个棉花蛋白激酶及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及蛋白激酶及其编码基因与应用，特 别是涉及一个来源于棉花的棉 花蛋白激酶 CIPK1-1及其编码基因， 以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的 应用。 背景技术 非生物胁迫， 如干旱、 盐渍、 极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的 生长发育造成严重的危害， 对作物产量造成极大损失， 其中干旱对作物产量的影 响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于 其它灾害之和，是许多地区是农业发 展的瓶颈。 据统计，世界干早、 半干早地区占陆地面积的 34%; 我国干早、 半干旱 地区约占国土面积的 52%，年受早面积达 20〜270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米，因缺水而少收粮食 350〜40亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱 频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状， 现有可利用的种质资源匮乏， 采 用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当 大， 培育出真正的耐胁迫品种就 尤为困难。近年来， 随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分 子生物学技术 的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到 分子水平， 促进了植物抗逆基因工 程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的 应答反应， 来降低或消除给植株带 来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多 基因、 多信号途径、 多基因产物的 复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为 3类： （1)参与信号级联放大系统和转 录控制的基因及产物； （2) 直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其 表达产 物； （3 ) 与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。 近年来， 通过转基因技术提 高植物对胁迫耐受能力的研究， 以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物 和 盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫 相关基因和信号转导系统也有了更 进一步的了解 ( Liu Q. 1998. Two transcrip tion facto rs, DREB1 and DREB2, w ith an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cel lular signal transduction pathways in drought—and low temperature-responsive gene exp ression, respectively, in A rabidopsis. Plant Cel l, 10 : 1391-1406； KAN GJY. 2002. A rabid op sis basic leucine zipper p ro teins that mediate stress2responsive abscisic acid signal ing。 Plant Cel l, 14 : 343 - 357； ABE H. 2003. A rabid op sis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcrip tional activato rs in abscisic acid signal ing. Plant Cel l, 15 : 63 - 78. ) 。

但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂， 许多植物对逆境下的生物 化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控 方面的研究占多数，但抗逆相关的信号传递途 径之间的联系以及整个信号传递网 络系统的机理还有待进一步研究。

发明内容 本发明人利用 SSH与 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个蛋白激� � （本 文命名为 CIPK1-1 ) 的编码基因的 DNA序列。 并发现将其导入转基因植株后， 可 明显改善转基因植株的耐旱性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个蛋白激酶 CIPK1-1 的编码基因， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含 有本发明第一方面所述的基因 并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的 表达控制序列可操作地连接；优选 地， 所述载体为附图 2所示的 rd29A-GhCIPKl-l-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本 发明第一方面所述的核苷酸序 列或者本发明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆 菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方 法， 包括： 将本发明第一方面 所述的核苷酸序列或者本发明第二方面所述的 重组表达载体导入植物或植物组 织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法， 包括： 在有效产生植物的 条件下培养含有本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组表达载 体的植物或植物组织； 优选地， 所述植物是烟草。 本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、本发明第二方面所述的重 组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细 胞用于改善植物耐旱性以及用于 植物育种的用途； 优选地， 所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因 编码的氨基酸序列，如 SEQ ID N0: 1所示。 附图说明 图 1是 GhCIPKl-1的植物表达载体（rd29A-GhCIPKl-l-2300)的构 建流程。 图 2是 GhCIPKl-1的植物表达载体（rd29A-GhCIPKl-l-2300)的质 粒图。 图 3是 GhCIPKl-1转基因 1\代烟草植株 （图中， T\S4; 图右， T\S7) 和作为 对照的非转基因烟草植株 （图左） 的耐旱模拟实验结果。

图 4是 GhCIPKl-1转基因 1\代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平� ��的 蛋白表达验证结果。 M为 Marker, 1-8为转基因植株， 9_12为对照植株， 13为 正对照 （GhCIPKl_l )。

具体实施方式

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明。 实施例 1、 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

禾 IJ用 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit 所示的方法通 过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过 程中以干旱处理的棉花幼苗的叶子 的 mRNA 作为样本 （tester ) , 以未处理的棉花幼苗的叶子的 mRNA 作为对照 ( driver )。 具体步骤简述如下：

( 1 ) 供试材料：

非洲棉（国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-06838) 播种到灭过菌的蛭石上， 在 25°C、 光周期 16h/8h (光强 2000— 3000 Lx) 条件 下培养， 每周浇 1/2MS培养基 （9. 39 mM KN0 ₃ ， 0. 625 mM KH ₂ P0 ₄ , 10. 3 mM N N0 ₃ ， 0. 75 mM MgS0 ₄ ， 1. 5 mM CaCl ₂ ， 50 μΜ KI , 100 μΜ H ₃ B0 ₃ ， 100 μΜ MnS0 ₄ ， 30 μΜ ZnS0 ₄ ， 1 μΜ N¾Mo0 ₄ ， 0. 1 μΜ CoCl ₂ ， 100 μΜ N¾EDTA， 100 μΜ FeS0 ₄ ) 一次。 当苗株高达 25— 30cm时用于实验。

( 2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光照培养， 正常浇灌。 第二组为干旱处理组， 25°C、 光照培养， 停止浇灌， 处理 10天， 处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。

( 3) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片 0. 5g， 用植物 RNA 提取试剂盒

( invitrogen) 提取棉花的总 RNA。 用 HITACHI 公司的紫外分光光度计 U-2001 测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 0D260/0D280比值为 1. 8-2. 0， 表 明总 RNA纯度较高， 用 1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的 亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试齐 [J盒（purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

(4) 抑制消减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方 法进行抑制差减杂交。应用 Clontech 的 PCR-Select cDNA Subtraction Kits 差 减杂交试剂盒， 先将 Driver 和 Tester 的 mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再 以 2 μ g Tester 和 2 μ g Driver cDNA 作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水 浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1. 5 h， 然后将酶切后的 Tester cDNA 分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA 不连接头。 两 种连有不同接头的 Tester cDNA 分别与过量的 Driver 混合， 进行第一次差减杂 交。 将两种第一次差减杂交的产物混合， 再与新鲜变性的 Driver cDNA 进行第 二次差减杂交，通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

( 5) cDNA消减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit 纯化，购自 Qiagen)与 pGEM_T Easy (购自 Promega试剂盒）载体连接，依照 pGEM_T Easy试剂盒的程序， 具体步骤如下： 用 200 μ 1 PCR管依次加入下列成分： 纯 化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1， Τ4连接酶缓冲液 5 μ 1， pGEM-T Easy载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ ΐ ， 于 4 °C连接过夜。 取 10 μ L 连接反应产物， 加入到 100 感受态大肠杆菌 JMI09 (购自 TAKARA)中， 冰浴 30 min、 热休克 60 s、 冰浴 2 min,另加 250 μ L LB培养液 （ 1% Tryptone购自 0X0ID , 0· 5% Yeast Extract购自 0X0ID , 1% NaCl购自国药） 置 37 °C水浴中， 以 225 r/min振荡培养 30 min, 取 200 μ L菌液种植于含 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同上) /X-gal/IPTG ( X- gal/IPTG购自 TAKARA ) 培养板上， 37 °C培育 18 h。 计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数， 随机挑取 540个白色菌落 (编号： Gh-D2-001至 Gh-D2-540)。 将所有白色克隆挑于含有 50 μ g/mL氨苄青 霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37 °C培养过夜后加甘油 至终浓度 20%， 于 - 80 °C保存备用。 以巢式 PCR 引物 Primer 1 和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-se l ectTM cDNA Subtract ion Ki t试剂盒自带） 进行菌 液 PCR扩增， 得到 452个阳性克隆， 对所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海） 贸 易有限公司测序

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 405个有 效 EST (uni gene)。 实施例 2 棉花蛋白激酶类编码基因 GhCIPKl-1的克隆

克隆子 Gh-D2-057去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID NO : 3， 序列分析表明 该序列的编码的氨基酸序列属于蛋白激酶，本 文将克隆子 Gh-D2-057编码的全长 基因命名为 GhCIPKl-l， 对应的蛋白命名为 CIPK1-1。

SEQ ID NO: 3

1 ACCTTAGACT CGTTAATTAC CGACGATAGT TCTGGTTCTT GGGAGCCGAG AAGCCCGGTT

61 AGGCCGAGTT ATTTCAATGC TTTCGACATT ATATCTCTTT CACAAGGTTT AAACTTATCA

121 GGTTTGTTTG AGAAAGATTT GAACCAAAGG GATTGCTCAC GGTTCACCAC TAGAAAACCA

181 GCCAGCGATA TCGTTTCAAA ATTTCAACAA ATAGCCCAGA CCGAGAGTTT TAGCATCAAG

241 AACAAGGATG GGAAGGTGAA ATTGCAAGGC AGTAAGGAAG GGAGAAAGGG ACAGCTTGGT

301 ATAGATGCTG AGATCTTTGA AGTTACCGCT TCGTTTTATG TGGTGGAGTT GAAGAAAACT

361 GCTGGGGATA CTTTGGAATA CAAGAATTTC TGTAACAAAG AATTGAAGCC GTCGCTCAAG

421 GATATAGTGT GGGCTTGGCA AGGCAGCAAC AATTATACCC AGAGCCTGGT TTGAGTTTTC

481 GTATTCCAAC CAACAACTAT ACTGTGGTAG CAGCTAATTA GGGAGCTTCT TACCCTCTCC

541 GAATTTCAAT TTCTTTTCTT TTCTCGCCTT TTGTAATTAA GCTCCAAATT TTAGTTTATG

601 AATGTAAGAA GATGTGTAAA TAATTAACAA ATTAACCTTT CTACTAAAAA AAAAAAAAAA

661 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GhCIPKl-1全长基因的克隆

根据已经获得的 Gh-D2-057基因片段， 设计两条特异性引物， 作为 5' RACE 的 3' 端特异性引物。

GhCIPKl- 1 GSP1 : SEQ ID NO: 4：

CTTCAAAGATCTCAGCATCTAT

GhCIPKl— 1 GSP2: SEQ ID NO: 5：

ATTTCACCTTCCCATCCTTGTT

GhCIPKl— 1 GSP3: SEQ ID NO: 6：

AAGCATTGAAATAACTCGGCCT

实验步骤按试剂盒说明书操作 （5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 5与 5' 通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 4)为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP, 2. 0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2. 0 μ 1 , 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 55°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2. 0 μ 1作为模板， 用 SEQ ID NO: 6与 3' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下： 50 μ 1 PCR反应体 系： 5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1稀释的第一轮 PCR 产物， 1. 0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8和 AUAP各 2. 0 μ 1， 以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退 火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR产物 回收片段约为 900bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA)连接于 pGEM_T Easy Vector, 转化到 JM109 (具体方法同上）， 随机挑取 10 个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, -80°C保存备用。 SEQ ID N0: 8与 3' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增 （反 应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限� �司 测序测序，获得该基因的 cDNA的 5' 端。

所得的 5' RACE产物克隆测序后，与 SEQ ID NO: 3结果拼接。获得 GhCIPKl-1 的 cDNA序列 SEQ ID NO: 7。

SEQ ID NO: 7：

1 TGACTGATTT GTGGAAACTC AGGAAAAACA ACAAAAAGAG TGTGTTGGTT GTAGGATCCT

61 CAGCCTAAAA TTTTGGTAGC AGTGAGGAGA TCATCACAAA ATGGAGAAGA AAGGGACAGT

121 ATTGATGCAA AGGTTTGAGG TGGGACGATT ACTGGGTCAA GGGACATTCG CCAAGGTTTA

181 CCAAGCCAGG AATCTAAGAA CCGGCGAAAG CTGCGCCATT AAAACCATCG ATAAAGAGAA

241 GATAATGAAA GGAGGTTTGA TAGATCAAAT CAAGCGTGAA ATCTCAGTTA TGCGCCTCGT

301 TAAACATCCC AATGTTGTTC GACTCTATGA GGTAATGGCT AGCAAATCAA AGATATATTT

361 CGTGATGGAA TATGTTAAAG GCGGTGAGCT TTTCAACAAG ATCGCTAAAG GGAAGCTCAA

421 GGAAGATGAC GCCCGACGCT ATTTCCAGCA ATTGATAGCT GCCGTTGATT ACTGCCATAG

481 CAGAGGTGTT TATCACCGGG ATTTGAAGCC CGAGAATCTC CTCCTCGATG AAAATGGGAA

541 TCTCAAGGTT TCGGATTTTG GGCTGAGTGC GTTTATAGAA TCAAGCAGAC AAGATGGGCT

601 TCTTCACACC ACTTGCGGAA CTCCAGCTTA TGTTGCACCC GAAGTCATTC ACCACAAAGG

661 CTACGACGGA GCCAAGGCTG ATATTTGGTC TTGTGGAGTC ATTCTTTACG CTCTGTTGGC

721 TGGTTTTCTC CCTTTTCAAC ACTCCAATCT CATGGAACTG TATAGAAAGA TAAGTAGAGG

781 AGAATTCAAG TGCCCACAGT GGTTCTCTCC CCAAGTTCGG AAGCTTCTTT CCAGGATTCT

841 TGAACCCAAT CCAATCCAAA GAATCACTGT GGCTAAGCTA ATGGAAAATT GTTGGTTTAG

901 GAAAGGGTAT AAACATATTG ATATCCCACC ACCATCCCCT CAACCCCGTA CCTTAGACTC

961 GTTAATTACC GACGATAGTT CTGGTTCTTG GGAGCCGAGA AGCCCGGTTA GGCCGAGTTA

1021 TTTCAATGCT TTCGACATTA TATCTCTTTC ACAAGGTTTA AACTTATCAG GTTTGTTTGA

1081 GAAAGATTTG AACCAAAGGG ATTGCTCACG GTTCACCACT AGAAAACCAG CCAGCGATAT

1141 CGTTTCAAAA TTTCAACAAA TAGCCCAGAC CGAGAGTTTT AGCATCAAGA ACAAGGATGG

1201 GAAGGTGAAA TTGCAAGGCA GTAAGGAAGG GAGAAAGGGA CAGCTTGGTA TAGATGCTGA

1261 GATCTTTGAA GTTACCGCTT CGTTTTATGT GGTGGAGTTG AAGAAAACTG CTGGGGATAC

1321 TTTGGAATAC AAGAATTTCT GTAACAAAGA ATTGAAGCCG TCGCTCAAGG ATATAGTGTG

1381 GGCTTGGCAA GGCAGCAACA ATTATACCCA GAGCCTGGTT TGAGTTTTCG TATTCCAACC

1441 AACAACTATA CTGTGGTAGC AGCTAATTAG GGAGCTTCTT ACCCTCTCCG AATTTCAATT

1501 TCTTTTCTTT TCTCGCCTTT TGTAATTAAG CTCCAAATTT TAGTTTATGA ATGTAAGAAG

1561 ATGTGTAAAT AATTAACAAA TTAACCTTTC TACTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

1621 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

根据 SEQ ID NO: 7： 序列设计一对引物如下：

GhCIPKF: SEQ ID NO: 8：

ATGGAGAAGAAAGGGACAGTAT

GhCIPKR: SEQ ID NO: 9：

TCAAACCAGGCTCTGGGTATAA

通过 SEQ ID NO: 8和 SEQ ID NO: 9来克隆 GhCIPKl-1全长。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 8和 SEQ ID NO: 9各 2. 0 μ 1 , 以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2. 5倍的无水乙醇， _20°C放置 10分钟， 离心， 去上清， 晾干， 用 21 μ ΐ双蒸水溶解。 加入 2. 5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer, 0. 5 μ 1 5 mM的 dATP ， 2. 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Taq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 1300 bp的 DNA片段回收 （Omega回收试剂盒）， 连接至 pGEM T-easy 载体上 （得到 GhCIPKl-1-pGEM质粒） ，转化 JM109 (方法同上）， 随机挑取 10个 白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜 后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 8与 SEQ ID NO: 9进行菌 液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）， 得到 3个阳性克隆，送至英潍捷基（上 海） 贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID N0: 2， 其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ

ID NO: l o

CIPK1- -1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MEKKGTVLMQ RFEVGRLLGQ

21 GTFAKVYQAR NLRTGESCAI

41 KTIDKEKIMK GGLIDQIKRE

61 ISVMRLVKHP NVVRLYEVMA

81 SKSKIYFVME YVKGGELFNK

101 IAKGKLKEDD ARRYFQQLIA

121 AVDYCHSRGV YHRDLKPENL

141 LLDENGNLKV SDFGLSAFIE

161 SSRQDGLLHT TCGTPAYVAP

181 EVIHHKGYDG AKADIWSCGV

201 ILYALLAGFL PFQHSNLMEL

221 YRKISRGEFK CPQWFSPQVR

241 KLLSRILEPN PIQRITVAKL

261 MENCWFRKGY KHIDIPPPSP

281 QPRTLDSLIT DDSSGSWEPR

301 SPVRPSYFNA FDIISLSQGL

321 NLSGLFEKDL NQRDCSRFTT

341 RKPASDIVSK FQQIAQTESF

361 SIKNKDGKVK LQGSKEGRKG

381 QLGIDAEIFE VTASFYVVEL 401 KKTAGDTLEY KNFCNKELKP

421 SLKDIVWAWQ GSNNYTQSLV

441 *

GhCIPKl-1编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGAGAAGA AAGGGACAGT ATTGATGCAA AGGTTTGAGG TGGGACGATT ACTGGGTCAA

61 GGGACATTCG CCAAGGTTTA CCAAGCCAGG AATCTAAGAA CCGGCGAAAG CTGCGCCATT

121 AAAACCATCG ATAAAGAGAA GATAATGAAA GGAGGTTTGA TAGATCAAAT CAAGCGTGAA

181 ATCTCAGTTA TGCGCCTCGT TAAACATCCC AATGTTGTTC GACTCTATGA GGTAATGGCT

241 AGCAAATCAA AGATATATTT CGTGATGGAA TATGTTAAAG GCGGTGAGCT TTTCAACAAG

301 ATCGCTAAAG GGAAGCTCAA GGAAGATGAC GCCCGACGCT ATTTCCAGCA ATTGATAGCT

361 GCCGTTGATT ACTGCCATAG CAGAGGTGTT TATCACCGGG ATTTGAAGCC CGAGAATCTC

421 CTCCTCGATG AAAATGGGAA TCTCAAGGTT TCGGATTTTG GGCTGAGTGC GTTTATAGAA

481 TCAAGCAGAC AAGATGGGCT TCTTCACACC ACTTGCGGAA CTCCAGCTTA TGTTGCACCC

541 GAAGTCATTC ACCACAAAGG CTACGACGGA GCCAAGGCTG ATATTTGGTC TTGTGGAGTC

601 ATTCTTTACG CTCTGTTGGC TGGTTTTCTC CCTTTTCAAC ACTCCAATCT CATGGAACTG

661 TATAGAAAGA TAAGTAGAGG AGAATTCAAG TGCCCACAGT GGTTCTCTCC CCAAGTTCGG

721 AAGCTTCTTT CCAGGATTCT TGAACCCAAT CCAATCCAAA GAATCACTGT GGCTAAGCTA

781 ATGGAAAATT GTTGGTTTAG GAAAGGGTAT AAACATATTG ATATCCCACC ACCATCCCCT

841 CAACCCCGTA CCTTAGACTC GTTAATTACC GACGATAGTT CTGGTTCTTG GGAGCCGAGA

901 AGCCCGGTTA GGCCGAGTTA TTTCAATGCT TTCGACATTA TATCTCTTTC ACAAGGTTTA

961 AACTTATCAG GTTTGTTTGA GAAAGATTTG AACCAAAGGG ATTGCTCACG GTTCACCACT

1021 AGAAAACCAG CCAGCGATAT CGTTTCAAAA TTTCAACAAA TAGCCCAGAC CGAGAGTTTT

1081 AGCATCAAGA ACAAGGATGG GAAGGTGAAA TTGCAAGGCA GTAAGGAAGG GAGAAAGGGA

1141 CAGCTTGGTA TAGATGCTGA GATCTTTGAA GTTACCGCTT CGTTTTATGT GGTGGAGTTG

1201 AAGAAAACTG CTGGGGATAC TTTGGAATAC AAGAATTTCT GTAACAAAGA ATTGAAGCCG

1261 TCGCTCAAGG ATATAGTGTG GGCTTGGCAA GGCAGCAACA ATTATACCCA GAGCCTGGTT

1321 TGA 实施例 3 GhCIPKl-1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任 公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启 动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择诱导型启动子 rd29A及 Tnos作 为 GhCIPKl-1基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11 以植物表达载体 PBI 121 (购自北 京华夏远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 PBI 121 , 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2. 0 μ 1 , 以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒）获 得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 10 ：

GCACGAATTCGGCGGGAAACGACAATCTGA

SEQ ID NO: 11：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13以 PBI 121为模板扩增 Tnos， 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 PBI 121 , 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2. 0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个 循环后，72°C 延伸 10 min。通过 KpnI、EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300_l (promega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO: 12：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 13：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO: 14 和 SEQ ID NO: 15 以拟南芥 （哥伦比亚型， 购自 TARI , www. arabidopsis. org) DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子 （参考 Zeng J. , et L. 2002, Preparation of total DNA from "recalcit rant plant taxa"， Acta Bot. Sin.， 44 (6) : 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA )。 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 拟南芥 DNA， 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2. 0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个 循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 HindIII、 Sail酶切连接到 （连接方法同上） PCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300_3

SEQ ID NO: 14： ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA

SEQ ID NO : 15：

TGAGTCGACTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO : 16和 SEQ ID NO : 17扩增 GhCIPKl-1 (模板是实施例 2所获得 的 GhCIPKl-1-pGEM质粒）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 GhCIPKl- 1- pGEM 质粒， 1. 0 μ ΐ PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 16禾 P SEQ ID NO : 17各 2. 0 μ 1 , 以及 31 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变 性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 Kpnl、 Sai l酶切连接到 （连接方法同上） pCAMBIA2300_3， 获得植物表达载 体 rd29A- GhCIPKl-l-2300。

SEQ ID NO : 16：

TGAGGTACCATGGAGAAGAAAGGGACAGTAT SEQ ID NO : 17：

AAGGTCGACTCAAACCAGGCTCTGGGTATAA 实施例 4 rd29A- GhCIPKl-1-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc ) 感受态制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养 基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利 福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16 h) 至 0D600值为 0. 4， 形成种子菌液。 取 5 ml活化后的菌液 （1 : 20的比例） 接种 于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2. 5 h至 0D ₆ 。。=0. 8。 冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次， 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液； 加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀； 用 10%甘油重复洗 3_4次； 加入适量冰浴预冷的 10% 甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μ ΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μ 1的感受态细胞中加入 1 μ 1 的质粒， 混匀后冰浴约 10 min。 将感受态和 DNA的混合物用枪转移到预冷的电 击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部， 注意不要有气泡。 将电击杯 （购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使 用 0. lcm的 电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad)的程序设置为 "Agr" ， 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用枪将细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。 取 100〜200 μ 1的 菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 g/ml利福 平、 50 y g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库， 获取单位： 中国农科院烟草所， 库编号 I5A00660) 30 s， 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0.1%升汞浸泡 8 min， 用 灭菌双蒸水洗两次， 完成表面灭菌。 将表面灭菌的烟草种子置于 MS (18.78 mM KN0 ₃ ， 1.25 mM KH ₂ P0 ₄ ， 20.6 mM NH ₄ N0 ₃ ， 1.5 mM MgS0 ₄ ， 3.0 mM CaCl ₂ ， 50 μ M KI， 100 μΜ Η ₃ Β0 ₃ ， 100 μ M MnS0 ₄ , 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ M N¾Mo0 ₄ ， 0.1 μΜ CoCl ₂ , 100 μ M N¾EDTA， 100 μ M FeS0 ₄ ， 7.4 g/L琼脂， 蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件 下发芽， 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5 mmX5 mm大小的叶盘， 用处于对数 生长期的含表达载体 rd29A-GhCIPKl-l-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌 液， 在黑暗条件下共培养 2天（MS培养基）。 将叶片转到分化培养基（MS+l mg/L 细胞分裂素 （BA) +0.1 mg/L萘乙酸 （NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢 霉素）上，光照条件下培养 45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基� ��MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素） 中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗转 入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法）， 用 SEQ IDN0: 9: 禾 P SEQ IDN0: 10 (50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 DNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ 1， 以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预 变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72V 延伸 10 min), PCR鉴定， 保存阳性植株进行编号 T。S1_T。S20。 实施例 6 过表达 GhCIPKl-1转基因烟草 T1的耐旱模拟实验及功能鉴定 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T。S1-T。S20及对照烟草种子分别播种在 蛭石上， 每盆播种 15颗种子， 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环， 每 5 天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后， SEQ ID NO : 8和 SEQ ID NO : 9做 PCR检测， 去除阴性植株。选取大小一致的转基因烟草及 对照烟草做耐旱实验， 每盆保留大 小较一致的 4-5颗苗。 转基因烟草、 对照烟草干旱 14天 (不浇水）， 25°C、 14小 时光培养 /10小时暗培养循环。 T1代转基因植株 （TO代转基因植株的种子长成 的植株） 的抗旱性鉴定表明， 对照植株都萎蔫严重， 而 T\S4、 T\S7、 T\S9、 T\S10、 T\S16五个株系烟草表现出明显的耐旱性 （参见图 2， 以 T\S4、 T\S7为例， T\S9、 T\S10、 T\S16的结果与 T\S4、 T\S7类似， 在此未示出）。 实施例 7 在转录水平上验证 CIPK1-1蛋白表达 实施 6中正常生长转基因植株随机选取 8棵， 实施 6中对照植株随机选取 4 棵，干旱 14天叶片 0. 05g，用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen)提取的总 RNA。 紫外分光光度测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA浓度。 依照 invitrogen反转录试齐 [J盒 Superscript I I I Reverse Transcriptase所不 方法进行反转录（1 μ g总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID N0 : 9)。通过 SEQ ID NO : 18禾 P SEQ ID NO : 19检测 GhCIPKl_l， 检测 CIPKl-1蛋白相对表达情况。 采 用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 18和 SEQ ID NO : 19各 2. 0 μ 1 , 以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72°C延伸 lmin， 28个循环后， 72°C延伸 10 min。 产物电 泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000,购自深圳瑞真生物技术有 限公司）， 1-8为转基因植株， 9-12为对照植株， 13为正对照 （GhCIPKl_l， SEQ ID NO : 2)。 图中所示条带大小与正对照的大小一致。 结果表明正常生长植株植 株对 GhCIPKl-1转录较强， 不能正常生长植株没有转录或转录很弱。

SEQ ID NO : 18： CGCTATTTCCAGCAATTGATAGC

SEQ ID NO : 19： GTATTCCAAAGTATCCCCAGCA