Demande de Brevet Parente

La présente demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français numéro FR 20 11647 déposée le 13 novembre 2020. Le contenu de la demande de brevet français est incorporé par référence dans sa totalité.

Domaine Technique

La présente invention concerne le domaine de la détection des virus respiratoires. Elle fournit en particulier une méthode de collecte d’échantillons biologiques pour le diagnostic d’infections respiratoires virales.

Contexte de l’invention

Les virus respiratoires sont les agents pathogènes les plus fréquents chez l’homme. Les infections virales des voies respiratoires concernent des millions de personnes annuellement et représentent une cause majeure de morbidité et de mortalité, en particulier chez les personnes à risque - les jeunes enfants, les personnes âgées, les patients immunodéprimés et ceux souffrant d’une maladie pulmonaire ou cardiaque sous-jacente. Ainsi par exemple, chaque année, la grippe entraîne des infections des voies respiratoires chez 5 à 15% de la population mondiale avec des maladies graves chez environ 5 millions de personnes et 290000 à 650000 décès (who.int/fr/news- room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)). De même, le virus respiratoire syncytial (VRS), qui est la cause la plus fréquente, dans le monde, d’infections respiratoires des jeunes enfants, cause près de 34 millions d’épisodes par an (Ducharme, BMJ, 2011, 342: dl658). La caractéristique commune des infections respiratoires virales est leur grande contagiosité, ce qui explique le risque de survenue d’épidémies sévères. La lutte contre les virus respiratoires est donc devenue un enjeu majeur en termes de santé publique, et ce d’autant plus que, de manière inquiétante, de nouveaux pathogènes respiratoires font leur apparition. En effet, les épidémies de Syndrome Respiratoire Aigu Sévère en 2002-2003 (due à un coronavirus, le virus SARS-CoV), de grippe aviaire A (H5N1) en 2004, de grippe A (H1N1) en 2009-2010, du Syndrome Respiratoire du Moyen-Orient (dû au coronavirus MERS-CoV) en 2012, et de grippe aviaire A (H7N9) en 2013-2014, ainsi que la pandémie qui a débuté en Chine en 2019 et

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP qui est causée par un nouveau coronavirus, le coronavirus 2 du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère ou SARS-CoV-2, ont rappelé et continuent de rappeler la fréquence et la gravité des infections respiratoires aiguës dans le monde.

Les cliniciens et les virologues sont maintenant convaincus qu’il est important de faire le diagnostic précis des infections respiratoires virales. Or, ces infections sont actuellement mal diagnostiquées car il s’agit d’infections communautaires pour lesquelles l’attentisme est généralement l’attitude diagnostique et thérapeutique la plus répandue. Le problème majeur auquel est confronté le praticien réside dans la multiplicité des pathogènes respiratoires susceptibles d’être responsables d’une même symptomatologie (Brunstein et al., Diagn. Mol. Pathol., 2006, 15: 169-173). La disponibilité d’un test permettant d’identifier très rapidement le virus en cause est essentielle pour plusieurs raisons. Les traitements curatifs, lorsqu’ils sont disponibles, ne sont efficaces qu’à un stade précoce de l’infection respiratoire virale. Bien détecter les infections virales est également primordial dans le cadre de la lutte contre l’ antibiorésistance, car pouvoir confirmer que l’infection n’est pas d’origine bactérienne permet de limiter la prescription inutile d’antibiotiques (Byington et al., Arch. Pcdiatr. Adolesc. Med., 2002, 156: 1230-1234; Henrickson, Pediatr., 2005, 34: 24-31; Gonzales et al., Clin. Infect. Dis., 2001, 33: 757-762; Keske et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2018, 37: 779-783; Mahony et al., J. Clin. Microbiol., 2009, 47: 2812-2817; Rogan et al., I. Mol. Diagn., 2017, 19: 460-467). L’identification précise et opportune des virus respiratoires est également essentielle pour l’adoption de mesures de santé publique et pour le contrôle d’éventuelles flambées.

Le diagnostic de l’infection respiratoire virale repose généralement sur un prélèvement nasopharyngé obtenu par écouvillonnage et transporté dans un milieu de transport viral vers un laboratoire d’analyses biologiques. À réception, le laboratoire peut choisir d’appliquer différentes technologies, telles que la détection sensible d’antigènes viraux (par immunofluorescence ou immunochromatographie) et la détection d’acides nucléiques viraux (basée sur une PCR en temps réel précédée ou non d’une transcription inverse). La qualité du prélèvement est la condition indispensable pour tout diagnostic virologique fiable. Cependant, un écouvillonnage nasopharyngé nécessite l’intervention d’un personnel médical qualifié car l’écouvillon doit être introduit profondément dans les narines jusqu’au nasopharynx. Un écouvillonnage inadéquat peut conduire à des résultats faussement négatifs.

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP Il existe donc un besoin de nouvelles stratégies simplifies mais fiables de collecte d’échantillons biologiques pour le diagnostic d’infections respiratoires virales.

Résumé de l’invention

La présente invention fournit une méthode alternative comprenant T auto-collecte d’un échantillon biologique pour la détection de virus respiratoires. Plus spécifiquement, dans la méthode proposée, l’individu à tester collecte l’échantillon en se mouchant et/ou en crachant dans un mouchoir jetable. Le mouchoir souillé est inséré dans un récipient, qui est ensuite acheminé vers un laboratoire d’analyses, où il est utilisé pour détecter des acides nucléiques viraux à l’aide d’une méthode moléculaire sensible. Les résultats expérimentaux présentés ci-dessous et obtenus, aussi bien dans une crèche au cours d’une année que dans deux classes de petite et grande sections d’une école maternelle, montrent que la méthode décrite ici permet la détection efficace de virus respiratoires saisonniers et de virus à transmission respiratoire. De plus, des résultats expérimentaux obtenus en utilisant des mouchoirs souillés par des adultes se présentant pour un diagnostic de COVID-19 par un prélèvement standard naso- pharyngé ont mis en évidence les performances prometteuses de l’approche de la présente invention dans la détection du SARS-CoV-2. La collecte de l’échantillon biologique proposée ici est un acte simple, rapide, et non-invasif. Elle ne nécessite aucune compétence médicale et rend le patient autonome. Elle diminue les possibilités de contamination externe et élimine tout risque de contamination d’une tierce personne (en supprimant tout déplacement du patient et/ou tout contact avec un professionnel de santé au moment de la collecte de l’échantillon). De plus, comparée à d’autres méthodes de collecte d’échantillons biologiques, la méthode proposée ici est peu onéreuse.

En conséquence, la présente invention concerne une méthode de détection d’acides nucléiques d’un virus respiratoire à partir d’un mouchoir contenant un échantillon biologique d’un individu à tester, la méthode comprenant les étapes suivantes : obtenir un mouchoir contenant un échantillon biologique, où l’échantillon biologique a été collecté par une méthode comprenant les étapes suivantes dans lesquelles : l’individu à tester se mouche dans un mouchoir à usage unique ;

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP l’individu introduit le mouchoir souillé seul dans un récipient et ferme le récipient ; et le récipient contenant le mouchoir souillé est acheminé vers un laboratoire d’analyses biologiques ; récupérer l’échantillon biologique contenu dans le mouchoir souillé à l’aide d’une solution physiologique, notamment un tampon phosphate salin ; détecter la présence d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré ; et si des acides nucléiques viraux ont été détectés, conclure à la présence du virus respiratoire dans l’échantillon biologique et éventuellement diagnostiquer une infection respiratoire virale chez l’individu ayant collecté l’échantillon biologique.

Dans certains modes de réalisation, la méthode de collecte de l’échantillon biologique comprend en outre une étape dans laquelle l’individu à tester crache dans le mouchoir à usage unique.

Dans certains modes de réalisation, le récipient a un volume de 50 ml.

Dans certains modes de réalisation, le récipient est un tube à centrifuger en plastique ou une seringue sans aiguille en plastique.

Dans certains modes de réalisation, le mouchoir souillé est acheminé vers un laboratoire d’analyses biologiques à température ambiante.

Dans certains modes de réalisation, le récipient contenant le mouchoir souillé est inséré dans une enveloppe et acheminé vers un laboratoire d’analyses biologiques par courrier ou par transport médical spécialisé.

Dans certains modes de réalisation, le virus respiratoire est choisi parmi le groupe constitué des virus grippaux, des virus parainfluenza, du virus respiratoire syncytial (hRSV), des métapneumo virus (hPMV), des adénovirus, des rhinovirus, et des coronavirus.

Dans certains modes de réalisation, le virus respiratoire est choisi dans le groupe constitué des virus de la grippe A, notamment les sous-types HINT, H3N2, A(H5N1), A(H7N7), A(H9N2), et A(H7N9), les virus de la grippe B, les virus parainfluenza de type 1, de type 2, de type 3 et de type 4, le virus respiratoire syncytial (hRSV) du sous- groupe A, le virus respiratoire syncytial (hRSV) de sous-groupe B, les métapneumo virus de sous-type A, les métapneumo virus de sous-type B, les adénovirus

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP responsables d’infections respiratoires, et les coronavirus 229E, NL63, OC43, HKU1, B814, SARS-CoV, MERS-CoV, et SARS-CoV-2.

Dans certains modes de réalisation, l’individu à tester est suspecté d’être infecté par un virus respiratoire ou est à risque d’être infecté par un virus respiratoire.

Dans certains modes de réalisation, l’individu à tester n’est pas un patient pédiatrique.

Dans certains modes de réalisation, détecter la présence d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré est réalisée par une technique d’amplification d’acides nucléiques, notamment une technique choisie parmi les techniques de PCR, RT-PCR, NASBA, TMA, LAMP, SDA, LCR et MLPA.

Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de collecte d’un échantillon biologique pour la détection d’un virus respiratoire humain chez un individu à tester, la méthode comprenant les étapes suivantes dans lesquelles : l’individu à tester se mouche et/ou crache dans un mouchoir à usage unique ; l’individu introduit le mouchoir souillé dans un récipient et ferme le récipient ; et le récipient contenant le mouchoir souillé est acheminé vers un laboratoire d’analyses biologiques.

Dans les modes de réalisation où l’échantillon biologique est recueilli en crachant, l’individu a préférablement une toux productive.

Dans certains modes de réalisation, le virus respiratoire destiné à être détecté est un virus respiratoire choisi parmi le groupe constitué des virus grippaux, des virus parainfluenza, du virus respiratoire syncytial (hRSV), des métapneumo virus (hMPV), des adénovirus, des rhinovirus, et des coronavirus. Par exemple, le virus respiratoire peut être choisi parmi le groupe constitué des virus de la grippe A, notamment les sous- types H1N1, H3N2, A(H5N1), A(H7N7), A(H9N2), et A(H7N9), les viras de la grippe B, les virus parainfluenza de type 1, de type 2, de type 3 et de type 4, le viras respiratoire syncytial (hRSV) du sous-groupe A, le viras respiratoire syncytial (hRSV) de sous-groupe B, les métapneumoviras de sous-type A, les métapneumo viras de sous- type B, les adénovirus responsables d’infections respiratoires, et les coronavirus 229E, NL63, OC43, HKU1, B814, SARS-CoV, MERS-CoV, et SARS-CoV-2.

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP Dans certains modes de réalisation, l’individu à tester est suspecté d’être infecté par un virus respiratoire ou est à risque d’être infecté par un virus respiratoire.

Dans certains modes de réalisation, l’individu à tester n’est pas un patient pédiatrique.

Dans certains modes de réalisation, le mouchoir souillé est introduit seul dans le récipient.

Dans certains modes de réalisation, le récipient a un volume de 50 mL.

Dans certains modes de réalisation, le récipient est un tube à centrifuger en plastique ou une seringue sans aiguille en plastique.

Dans certains modes de réalisation, le récipient contenant le mouchoir souillé est acheminé vers un laboratoire d’analyses biologiques à température ambiante.

Dans certains modes de réalisation, le récipient contenant le mouchoir souillé est inséré dans une enveloppe et acheminé vers un laboratoire d’analyses biologiques par courrier ou par transport médical spécialisé.

La présente invention concerne également l’utilisation d’un échantillon biologique obtenu par une méthode de collecte décrite plus haut, pour la détection d’acides nucléiques d’un virus respiratoire et/ou pour le diagnostic d’une infection respiratoire virale chez l’individu ayant fourni l’échantillon biologique.

La présente invention concerne aussi une méthode de détection d’acides nucléiques d’un virus respiratoire à partir d’un mouchoir souillé, la méthode comprenant les étapes suivantes : récupérer l’échantillon biologique contenu dans un mouchoir souillé, le mouchoir souillé ayant été obtenu par une méthode de collecte d’un échantillon biologique telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 10 ; détecter la présence d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré ; et si des acides nucléiques viraux ont été détectés, conclure à la présence du virus respiratoire dans l’échantillon biologique et éventuellement diagnostiquer une infection respiratoire virale chez l’individu ayant collecté l’échantillon biologique.

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP Les termes “virus respiratoire” et “virus respiratoire humain” sont donc utilisés ici de manière interchangeable. Chez l’homme, la transmission de ces virus se fait par des aérosols ou des gouttelettes émises soit directement par la toux ou l’éternuement soit indirectement par contact via les mains contaminées au contact de sécrétions.

Les virus respiratoires auxquels la présente invention peut s’appliquer incluent, sans limitation, les virus grippaux, les virus parainfluenza, le virus respiratoire syncytial, les métapneumovirus, les adénovirus, les rhinovirus, et les coronavirus.

Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un virus grippal. Les virus grippaux (influenza) sont des virus enveloppés à ARN appartenant à la famille des Orthomyxoviridæ. Il existe trois types de virus influenza qui infectent l’homme: les virus de la grippe A, les virus de la grippe B, et le virus de la grippe C. Les virus de type A infectent l’homme et de nombreuses espèces animales : les espèces aviaires qui constituent le réservoir ainsi que différentes espèces de mammifères, notamment le porc. Les virus de type A (les plus fréquents et les plus virulents) sont encore plus finement caractérisés et différenciés en sous-types sur la base de leurs antigènes de surface: l’hémagglutinine (H1 à H18) et la neuraminidase (NI à Ni l). Chez l’homme, il existe des virus à Hl, H2, H3 et NI ou N2 responsables de la grippe annuelle. Les sous-types H1N1 et H3N2 sont ceux qui circulent le plus fréquemment ces dernières années. La pathogénicité de ces virus est variable d’une année à l’autre et dépend de nombreux facteurs dont l’âge de la personne infectée, de son statut vaccinal et de la capacité de son système immunitaire. Ces dernières décennies, des cas d’infection par des virus de la grippe aviaire ou porcine, dont les sous-types A(H5N1), A(H7N7), A(H9N2), et A(H7N9), ont été signalés chez l’homme. Les cas humains d’infection avec ces sous-types sont majoritairement associés à des contacts directs avec des animaux ou des environnements contaminés, mais ils n’entraînent pas de transmission interhumaine efficace. Les virus de la grippe B infectent quasi-exclusivement l’homme. On distingue deux lignages de virus de type B : la lignée B/Yamagata et la lignée B/Victoria. Les cas d’infection au virus de grippe B sont généralement moins fréquents que ceux liés au virus de la grippe A. Les virus de types A et B sont responsables des épidémies saisonnières, mais seuls les viras grippaux de type A ont été à l’origine de pandémies. Le virus de la grippe C semble lié à des cas sporadiques et donne le plus souvent une grippe d’expression modérée.

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Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un virus parainfluenza. Les virus parainfluenza sont des virus enveloppés à ARN, qui appartiennent à la famille des Paramyxoviridœ . Chez l’homme, on retrouve quatre représentants de ces virus dans le cadre des infections virales communautaires : les virus parainfluenza de type 1 et de type 3 (qui se classent dans le genre Respirovirus) et de type 2 et de type 4 (qui se classent dans le genre Rubulavirus). Les virus parainfluenza sont transmis par voie aérienne et entraînent une réaction fébrile après 3 à 5 jours d’incubation. Les virus parainfluenza de type 1 et 2 se limitent à une atteinte laryngée et l’infection survient chez les enfants de moins de 6 ans. Le virus parainfluenza de type 3 diffuse dans les bronches et bronchioles. L’infection est précoce et apparaît avant l’âge de deux ans. Le parainfluenza de type 4 est peu virulent. L’infection par les virus parainfluenza n’étant pas immunisante, les réinfections sont fréquentes tout au long de la vie. Elles peuvent provoquer des pneumopathies chez les adultes, notamment chez les sujets immunodéprimés.

Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un virus respiratoire syncytial (VRS ou hRSV pour human Respiratory Syncytial Virus). Le hRSV est un virus à ARN classé parmi les pneumovirus. Deux sous-groupes A et B ont été identifiés. Le hRSV est la cause la plus fréquente, dans le monde, d’infections respiratoires des jeunes enfants. Très contagieux, ce virus infecte principalement les nourrissons âgés de moins de deux ans. Une infection par le hRSV chez le jeune enfant peut se compliquer et devenir une bronchiolite, qui peut entraîner l’hospitalisation dans des cas exceptionnels. Les réinfections sont fréquentes. Chez l’adulte, l’infection à hRSV est rare, bénigne (sauf chez le sujet âgé), et est responsable d’une rhinite ou d’un syndrome pseudogrippal.

Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un métapneumo virus human (hMPV). Ce virus est un Pneumovirinœ identifié en 2001, et dont le génome est proche de celui du virus respiratoire syncytial human. L’analyse phylogénétique de hMPV a démontré l’existence de deux grandes lignées génétiques appelées sous-type A et B, qui contiennent respectivement les sous- groupes Al, A2 et B l, B2. Le métapneumovirus humain est responsable d’infections respiratoires hautes et basses chez les jeunes enfants, mais également chez les adultes sains et les sujets immunodéprimés. Ce virus provoque principalement des bronchiolites infantiles, des pneumonies et des otites et serait responsable de 5% à 10%

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 11 - des hospitalisations pédiatriques pour infection respiratoire. La primo-infection par le hMPV a lieu dans la petite enfance et est suivie de réinfections multiples à l’âge adulte.

Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un adénovirus, en particulier un adénovirus humain causant une infection respiratoire. Les adénovirus sont des virus à ADN. Il existe 7 espèces d’ adénovirus humains (A à G) et 57 sérotypes. Différents sérotypes sont associés à différentes pathologies. Les maladies respiratoires sont principalement associées aux espèces B et C, et en particulier aux sérotypes Cl, C2, B3, C5, B7, B 14, et B55 (pneumonie et autres maladies respiratoires aiguës), aux sérotypes Cl, B3, C5 et B7 (infections des voies respiratoires supérieures), et aux sérotypes B3, E4, B7, et B21 (infection des voies respiratoires inférieures). Les infections à adénovirus symptomatiques surviennent majoritairement chez l’enfant. Chez les patients immunocompétents, la plupart des infections sont asymptomatiques. Cependant, les infections adénovirales sont de plus en plus reconnues comme des causes de maladies respiratoires graves chez les adultes immunodéprimés .

Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un rhinovirus. Les rhinovirus sont une espèce de virus appartenant à la famille des Picomavirus. Ils sont l’agent causal principal du rhume et de la rhinite chez l’humain.

Dans certains modes de réalisation, la présente invention est appliquée à la détection d’un coronavirus. Les coronavirus (CoV) sont des virus enveloppés à ARN qui constituent la sous-famille Orthocoronavirinæ de la famille des Coronaviridœ. Les chauve-souris et les oiseaux, en tant que vertébrés volants à sang chaud, sont les hôtes idéaux pour les coronavirus assurant l’évolution et la dissémination du coronavirus. Les coronavirus sont normalement spécifiques à un taxon animal comme hôte, mais ces virus peuvent parfois changer d’hôte à la suite d’une mutation. Leur transmission interhumaine se produit principalement par contacts étroits via des gouttelettes respiratoires générées par les éternuements et la toux ou plus rarement par contact indirect (manuportage). Sept principaux coronavirus sont généralement cités comme pouvant contaminer l’humain (CDC, “Coronavirus - Human Coronavirus Types”, 27 février 2020). Un huitième a été identifié : le B814 (Kapikian, Developments in Biological Standardization, 1975, 28: 42-64) - le premier coronavirus humain identifié - mais cette souche semble ne plus circuler. Quatre coronavirus en circulation sont

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 12 - considérés sans gravité : 229E, NL63, OC43 et HKU1, qui seraient la cause de 15 à 30 des rhumes courants. Plus récemment ont été identifiés trois types de coronavirus responsables de graves pneumopathies : le SARS-CoV, agent pathogène du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) qui est apparu en 2002, le MERS-CoV, agent pathogène du syndrome respiratoire du Moyen-Orient à partir de 2012, et le SARS- CoV-2, l’agent pathogène de la maladie à coronavirus 2019 (Covid-19) apparue en Chine en 2019 et responsable d’une sévère pandémie en 2020.

Comme le reconnaîtra l’homme du métier, la présente invention peut s’appliquer à tout autre virus respiratoire humain qui n’est pas spécifiquement listé ici, en particulier les virus transmissibles par voie respiratoire tels que le cytomegalovirus (CMV), le virus varicelle -zona (VZV), l’Epstein-BaiT virus (EBV), le parvovirus B 19, le virus de la rougeole, des oreillons ou de la rubéole.

B. Les Patients Concernés

Dans une méthode selon l’invention, le patient collecte l’échantillon biologique. Les termes “personne” , “individu”, et “patient” sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent un être humain qui peut être infecté par un virus respiratoire, mais qui n’est pas nécessairement infecté par ce virus. Ces termes ne désignent pas un âge particulier et englobent donc les nourrissons, les enfants, les adolescents, et les adultes, y compris les personnes âgées. Dans certains modes de réalisation, la présente invention s’applique à un individu qui n’est pas un patient pédiatrique (c’est-à-dire qui n’est pas un enfant, l’enfant étant défini en droit comme tout sujet âgé de moins de 18 ans selon l’article 1 ^er de la Convention Relative aux Droits de T Enfant).

Dans certains modes de réalisation, l’individu est suspecté d’être infecté par un virus respiratoire ou est à risque d’être infecté par un virus respiratoire. Une personne peut être “suspectée d’être infectée par un virus respiratoire” si la personne présente des symptômes cliniques a priori attribuables à une infection respiratoire virale. Les symptômes d’une infection des voies respiratoires comprennent, sans limitation: la fièvre, l’inflammation de la muqueuse respiratoire, la toux, les éternuements, les écoulements nasaux, la congestion nasale, la gorge irritée ou douloureuse, les maux de tête, les douleurs musculaires, les douleurs thoraciques, une respiration sifflante, de la fatigue, etc. Une personne peut être considérée comme “à risque d’être infectée par un virus respiratoire” s’il y a des cas d’infection (voire une épidémie) dans la région, la

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP ville, ou l’endroit où elle vit, ou encore parce qu’elle a été en contact avec un individu qui a été diagnostiqué comme étant infecté par le virus respiratoire, ou bien encore parce que dans le cas de cette personne l’exposition au virus respiratoire a une probabilité plus élevée de conduire à une infection et en outre d’entraîner des symptômes, conditions et/ou complications graves (par ex. les nourrissons, les jeunes enfants, les personnes âgées, et les personnes immunodéprimées). Dans certains contextes, par exemple sans limitation, dans les institutions telles que les hôpitaux, les écoles, les garderies, les installations militaires, les maisons de soins infirmiers, les maisons de convalescence, les établissements d’hébergement de personnes âgées dépendantes, les bateaux et les avions, une personne est déterminée comme étant à risque en raison du temps passé à proximité d’au moins une autre personne qui peut être infectée. Dans certaines situations, parce que les virus respiratoires sont omniprésents, généralement tout individu peut être à risque d’exposition au virus respiratoire. Le terme 'exposition ' signifie une rencontre avec un virus respiratoire (ex. par contact avec un individu infecté ou un endroit/ surf ace contaminé(e)) qui permet une infection.

C. Echantillon Biologique et Mouchoirs Jetables

1. Collecte par Mouchage

Dans une méthode selon l’invention, la collecte de l’échantillon biologique se fait par mouchage dans un mouchoir jetable. Le terme 'échantillon biologique” , tel qu’utilisé ici, désigne donc une mouchure, à savoir : la mucosité nasale ou sécrétion nasale extraite en se mouchant. Dans la plupart des cas, la collecte de l’échantillon biologique selon une méthode de l’invention est une auto-collecte (c’est-à-dire que l’individu recueille lui-même l’échantillon en se mouchant vigoureusement). Mais il est également envisagé que le patient (par exemple un nourrisson ou un jeune enfant) bénéficie d’une aide pour se moucher (par exemple de la part d’un parent ou d’un assistant maternel). Cela peut également être le cas des personnes handicapées par la maladie, l’âge avancé ou un handicap physique ou mental qui peuvent se faire aider par une personne de leur entourage ou un auxiliaire de vie. Ainsi, les expressions "collecter un échantillon biologique en se mouchant” et “se moucher”, telles qu’utilisées ici de manière interchangeable, signifient aussi bien une auto-collecte qu’une collecte assistée, à condition que l’assistance ne soit pas délivrée par un professionnel de santé qualifié. Généralement, la collecte de l’échantillon se fait au domicile, au lieu de résidence ou au heu de vie de l’individu à tester.

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Le mouchage est effectué de manière classique et le plus correctement possible, par exemple en suivant la recommandation de ne pas moucher les deux narines en même temps mais plutôt d’en vider une après l’autre, en gardant la tête bien droit, le tout en soufflant raisonnablement et efficacement. Dans certains cas, il peut être conseillé de se laver les mains avant de se moucher ou d’aider un tiers à se moucher.

La collecte de l’échantillon se fait préférablement le plus tôt possible après l’apparition de symptômes ou après un délai défini après contact avec une personne diagnostiquée comme étant infectée par un virus respiratoire, le délai avant la collecte sera dicté par le type de virus retrouvé chez la personne ou la population infectée.

2. Collecte par Crachat

Dans une méthode selon l’invention, lorsque l’individu à tester a une toux productive, la collecte de l’échantillon biologique se fait en crachant et plus précisément en déposant un crachat dans un mouchoir jetable. Les termes “toux productive” et “toux encombrée” sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent une toux, connue sous le nom de “toux grasse”, qui est accompagnée d’une production abondante de glaires et mucosité et encombrement des voies respiratoires. Ainsi, le terme “échantillon biologique” , tel qu’utilisé ici, désigne également un crachat, encore appelé expectoration. Dans certains modes de réalisation, le crachat est ajouté au mouchoir utilisé par l’individu pour se moucher. L’expression “collecter un échantillon biologique par crachat”, telle qu’utilisée ici, signifie aussi bien une auto-collecte qu’une collecte assistée, à condition que l’assistance ne soit pas délivrée par un professionnel de santé qualifié. Comme pour la collection par mouchage, généralement, la collecte de l’échantillon par crachat se fait au domicile, au lieu de résidence ou au lieu de vie de l’individu à tester, et préférablement le plus tôt possible après l’apparition de symptômes ou après un délai défini après contact avec une personne diagnostiquée comme étant infectée par un virus respiratoire.

3. Mouchoirs Jetables

Le mouchoir utilisé pour recueillir l’échantillon biologique peut être tout mouchoir papier bien connu à usage unique, jetable ou éphémère (de type Kleenex® commercialisé par Kimberly-Clark Corporation ou similaire). La taille de ces mouchoirs varie généralement de 18 à 22 cm de longueur et de 18 à 22 cm de largeur. Bien entendu, des mouchoirs papier plus grands ou plus petits que ceux décrits ci-dessus sont également appropriés à la mise en œuvre de la méthode de collecte de la présente

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP invention. Les mouchoirs papier sont généralement constitués de papier recyclé, fibre de bois, et/ou cellulose (en particulier ouate de cellulose), et peuvent être monocouches ou multicouches (par exemple double ou triple épaisseur). Ils peuvent être blancs ou colorés, unis ou à motifs. Dans certains modes de réalisation préférés, le mouchoir utilisé pour recueillir l’échantillon biologique est blanc et sans motif. Les mouchoirs en papier jetables peuvent être parfumés (par exemple par de l’eucalyptus et/ou du menthol, ou tout autre parfum). Dans la mise en œuvre de la présente invention, le mouchoir utilisé pour recueillir l’échantillon biologique est préférablement non- parfumé. Certains mouchoirs papier jetables peuvent également comprendre des baumes protecteurs enrichis au calendula, à l’aloe vera et à la vitamine E pour apaiser et protéger le nez des irritations. Dans certains modes de réalisation préférés, le mouchoir utilisé pour recueillir l’échantillon biologique ne contient pas de baumes protecteurs. Enfin, le mouchoir utilisé pour recueillir l’échantillon biologique ne doit pas contenir d’agents antimicrobiens, comme l’acide citrique, le laurylsulfate de sodium ou autres qui sont des agents antiseptiques et antiviraux (et qui sont par exemple présents dans les mouchoirs Kleenex® Anti-Viral™ vendus aux Etats-Unis et au Canada).

D. Récipient d’ Envoi ou de Transport

Une fois l’échantillon recueilli, l’individu à tester introduit le mouchoir souillé dans un récipient. Par 'mouchoir souillé”, on entend ici le mouchoir dans lequel l’individu s’est mouché et/ou a craché, et qui contient donc l’échantillon biologique. Le récipient est ensuite fermé à l’aide d’un bouchon, ou de tout autre système de fermeture approprié, pour éviter toute contamination supplémentaire. Préférablement le récipient destiné à recueillir l’échantillon biologique est stérile.

Le récipient doit être d’un volume adéquat pour contenir le mouchoir. Par exemple, le récipient peut avoir un volume de 20 mL, 30 mL ou 50 mL. Préférablement, le récipient a un volume de 50 mL. Le récipient est préférablement en plastique (par exemple : polypropylène (PP), polyéthylène (PE), polytéréphtalate d’éthylène (PET) ou similaires). Le récipient doit également avoir une forme adéquate pour contenir le mouchoir. Le récipient peut par exemple avoir une forme allongée, comme celle d’un tube cylindrique ou conique ayant un diamètre suffisant, par exemple un diamètre compris entre 2 et 5 cm.

Dans certains modes de réalisation, le récipient est un tube à centrifuger, par exemple un tube à centrifuger en plastique de 50 mL, comme les tubes à centrifuger

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 16 - coniques Falcon™ de 50 ml de Coming™, les tubes de centrifugeuse en polypropylène Easy Reader™ de 50 mL de Fisherbrand™ , les tubes à centrifuger coniques et stériles en polypropylène Nunc™ de 50 mL de Thermo Scientific™, et similaires.

Dans d’autres modes de réalisation, le récipient est une seringue sans aiguille en plastique de 50 mL, comme par exemple les seringues Plastipak de 50 mL à embout Luer-Lock de la marque BD Medical, et similaires. Dans ce cas, après la collecte de l’échantillon par mouchage et/ou par crachat, le mouchoir souillé est introduit dans le corps de la seringue et la seringue est fermée avec le piston correspondant pour éviter toute contamination supplémentaire.

Il est important de noter ici, que le mouchoir souillé est introduit seul dans le récipient (c’est-à-dire en particulier en l’absence de tout milieu de transport, comme une solution de transport viral (VTM)).

E. Envoi ou Transport vers un Laboratoire cl Analyses Biologiques

Dans une méthode selon l’invention, le récipient fermé contenant le mouchoir souillé est ensuite acheminé vers le lieu d’analyse. L’acheminement peut se faire par n’importe quel moyen approprié. Par exemple, le récipient fermé peut être inséré dans une enveloppe et envoyé par courrier standard à un laboratoire d’analyses biologiques. Alternativement, il peut être acheminé par transport médical spécialisé. Durant l’acheminement vers le laboratoire d’analyses, le récipient fermé ne nécessite pas une conservation à une température inférieure à la température ambiante. Par “température ambiante”, on désigne une température comprise entre environ 15°C et environ 35°C, par exemple entre 20°C et 30°C.

II - Analyse d’Acides Nucléiques Viraux à partir d’un Mouchoir Souillé

La présente invention concerne également l’utilisation d’un mouchoir souillé obtenu comme décrit précédemment pour la détection d’acides nucléiques d’un virus respiratoire, et/ou pour le diagnostic d’une infection respiratoire virale chez l’individu ayant fourni l’échantillon biologique par mouchage ou crachat. La présente invention concerne aussi une méthode de détection d’acides nucléiques viraux à partir d’un mouchoir souillé, et une méthode de diagnostic d’une infection respiratoire virale chez l’individu ayant fourni l’échantillon biologique par mouchage ou crachat. De telles méthodes sont généralement mises en œuvre par un laboratoire d’analyses biologiques, mais il est envisagé qu’elles puissent être réalisées par un laboratoire de recherche ou un

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP laboratoire clinique ou hospitalier convenablement équipé. Les termes “laboratoire d’analyses biologiques”, “laboratoire d’analyses médicales”, et “laboratoire de biologie médicale” sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent un lieu où sont analysés divers fluides biologiques d’origine humaine sous la responsabilité de biologistes médicaux, qui interprètent les résultats dans le but de participer au diagnostic et au suivi de certaines maladies. Dans le contexte de la présente invention, le laboratoire d’analyses biologiques doit être équipé pour réaliser des tests diagnostiques permettant de déterminer la présence ou l’absence d’un virus respiratoire dans un échantillon, en particulier la présence ou l’absence d’acides nucléiques de ce virus dans des conditions requises de sécurité microbiologique.

Plus spécifiquement, une méthode selon l’invention pour la détection d’acides nucléiques d’un virus respiratoire à partir d’un mouchoir souillé comprend les étapes suivantes consistant à : (a) récupérer l’échantillon biologique à partir du mouchoir souillé (le mouchoir souillé ayant été obtenu comme décrit plus haut) ; (b) détecter la présence d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré et, (c) si des acides nucléiques viraux ont été détectés, conclure à la présence du virus respiratoire dans l’échantillon biologique et éventuellement diagnostiquer une infection respiratoire d’origine virale chez l’individu ayant collecté l’échantillon biologique.

A. Récupération de l’Echantillon Biologique Contenu dans le Mouchoir Souillé

D’une manière générale, à son arrivée au laboratoire d’analyses biologiques, le récipient est manipulé dans des conditions adéquates de biosécurité visant à prévenir le risque accidentel d’exposition du personnel à des agents pathogènes. Un laboratoire d’analyses biologiques sait appliquer les mesures de confinement adaptées au risque identifié. Ces mesures de confinement sont de type architectural (présence d’un sas, filtration de l’air extrait, etc...) et organisationnel (matériel dédié à la pièce technique, rangement des vêtements de protection, nettoyage des locaux, etc....).

Après réception, la première étape de la méthode selon l’invention consiste à récupérer l’échantillon biologique à partir du mouchoir souillé. Dans le contexte de la présente invention, le terme “récupérer” signifie isoler, séparer ou dissocier l’échantillon biologique du mouchoir souillé. Ces isolations, séparations ou dissociations peuvent être effectuées par n’importe quelle méthode appropriée à condition que cette méthode ne dénature pas l’échantillon biologique.

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - Io -

Dans certains modes de réalisation, l’échantillon biologique est récupéré à l’aide d’une solution aqueuse, préférablement une solution physiologique. Tel qu’utilisé ici, le terme “solution physiologique” désigne toute solution tampon isotonique. Des exemples de solutions physiologiques appropriées incluent, sans limitation, les solutions physiologiques couramment utilisées en recherche biologique ou biochimique comme : le liquide physiologique (composé d’eau distillée et de chlorure de sodium (NaCl) dilué à 9 pour 1000) ; le liquide de Ringer ; la solution de Krebs-Henseleit ; les tampons phosphate salins (PBS), les solutions salines tamponnées au Tris (TBS) ; les solutions salines équilibrées de Hank (HBSS) ; les solutions salines équilibrées de Earle (EBSS) ; les solutions salines de citrate de sodium (SSC) ; les solutions salines tamponnées HEPES (HBS) ; et les solutions salines équilibrées de Gey (GBSS). Dans certains modes de réalisation, l’échantillon biologique est récupéré à l’aide de PBS.

La récupération de l’échantillon biologique à partir du mouchoir souillé se fait par « lavage » ou par « mouillage » du mouchoir souillé avec une solution physiologique. L’échantillon biologique est fluidifié par la solution physiologique, et se retrouve donc dans la phase aqueuse, ce qui permet une séparation de l’échantillon biologique (liquide) du mouchoir (solide). Il est possible d’effectuer un seul lavage ou mouillage, mais préférablement, plusieurs lavages ou mouillages sont effectués successivement. Plus préférablement encore, les lavages ou mouillages sont réalisés avec une seule et même aliquote de solution physiologique utilisée plusieurs fois. Le volume de solution physiologique utilisé pour récupérer l’échantillon biologique est choisi de telle sorte qu’il permet de récupérer l’échantillon biologique avec le plus grand rendement possible tout en évitant une trop grande dilution de l’échantillon biologique. Un volume de solution physiologique (par exemple de PBS) approprié est généralement compris entre environ 2 et environ 8 mL, par exemple environ 2 mL, environ 3 mL, environ 4 mL, environ 5 mL, environ 6 mL, environ 7 mL, ou environ 8 mL. L’étape de lavage ou mouillage peut être réalisée dans le récipient d’envoi ou de transport où le patient a placé le mouchoir souillé. Alternativement, à l’arrivée au laboratoire d’analyses biologiques, le mouchoir souillé est retiré du récipient d’envoi ou de transport et introduit dans un autre récipient pour l’étape de récupération de l’échantillon biologique.

Pour séparer l’échantillon biologique extrait dans la phase aqueuse du mouchoir, on peut utiliser n’importe quelle méthode appropriée. Par exemple, si le récipient

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 19 - d’envoi ou de transport utilisé est un tube à centrifuger, il est possible de verser la phase aqueuse dans un nouveau récipient tout en conservant le mouchoir dans le tube à centrifuger. Le mouchoir peut, en outre, être pressé au fond du tube pour optimiser le volume de phase aqueuse recueillie. Alternativement, on peut aspirer la phase aqueuse et l’introduire dans un nouveau récipient. Si le récipient d’envoi ou de transport utilisé est une seringue sans aiguille, l’échantillon biologique dans la phase aqueuse est recueilli dans un autre récipient en activant le piston, ce qui expulse la phase aqueuse du corps de la seringue. L’homme du métier est en mesure de modifier ou d’adapter ces méthodes en fonction du type de récipient utilisé.

Un exemple particulier de récupération de l’échantillon biologique à partir d’un mouchoir souillé contenu dans une seringue en plastique sans aiguille comprend les étapes suivantes :

(a) Ouvrir la seringue en retirant le piston tout en gardant le mouchoir souillé en bas de la seringue ;

(b) Disposer la seringue au-dessus d’un tube vide de 5 à 10 mL ;

(c) Ajouter 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le corps de la seringue pour tremper correctement le mouchoir, et conserver le mouchoir ainsi imbibé, dans la seringue, pendant 1 minute ;

(d) Mettre le piston dans la seringue pour collecter, dans le tube vide, tout le liquide sortant de la seringue ;

(e) Enlever le piston de la seringue, et introduire le liquide collecté dans le corps de la seringue ; et

(f) Répéter les étapes (d) et (e) deux fois.

Cette méthode permet de récupérer un volume final d’environ 2 à environ 5 mL de PBS contenant l’échantillon biologique.

B. Détection d’ Acides Nucléiques Viraus

L’étape suivante de la méthode selon l’invention inclut la détection d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré à partir du mouchoir souillé. Tel qu’utilisée ici, l’expression "détection d’acides nucléiques viraux” désigne globalement un processus de détermination de la présence ou de l’absence d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique et/ou de détermination d’une quantité ou d’un niveau d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique. Ainsi, la détection peut être qualitative, quantitative, ou semi-quantitative. La détection

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 20 - qualitative et la détection semi-quantitative comprennent une comparaison avec une valeur prédéterminée.

Dans le contexte de la présente invention, la détection peut être réalisée en utilisant n’importe quelle technique moléculaire connue dans l’art et permettant de détecter, au moins en partie, le génome viral (ADN ou ARN). On entend par “technique d’amplification d’acides nucléiques” (TAAN ou NAATs en anglais pour Nucleic Acid Amplification Tests) une technique qui utilise l’extraction d’infimes quantités d’ADN ou d’ARN et les réplique de très nombreuses fois, permettant de détecter des traces minimes d’un microorganisme dans un échantillon biologique, sans avoir à recourir à une culture. La mise en œuvre des techniques d’amplification des acides nucléiques a révolutionné le diagnostic des infections virales des voies respiratoires en raison de leur haute sensibilité et spécificité, de l’identification rapide du virus et de la possibilité de détecter des agents pathogènes qui ne pouvaient pas être identifiés par des méthodes de diagnostic conventionnelles (Ginocchio et al., J. Clin. Microbiol., 2011, 49(9): S44-S48; Charlton et al., Clin. Microbiol. Rev., 2018, 32: c00042-18). De plus, des techniques TAAN commerciales rapides et entièrement automatisées, qui permettent la détection d’un large panel de virus respiratoires, ont été développées. Avec ces techniques « multiplex », il est possible d’analyser un nombre variable d’échantillons et d’appliquer des algorithmes de diagnostic (Charlton et al., Clin. Microbiol. Rev., 2018, 32: e00042-18) prenant en compte des paramètres tels que les caractéristiques des patients (immunosuppression, maladies respiratoires basales, etc.) et la saisonnalité des virus.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, la détection d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré à partir du mouchoir souillé est réalisée par une technique d’amplification d’acides nucléiques. Les techniques d’amplification d’acides nucléiques comprennent, en particulier, la PCR (amplification en chaîne par polymérase ou Polymerase Chain Reaction en anglais), notamment la PCR en temps réel après transcription inverse (RT-PCR) ; la technique NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) ; la technique TMA (transcription-mediated amplification) ; la technique LAMP (loop-mediated isothermal amplification) ; la technique SDA (strand displacement amplification) ; la technique LCR (ligase chain reaction), la technique MLPA (multiplex ligation-dependent amplification) et similaires. La PCR (qui quantifie l’ADN, en temps réel, au cours de la réaction d’amplification) et la RT-PCR

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 21 -

(qui quantifie TARN en effectuant la transcription inverse de TARN message (ARNm) et en amplifiant l’ADN complémentaire résultant (ADNc)) sont de nos jours devenues des références dans la détection des virus respiratoires. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la détection d’acides nucléiques viraux dans l’échantillon biologique récupéré à parti d’un mouchoir souillé est réalisée à l’aide d’une technique de PCR ou de RT-PCR.

Il existe de nombreux kits, tests et automates pour détecter, par amplification, les acides nucléiques de virus respiratoires (Hanson et Couturier, Clin. Infect. Dis., 2016, 63: 1361-1367) qui peuvent être utilisés dans la pratique d’une méthode selon la présente invention. Les analyses peuvent être simples (détection d’un seul virus respiratoire), multiplexes (détection et différenciation simultanées d’au moins deux (types ou sous-types de) virus respiratoires) ou en panel (détection et différenciation simultanée d’une large gamme de virus respiratoires et éventuellement de bactéries responsables d’infections respiratoires). Il existe en effet des tests sur panel multiplex à haute complexité, qui permettent de détecter simultanément et rapidement jusqu’à 20 virus respiratoires (Mahony et al., J. Clin. Microbiol., 2007, 45: 2965-2970), 18 virus respiratoires et 2 ou 3 bactéries atypiques (Gonsalves et al., Methods, 2019, 158: 61- 68), 18 virus et 4 bactéries respiratoires (Beckmann et Hirsch, J. Med. Virol. , 2016, 88: 1319-1324) et un total de 33 agents pathogènes respiratoires (Fast Track Diagnostic, 2018, www.fast-trackdiagnostics.com/human-line/products/ftd-respir atory-pathogens- 33).

Des exemples de panels respiratoires appropriés qui peuvent être utilisés dans la pratique de la présente invention comprennent, sans limitation, ceux commercialisés par bioMérieux : le panel respiratoire BIOFIRE® FILMARRAY® (qui permet d’analyser simultanément 17 virus et 3 bactéries à l’origine de maladies respiratoires), le panel respiratoire 2 BIOFIRE® FILMARRAY® (RP2) (qui permet de détecter 21 pathogènes (17 virus et 4 bactéries) responsables de maladies respiratoires), et le panel respiratoire 2 plus BIOFIRE® FILMARRAY® (RP2plus) (qui détecte 22 pathogènes (18 virus et 4 bactéries) responsables d’infections respiratoires). D’autres panels respiratoires sont commercialisés par Qiagen, comme par exemple le QIAstatDx® Respiratory Panel (qui détecte 18 virus et 3 bactéries causant des maladies respiratoires) et les tests ResPlex I et II ; ou par Luminex Molecular Diagnostics, comme par exemple le xTAG™ Respiratory Viral Panel (R VP) Fast v 2.0 (qui permet de détecter 19 types et sous-types

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP de virus respiratoires) ; ou par Fast Track Diagnostics, comme par exemple les Fast Track Diagnostics Respiratory Pathogen 21 et 33 (FTD®-RP21 et FTD®-RP33) (qui détectent respectivement 21 et 33 pathogènes respiratoires) ; ou par Genomica, comme par exemple le CLART® PneumoVir (qui permet la détection de 17 virus respiratoires) ; ou encore par Eurogentec, comme par exemple les RespiFinder 19 et SMART 22 (qui permettent respectivement la détection de 19 et 22 pathogènes respiratoires). D’autres exemples de tests et panels qui peuvent être utilisés dans la pratique de la présente invention incluent, sans limitation, le MultiCode-PLx RVP (EraGen Biosciences, Etats- Unis), les Seeplex® RV, RV-12 et RV-15 (Seegene Inc., République de Corée), le Magicplex RV Panel Real-Time Test (Seegene Inc., République de Corée), le Panther Fusion® (Hologic Inc., Etats-Unis), le NGEN™ RVA ASR (Nanogen Inc., Etats-Unis), le Pro-FLu+ et le Pro-Flu ST (Prodesse GenProbe, Etats-Unis), le Infiniti® RVP Plus (AutoGenomics, Etats-Unis), le Simplexa™ Flu A/B/RSV/FluA/HINl (Focus Diagnostics, Etats Unis), le eSensor Respiratory Viral Panel (Gen-Mark Dx, Etats- Unis), le Easyplex respiratory pathogen 12 kit (Ausdiagnostics, Australia), le Verigene® Respiratory Virus Plus (Nanosphere Inc., Etats-Unis) et les panels Allplex™ RV1, RV2 et RV3 de Seegene (République de Corée).

Des kits ont même été développés pour la détection, par amplification PCR ou RT-PCR, du coronavirus SARS-CoV-2, qui est responsable de la covid 19. Ces kits incluent, sans limitation, TaqPath COVID- 19 CE-IVD RT-PCR kit (de Life Technologies Thermofisher Scientific), Allplex™ 2019 nCoV Assay (de Seegene), Cobas SARS-CoV-2 (de Roche Molecular Systems), Standard M nCoV Real-Time Detection kit (de SD Biosensor), VIASURE SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection (de Certest), GeneFinder COVID-19 PLUS RealAmp Kit (de Osang Healthcare), PRESTO 2019-nCoV Direct qPCR kit (de AAZ), Novel Coronavirus (2019-nCoV) Nucleic acid diagnostic kit (PCR Fluorescence probing) (de Sansure Biotech), AmoyDx Novel Coronavirus (2019-nCoV) Detection kit (de Amoy Diagnostics), Novel Coronavirus (2019-nCoV) Nucleic acid detection kit (Fluorescence PCR method) (de Suzhou Tianlong Biotechnology), Bosphore Novel Coronavirus (2019-nCoV) Detection kit v2 (1 mastermix) (de Anatolia Geneworks), Bosphore Novel Coronavirus (2019- nCoV) Detection kit (2 mastermix) (de Anatolia Geneworks), Vitassay qPCR SARS- CoV-2 (de Vitassay Healthcare), Detection Kit for 2019 Novel Coronavirus (2019- nCoV) RNA (PCR-Fluorescence Probing (de DAAN Gene), EurobioPlex SARS-CoV-2 Multiplex/RT-PCR en temps réel (de Eurobio Scientific), Abbott RealTime SARS-

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP CoV-2 (de Abbott), COVID- 19 Nucleic acid detection kit (de Wuhan Healthcare Biotechnology), Test de détection du coronavirus PCR en temps réel Quantivirus (SARS-CoV-2) (de Diacarta), Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Detection for 3 Genes), (de Liveriver), VitaPCR SARS-CoV-2 Assay (de Credo Biomedical/Trenton Biomedical), LabGun™ COVID-19 Assay (de Labgenomics), QIASTAT-DX Respiratory SARS-CoV-2 panel (de Qiagen), COVID- 19 Coronavirus Real Time PCR kit (de Jiangsu Bioperfectus Technologies), PerkinElmer® SARS-CoV-2 Real-time RT-PCR Assay (de Perkin Elmer), VIRELLA SARS-CoV-2 seqc real time RT-PCR kit (de Gerbion), Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR Detection Kit - Fosun 2019-nCoV qPCR (de Shanghai Fosun Long March Medical Science), Xpert® Xpress SARS-CoV-2 ou SARS-CoV-2/Flu/RSV (de Cepheid) et Multiple Real-Time PCR Kit Detection 2019-nCoV (de XABT Beijing Applied Biological Technologies).

Avant 1’analyse par amplification, il est nécessaire d’extraire les acides nucléiques viraux de l’échantillon biologique récupéré. Cette extraction requiert la lyse cellulaire, l’inactivation des nucléascs cellulaires et la séparation de l’acide nucléique souhaité de débris cellulaires et de protéines. Les méthodes d’extraction d’acides nucléiques viraux sont connues dans l’art. De nombreux kits peuvent être utilisés pour l’extraction de l’ADN ou de l’ARN viral à partir de fluides corporels ou de tissus humains et sont disponibles dans le commerce, par exemple, chez ThermoFischer Scientific (Etats- Unis), Qiagen (Allemagne), Macherey-Nagel (Allemagne), Roche (Suisse), Promega (Etats-Unis), PerkinElmer (Etats-Unis), MGI (Chine). Des guides d’utilisation, qui décrivent en détail le protocole à suivre sont généralement inclus dans tous ces kits. La sensibilité, le temps de traitement et le coût peuvent être différents d’un kit à l’autre. Les biologistes médicaux des laboratoires d’analyses savent sélectionner le ou les kits les plus appropriés à une situation particulière. De plus, les kits d’analyse par amplification contiennent parfois les réactifs nécessaires à l’extraction des acides nucléiques viraux.

Une méthode, selon la présente invention, pour la détection d’acides nucléiques d’un virus respiratoire à partir d’un mouchoir souillé obtenu comme décrit ici, peut fournir au moins l’un des résultats suivants : présence ou absence d’un virus respiratoire dans l’échantillon biologique testé, identité du virus respiratoire présent dans l’échantillon testé, et quantité ou niveau de virus respiratoire présent dans l’échantillon

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP testé. La quantité de virus respiratoire peut par exemple correspondre à une charge virale ou un titre viral. Les termes “charge virale” et “titre viral” sont utilisés ici de manière interchangeable. Us désignent une expression numérique de la quantité de virus rapporté au nombre de cellules recueillies sur le mouchoir. Cette quantité de cellules reflète approximativement la qualité du mouchage ou du crachat déposé sur le mouchoir.

C. Présence d’un Virus Respiratoire dans l’Echantillon Biologique et Diagnostic d’une Infection Respiratoire Virale

Dans une méthode selon l’invention, si des acides nucléiques viraux ont été détectés lors de l’analyse de l’échantillon biologique par une technique d’amplification, il est conclu à la présence d’un virus respiratoire dans l’échantillon biologique récupéré du mouchoir souillé. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend, en outre dans ce cas, le diagnostic d’une infection respiratoire virale chez l’individu ayant collecté l’échantillon biologique. Tel qu’utilisé ici, l’expression “diagnostic d’une infection respiratoire virale” désigne une conclusion basée sur l’identification du virus respiratoire et éventuellement la détermination de la charge virale (ou de tout autre expression numérique de la quantité ou du niveau de virus dans l’échantillon biologique). La quantité des cellules obtenues sur le mouchoir permettra, si nécessaire d’attester de la bonne réalisation de l’ auto-prélèvement. Cependant, les résultats d’une méthode selon l’invention doivent être interprétés dans le contexte de toutes les données cliniques pertinentes. Ainsi, il revient au praticien de poser le diagnostic médical définitif.

Les résultats d’une méthode selon l’invention peuvent permettre d’administrer un traitement adéquat à l’individu qui a fourni l’échantillon biologique par mouchage et/ou crachat et/ou d’imposer une quarantaine ou un isolement à cet individu et/ou d’initier une identification des cas contacts, en fonction de la nature du virus respiratoire. Le terme “traitement” est utilisé ici pour caractériser une méthode ou un processus qui vise (1) à ralentir ou stopper la progression ou l’aggravation de l’infection respiratoire virale, et/ou (2) à améliorer au moins un symptôme de l’infection respiratoire virale (par exemple en réduisant la gravité ou la durée du symptôme), et/ou (3) à prévenir au moins un symptôme de l’infection respiratoire virale, et/ou (4) à supprimer l’infection respiratoire virale et/ou (5) à limiter la transmission de l’infection respiratoire à l’entourage Tel qu’utilisés ici, les termes “quarantaine” et “isolement” désignent une

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 25 - mesure-barrière qui consiste à isoler une personne durant un certain temps, en cas de diagnostic d’infection respiratoire virale, pour empêcher la contagion de tiers et la propagation du virus.

En outre, les méthodes fournies ici ont une variété d'autres utilisations, y compris, sans limitation, (1) dans la détection d’individus qui ont été exposés à un virus respiratoire et qui ont une infection imminente mais non symptomatique (par exemple dans le cas d’une épidémie) ; (2) dans la surveillance de la réponse à un vaccin ou à un médicament, soit dans le cadre d’un essai clinique, soit pour surveiller l’immunité d’une population ; et (3) dans le dépistage d’une infection respiratoire virale imminente avant un déploiement (par exemple un déploiement militaire ou civil tel que l’embarquement sur un navire de croisière). par exemple entre 20°C et 30°C.

III - Kits de Collecte d’Echantillons Biologiques pour la Détection de Virus Respiratoires

Dans un autre aspect, la présente invention propose des kits comprenant du matériel utile dans la mise en œuvre d’une méthode de collecte d’au moins un échantillon biologique selon l’invention.

Ainsi, par exemple, un kit selon l’invention peut comprendre un récipient destiné à recueillir un mouchoir souillé, et un élément d’identification de l’échantillon. Le récipient, par exemple un tube à centrifuger ou une seringue sans aiguille comme décrits ci-dessus, peut être contenu dans une pochette d’emballage en plastique, à retirer avant utilisation. On entend ici par “élément d’identification” tout moyen permettant de relier, sans aucune ambiguïté, l’échantillon au patient ayant fourni cet échantillon. Dans certains modes de réalisation, l’élément d’identification permet de renseigner, par exemple de manière manuscrite, les informations concernant l’identité du patient ayant fourni l’échantillon biologique (par exemple : nom, prénom, date de naissance et sexe). Dans d’autres modes de réalisation, l’élément d’identification peut comporter un numéro unique d’identification ou un code-barres spécifiquement assigné au patient qui a préalablement fourni son identité ou qui fournit son identité sur une fiche ou un formulaire, qui est également inclus dans le kit et qui comporte ce même numéro unique d’identification ou code-barres. Cet élément d’identification peut se trouver sous n’importe quelle forme appropriée, par exemple sous forme d’une étiquette autocollante, qui peut être collée sur le récipient avant envoi, ou sous la forme d’une

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 26 - fiche ou d’un formulaire à insérer dans l’enveloppe avant envoi. L’élément d’identification ou un autre élément de renseignements peut permettre de fournir d’autres informations utiles comme par exemple, la date et l’heure du prélèvement de l’échantillon biologique, l’adresse d’envoi des résultats, le nom du médecin traitant, l’état de santé du patient, le(s) traitement(s) médicamenteux suivi(s) par le patient, etc.

Dans certains modes de réalisation, un kit selon l’invention comprend, en outre, un mouchoir contenu dans un sachet plastique individuel.

Un kit selon l’invention peut également comprendre une enveloppe pour l’envoi ou le transport vers un laboratoire d’analyse.

Un kit selon la présente invention peut aussi comprendre une notice d’instructions d'utilisation du kit selon une méthode de collecte d’échantillon décrite ici et/ou une liste d’adresses de laboratoires d’analyses biologiques appropriés.

Un kit selon l’invention permet généralement la collecte d’un seul échantillon biologique d’un seul individu. Cependant, il est envisagé qu’un kit contienne assez de récipients et d’éléments d’identification pour permettre la collecte de plusieurs échantillons biologiques de plusieurs individus (par exemple pour une famille, ou pour une communauté).

Un kit selon l’invention peut éventuellement contenir un avis ou une notice sous la forme prescrite par une agence gouvernementale réglementant la fabrication, l’utilisation ou la vente de produits pharmaceutiques ou biologiques, cette notification reflétant l’approbation, par l’agence, de la fabrication, de l’utilisation ou de la vente pour usage humain.

Les composants individuels du kit sont de préférence maintenus en confinement étroit pour la vente commerciale.

Un identifiant, par exemple, un code à barres, une fréquence radio, etc., peut être présent dans ou sur le kit. L’identifiant peut être utilisé, par exemple, pour identifier de manière unique le kit à des fins de contrôle qualité, de contrôle des stocks, de suivi des mouvements entre les postes de travail, etc.

D’autres aspects et avantages de la présente invention sont décrits dans les figures et les exemples suivants, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitant pas la portée de l’invention.

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP - 27 -

Examples

Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples et les figures ne sont présentés qu’à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l’invention.

Expériences

Plusieurs expériences ont été menées. Elles ont permis de valider l’approche de l’analyse de mouchoirs pour la détection de virus respiratoires. La validation a été effectuée pour trois situations différentes :

1. La détection de virus respiratoires après collecte de mouchoirs dans une crèche au cours d’une année ;

2. La détection de virus respiratoires après collecte de mouchoirs dans une école maternelle ; et

3. Détections et diagnostics individuels chez des personnes symptomatiques.

1. Détection de Virus Respiratoires Après Collecte de Mouchoirs dans une Crèche Durant une Année

Une opération a été menée dans une crèche accueillant des enfants de septembre 2018 à septembre 2019. Les enfants ont été séparés structurellement en "petits" (<18 mois) et en "grands" (>18 mois) et accueillis dans des pièces indépendantes au sein de la même crèche. Chaque semaine, les mouchoirs de tous les enfants étaient collectés de façon groupée et non individuelle afin de détecter, selon la présente invention, les virus qui pouvaient circuler au fil du temps au sein de la structure d’accueil.

La Figure 1 résume les virus détectés tout au long de l’année (chaque semaine est identifiée "S") pour les "petits" (salle B) et pour les "grands" (salle G) au sein de la crèche. Chaque case qui a été cochée indique qu’un virus a été détecté au cours de la semaine considérée. De façon notable, on constate la circulation indépendante des virus saisonniers selon la salle considérée. En d’autres termes, les "petits" peuvent être infectés par certains virus à certains moments, sans que les "grands" soient infectés par les même virus au même moment. On notera également, qu’en plus des virus respiratoires saisonniers, d'autres virus responsables de maladies infantiles ont été recherchés sur les mouchoirs (B 19 : parvovirus B 19; VZV : virus de la varicelle et du zona; CMV : cytomégalovirus).

Cette étude démontre la faisabilité de l’approche de détection des virus sur des mouchoirs collectés de façon hebdomadaire. Elle a donné une vision objective de

FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP - 28 - l’écologie virale sur une année complète dans une crèche recevant deux populations enfantines d’âges différents. Cette étude révèlent également que les virus semblent ainsi circuler différemment à partir du moment où les enfants sont physiquement séparés dans des pièces différentes et les règles d’hygiène sont respectées.

Les conséquences pratiques ont été d’informer les parents de la circulation de certains virus tout au long de Tannée et d’expliquer ainsi certains symptômes qu’ils pouvaient observer sur leurs enfants, ou sur eux-mêmes, tout en les rassurant sur l’étiologie de ces manifestations cliniques généralement bénignes. La généralisation de cette démarche pourrait à terme conduire à une moindre utilisation des antibiotiques puisque l’identification d'un virus apporte un argument majeur pour la non-utilisation des antibiotiques, inefficaces sur les viras.

2. Détection de Virus Respiratoires Après Collecte de Mouchoirs dans une Ecole Maternelle

Dans une deuxième étude, un protocole assez semblable a été mené en collectant les mouchoirs usagés dans deux classes de maternelle de petite et grande sections. Chaque semaine, les mouchoirs utilisés par les écoliers étaient collectés et analysés pour la présence de viras respiratoires selon le protocole de la présente invention.

La Figure 2 présente un tableau qui indique les viras détectés chaque semaine de l’année scolaire (2019-2020). Cette année scolaire ayant été marquée par le confinement, cela a arrêté brutalement l’étude début mars. Chaque case qui a été cochée indique la détection du viras dans la semaine considérée.

Cette seconde étude a permis de valider l’approche expérimentale et démontre la possibilité de détecter des virus sur des mouchoirs selon le protocole de la présente invention. Il a été constaté à nouveau une circulation souvent dissociée des viras entre les deux groupes d’écoliers. Cela est à mettre en lien avec les phénomènes d’immunisation tout au cours de la vie. Les jeunes élèves contaminés par un viras dans les premières années s’infectent moins par ces mêmes viras les années suivantes.

3. Détections et Diagnostics Individuels chez des Personnes Symptomatiques

Une autre étude a été menée dans le but de comparer la fiabilité du dépistage du SARS-CoV-2 selon la méthode de la présente invention et celle de la méthode de référence. Cette dernière est définie par l’état de l’art et les recommandations de l’HAS, à savoir un écouvillonnage nasopharyngé pour le diagnostic de la COVID-19.

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP Il a été proposé à 17 personnes adultes se présentant pour un diagnostic de COVID et bénéficiant d’un prélèvement nasopharyngé selon l’état de l’art, de se moucher selon le protocole décrit ici. Les prélèvements analysés selon la procédure classique de détection du SARS-CoV-2 au laboratoire sur les écouvillons nasopharyngés ont révélés 9 cas positifs. Les mouchoirs de toutes ces personnes (n=17) ont été analysés selon la procédure décrite ici et 6 se sont révélés positifs. On notera que les 6 prélèvements présentant une charge virale compatible avec un risque de transmission du virus (soit un signal de RT-PCR <30 Ct) ont tous été détectés positifs sur les mouchoirs. Il n’a pas été noté de signaux faussement positifs après analyse des mouchoirs sur les échantillons nasopharyngés négatifs.

La Figure 3 indique les valeurs de Ct (cycle de seuil) obtenues sur le gène N du SARS-CoV-2 selon que la technique de détection a été réalisée sur l’écouvillon nasopharyngé (NPS) ou sur le mouchoir collecté auprès de la même personne. Les trois individus avec les NPS ayant les Ct les plus élevés (30, 31 et 36, c’est-à-dire des charges virales plus faibles) n'ont pas été détectés lors de l’analyse des mouchoirs.

Ces résultats sont conformes à ce qui était attendu, à savoir une sensibilité moindre de la détection du SARS-CoV-2 sur les mouchoirs, comparativement à l’écouvillon nasopharyngé. Plusieurs études récentes travaillant sur des matrices différentes que celles recommandées, en particulier la salive ou des écouvillons oropharyngés, indiquent des résultats comparables avec une sensibilité moindre que la méthode standard (écouvillonnage nasopharyngé). Les discussions actuelles portent sur le fait qu’une technique moins sensible serait néanmoins le meilleur reflet d’un risque de contagiosité de l’individu. Une analyse des mouchoirs permettrait donc d’identifier correctement les personnes à risque de transmettre le SARS-CoV-2.

Des travaux ont été également réalisés ponctuellement sur des mouchoirs adressés au laboratoire et analysés à titre gracieux et expérimental pour des personnes présentant des symptômes cliniques évocateurs d’une infection virale respiratoire. Les mouchoirs ont pu être acheminés par la poste ou directement au laboratoire par les personnes elles- mêmes en sachet plastique. L’analyse de ces mouchoirs selon le protocole décrit ici a permis d’identifier des virus influenza B, des métapneumo virus, des rhinovirus ou du SARS-CoV-2. Ces expériences ponctuelles indiquent la faisabilité d’analyser à titre individuel des mouchoirs, même à distance du mouchage, et d’établir un diagnostic étiologique expliquant les symptômes ressentis.

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Conclusion

L’ensemble des études menées indique que les mouchages collectés sont de bonnes matrices pour la détection des virus respiratoires ou à transmission respiratoire. L’analyse des mouchoirs utilisés fournit des indications sur les virus qui circulent durant une période donnée et dans une population définie. Sachant qu’il n'existe que de très rares traitements antiviraux efficaces sur ces virus saisonniers, analyser les mouchoirs et apporter l’information sur les virus circulants permet de renseigner la population et d’éviter la prise inutile d’antibiotiques tout en renforçant la mise en place de mesures barrières pour éviter la dissémination virale. A l’échelon individuel, l’analyse des mouchoirs permet de porter un diagnostic chez les personnes présentant des symptômes évocateurs d’une infection virale. La sensibilité clinique de la détection de génomes viraux sur les mouchoirs n’est pas parfaitement établie par rapport à l’état de l’art reposant sur un prélèvement nasopharyngé mais un test positif signe de façon certaine une infection en cours. L’intérêt du dépistage sur mouchoir est la possibilité de réaliser un autoprélèvement, de ne pas exposer ainsi un éventuel préleveur et de pouvoir envoyer simplement le mouchoir sans précaution particulière de stockage dans un laboratoire habilité pour la détection des génomes viraux.

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