Titre de l'invention : Dispositif de culture végétale in vitro par immersion temporaire dans un liquide nutritif

[0001] [La présente invention entre dans le domaine de la culture in vitro de matériel végétal, par immersion temporaire, en condition stérile, notamment destiné aux techniques de micro propagation par organogénèse somatique et embryogénèse.

[0002] Elle concerne plus particulièrement un dispositif de culture végétale in vitro par immersion temporaire dans un liquide nutritif et son procédé de mise en oeuvre.

[0003] Un tel dispositif trouvera une application particulière dans les domaines de l'horticulture et de l'agriculture, où la multiplication des végétaux par culture in vitro en condition stérile est une pratique courante.

[0004] La technique de culture végétale in vitro par immersion temporaire consiste à immerger temporairement dans un milieu nutritif liquide, quelques minutes par jour, un matériel végétal en culture. L'immersion peut être totale ou partielle. Pour permettre la croissance du matériel végétal, on alterne, une phase active d'immersion dans un milieu nutritif liquide, avec, une phase de repos où le matériel végétal n'est pas immergé dans le milieu nutritif liquide. Pendant la phase de repos, le matériel végétal en culture est émergé et sans mouvement. Toutefois, à cause de la phase d'immersion précédente, un film de milieu nutritif est retenu sur le matériel végétal. Ledit film de milieu nutritif maintien humidifié et alimenté en nutriments, nécessaires à sa croissance, ledit matériel végétal.

[0005] La culture végétale in vitro par immersion temporaire est un procédé qui permet d'éviter les problèmes d'asphyxie de la culture et/ou de force de friction que l'on retrouve avec des techniques de culture végétale où le matériel végétal est en permanence immergé et sous agitation. De plus, la culture végétale in vitro par immersion temporaire permet d'éviter également l'accumulation des coûts de culture liés à la multiplication des manipulations que demande par exemple la culture in vitro en milieu solide.

[0006] De manière connue, pour la mise en oeuvre de la technique de culture végétale in vitro par immersion temporaire dans un liquide nutritif, on utilise un récipient spécifique et adapté tel que celui divulgué dans le document WO2012/146872.

[0007] Plus spécifiquement, le document WO 2012/146872 divulgue un récipient pour la culture in vitro de matériel végétal par immersion temporaire. Ce récipient comprend deux chambres superposées, refermées en partie supérieure par un couvercle.

[0008] La chambre supérieure est destinée à contenir le matériel végétal à cultiver. La chambre inferieure est destinée à contenir le liquide nutritif. [0009] Ce récipient comporte également des moyens pour le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif depuis la chambre inférieure jusqu'à la chambre supérieure.

[0010] Plus précisément, le récipient consiste en une pièce extérieure monobloc constituée d'une partie supérieure de grand diamètre formant la chambre supérieure et d'une partie inférieure, de diamètre inférieur à la partie supérieure, formant la chambre inférieure.

[0011] Ce récipient comporte également, logé dans la chambre supérieure, un panier de culture contenant le matériel végétal.

[0012] Ce panier présente un orifice central traversant qui permet de recevoir une partie des moyens de transfert du liquide nutritif entre les deux chambres.

[0013] Le panier comporte un organe de filtration qui consiste en un tamis qui permet la répartition, de la chambre inférieure vers la chambre supérieure, du liquide nutritif et du gaz de surpression. [0014] Les moyens de transfert comportent un conduit de raccordement central, assurant la liaison hydrique entre les deux chambres, et, un conduit latéral pour l'introduction de gaz au niveau de la chambre inférieure.

[0015] En outre, la partie supérieure de ce récipient est fermée par un couvercle amovible. Ce couvercle est muni d'ailettes d'accrochages rentrantes complémentaires à des nervures présentes en bordure périphérique supérieure de la chambre supérieure. L'étanchéité du couvercle, assemblé sur la bordure de la chambre supérieure, est assurée par son verrouillage par vissage sur la bordure périphérique de la chambre supérieure, en combinaison avec un joint d'étanchéité. Un mouvement de rotation du couvercle sur le récipient permet de fermer hermétiquement la pièce extérieure monobloc par écrasement du joint d'étanchéité. En position verrouillée, le couvercle exerce donc une force d'appui dirigée vers la chambre inférieure et qui écrase le joint.

[0016] De plus, ledit couvercle comporte un évent recouvert d'un filtre stérilisant pour garantir la stérilité du volume intérieur du récipient une fois le couvercle verrouillé. L'évent permet le passage de gaz entre l'intérieur et l'extérieur du récipient.

[0017] En phase active d'immersion, la technique de culture in vitro par immersion temporaire, utilisant ce récipient, consiste à appliquer une surpression dans la chambre inférieure, contenant le liquide nutritif. La surpression est appliquée en introduisant un gaz, stérilisé via un filtre stérilisant, au travers du conduit latéral. L'introduction du gaz est contrôlée et réalisée à l'aide d'une pompe délivrant de l'air comprimé.

[0018] Le fonctionnement de la pompe rythme la durée des immersions du matériel végétal.

[0019] En effet, la surpression générée pousse le milieu nutritif depuis la chambre inférieure jusqu'à la chambre supérieure. En d'autres termes, sous l'effet de la surpression, le liquide nutritif de la chambre inférieure remonte au travers du conduit de raccordement, puis au travers de l'organe de filtration, pour se retrouver dans la chambre supérieure. [0020] Ainsi, le maintien de l'alimentation de la surpression, au niveau de la chambre inférieure, permet de maintenir le milieu nutritif dans la chambre supérieure pour une immersion du matériel végétal. Ceci constitue en la phase active d'immersion. Pendant cette phase active d'immersion, lors de la remonté du liquide nutritif, l'évent du couvercle permet d'évacuer le gaz contenu dans la chambre supérieure et qui est poussé par le liquide nutritif.

[0021] Puis, on retourne vers une phase de repos, en stoppant l'alimentation de la surpression. L'arrêt de l'entrée de gaz, donc de la surpression, entraîne le retour par gravité du milieu nutritif de la chambre supérieure vers la chambre inférieure. L'évent du couvercle permet également, en phase de repos, d'évacuer la surpression continuant d'être alimentée par la descente du milieu nutritif [0022] Cependant en pratique, dans une configuration à la verticale, où le récipient est une pièce extérieure monobloc se composant d'une chambre de culture superposée à une chambre de liquide nutritif, la demanderesse a constaté, de manière désavantageuse, que le raccordement à un réseau d'alimentation d'air comprimé, pour générer le phénomène de surpression, provoque des fuites localisées au niveau du couvercle. Ces fuites au niveau du couvercle interviennent dès la mise en surpression de l'appareil, ainsi le couvercle recouvrant la partie supérieure du récipient ne permet plus de fermer hermétiquement la pièce extérieure monobloc constituant ledit récipient.

[0023] Désavantageusement, avec le récipient du document WO 2012/146872, la surpression génère un risque de soulèvement du couvercle, c'est-à-dire une entrée ou sortie d'air à proximité du joint d'étanchéité qui ne peut plus assurer son rôle. Le mode de fonctionnement par surpression du récipient du document WO 2012/146872 entraîne le fait que la chambre supérieure est soumise à une pression permanente due à l'évacuation très lente du flux d'air par l'évent du couvercle. Ce phénomène de surpression de la chambre supérieure tend à contraindre et déformer le récipient jusqu'à créer des fuites localisées.

[0024] Or, ces fuites localisées peuvent être à l'origine de la contamination du matériel végétal en croissance et de la perte de l'asepsie de la chambre supérieure de culture.

[0025] La présence des filtres stérilisants, au niveau de l'évent du couvercle et du conduit latéral de la chambre inférieure, est insuffisant pour garantir la stérilité de l'environnement autour du matériel végétal contenu dans le récipient divulgué dans le document WO2012/146872. L'utilisation du récipient divulgué possède donc ses limites en termes de surpression à appliquer, afin de conserver une pression admissible au sein de la chambre supérieure pour éviter qu'elle ne se déforme localement. Or dans un protocole de culture in vitro par immersion, où le milieu nutritif doit remonter vite vers la chambre de culture, il peut s'avérer nécessaire de dépasser cette limite de pression en risquant toutefois de déformer la chambre de culture, notamment son couvercle, et de créer des fuites donc des contaminations du matériel végétal. Or pour un usage industriel et une conservation de la stérilité du matériel végétal, ceci est impensable. [0026] De plus, le récipient, divulgué dans le document WO2012/146872, nécessite une pompe à air comprimé reliée à chaque chambre inférieure de chaque récipient. En effet, le document WO2012/146872 envisage autant de pompe que de récipient, ce qui génère des coûts élevés et une gestion complexe dans le cas d'une culture à grande échelle nécessitant plusieurs récipients.

[0027] C'est pourquoi et compte tenue de ces observations, il convient de trouver une solution alternative à celle mise en place avec le récipient existant. Le but est de pouvoir réaliser la technique de culture végétale in vitro par immersion temporaire dans un milieu liquide nutritif, à échelle industrielle, sans risque de contamination du matériel végétal, qui soit de faibles coûts de production et peu énergivore. Il convient d'optimiser la solution prévue par le document WO2012/146872 pour la technique de culture végétale in vitro par immersion temporaire dans un milieu liquide nutritif en la rendant plus fiable en limitant notamment les fuites.

[0028] La présente invention a pour but de pallier les inconvénients de l'état de la technique.

[0029] Un premier aspect de l'invention a trait à un dispositif de culture in vitro d'un matériel végétal par immersion temporaire dans un liquide nutritif. Ce dispositif comprend: au moins un récipient de culture , chacun comportant : a/ une chambre de culture , qui présente un volume interne, et qui est destinée à contenir le matériel végétal à cultiver, b/ une chambre de liquide nutritif qui est destinée à contenir le liquide nutritif , c/ des moyens de transfert pour le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif depuis ladite chambre de liquide nutritif vers la chambre de culture , d/ un couvercle amovible pour refermer ladite chambre de culture ainsi que des moyens d'étanchéité interposés entre ce couvercle et cette chambre de culture; e/ des moyens de communication, que comporte le couvercle amovible, et qui sont destinés à assurer une communication entre le volume interne de la chambre de culture et l'extérieur du récipient de culture.

Selon une spécificité de l'invention, ledit dispositif de culture comporte, encore, d'une part, des moyens de dépression pour établir, dans la chambre de culture, une pression qui est inférieure à la pression dans la chambre de liquide nutritif et, d'autre part, des moyens de raccordement pour raccorder les moyens de dépression auxdits moyens de communication dudit au moins un récipient de culture.

Selon un mode préféré de réalisation du dispositif de l'invention : lesdits moyens de dépression comportent au moins un moyen d'aspiration , de préférence chaque moyen d'aspiration est constitué par une pompe à vide, lesdits moyens de dépression comportent, en outre, au moins une cuve tampon interposée entre ledit au moins un moyen d'aspiration et ledit au moins un récipient de culture, lesdits moyens de dépression comportent, encore, au moins une vanne interposée entre ledit au moins un moyen d'aspiration et ladite au moins une cuve tampon.

De préférence, ledit dispositif de l'invention comporte au moins une vanne interposée entre lesdits moyens de dépression et ledit au moins un récipient.

Selon un autre mode de réalisation du dispositif de l'invention, lesdits moyens de communication consistent en un conduit qui traverse le couvercle amovible.

Selon un autre mode de réalisation préféré du dispositif de l'invention, lesdits moyens de communication consistent en un embout qui équipe ledit couvercle et qui comporte un orifice traversant et communiquant avec un orifice qui traverse ledit couvercle.

Avantageusement, ledit dispositif comporte au moins deux récipients de culture comportant, chacun, des moyens de communication tandis que les moyens de raccordement comportent, d'une part, une rampe raccordée aux moyens de dépression et, d'autre part, des organes de raccordement pour raccorder ladite rampe aux moyens de communication que comportent chacun des récipients de culture.

Selon un premier mode de réalisation du dispositif de l'invention, ladite rampe adopte une forme linéaire et présente une extrémité raccordée aux moyens de dépression, tandis que les organes de raccordement sont répartis sur une partie au moins de la longueur de la rampe.

Selon un second mode de réalisation du dispositif de l'invention, ladite rampe adopte une forme de boucle, tandis que les organes de raccordement sont répartis sur au moins une partie de la longueur de la boucle et, d'autre part, les moyens de raccordement comportent en outre au moins un conduit de raccordement pour raccorder ladite rampe aux moyens de dépression. Avantageusement pour ce second mode de réalisation, ledit dispositif comporte une pluralité de conduits de raccordement qui s'étendent à partir de la rampe adoptant une forme de boucle et qui convergent en un point raccordé aux moyens de dépression.

Selon une autre caractéristique du dispositif de l'invention, ledit au moins un récipient de culture comporte un évent pour assurer la communication entre le volume interne de la chambre de liquide nutritif et l'extérieur d'un tel récipient de culture.

[0030] Un deuxième aspect de l'invention a trait à un procédé de culture in vitro de matériel végétal par immersion temporaire dans un liquide nutritif, au sein d'au moins un récipient de culture comportant : f/ une chambre de culture (3), qui présente un volume interne, et qui est destinée à contenir le matériel végétal (M) à cultiver, g/ une chambre de liquide nutritif (4) qui est destinée à contenir le liquide nutritif (L) , h/ des moyens de transfert (5) pour le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif

(L) depuis ladite chambre de liquide nutritif (4) vers la chambre de culture (3) , i/ un couvercle amovible (6) pour refermer ladite chambre de culture (3) ainsi que des moyens d'étanchéité (7) interposés entre ce couvercle (6) et cette chambre de culture (3) ; j/ des moyens de communication (8), que comporte le couvercle amovible (6), et qui sont destinés à assurer une communication entre le volume interne de la chambre de culture (3)et l'extérieur du récipient de culture (2).

Ledit procédé de culture in vitro de matériel végétal par immersion temporaire dans un liquide nutritif comporte les étapes suivantes :

- on cultive ledit matériel végétal M au sein de ladite chambre de culture,

- on transfère, de manière temporaire, lors de la phase active d'immersion, ledit liquide nutritif de la chambre de liquide nutritif vers la chambre de culture en générant une différence de pression entre lesdites chambres et, et en particulier les étapes suivantes :

- on aspire les gaz contenus dans ladite chambre de culture jusqu'à ce que la pression de ladite chambre de culture soit inférieure à la pression de ladite chambre de liquide nutritif de sorte à générer ladite différence de pression, entre ladite chambre de culture et ladite chambre de liquide nutritif par dépression de ladite chambre de culture.

Selon une autre caractéristique ledit procédé de culture in vitro de matériel végétal par immersion temporaire dans un liquide nutritif est mis en oeuvre par le dispositif de culture in vitro d'un matériel végétal par immersion temporaire dans un liquide nutritif.

[0031] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre des modes de réalisation non limitatifs de l'invention, en référence aux figures annexées, dans lesquelles :

[0032] [Fig.l] la figure 1 représente schématiquement une vue de profil éclaté d'un mode de réalisation d'un récipient de culture du dispositif de culture de l'invention ;

[0033] [Fig.2] la figure 2 représente schématiquement un dispositif de culture de l'invention comprenant le récipient de culture refermer par son couvercle de la figure 1, des moyens de dépression et des moyens de raccordement ;

[0034] [Fig.3] la figure 3 représente schématiquement un dispositif de culture de l'invention multi- récipients selon un premier mode de réalisation,

[0035] [Fig.4] la figure 4 représente schématiquement une vue du dessus des raccordements du dispositif de culture de l'invention multi-récipient selon le premier mode de réalisation de la figure 3; [0036] [Fig.5] la figure 5 représente schématiquement un dispositif de culture de l'invention multi- récipients selon un second mode de réalisation ; [0037] [Fig.6] la figure 6 représente schématiquement une vue du dessus des raccordements du dispositif de culture de l'invention multi-récipient selon le second mode de réalisation de la figure 5; [0038] [Fig.7] la figure 7 représente schématiquement une vue du dessus du dispositif de culture de l'invention multi-récipient selon le second mode de réalisation en présence d'une cuve tampon. [0039] En référence à ces dessins, la présente invention concerne un dispositif de culture in vitro 1 d'un matériel végétal M par immersion temporaire dans un liquide nutritif L.

[0040] Ledit matériel végétal M à cultiver consiste en tous tissus végétaux cultivés in vitro, tel que des micro-tiges, des micro- boutures, du cal, des embryons somatiques, ou encore du matériel végétal sous forme d'explants ou de cellules.

[0041] Le liquide nutritif L consiste en tous milieux connus permettant la croissance et la multiplication in vitro dudit matériel végétal M, tel que par exemple un milieu liquide contenant les sels minéraux de Murashige et Skoog (1962) ou des formulations dérivées, du sucre, des vitamines ou encore des hormones végétales.

[0042] Le dispositif 1 de l'invention comprend au moins un récipient de culture 2.

[0043] Ledit récipient 2 comporte une chambre de culture 3, une chambre de liquide nutritif 4, des moyens de transfert 5 du liquide nutritif L d'une chambre à l'autre, un couvercle amovible 6 associé à des moyens d'étanchéités 7 pour sa fermeture. En d'autres termes, ledit récipient comporte un seul couvercle amovible 6 pour assurer sa fermeture et son étanchéité.

[0044] Ledit récipient 2 comporte également des moyens de communication 8 assurant une communication entre son extérieur et le volume interne de sa chambre de culture 3.

[0045] Selon l'invention, ledit récipient 2 comporte une pièce extérieure monobloc 21 recouverte par ledit couvercle amovible 6. En conséquence, ladite pièce extérieure monobloc 21 peut être fermée hermétiquement par ledit couvercle amovible 6. Selon la présente invention, ladite pièce extérieure monobloc 21 est divisée en une première et une seconde partie.

[0046] Ladite première partie définit la chambre de liquide nutritif 4. Ladite première partie est destinée à contenir, au sein de son volume interne, ledit liquide nutritif L. De préférence, ledit liquide nutritif L est contenu directement au sein du volume interne de la première partie de la pièce extérieur monobloc 21 du récipient 2, c'est-à-dire au sein du volume interne de la chambre de liquide nutritif 4.

[0047] Ladite seconde partie définit la chambre de culture 3. Ladite seconde partie est destinée à contenir, au sein de son volume interne, ledit matériel végétal M. Selon l'invention, ladite seconde partie définissant la chambre de culture 3, internalise dans son volume interne, une pièce intérieure 31 dans laquelle se trouve ledit matériel végétal M. Dans ce cas, le volume interne de la chambre de culture 3, destinée à contenir le matériel végétal M correspond au volume occupé par la pièce intérieure 31 dans laquelle se trouve le matériel végétal M. Ladite pièce intérieure 31 sépare la chambre de liquide nutritif 4 du matériel végétal M de la chambre de culture 3.

[0048] Selon un premier mode de réalisation, la pièce extérieure monobloc 21, que comporte ledit récipient 2, présente un agencement selon un axe horizontal. Selon cet agencement, la première partie et la seconde partie, divisant la pièce extérieure monobloc, sont agencées de manière adjacente l'une de l'autre, selon un axe horizontal. En d'autres termes, la chambre de culture 3 et la chambre de liquide nutritif 4 sont positionnées l'une à côté de l'autre de manière adjacente, et elles constituent la pièce extérieure monobloc 21, que comporte ledit récipient 2, recouvert par ledit couvercle amovible 6. Ainsi, ledit couvercle amovible 6 recouvre à la fois ladite chambre de culture 3 adjacente à ladite chambre de liquide nutritif 4, de sorte à fermer hermétiquement l'intégralité de la pièce extérieure monobloc 21, c'est-à-dire à fermer hermétiquement chacune des deux chambres de culture 3 et de liquide nutritif 4. Selon ce mode particulier de configuration, selon un axe horizontal, au moins une partie de la paroi de la chambre de culture 3 communique avec au moins une partie de la paroi de la chambre 4 de liquide nutritif L, au travers des moyens de transfert 5. En d'autres termes, lesdits moyens de transfert 5 permettent le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif L depuis la chambre 4 de liquide nutritif L vers la chambre de culture 3. [0049] Selon un second mode de réalisation privilégié, ladite première partie est superposée sur ladite seconde partie tel que visible sur la figure 1.

[0050] Dans ce second mode de réalisation, le récipient 2 comporte une pièce extérieure monobloc 21 qui se compose de deux parties annulaires superposées, de diamètres différents. La pièce extérieure monobloc 21 se compose d'une première partie supérieure annulaire surmontant la seconde partie inferieure annulaire. La première et la seconde partie annulaire représentant respectivement ladite chambre de culture 3 et ladite chambre de liquide nutritif 4. Ladite chambre de culture 3 ayant un diamètre supérieur à celui de ladite chambre de liquide nutritif L. Lesdites chambres 3 et 4 sont jointes entre elles par une jonction constituant un épaulement annulaire en forme de couronne sur lequel peut reposer ladite pièce intérieure 31. L'avantage d'une configuration à la verticale du récipient 2, sous forme de pièce extérieure monobloc 21 comportant la chambre de culture 3 superposée sur la chambre de liquide nutritif 4, est que le dispositif de culture in vitro 1 est moins volumineux, par rapport à une disposition selon un axe horizontal des chambres de culture 3 et nutritif 4.

En outre, cette configuration à la verticale est économique en termes de nombre de pièce nécessaire pour assurer la fermeture hermétique à la fois de la chambre de culture 3 et de la chambre de liquide nutritif 4 du récipient 2. En effet dans la configuration à la verticale du récipient 2, la mise en place d'un seul couvercle pour fermer hermétiquement les deux chambres 3 et 4 est suffisante. En effet, dans cette configuration, ledit couvercle amovible 6 recouvre et peut fermer hermétiquement l'intégralité de la pièce extérieure monobloc 21, de sorte à fermer hermétiquement la chambre de culture 3 et la chambre de liquide nutritif 4. La diminution du nombre des pièces permettant d'assurer l'étanchéité, permet également de réduire drastiquement les zones possibles de sortie ou d'entrée des flux au sein des chambres 3 et 4 et du récipient de culture 2. Ainsi, par rapport à l'état de la technique, la diminution du nombre de couvercle nécessaire, assurant l'étanchéité des chambres 3 et 4, permet de diminuer le risque de contamination du matériel végétal et de conserver l'étanchéité de tout le récipient de culture 2, tout en diminuant son coût de fabrication.

[0051] Selon une autre caractéristique de l'invention, le récipient 2 comporte également des moyens de transfert 5 pour le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif L, de préférence l'intégralité du liquide L, depuis ladite chambre de liquide nutritif 4 vers la chambre de culture 3. [0052] Selon un mode de réalisation préférentiel, les moyens de transfert 5 pour le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif L comporte au moins un conduit de passage des fluides raccordant la chambre de liquide nutritif 4 et de la chambre de culture 3.

[0053] Selon le second mode de réalisation visible sur la figure 1, ledit au moins un conduit de passage des fluides s'étend, d'une part, de manière verticale et, d'autre part, à l'intérieur de la chambre de liquide nutritif 4 (notamment en direction du fond de cette chambre de liquide nutritif 4 et/ou jusqu'à proximité de ce fond) ainsi qu'à l'intérieur de la chambre de culture 3, plus particulièrement à l'intérieur de la pièce intérieur 31. Ledit conduit de passage présente une extrémité positionnée à proximité du fond de la chambre de liquide nutritif 4, ladite extrémité est destinée à plonger à l'intérieur du liquide nutritif L, au moins en phase de repos.

[0054] De plus, tel que visible sur la figure 1 et la figure 2, ledit récipient 2 comporte également un couvercle amovible 6. Ledit couvercle amovible 6 permet de refermer ladite chambre de culture 3, plus spécifiquement, ledit couvercle amovible 6 permet de refermer l'intégralité de ladite pièce extérieure monobloc 21 que comporte ledit récipient 2. Ainsi, ledit couvercle amovible 6 permet de fermer hermétiquement ladite pièce extérieure monobloc 21 divisée en une première partie définissant la chambre de liquide nutritif 4 et en une seconde partie définissant ladite chambre de culture 3. En d'autres termes, ledit couvercle amovible 6 permet de fermer hermétiquement et en simultanée, à la fois ladite chambre de liquide nutritif 4 et ladite chambre de culture 3.

[0055] En outre, des moyens d'étanchéités 7, par exemple de type joint d'étanchéité, interposés entre ledit couvercle 6 et ladite chambre de culture 3 ont pour rôle d'assurer la fermeture hermétique par le couvercle de la pièce extérieure monobloc 21 qui présente, au niveau de la chambre de culture 3, une ouverture.

[0056] Selon un mode de réalisation privilégié visible sur la figure 1, le couvercle 6 est manoeuvrable en rotation sur la partie périphérique de l'ouverture de la chambre de culture 3. La chambre de culture 3 présente, en périphérie de son ouverture, des collerettes 62 définissant entre elles des ouvertures périphériques 63. Ledit couvercle 6 est muni, en périphérie, de préférence régulièrement répartis, de plusieurs ailettes d'accrochages rentrantes 61 destinées à venir se loger par un mouvement de translation verticale au travers des ouvertures périphériques 63 de la chambre de culture 3, puis par un mouvement de rotation horaire, en dessous de l'une des collerettes 62. Ainsi, dans la position verrouillée, chacune des ailettes 61 du couvercle 6 se positionne en dessous de l'une des collerette 62 correspondantes de l'ouverture de la chambre de culture 3, de sorte à écraser le joint d'étanchéité présent sur la périphérie de la chambre de culture 3 et fermer hermétiquement ladite pièce extérieure monobloc 21 que comporte ledit récipient 2. Au contraire, en position déverrouillée, chacune des ailettes 61 du couvercle 6 est dissociée de sa collerette 62 correspondante et vient se positionner au travers des ouvertures périphériques 63 de la chambre de culture 3.

[0057] Selon l'invention, ledit récipient 2 comporte encore des moyens de communication 8 au niveau de son couvercle 6. Lesdits moyens de communication 8 sont destinés à assurer une communication entre le volume interne de la chambre de culture 3, et l'extérieur du récipient de culture 2.

[0058] Selon un mode de réalisation particulier visible sur la figure 1, lesdits moyens de communication 8 consistent en au moins un conduit vertical que comporte ledit couvercle 6.

Selon un autre mode de réalisation, lesdits moyens de communication 8 consistent en deux conduits verticaux que comporte ledit couvercle amovible 6. Le premier conduit vertical permet l'aspiration du flux gazeux interne, il permet au sein du dispositif, en particulier au sein du récipient 2, un retour à la pression atmosphérique. L'aspiration du flux gazeux interne contenu dans ledit récipient 2 comportant ladite pièce extérieur monobloc 21 permet le cas échant une descente plus rapide du liquide nutritif de la chambre de culture 3 vers la chambre de liquide nutritif 4. Le second conduit vertical peut par exemple permettre l'injection d'un gaz, notamment du C02.

[0059] Selon une spécificité de l'invention, ledit dispositif de culture 1 comporte des moyens de dépression 9, par exemple tel que visible sur la figure 2. Lesdits moyens de dépression 9 ont pour rôle de diminuer la pression dans la chambre de culture 3 de sorte qu'elle devienne inférieure à la pression contenue dans la chambre de liquide nutritif 4.

[0060] Tel que visible sur la figure 2, lesdits moyens de dépression 9 comportent au moins un moyen d'aspiration 91 de gaz, permettant de diminuer la pression du volume interne de la chambre de culture 3. Ledit moyen d'aspiration 91 étant à l'origine du phénomène de dépression appliquée au sein de ladite chambre de culture 3.

[0061] De préférence, ledit moyen d'aspiration 91 est constitué par une pompe à vide.

[0062] Selon un autre mode de réalisation préféré, lesdits moyens de dépression 9 comportent, en plus, au moins une cuve tampon 92 visible sur la figure 2. Ladite cuve tampon 92 est interposée entre ledit au moins un moyen d'aspiration 91 et ledit au moins un récipient de culture 2. Plus spécifiquement, ladite cuve tampon 92 est interposée entre ladite pompe à vide et ledit au moins un récipient 2.

[0063] Tel que visible avec le dispositif 1 de la figure 2, ladite cuve tampon 92 est positionnée :

- en amont dudit récipient 2, avant son moyen de communication 8,

- en aval de ladite pompe à vide.

[0064] Ladite cuve tampon 92 permet de servir de sas de dépression, afin de ne pas appliquer directement un vide dans la chambre de culture 3 du récipient 2. La présence de la cuve tampon 92 a pour avantage de permettre la création d'un vide uniforme avant la connexion avec ledit au moins un moyen d'aspiration 91 de chacun desdits au moins un récipient 2 du dispositif 1. De plus, la présence d'une cuve tampon 92 permet de travailler avec un moyen d'aspiration 91, notamment une pompe à vide, qui présente une capacité de débit d'aspiration réduite par rapport au débit minimum nécessaire au fonctionnement du dispositif 1 ne présentant pas de cuve tampon 92. Ainsi, la présence d'une cuve tampon 92 permet de diminuer le prix global du dispositif 1 en intégrant une pompe à vide moins coûteuse à faible capacité de débit.

[0065] Selon un mode de réalisation avantageux, lesdits moyens de dépression 9 comportent, encore, au moins une vanne 93 interposée entre ledit au moins un moyen d'aspiration 91 et ladite au moins une cuve tampon 92. Par exemple, ladite vanne 93 consiste en une vanne manuelle ou encore en une électrovanne, notamment une électrovanne disposant d'un échappement permettant le retour à la pression atmosphérique.

[0066] Ladite vanne 93 permet de contrôler l'application d'un vide de pression au sein de ladite cuve tampon 92, toujours dans le but d'obtenir au sein de la cuve tampon 92 un vide.

[0067] Selon l'invention, ledit dispositif 1 comporte également des moyens de raccordement 10 pour raccorder les moyens de dépression 9 auxdits moyens de communication 8 dudit au moins un récipient de culture 2. Par exemple, lesdits moyens de raccordement 10 consistent en des tuyaux, conduits de transfert de gaz, notamment d'air.

[0068] Ainsi, au travers des moyens de raccordement 10, les moyens de dépression 9 vont permettre l'application d'un vide de pression au sein de la chambre de culture 3. En d'autres termes, le fonctionnement des moyens de dépression 9 va permettre une aspiration des gaz contenues dans la chambre de culture 3 du récipient 2. L'aspiration des gaz se fait à l'aide desdits moyens de communication 8 que comporte chaque récipient 2.

[0069] Selon un mode de réalisation particulier, ledit dispositif 1 comporte au moins une vanne 11 entre lesdits moyens de dépression et ledit au moins un récipient 2, de sorte à contrôler l'application d'un vide de pression dans la chambre de culture 3. [0070] Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits moyens de communication 8 consistent en un conduit 81 qui traverse le couvercle amovible 6. Ledit conduit 81 permet de relier l'extérieur du récipient 2, c'est-à-dire les moyens de raccordement 10 avec le volume interne de la chambre de culture 3. Lesdits moyens de communication 8, c'est-à-dire le conduit 81 permet le passage du gaz entre le volume interne de la chambre de culture 3 et l'extérieur du récipient 2. C'est au travers des moyens de communication 8 et de son conduit 81 que les gaz contenus dans la chambre de culture 3 sont aspirés par les moyens de dépression 9 en fonctionnement.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, lesdits moyens de communication 8 consistent en un embout qui équipe ledit couvercle (6). Cet embout comporte un orifice traversant qui communique avec un autre orifice qui traverse ledit couvercle (6). Ledit embout permet le passage du gaz entre le volume interne de la chambre de culture 3 et l'extérieur du récipient 2.

[0071] Selon un mode de réalisation préféré, tel que visible sur les figures 3 à 6, ledit dispositif 1 comporte au moins deux récipients de culture 2. La multiplication du nombre de récipient 2 au sein du dispositif 1 a pour avantage de permettre d'appliquer la technique de culture in vitro par immersion temporaire dans un liquide nutritif à échelle industrielle.

[0072] Par exemple, tel que visible sur la figure 3, ledit dispositif 1 comporte six récipients 2, ou encore comme visible sur la figure 5, ledit dispositif comporte 7 récipients 2.

[0073] Sur les figures 4, 6 et 7, ledit dispositif 1 comporte dix récipients 2, le premier récipient 2 étant nommé Ml, le second M2 et ainsi de suite.

[0074] Selon l'invention, quand le dispositif 1 est multi-récipient 2, chaque récipient 2 comporte des moyens de communication 8 raccordés aux moyens de raccordement 10. En d'autres termes, lesdits moyens de raccordements 10 sont configurés pour raccorder lesdits moyens de dépression 9 à chacun desdits moyens de communication 8 que comporte chacun desdits aux moins deux récipients 2.

[0075] Dans le cas des dispositif 1 multi-récipients 2, les moyens de raccordement 10 comportent, d'une part, une rampe 100 et, d'autre part, des organes de raccordement 101 tel que visible sur les figures 3 à 7.

[0076] Ladite rampe 100 est raccordée aux moyens de dépression 9.

[0077] Lesdits organes de raccordement 101 permettent de raccorder la rampe 100 avec chacun des moyens de communication 8 que comporte chaque récipient 2 du dispositif 1 multi-récipients 2. [0078] Selon un premier mode de réalisation visible sur les figures 3 et 4, ladite rampe 100 adopte une forme linéaire. Une des extrémités de la rampe 100 linéaire est raccordée aux moyens de dépression 9. Tel que visible sur la figure 4, une des extrémités de la rampe 100 linéaire est raccordée par exemple directement à un moyen d'aspiration 91 de type pompe à vide. [0079] Selon ce premier mode de réalisation visible sur les figures 3 et 4, les organes de raccordement 101 sont répartis sur une partie au moins de la longueur de la rampe 100 linéaire, de préférence sur l'intégralité de sa longueur.

[0080] Selon un mode de réalisation visible sur la figure 3, lesdits récipients 2 sont répartis de part et d'autre de la rampe 100 linéaire.

[0081] Selon un mode de réalisation visible sur la figure 4, lesdits récipients 2, dénommés Ml à M10 sont avantageusement espacés régulièrement sur l'intégralité de la longueur de la rampe 100 linéaire.

[0082] Selon un mode de réalisation préféré, lesdits récipients 2 du dispositif 1 multi récipients 2 sont espacés et répartis régulièrement sur l'intégralités de la longueur de la rampe 100 linéaire.

[0083] Selon un second mode de réalisation visible sur les figures 5 à 7, ladite rampe 100 adopte une forme de boucle, c'est-à-dire qu'elle prend n'importe quelle forme qui est une forme fermée, par exemple de type ronde, ovoïde, rectangle.

[0084] Avantageusement, lesdits organes de raccordement 101 sont répartis sur au moins une partie de la longueur de la boucle. De préférence, lesdits organes de raccordement 101 sont espacés régulièrement sur la rampe 100 en boucle. De préférence encore, lesdits organes de raccordement 101 sont réparties sur l'intégralité de la boucle.

[0085] Selon le second mode de réalisation visible sur les figures 5 et 7, avec une rampe 100 en boucle, les moyens de raccordement 10 comporte en plus au moins un conduit de raccordement 102. Ledit conduit de raccordement 102 raccorde la rampe 100 en boucle aux moyens de dépression 9.

[0086] De préférence et comme visible sur les figures 5 à 7, ledit dispositif 1 présentant une rampe 100 en boucle comporte une pluralité de conduits de raccordement 102 qui s'étendent à partir de la rampe 100 de forme de boucle et qui convergent en un point. Ce point est raccordé aux moyens de dépression 9.

[0087] Selon un mode privilégié, ledit point est au centre de la rampe 100 de forme de boucle. Ceci a pour effet d'équilibrer les débits des flux traversant les différents conduits, de sorte à synchroniser le mouvement du liquide nutritif L de chacun des récipients de culture 2 connectées entre eux à une même rampe 100. Ainsi, le fonctionnement des différents récipients 2 d'un même dispositif 1 est synchronisée et permet un usage à échelle industrielle.

[0088] Selon une autre caractéristique du dispositif 1 de l'invention, ledit au moins un récipient de culture 2 comporte un évent 12. De préférence et tel que visible sur les figures 1 et 2, l'évent 12 est, d'une part, présent sur la paroi de la chambre de liquide nutritif 4 et, d'autre part, positionné au- dessus du niveau maximum que peut atteindre le liquide nutritif L que comporte la chambre de liquide nutritif 4. L'évent 12 assure la communication entre le volume interne de la chambre de liquide nutritif 4 et l'extérieur du récipient de culture 2.

[0089] Selon un mode de réalisation privilégié et afin d'éviter une contamination du milieu végétal M, lesdits moyens de communication 8 et ledit évent 12 comprennent des moyens de stérilisation des flux, par exemple de type filtre stérilisant.

[0090] Selon un mode privilégié de réalisation de l'invention, le dispositif 1 comporte des moyens de contrôle permettant de piloter l'ouverture et la fermeture des vannes 93 et/ou 11, et de faire fonctionner ou non lesdits moyens de dépression 9, notamment le fonctionnement du moyen d'aspiration 91.

[0091] Ainsi, lesdits moyens de dépression 9 du dispositif 1 permettent d'appliquer dans la chambre de culture 3 une dépression. En effet, les moyens de dépression 9 vont aspirer le flux d'air de la chambre de culture 3, de sorte que la pression de la chambre de culture 3 soit inférieure à celle de la chambre de liquide nutritif 4. Suite à la différence de pression entre la chambre de culture 3 et la chambre de liquide nutritif 4, en respectant la mécanique des fluides, la chambre de culture 3 va chercher à rééquilibrer les pressions de son volume interne par rapport aux pressions de la chambre de liquide nutritif 4. La chambre de culture cherche à combler sa perte de volume d'air aspiré en aspirant le volume contenu dans la chambre de liquide nutritif 4. Ainsi, à la suite de ce phénomène et afin de rééquilibrer les fluides en présences, il y aura une montée du liquide nutritif L au sein de la chambre de culture 3. Ainsi, l'application d'une dépression au sein de la chambre de culture 3 permet le transfert du liquide nutritif L de la chambre de liquide nutritif 4 vers la chambre de culture 3. Dès l'arrêt de l'aspiration, il y aura un nouveau déséquilibre de pression entre la chambre de culture 3 et la chambre de liquide nutritif 4 ce qui va générer une descente du liquide nutritif L de la chambre de culture 3 vers la chambre de liquide nutritif 4.

[0092] Dans le cas, où la chambre de culture 3 et la chambre de liquide nutritif 4 sont à pression atmosphérique, le fonctionnement des moyens de dépression 9 permet d'abaisser la pression de la chambre de culture 3 en dessous de la pression atmosphérique, alors que la chambre de liquide nutritif 4 reste à pression atmosphérique. Ainsi, sous l'effet des moyens de dépression 9, le liquide nutritif L va monter dans la chambre de culture 3. Puis dès l'arrêt de l'application de la dépression au sein de la chambre de culture 3, le milieu redescend par gravité vers la chambre de liquide nutritif 4. Dans ce cas, les valeurs de pressions contenues dans la chambre de culture 3 et la chambre de liquide nutritif 4 ne dépassent jamais la valeur de la pression atmosphérique, ainsi le retour à l'équilibre des pressions entre les volumes internes des deux chambres 3 et 4 n'est pas brutal sous la forme d'une surpression. En conséquence, le couvercle amovible 6, lors du retour à l'équilibre des pressions ne subit pas de contraintes mécaniques générant des fuites de flux. Au contraire, lors du retour à l'équilibre des pressions entre les deux chambres 3 et 4, ledit couvercle amovible 6 sera juste plaqué avec moins de force contre ladite pièce extérieure monobloc 21 que comporte ledit récipient 2

[0093] Ainsi, lors de son fonctionnement, le dispositif 1 permet de réaliser une culture in vitro par immersion temporaire dans un liquide nutritif (L) qui évite, lors du transfert de liquide nutritif de la chambre de liquide nutritif 4 vers la chambre culture 3 et vice versa, la formation de fuites localisées résultant d'une déformation du volume interne du récipient sous l'effet de l'application d'une surpression dans son volume interne. Au contraire, l'application d'une dépression interne et un retour à une pression atmosphérique au sein de la chambre de culture 3 empêche le phénomène de déformation du récipient 2donc évite les fuites et la contamination du matériel végétal M. Plus précisément, l'application d'une dépression interne et un retour à une pression atmosphérique au sein de la chambre de culture 3 empêche le phénomène de déformation du couvercle amovible 2 fermant hermétiquement ladite pièce extérieure monobloc 21 que comporte ledit récipient 2. Avantageusement, l'application d'une dépression dans la chambre de culture 3 du récipient 2, par les moyens de dépression 9 du dispositif de culture 1, permet de plaquer par aspiration le couvercle amovible 6 contre la pièce extérieure monobloc 21 que comporte ledit récipient 2 avec une plus grande pression que celle existante à pression atmosphérique. L'aspiration par dépression renforce l'étanchéité du récipient 2 générée par le positionnement du couvercle amovible 6 contre la pièce monobloc 21.

[0094] La présente invention concerne également un procédé de culture in vitro (1) de matériel végétal (M) par immersion temporaire dans un liquide nutritif, au sein d'au moins un récipient de culture (2) comportant : a/ une chambre de culture (3), qui présente un volume interne, et qui est destinée à contenir le matériel végétal (M) à cultiver, b/ une chambre de liquide nutritif (4) qui est destinée à contenir le liquide nutritif (L) , c/ des moyens de transfert (5) pour le transfert temporaire d'au moins une partie du liquide nutritif (

L) depuis ladite chambre de liquide nutritif ( 4) vers la chambre de culture (3) , d/ un couvercle amovible (6) pour refermer ladite chambre de culture (3) ainsi que des moyens d'étanchéité (7) interposés entre ce couvercle (6) et cette chambre de culture (3) ; e/ des moyens de communication (8), que comporte le couvercle amovible (6), et qui sont destinés à assurer une communication entre le volume interne de la chambre de culture (3)et l'extérieur du récipient de culture (2) , dans lequel :

- on cultive ledit matériel végétal M au sein de ladite chambre de culture (3),

- on transfère, de manière temporaire, lors de la phase active d'immersion, ledit liquide nutritif (L) de la chambre de liquide nutritif (4) vers la chambre de culture (3) en générant une différence de pression entre lesdites chambres (3) et (4), caractérisé en ce que : - on aspire les gaz contenus dans ladite chambre de culture (3) jusqu'à ce que la pression de ladite chambre de culture (3) soit inférieure à la pression de ladite chambre de liquide nutritif (4) de sorte à générer ladite différence de pression, entre ladite chambre de culture (3) et ladite chambre de liquide nutritif (4) par dépression de ladite chambre de culture (3).

[0095] L'étape d'aspiration de gaz pour créer une dépression dans ladite chambre de culture 3 a pour avantage d'accentuer la pression et l'appui que peut avoir le couvercle sur ladite chambre et donc de renforcer l'étanchéité du récipient 2. Les contraintes de fuites ou de limite de surpression n'existe plus avec Le procédé de culture in vitro par immersion temporaire de l'invention.

[0096] Avantageusement, ledit procédé de l'invention est mis en oeuvre à l'aide du dispositif 1 de l'invention.

[0097] Ainsi, la présente invention a pour avantage de s'affranchir des contraintes de limitation de surpression applicable, de fuites et de contamination des végétaux retrouvées avec le récipient de culture in vitro de matériel végétal par immersion temporaire dans un milieu nutritif divulgué dans le document WO2012/146872.