Campo de la invención.

La invención consiste una formulación química basada en un biopolímero, un enlazador y un agente fotoactivo, la cual puede ser utilizada para el control biológico de diferentes patógenos de interés agronómicos. El modo de aplicación de esta formulación es a través de un atomizador aerosol y mediante una irradiación con luz visible se activan los efectos fotoactivos, inhibiendo de esta forma el crecimiento de hongos de los géneros Botritys, Penicillium y fíhizopus, mediante la generación de Oxígeno Singlete.

Antecedentes.

La agricultura es la base fundamental para la sostenibilidad de la seguridad alimentaria en el planeta, ya que representa la principal fuente de alimento y hace parte de la economía de los países en desarrollo. En la actualidad la demanda por alimentos se ha incrementado, por lo que existe una necesidad de optimizar la producción agrícola. Para minimizar las pérdidas en la producción agrícola se utilizan diferentes agentes de control biológico con el objetivo de minimizar las pérdidas producidas por diferentes patógenos tanto en pre y post cosecha.

Se han descritos dos aproximaciones para controlar enfermedades de postcosecha: el uso y manejo de microflora benéfica que ya existe en las frutas y superficies vegetales, o la introducción de antagonistas artificiales. El estado del arte enseña que los métodos para manipular poblaciones de microorganismos de manera beneficiosa, no son ampliamente utilizados debido principalmente al escaso conocimiento de como crecen estas poblaciones de microorganismos en las distinas matrices de alimentos. En la actualidad el método de control biológico más utilizado es la utilización de diferentes antagonistas.

Dentro de esta aproximación la eliminación o disminución de microorganismos patógenos se lleva a cabo típicamente por tensioactivos, irradiación, exposición a solventes o exposición a agentes que causan daño oxidativo a las macromoléculas biológicas de los microorganismos. Estos últimos tratamientos incluyen gases, tales como el óxido de etileno y el dióxido de cloro. En los entornos en los que los seres humanos están presentes, el uso de irradiación con rayos gamma o con radiación UV de alta intensidad es indeseable, al igual que la exposición de los seres humanos a disolventes orgánicos y gases nocivos.

Adicionalmente, la utilización de sustancias biodegradables que no dañan el medio ambiente y son inocuas para la salud de las personas es uno de los desafíos tanto de la agricultura como de la industria de la post-recolección de frutas y hortalizas. La Poli- (BGA-AGA), también conocida de manera genérica como quitosano (aunque este nombre abarca una más amplia familia del biopolímero con diferentes proporciones entre los monómeros 2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa y 2-acetamido-2-desoxi-D- glucopiranosa), es un biopolímero biodegradable orgánico procedente de la quitina, formado por la mezcla de unidades poliméricas (o monómeros) de b(1-4)-2-3qbί3GTΐ^o- 2-desoxi-D-glucosa y monómeros de b(1-4)-2-3Ghίho-2^b5qcί-ϋ^Iua)53, donde el primer monómero predomina al segundo en al menos una proporción 2:1 . La interacción selectiva de la Poli-(BGA-AGA) con trazas de metales inhibe la producción de toxinas y el crecimiento microbiano.

La Poli-(BGA-AGA) tiene actividad antifúngica y antibacteriana que puede ser bactericida o bacteriostática, dependiendo de las cepas y de las características específicas del Poli-(BGA-AGA). La actividad antimicrobiana de la Poli-(BGA-AGA), está influenciada por la naturaleza y/o la estructura fisicoquímica de cada polímero. Así, el grado de desacetilación (GD) y la longitud de la molécula están relacionados con la intensidad de la acción antifúngica. En general, a mayor GD, mayor capacidad antimicrobiana. Además, la actividad antimicrobiana de la Poli-(BGA-AGA) depende de algunos factores inherentes al sustrato sobre el que actúa, como son las condiciones ambientales (temperatura y humedad), la composición en nutrientes, el pH y la actividad de agua.

La utilización de Poli-(BGA-AGA) ha alcanzado un progresivo y sostenido interés en los últimos años, puesto que su uso evita la acumulación de residuos de degradación lenta como es el caso de la quitina. Además, puesto que la Poli-(BGA-AGA) posee propiedades antimicrobianas, su aplicación constituye una alternativa a los productos químicos de síntesis para la conservación de frutas y hortalizas comestibles.

Por otra parte el estado de la técnica enseña que ciertos compuestos tales como colorantes, porfirinas, fluorescenos, fenotiazinios y ftalocianinas, generan oxígeno singlete en estado de alta energía, un potente antimicrobiano, cuando se exponen a la luz y al aire. Estos materiales a menudo se denominan "materiales antimicrobianos activados por la luz" (LAAM). Sin embargo, para que estos compuestos LAAM ejerzan su actividad antimicrobiana, estos tienen que ser activados de forma muy cercana a los microorganismos contra los cuales se desea que actúen, siendo estos ineficientes si no existe un adecuado método de direccionamiento de esto agentes a las paredes celulares de los microorganismos patógenos.

Se ha descrito que uno de los principales problemas que sufren los exportadores de frutas son las pérdidas por rechazos al llegar al país de destino, y en el caso de las uvas se ha calculado que el porcentaje de pérdida alcanza el 15%. El principal agente que provoca el rechazo en las uvas exportadas corresponde al desarrollo de pudrición gris, provocada por el hongo Botrytis cinérea. Este hongo no solo provoca problemas en la producción de uvas sino también afecta a una serie de cultivos de importancia económica como lo son los berries, tomates, peras, almendras, paltas, etc. A pesar de que se han evaluado diferentes compuestos en cuanto a su actividad contra este hongo, en la actualidad aún no existen tratamiento eficientes. Adicionalmente los hongos del género Penicillium y Rhizopus son importantes patógenos de diferentes frutas y vegetales de gran importancia económica, tales como los cítricos.

Se mantiene entonces como problema de la técnica el proveer productos eficientes para el control de estos patógenos en etapa de postcosecha, y en particular no existen productos en el mercado que dirijan eficientemente agentes antimicrobianos a las paredes celulares de los microorganismos patógenos blancos.

Para evaluar los méritos de la invención descrita en este documento, se presenta un breve resumen de los documentos más relevantes presentes en la técnica, para la presente invención. La búsqueda se enfocó en documentos relacionados con formulaciones antimicrobianas que inhiban el crecimiento de patógenos de interés agronómico. Más específicamente, la búsqueda se enfocó en formulaciones que comprendan quitosano y un compuesto antimicrobiano fotoactivable, para ser utilizado como agente antimicrobiano de patógenos del género Penicillium, Botrytis y Rhizopus. De manera general, el análisis realizado sugiere que no existe ninguna formulación que pueda ser utilizada como antimicrobiano que posea las mismas características, composición y/o los mismos excipientes, en comparación a la formulación descrita en la presente invención. El documento que se puede considerar como el más cercano para la presente invención es el documento W02010017386A2, el cual enseña una composición que comprende un material antimicrobiano activado por luz que tiene uno o más grupos generadores de oxígeno singlete, y que también comprende un polímero mediador capaz de unir el agente microbiano con una superficie. Sin embargo, no se menciona la utilización de quitosano como polímero ni tampoco se describe el uso de una composición para combatir infecciones fúngicas tales como Botrytis, Penicillium y fíhizopus. Adicionalmente, ninguno de dichos documentos describe que el quitosano puede ser enlazado a un agente antimicrobiano fotoactivable, para inhibir sorprendentemente el crecimiento de cada uno de los microorganismos individualizados anteriormente.

A fin de mejor ilustrar la invención, el presente documento describe a la presente invención considerando algunos casos en los cuales puede aplicarse, sin embargo, estos ejemplos no deben considerarse como limitantes de la invención.

Breve descripción de la invención

La invención describe una formulación química que comprende un biopolímero en tamaño nanométrico, un enlazador y un agente fotoactivo, los cuales están en un porcentaje de un 1% en la formulación. El modo de aplicación de esta formulación es mediante un atomizador aerosol y mediante una irradiación con luz visible se activan los efectos fotoactivos del compuesto, inhibiendo de esta forma el crecimiento de hongos de los géneros Botritys, Penicillium y fíhizopus, mediante la generación de Oxígeno Singlete, especie química conocida por su actividad fungicida.

Descripción detallada del invento

En una realización preferida general la invención es una formulación que comprende un biopolímero seleccionado del grupo formado por quitosano, quitosano modificado o sus derivados, poli-lisina o sus derivados, alginato, alginato modificado o sus derivados, celulosa, celulosa modificada o sus derivados, entre otros, y uno o más agentes antimicrobianos fotoactivos.

En una realización específica el biopolímero es seleccionado de quitosano, quitosano modificado o sus derivados. En una realización más específica los agentes fotoactivos se seleccionan de porfirinas, ftalocianinas, naftalocianinas, clorinas, fenotiazinas, acridinas, bodipys, entre otros.

En otra realización aún más específica los agentes fotoactivos se seleccionan de rivoflavina y protoporfirina.

En una realización preferida la invención describe dos compuestos químicos nuevos llamados CH-RF y CH-PPIX. Ambos corresponden a una formulación química basada en dos componentes: Un agente fotoactivo o fotosensibilizador llamado Riboflavina (RF) o Protoporfirina IX (PPIX) y el Polímero Quitosano (CH), conjugados químicamente a través de un agente acoplante isocianato de 4-maleimidofenilo (PMPI) o 1 -etil-3-(3- dimetilaminopropiljcarbodiimida (EDC), respectivamente.

En una realización preferida específica la formulación de CH-RF se presenta como un sólido amarillo el cual es muy soluble en agua y en soluciones ácidas diluidas.

La formulación de CH-PPIX se presenta como un sólido morado, soluble en soluciones ácidas diluidas con surfactantes.

Ambas formulaciones aprovechan el potencial del efecto fungicida de los 2 componentes: el CH, conocido por su efecto fungicida en agricultura y la RF o PPIX por su acción en terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT).

Para preparar ambos compuestos se utiliza un quitosano de bajo peso molecular hidrolizado por tratamiento con microondas en presencia de sales.

La presente invención consiste adicionalmente, en un método de producción de un compuesto antimicrobiano que comprende quitosano enlazado a rivoflavina o protoporfirina.

El método de producción de los conjugados comprenden los siguientes pasos: compuesto antimicrobiano biopolímero-Agente foto activable (BP-AF) comprende los siguientes 3 pasos: (1) se conjuga el agente fotoactivable (AF) con el agente acoplante PMPI a 45 ^e C en atmosféra de nitrógeno por 24 h, obteniendo el derivado AF-PMPI; (2) el biopolímero (BP) hidrolizado anteriormente es tratado con acido tioglicólico, EDC y N- hidroxisuccinimida para anclar grupos tioles reactivos al biopolímero (BP-SH); (3) Finalmente el derivado AF-PMPI y el BP-SH se hacen reaccionar en solución acuosa a pH 6 durante 24 horas. Luego el producto es dializado y liofilizado para su almacenamiento.

En una realización preferida más específica el método de producción utiliza el biopolímero quitosano y los agentes fotoactivables seleccionados de riboflavina y protoporfirina IX.

La preparación del compuesto CH-PPIX se realiza en un solo paso: Se hacen reaccionar PPIX, EDC y CH en una mezcla de ácido acético 1% acuoso (50%) y metanol (50%) durante 24 h. Luego el producto se precipita con una solución amoniaco:metanol 7:3 y se seca en estufa a 30 ^e C.

En otra realización preferida, la formulación de la presente invención, contiene entre 0,1 y 5% de quitosano.

En una realización más específica la formulación contiene entre 0,1% a 2,5% de quitosano.

En otra realización preferida, la formulación de la presente invención, contiene entre 0,1 y 15% de riboflavina.

En una realización más específica la formulación contiene entre 0,1% a 1% de rivoflavina.

En otra realización preferida, la formulación de la presente invención, contiene entre 0,1 y 5% de protoporfirina.

En una realización más específica la formulación contiene entre 0,1% a 1% de protoporfirina.

En una realización específica, la formulación de la presente invención está formada por entre 0,1 y 5,0 % de quitosano, entre 0,1% y 5,0% de rivoflavina o protoporfirina.

En una realización aún más específica, la formulación de la presente invención está formada por entre 0,1 y 1 ,0 % de quitosano, entre 0,1% y 1 ,0% de rivoflavina o protoporfirina.

En una realización mucho más específica, la formulación de la presente invención está formada por 1 ,0 % de quitosano y 1 ,0% de rivoflavina o protoporfirina. En una modalidad preferida, la formulación de la presente invención es usada como agente antimicrobiano para controlar el crecimiento de patógenos de frutas, vegetales y otros alimentos.

En otra modalidad preferida la formulación de la presente invención es utilizada para combatir infecciones provocadas por patógenos bacterianos y fúngicos de diferentes cultivos de interés agronómico.

En una modalidad preferida más específica las patógenos blancos de la formulación se seleccionan de los géneros Penicillum, Botrytis y Rhizopus.

En una modalidad aún más específica la enfermedad a controlar mediante la formulación corresponde a la enfermedad de pudrición gris ( B.cinerea ), pudrición verde ( P.digitatum ) y pudrición blanda ( Rhizopus stoloniser).

Breve descripción de Figuras

Figura 1. Determinación de grado de desacetilación (GD) de Quitosano Hidrolizado. Análisis realizado por Resonancia Magnética Nuclear. GD determinado por la razón entre la integración de las señales entre 4.5 a 3 ppm y la señal en 2 ppm.

Figura 2. Fórmulas químicas y condiciones de síntesis de los precursores del biofungicida. La primera ecuación muestra a el quitosano a la izquierda, los reactivos y condiciones necesarios para la reacción al medio y el producto quitosano tiolado a la derecha. La segunda ecuación es la derivatizacion de la riboflavina con PMPI. A la izquierda se encuentra el PMPI y la riboflavina respectivamente, al medio el catalizador y las condiciones utilizadas y a la derecha el producto RF-PMPI.

Figura 3. Separación de mezcla de reacción RF-PMPI por cromatografía preparativa en placa (eluyente Acetato: Metanol 9:1). Las fracciones inferiores corresponden a riboflavina sin reaccionar, la fracción central corresponde al producto RF-PMPI y la fracción superior corresponde a PMPI sin reaccionar y al catalizador DBTDL.

Figura 4. Espectros de absorción UV-Visible de los sistemas basados en Riboflavina. RF y RF-PMPI diluidos de solución de DMSO a solución acuosa y CH-RF en solución acuosa. Espectros medidos a temperatura ambiente. Línea solida: RF, Línea discontinua: CH-RF. Línea puntuada: RF-PMPI. A _max de absorción a 450nm en todos los casos.

Figura 5. Espectros de emisión de los sistemas basados en Riboflavina. RF y RF-PMPI diluidos de solución de DMSO a solución acuosa y CFI-RF en solución acuosa. Espectros obtenidos con una l excitación de 450nm. A _max de fluorescencia a 524nm en todos los casos. Espectros medidos a temperatura ambiente. Línea solida: RF, Línea discontinua: CFI-RF. Línea puntuada: RF-PMPI.

Figura 6. Perfiles de generación de oxígeno singlete de la riboflavina y del conjugado con quitosano. Perfiles obtenidos por el seguimiento de la disminución de fluorescencia de una sonda sensible al oxígeno singlete ácido 9,10- antracenodiilbis(metileno)dimalónico (ABMA). Muestras ajustadas a 0,1 u.a de absorción. Longitud de onda de excitación a 450nm y seguimiento de fluorescencia a 412 nm.

Figura 7. Curva de absorción RF-PMPI a 450nm para determinación de contenido de RF en CFI-RF. RF-PMPI diluido desde solución concentrada de DMSO. Conjugado (muestra) medido a 0,1% m/v de concentración.

Figura 8. Curva de emisión de fluorescencia a 524nm RF-PMPI para determinación de contenido de RF en CFI-RF. Longitud de onda de excitación a 450nm. RF-PMPI diluido desde solución concentrada de DMSO. Conjugado (muestra) medido a 0,1% m/v de concentración.

Figura 9. Evaluación de actividad fungicida ante Penicillium digitatum (1x10 ⁴ esporas/mL) de los sistemas de RF, CFI, CFI/RF (mezcla física) y CFI-RF (conjugado químico). Todas las muestras fueron pre-incubadas durante 1 hora. Las muestras aPDT se sometieron a irradiación con luz LED blanca durante 1 hora. El crecimiento del hongo fue llevado a 30°C durante 7 días, al séptimo día se midieron los diámetros de crecimiento y se determinaron los porcentajes de crecimiento.

Figura 10. Fotos de microscopía de fluorescencia de esporas de Penicillium digitatum en presencia de RF o CFI-RF utilizando luz de excitación de 450 nm y un filtro de fluorescencia de 510 nm en 50. Se utilizaron las mismas condiciones de concentración de esporas y de los sistemas. Se realizaron 3 lavados con solución tween 20 0,1% antes de realizar la medición. Figura 11. Porcentajes de crecimiento y fotos representativas de actividad fungicida de CH-RF frente a Botrytis cinérea en nuevas condiciones de crecimiento: 1x10 ⁶ esporas/mL, crecimiento con régimen de luz de 12 horas y a 20°C. (PS es una sigla en ingles de fotosensibilizador, en este caso corresponde a la riboflavina)

Figura 12. Resultados de actividad fungicida de CH-RF frente a Penicillium Digitatum en nuevas condiciones de crecimiento: 1x10 ⁴ esporas/mL, crecimiento con régimen de luz de 12 horas y a 20°C. (PS es una sigla en inglés de fotosensibilizador, en este caso corresponde a la riboflavina)

Ejemplos

A continuación, se incluyen ejemplos de realización para la presente invención tal como fue antes descrita:

Ejemplo 1 : Preparación de Quitosano comercial hidrolizado

Se realizó un proceso de hidrolización del quitosano comercial utilizado para el fungicida, con el fin de mejorar su solubilidad y reactividad ante los procesos posteriores. Se ha observado que el grado de desacetilación de este es importante para sus propiedades biológicas, y por lo tanto este parámetro fue evaluado. Tal como se muestra en la tabla 1 y en la figura 1 , se observa que este polímero posee un peso molecular de 2.4 kDa y un grado de desacetilación de 86%. El quitosano con este grado de desacetilación es el que fue ocupado para producir los compuestos antimicrobianos descritos en los ejemplos posteriores.

Tabla 1. Caracterización del quitosano comercial y del quitosano hidrolizado.

Ejemplo 2: Síntesis y caracterización de compuestos con actividad antimicrobiana.

En la figura 2 se presentan las condiciones de síntesis de los 2 precursores de la molécula biofungicida. Estos corresponden a un derivado de la riboflavina (RF-PMPI), a la cual se le incorpora el agente acoplante PMPI y Quitosano tiolado (CH-SH). Esta preparación previa de los precursores tiene el fin de dar las condiciones de reactividad entre estos 2 (RF-PMPI y CH-SH) para formar el conjugado químico entre el quitosano y la riboflavina (CH-RF).

Para obtener el precursor puro para su caracterización química y luego su unión con el quitosano, se realizó una separación por cromatografía preparativa en placa, la banda en el medio de la placa corresponde al derivado RF-PMPI, obteniéndose una separación exitosa (figura 3).

Adicionalmente, se realizó una caracterización de los espectros de absorción y emisión de la riboflavina, el derivado RF-PMPI y del conjugado químico. Es importante conocer el espectro de absorción debido a que de esta forma se conoce que tipo de luz absorbe la molécula para fotoactivarse. Esta absorbe en la región de la luz azul y el UV (la luz blanca y solar tienen estos componentes de luz presentes). El espectro de fluorescencia sirve para conocer en qué región del espectro de luz esta molécula emite luz, dato útil para experimentos posteriores. Tal como se demuestra en las figuras 4 y 5, el conjugado fluorece menos que la riboflavina, este fenómeno no afecta en su rendimiento como fungicida.

Posteriormente, se realizó una caracterización adicional en la cual se determinó los tiempos de vida y anisotropía de Fluorescencia de la rivoflavina y de los derivados de esta. Los datos obtenidos se muestran en la tabla 2, y estos resultados demuestran que destacar la riboflavina se encuentra unida químicamente a la matriz polimérica de quitosano.

Tabla 2. Tiempos de vida y anisotropía de Fluorescencia de sistemas basados en RF Ejemplo 3: Determinación de la generación de oxígeno singlete por los compuestos

En este ejemplo se evaluó la capacidad de generación de oxígeno singlete mediada por la rivoflavina y por el conjugado de quitosano-rivoflavina. Tal como se demuestra en la figura 6, los resultados obtenidos demuestran que el conjugado CH-RF posee una mayor capacidad de generación de oxígeno singlete que la riboflavina. Este resultado es buen indicador de que el conjugado CH-RF tendrá buen efecto fungicida.

Ejemplo 4: Cuantificación de la rivoflavina en los conjugados

Los resultados de la tabla 3 y las figuras 7 y 8 fueron obtenidos con la finalidad de cuantificar cuanta riboflavina se une al quitosano en el conjugado final. Se realizó una determinación por curva de absorción, por coeficiente de extinción molar utilizando la formula de la Ley de Lambert-Beer y finalmente por curva de fluorescencia.

Las concentraciones calculadas de 3 maneras distintas se encuentran dentro del mismo orden de magnitud, lo que es buen indicativo que la cantidad de riboflavina que se logró conjugar al quitosano se encuentra dentro de la magnitud micromolar. Por tanto, la composición porcentual del conjugado final es:

GlcN: 2,89x10 ⁴ moles, 70%

GIcNAc: 0,58x10 ⁴ moles, 14%

Grupos tioles: 61 ,01x10 ^® moles, 15%

Riboflavina: 4,19x10 ^® moles, 1%

El conjugado posee un 1% de riboflavina como agente fotoactivo.

Ejemplo 5: Actividad fungicida in vitro de las formulaciones quitosano-agente fotoactivo

Se puede ver en la figura 9 que el conjugado es el sistema que posee más actividad antifúngica frente al hongo patógeno de frutas Penicillium Digitatum. La actividad antifúngica del conjugado químico entre riboflavina y quitosano es mayor que la de los componentes por separado, además se observó que efectivamente el efecto se potencia cuando se somete a un régimen de luz. Cabe destacar que esta actividad sinérgica sorpredente no ha sido reportado con anterioridad. La riboflavina posee fluorescencia verde, por tanto en la figura 10 específicamente se puede apreciar que la riboflavina por si sola no tiene interacción con las esporas del hongo, en cambio, el conjugado sí posee interacción con las estructuras superficiales del hongo presentándose la fluorescencia característica de la riboflavina, se puede concluir entonces que la conjugación química de la riboflavina con el quitosano hace que este transporte al agente fotoactivo a las cercanías de la espora, por lo que el efecto fotoactivo se genera “in situ”.

Posteriormente, se realizaron pruebas en Penicillium digitatum y Botrytis cinérea para ver la actividad fotodinámica fungicida del conjugado, en condiciones más cercanas a la industria y óptimas para el crecimiento de ambos patógenos (20°C, régimen de luz 12/12, medio de cultivo Agar de Papa). Los resultados obtenidos para Botrytis cinérea y Penicillium digitatum se pueden observar en las figuras 11 y 12, respectivamente.

Estos nuevos resultados indican que el conjugado posee actividad antifúngica frente a estos 2 patógenos y que en ambos casos este efecto antifúngico se ve potenciado por la luz (irradiación por una hora con luz blanca LED). En el caso específico de Botrytis cinérea, el biofungicida elimina un 100% el crecimiento a una concentración de 1 % (m/v) bajo luz ambiente, mientras que, bajo una irradiación de 1 hora, solo se necesita de un 0,5% en concentración del biofungicida para controlar un 100% del patógeno. En el caso de Penicillium digitatum el control total se obtiene con una concentración de 1% bajo 1 hora de irradiación.

Ejemplo 6: Control de moho gris (Botrytis cinérea) en uva de mesa

Adicionalmente se evaluó la eficacia de la formulación desarrollada en la presente invención, la cual comprende el biopolímero activable por luz, en condiciones más desafiantes. Para demostrar las ventajas técnicas de este polímero se utilizaron tres tratamientos: (1) Testigo con herida e inoculado con agua estéril, (2) Tratamiento estándar con herida e inoculado con el patógeno y (3) tratamiento con la composición que tiene la molécula descrita en esta solicitud al 0,7%, con herida e inoculado con el patógeno.

Las bayas utilizadas se obtuvieron desde un huerto comercial, las cuales tenían una madurez de más de 16% de sólidos solubles, y se recolectaron dichas bayas desde racimos que nunca habían sido tratados con fungicidas. Se tomaron bayas de racimos al azar con pedicelo adherido, y se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 0,5% por 1 min, seguido de etanol 95% por 30 segundos y se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril, asegurando que no quedaran residuos sobre las bayas. Luego se dejaron secar a temperatura ambiente bajo cámara de flujo laminar. Las bayas recolectadas se distribuyeron en un número de 10 bayas con pedicelo sobre rejillas metálicas en cajas de polietileno de tamaño apropiado (Ej: 20 x 15 x 10 cm), colocando toalla de papel absorbente humedecida con 40 mi de agua estéril bajo las rejillas para armar cámaras húmedas. Se ajustó el nivel de agua dependiendo del tamaño del contenedor.

Se punzó un punto fijo en cada baya con una jeringa hipodérmica para luego montar una gota de 10 pL de 10 ⁶ conidias/ml de suspensión de B. cinérea sobre la herida haciendo uso de una micropipeta.

Posteriormente, se cerró y se mantuvo cámaras húmedas a 20°C y humedad relativa (HR) ³ 90% evitando el desplazamiento de la gota sobre la superficie de la baya por 24 horas.

Finalmente, se realizó la aplicación de los tratamientos (exceptuando T1 ), resellando cámaras y disponiendo los contenedores al azar en una cámara de almacenaje a 20°C y humedad relativa (HR) ³ 90% por 7 días. Se evaluará la incidencia de la enfermedad (moho gris) a los 7 días posterior a la aplicación de cada tratamiento.

Resultados:

Eficiencia control enfermedad T3> Eficiencia control enfermedad T2

Ejemplo 7: Control de moho verde ( Penicillium digitatum) en cítricos

Se utilizó una estrategia experimental muy similar al ejemplo anterior. Brevemente, se obtuvieron frutos de un huerto comercial en su punto de cosecha, de calibre y color homogéneo, sin defectos en la cáscara ni deformaciones, y los frutos no fueron tratados con fungicida previo a su recolección. Luego se desinfectaron los frutos con hipoclorito de sodio al 0,5% por 5 minutos, seguido de etanol 95% por 30 segundos y se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril, asegurando que no quedaran residuos sobre los frutos. Se dejaron secar a temperatura ambiente. Enseguida se tomaron 12 frutos y se distribuyeron en cámaras húmedas de polietileno de un tamaño adecuado según el calibre del fruto. Se ajustó el nivel de agua bajo las rejillas de la cámara húmeda según el tamaño del contenedor.

Se realizó una punción con la punta de un bisturí hasta no más de 3 mm de profundidad por 3 mm de ancho en la zona ecuatorial del fruto. Después de la acción anterior se inoculó sobre la herida con una gota de 10 pL de suspensión conidial de P. digitatum de 10 ⁴ conidias/ml haciendo uso de una micropipeta.

Posteriormente, se cerró y se mantuvo cámaras húmedas a 20°C y humedad relativa (HR) ³ 90% evitando el desplazamiento de la gota sobre la superficie de la baya por 24 horas.

Finalmente, se realizó la aplicación de los tratamientos (exceptuando T1 ), resellando cámaras y disponiendo los contenedores al azar en una cámara de almacenaje a 20°C y humedad relativa (HR) ³ 90% por 7 días. Se evaluará la incidencia de la enfermedad (moho verde) a los 7 días posterior a la aplicación de cada tratamiento.

Se espera observar que el desarrollo de las enfermas tras el tratamiento 3 (T3) sea significativamente inferior en comparación a los restantes tratamientos. En particular se espera que el T3 sea más eficiente en cuanto a la inhibición del desarrollo de la enfermedad en relación a T2.

Resultados: Eficiencia control enfermedad T3> Eficiencia control enfermedad T2.