständen von 2 oder mehr PCR-Zyklen eine elektrokinetische Injektion in die Kapillargelelektrophorese mit anschließender Signalquantifizierung erfolgt. Die Ergebnisse werden in Form von Echtzeit- PCR-Amplifikationskurven dargestellt und Schwellenwertzyklen (C _t ) berechnet (Figur 3). Ein PCR-Bestätigungstest für diesen Analyseautomat muss aufgrund des geschlossenen Analysesystems homogen im PCR-Ansatz erfolgen. Die vorliegende Erfindung bietet erstmalig einen solchen homogen, kontinuierlichen PCR-Ansatz zur Verwendung mit dem Qiagen ModaPlex System an.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Multiplex-Kits in einem Gerät zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR und einer Kapillargelelektrophorese, insbesondere in einem ModaPlex-System.

Beschreibung der Figuren (Fig.):

Fig. 1 : Relative Anordnung der verwendeten PCR-Primer, FEN-Sonden, FEN-Verstärker- Oligonukleotide und zusätzlichen Primer. A) Die relative Bindungsstellen der PCR- Primer (Can_Set003_SP1 1 , Can_Set002_ASP1 ), FEN-Sonden (Can_FEN1 ,

Can_FEN2) und FEN-Verstärker-Oligonukleotide (Can_ENH1 -4) in Bezug auf die 18s rDNA-Region von C. albicans sind dargestellt. Der 5'^3' Strang entspricht der Genbank Zugangsnummer AY497754. X steht für unmarkiert, Y steht für 6-Carboxyfluorescein. B) Die zielsequenzunabhängigen 5'-Sequenzbereiche (gestrichelte Pfeile) der FEN-Sonden Can_FEN1 und Can_FEN2 binden nach ihrer Abspaltung an die artifizielle

Matrizensequenz Alpha 1 . Die DNA-Sequenz des unmarkierten Primers WB127F ist identisch zum abgespalteten 5'-Sequenzbereich der FEN-Sonde Can_FEN1. Die Figuren sind nicht maßstabsgerecht dargestellt. Polymeraseblocker (3'-C3-carbon spacer) sind als vollflächige Karos dargestellt. 3'-Nukleotide der FEN-Verstärker- Oligonukleotide, welche mit den zielsequenz-spezifischen Bereichen der FEN-Sonden überlappen, sind als offene Kreise dargestellt. Pfeile verweisen auf Oligonukleotide, welche als Primer fungieren können.

Fig. 2: Hybridisierung der FEN-Sonden (Can_FEN1 , 2) und FEN-Verstärker- Oligonukleotide (Can_EHN1 - 4) mit ihren Zielsequenzen. A) Die Sequenzen von

Can_FEN1 und den korrespondierenden FEN-Verstärker-Oligonukleotiden Can_ENH1 und Can_ENH3 ist dargestellt. B) Die Sequenzen von Can_FEN2 und den korrespondierenden FEN-Verstärker-Oligonukleotiden Can_ENH2 und Can_ENH4 ist dargestellt. Die Zielsequenz entspricht dem Gegenstrang der 18s rDNA-Region von C. albicans mit der Genbank Zugangsnummer AY497754. 6FAM, 6-Carboxyfluorescein;

Spacer 3, Polymeraseblocker 3'-C3 carbon spacer. Fig. 3: Analyse eines artifiziellen Amplifikats, welches in Abhängigkeit des Spaltprodukts der FEN-Sonde Can_FEN2 gebildet wurde, mittels dem Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer. Die PCR bestand aus 50 pg genomischer DNA von C. albicans, den

PCR-Primern Can_Set003_SP1 1 und Can_Set002_ASP1 , der FEN-Sonde Can_FEN2, dem FEN-Verstärker-Oligonukleotid Can_ENH2, dem zusätzlichen Primer WB127 und der artifiziellen Matrizensequenz Alpha 1. Weitere Details siehe Text. Ein Aliquot von 1 μΙ_ einer 1 :20 Verdünnung des PCR-Amplifikats wurde analysiert. A) 6FAM- Analysekanal mit dem Amplifikationsprodukt von Alpha 1. B) Längenstandard im

Analysekanal BTO. RFU, relative Fluoreszenzeinheiten.

Fig. 4: Analyse eines artifiziellen Amplifikats, welches in Abhängigkeit des Spaltprodukts der FEN-Sonde Can_FEN2 gebildet wurde, mittels des Qiagen ModaPlex Systems. Die PCR bestand aus 50 pg genomischer DNA von C. albicans, den PCR-Primern

Can_Set003_SP1 1 und Can_Set002_ASP1 , der FEN-Sonde Can_FEN2, dem FEN- Verstärker-Oligonukleotid Can_ENH2, dem zusätzlichen Primer WB127 und der artifiziellen Matrizensequenz Alpha 1 . Weitere Details siehe Text. Die große Graphik zeigt das Elektropherogramm für den 35. Zyklus, wobei relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) über den Datenpunkten aufgetragen sind. Mit C1 10, C249 und C306 sind die internen Amplifikationsstandards im 6FAM-Kanal bezeichnet, welche als Referenzen für die Bestimmung der Fragmentlängen und für die Quantifizierung des Alpha 1 -Amplifikats (Beschriftung Alpha) verwendet wurden. Die interne Grafik zeigt die Auswertung der Quantifizierung des Alpha 1 -Amplifikats über 12 Injektionen, wobei der dekadische Logarithmus der Peakfläche in RFU über der Zykluszahl aufgetragen ist. Ein C _t -Wert von

24,36 wurde ermittelt.

Im Folgenden werden ausgewählte Bespiele zur Erzielung der erfindungsgemäßen Lösung erläutert, wobei die hier präsentierten Beispiele nicht beschränkend auszulegen sind. Beispiele

Beispiel 1 : Bestätigung eines PCR-Amplifikats unter Verwendung einer Flap- Endonuklease (FEN)-Sonde und einer artifiziellen Matrizensequenz mit dem Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer

Material und Methoden

DNA-Aufreinigung aus Candida albicans DSM 1386: Der Referenzstamm wurde über die DSMZ - Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, DE) bezogen. Hefezellen wurden bei 25 °C auf Sabouraud-Glucose-Agar mit Chloramphenicol (Bio- Rad Laboratories GmbH, München, DE) kultiviert. Die Zellen wurden mit einem sterilen Spatel geerntet und in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HP0 ₄ , 1 ,8 mM KH ₂ P0 ₄ , pH 7,4) resuspendiert. Die DNA-Aufreinigung erfolgte mit dem QIAamp ^® DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, DE) gemäß Herstellerangaben und folgender Veränderung: Die Proben wurden für den Zellaufschluss mit ATL-Puffer und Proteinase K des Herstellers versetzt und mindestens 12 h bei 50 °C inkubiert. Die aufgereinigte DNA wurde mittels UV-VIS-Spektroskopie unter Verwendung eines Eppendorf ^® BioPhotometer ^® (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) quantifiziert.

Entwurf und Synthese von PCR-Primern, FEN-Sonden, FEN-Verstärker-Oligonukleotiden und der universellen Matrizensequenz: Ein Teil des 18s rDNA-Gens von C. albicans (Genbank Zugangsnummer AY497754) wurde als Zielsequenz ausgewählt. Eine 127 Basen lange artifizielle Matrizensequenz Alpha 1 wurde teilweise von der /acZa-Sequenz des pUC19 Plasmids (Genbank Zugangsnummer L09137) abgeleitet. Die PCR-Primer, FEN-Sonden und FEN-Verstärker-Oligonukleotide wurden mit der Software Vector NTI ^® (Thermo Fisher Scientific Inc. - Life Technologies Div., Darmstadt, DE) and Mfold (Zuker 2003) entworfen. Die Primeranbindungstemperaturen (T _a ) der FEN-Sonden (Can_FEN1 and Can_FEN2) und FEN- Verstärker-Oligonukleotide (Can_ENH1 , Can_ENH2, Can_ENH3, Can_ENH4) wurden ähnlich den Entwurfsregeln für Hydrolysesonden mindestens 5 °C höher gewählt als die T _a der PCR- Primer (Heid et at. 1996).

Als FEN-Verstärker-Oligonukleotide wurden 3'-stromaufwärts der FEN-Sonden Oligonukleotide entworfen, welche am 3'-Ende mit ein (Can_ENH3, Can_ENH4) oder zwei (Can_ENH1 , Can_ENH2) Nukleotiden zur zielsequenzspezifischen 5'-Bindungsstelle der FEN-Sonde überlappten und zusätzlich an ihrem 3'-Ende eine nicht-paarende Base enthielten (3'-Flap) (Lyamichev et al. 1993, Xu et al. 2001 ) (Figur 2).

Die relative Anordnung der PCR-Primer, FEN-Sonden und FEN-Verstärker-Oligonukleotide auf der Zielsequenz ist in Figur 1 dargestellt. Figur 2 zeigt die DNA-Sequenzen der FEN-Sonden und FEN-Verstärker-Oligonukleotide sowie ihre Bindungsstellen auf der Ziel-DNA.

Alle Oligonukleotide wurden in HPLC-gereinigter Qualität bei biomers.net GmbH (Ulm, DE) bezogen.

Table 1 : Primer, FEN-Sonden, FEN-Verstärker-Oligonukleotide und artifizielle Matrizensequenz. Die Primeranbindungstemperatur (T _a ) wurde mit der Software Vector NTI ^{® (} Thermo Fisher Scientific Inc. - Life Technologies, Darmstadt, DE) unter Verwendung der Standardeinstellungen berechnet. Unterstrichende Sequenzen entsprechen den 5'-Enden der Flap-Endonuklease (FEN)-Sonden, welche nach der Abspaltung als PCR-Primer an die artifiziellen Matrizensequenz Alpha 1 oder deren Gegensequenz binden. 6FAM, 6- Carboxyfluorescein; X, unmarkiert, Y, 6FAM, Spacer 3, 3'-C3 carbon spacer.

Name Sequenz (5' -> 3'-Ende) und Modifikation T _a [°C]

Can_Set00

G GTAG G ATAGTG G C CTAC C ATG G 1 1 1 58,7 3_SP1 1

Can_Set00

CCGACCGTCCCTATTAATCATTACGAT 60,4 2_ASP1

X-TTAACTATG CG GCATCAGAG CAG ATTG GAGG G CAAGTCTG G

Can_FEN1 66,9

TGCCAGC-Spacer 3

Y-CAACAGTTGCGCAGCCTGAATGCGTACTGGACCCAGCCGA

Can_FEN2 67,7

GCC-Spacer 3

WB127F TTAACTATG C G G CATC AG AG C AG A 57,8

Can_F1 AACCTTGGGCTTGGCTGGC 58,6

Can_ENH2 CTTGGCTGGCCGGTCCATCTTTTTGAG 68,0

Can_ENH1 TTGGAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAAG 66,0

Can_ENH3 TTG GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAAC GAG GAAC AG 65,4

Can_ENH4 CTTGGCTGGCCGGTCCATCTTTTTGG 66,8

TTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCA nicht

Alphal TATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATA anwend¬

CCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTG bar Polymerasen-Kettenreaktion (PCR): Die PCR wurde in einem Volumen von 25 [iL durchgeführt und enthielt Ifachen REMA Puffer (mit Endkonzentrationen von 0,2 mM dNTPs und 1 ,5 mM MgCI ₂ ; Biotype Diagnostic GmbH, Dresden, DE), 2,5 Units Multi Taq2 DNA Polymerase (mit Hotstart-Funktion; Biotype Diagnostic GmbH, Dresden, DE), 10-50 pg chromosomaler DNA von C. albicans, 4 nM bis 4 μΜ artifizielle Matrizensequenz Alpha 1 , 0,3 μΜ PCR-Primer und 0,3 μΜ FEN-Sonden. FEN-Verstärker-Oligonukleotide (ENH, ENH _1-n ) und/oder Primer WB127 wurden optional ebenfalls in einer Endkonzentration von 0,3 μΜ eingesetzt (DNA-Sequenzen siehe Tabelle 1 und 2). Nullkontrollen wurden ohne chromsomale DNA von C. albicans durchgeführt. Zusätzlich wurden Experimente mit Klentaq ^* ! , einer N-terminalen Deletionsvariante der Taq DNA Polymerase ohne FEN-Aktivität, durchgeführt (US5436149; DNA Polymerase Technology Inc., St. Louis, US-MO). Ein Eppendorf MasterCycler ^® ep Gradient Thermal Cycler (Eppendorf AG, Hamburg, DE) wurde verwendet. Der Temperaturwechsel bestand aus 4 min Hotstart-Aktivierung bei 96 °C und 35 Zyklen mit 30 s bei 96 °C, 60 s bei 60 °C und 60 s bei 72 °C. Zum Schluss wurde ein Verlängerungsschritt für 10 min bei 72 °C durchgeführt, und die Reaktionsansätze wurden anschließend bis zur weiteren Analyse bei 4 °C gelagert.

Kapillargelelektrophorese unter Verwendung des Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific - Applied Biosystems Div., Foster City, US-CA): Der

Analyseautomat wurde mit dem 3500 POP-7™ Polymer (Performance Optimized Polymer) nach Herstellerangaben und mit folgenden Anpassungen verwendet: Die spektrale Kalibrierung des Geräts erfolgte mit dem virtuellen Filterset AnyöDye in Kombination mit dem Matrix- Standard BT5 (Fluoreszenzfarben 6FAM, BTG, BTY, BTR, BTO, für Blau, Grün, Gelb, Rot und Orange) (Biotype Diagnostic GmbH, Dresden, DE). Aliquote von 1 μΙ_ der PCR bzw. Verdünnungen davon wurden mit 12 μΙ_ HiDi Formamid (Thermo Fisher Scientific - Applied Biosystems Div., Foster City, US-CA) und 0,5 μΙ_ Längenstandard SST-BTO (Biotype Diagnostic GmbH, Dresden, DE) gemischt, für 3 min bei 95 °C inkubiert und anschließend bis zur elektrokinetischen Injektion (10.000 V, 5 s) bei Raumtemperatur im automatischen Probengeber des Geräts gelagert. Die Analyseeinheit des Analyseautomaten zeichnet relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) über der Fragmentlänge (Basen, b) auf (siehe Figur 3). Die Gerätekonfiguration erlaubt maximal eine semi-quantitative Auswertung (bis zu 20 % Schwankungen zwischen den Injektionen gleicher Proben). Ergebnisse und Diskussion

Zunächst wurde die optimale Primeranbindungstemperatur T _a von 60 °C für die C. albicans PCR und dem PCR-Primerpaar Can_Set003_SP1 1 and Can_Set002_ASP1 in einem T _a - Gradienten zwischen 55 °C und 65 °C bestimmt. Eine spezifische Bande, die der kalkulierten Länge von 539 bp entsprach, konnte mittels Ethidiumbromidfärbung nach Agarosegelelektrophorese dargestellt werden (nicht gezeigt). Danach wurde die optimale Konzentration für die universelle DNA-Matrize Alpha 1 in PCRs ermittelt, welche zusätzlich zum PCR-Primerpaar 0,3 μΜ der FEN-Sonde Can_FEN2 mit 6FAM-Markierung am 5'-Ende und 4 nM bis 4 μΜ der artifiziellen Matrizensequenz Alphal enthielten. Die Ergebnisse wurden mittels Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer ausgewertet.

Eine Verdünnung zwischen 20 nM bis 160 nM erbrachte gute Ergebnisse.

Tabelle 2: Analyse der PCR-Produkte mit dem Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer. Alle PCR wurden mit 50 pg chromosomaler DNA von C. albicans, 40 nM Alpha 1 , 0,3 μΜ Can_Set003_SP1 1 und 0,3 μΜ Can_Set002_ASP1 . Es wurden jeweils 1 μΙ_ einer 1 :20 Verdünnung der PCR-Amplifikate eingesetzt. RFU, relative Fluoreszenzeinheiten der Signalflächen.

Anschließend wurden PCRs durchgeführt, welche stets 40 nM Alphal und 0,3 μΜ der FEN- Sonde Can_FEN2 mit 5'-6FAM-Markierung enthielten. Zusätzlich wurden in bestimmten PCRs die unmarkierte FEN-Sonde Can_FEN1 , FEN-Verstärker-Oligonukleotide und/oder der Primer WB127F, welcher an das 5'-Ende des Alpha 1 -Gegenstrangs bindet (siehe auch Figur 1 und Tabelle 1 ), getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Das 127 bp Amplifikat, welches mit der artifiziellen Matrizensequenz Alpha 1 erwartet wurde, könnte bestätigt werden (Figur 3). Kontrollansätze ohne genomischer DNA oder mit der KlenTaql DNA Polymerase anstatt der Taq DNA Polymerase zeigten keine Amplifikate (nicht gezeigt). Die Amplifikation der artifiziellen Matrizensequenz Alpha 1 war somit abhängig von der FEN-Aktivität der Taq DNA Polymerase.

Wie in Tabelle 2 gezeigt konnte das Signal durch die Zugabe einer zweiten FEN-Sonde, deren 5'-Spaltprodukt an das 5'-Ende des Alpha 1 -Gegenstrang bindet, nicht wesentlich gesteigert werden. Durch alleinige Zugabe der FEN-Verstärker Can_ENH2 oder Can_ENH4 konnten ca. 5,5-6,5fach höhere Signale erzielt werden. Die Zugabe eines FEN-Verstärkers und des Primers WB127F führte überraschenderweise zu ca. 34-46fach höheren Signalen.

Beispiel 2: Bestätigung eines PCR-Amplifikats unter Verwendung einer FEN-Sonde und einer artifiziellen Matrizensequenz mit dem Qiagen ModaPlex System

Material und Methoden

Chromsomale DNA, Oligonukleotide und PCR: Die DNA-Aufreinigung aus C. albicans DSM 1386, der Entwurf und die Synthese der Oligonukleotide sowie die PCR wurde bereits im Beispiel 1 beschrieben (siehe auch Tabelle 1 ).

ModaPlex System (QIAGEN Mansfield Inc., Mansfield, US-MA): Der Analyseautomat ist ein modulares Gerät, welches aus einem PCR-Thermocycler, einem automatischen Probengeber, einer Kapillargelelektrophorese und einem Fluoreszenzdetektor mit zwei Analysekanälen besteht (US7445893, US7081339, US7674582, US8182995; Hlousek et al. 2012). Der Analyseautomat wurde vollständig mit den Reagenzien des Herstellers und gemäß seiner Angaben betrieben.

Die PCR wurde mit den Chemikalien des Herstellers angesetzt, wobei die Endkonzentrationen der PCR-Primer, FEN-Sonden und FEN-Verstärker-Oligonukleotide dem Beispiel 1 entsprachen. Die artifizielle Matrizensequenz Alpha 1 wurde in einer Endkonzentration von 40 nM eingesetzt. Das PCR-Programm umfasste 15 min Hotstartaktivierung bei 95 °C, gefolgt von 35 Zyklen mit 95 °C für 30 s, 62 °C für 90 s und 72 °C für 60 s. Die Echtzeitanalyse durch Kapillargelelektrophorese erfolgte 12 mal in der Elongationsphase bei 72 °C durch elektrokinetische Injektion (10.000 V, 15 s) ab dem 13. und bis zum 35. Zyklus (jeder zweite Zyklus). Die Detektionseinheit zeichnet relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) über den Datenpunkten in Form eines Elektropherogramms auf (Abbildung 4). Zusätzlich wird eine 2D- Gelansicht der Kapillargelelektrophorese dargestellt (in Abbildung 4 nicht gezeigt) sowie eine Echtzeit-PCR-Amplifikationskurve mit C _t -Werten (Threshold-Cycles) berechnet (graphisches Insert in Abbildung 4). Zur Berechnung von Fragmentlängen und zur Qualifizierung werden in jeder Probe je 3 interne PCR-Kalibratoren pro Analysekanal mit amplifiziert (C1 10, C249 und C306 für den 6FAM-Analysekanal in Figur 4).

Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Es konnten keine C _t -Werte berechnet werden wenn ausschließlich FEN-Sonden eingesetzt wurden. Der Zusatz von FEN-Verstärker- Oligonukleotiden bzw. des Primers WB127F führte zu C _t -Werten, welche zu den relativen Ergebnissen, die mit dem Applied Biosystems ^® 3500 Genetic Analyzer erzielt wurden, vergleichbar waren. Der Zusatz des FEN-Verstärker-Oligonukleotids Can-ENH2 und des Primers WB127F ergab auch hier bei gleicher Ausgangskonzentration an chromosomalen DNA das beste Ergebnis (C _t = 24,36).

Tabelle 3: Analyse der PCR-Produkte mit dem Qiagen ModPlex System. Alle PCR wurden mit 50 pg chromosomaler DNA von C. albicans, 40 nM Alpha 1 , 0,3 μΜ Can_Set003_SP1 1 und 0,3 μΜ Can_Set002_ASP1 durchgeführt, n. b., nicht berechnet.

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Hlousek L, Voronov S, Diankov V, Leblang AB, Wells PJ, Ford DM, Nolling J, Hart KW,

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