Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung statischer und dynamischer Streulichtmessungen in kleinen Volumina

Anmelderin: Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.

Technisches Anwendungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, ein Messsystem sowie ein Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, insbesondere statischer und dynamischer Streulichtmessungen. Bevorzugte Anwendungsgebiete sind solche, bei denen die Durchführung einer großen Zahl von Messungen in automatisierten Abläufen erforderlich ist, etwa bei der Untersuchung von Kristallisationsvorgängen im Rahmen der Züchtung von Proteinkristallen.

Stand der Technik

Streulichtmessungen, insbesondere Laser-Streulichtmessungen, werden bereits in etlichen Anwendungsgebieten eingesetzt, beispielsweise für die Charakterisierung von Kolloiden. In der Nahrungsmittelindustrie, für kosmetische Produkte oder aber auch für Polymere oder Klebstoffe spielen die Größenverteilung und Stabilität kolloidaler Partikel eine wichtige Rolle.

Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Aufklärung der Strukturen komplexer Proteine und anderer Biomoleküle, welche für die zielgerichtete Entwicklung neuer

Medikamente sowie die Untersuchung der biochemischen Funktion dieser

Moleküle von großer Wichtigkeit ist. Die auf Röntgenbeugungsexperimenten basierende Strukturaufklärung ist auf qualitativ hochwertige Einkristalle mit beugenden Eigenschaften angewiesen, die in der Regel aus Lösungen gezüchtet werden. Der entscheidende Schritt für die Züchtung von Proteineinkristallen besteht im Wesentlichen darin, für die Kristallisation geeignete

Lösungsbedingungen zu finden. Durch die Variation von Lösungsparametem wie

pH-Wert, Proteinkonzentration, die Zusammensetzung und Konzentration von Salzen und Fällungsreagenzien, Temperatur etc. werden die Wechselwirkungen zwischen den gelösten Proteinmolekülen variiert und es können attraktive oder repulsive Wechselwirkungen eingestellt werden. Die Untersuchung der Kristallisation von Proteinen wird bisher in der Regel empirisch durchgeführt und stellt einen Engpass in der Strukturaufklärung der Proteine dar.

Laser-Streulichtmessungen erlauben eine direkte Messung der in einer Kristallisationslösung vorherrschenden Wechselwirkung zwischen gelösten Proteinen und können daher für das gezielte Auffinden von für die Kristallisation optimalen Lösungsparametern eingesetzt werden. Der so genannte osmotische Virialkoeffizient ist eine thermodynamische Größe, die das reale Wechselwirkungsverhalten gelöster Teilchen als Abweichung vom Verhalten einer idealen Lösung beschreibt. Osmotische Virialkoeffizienten können mit Hilfe von statischen Streulichtmessungen ermittelt werden. Für das Messverfahren ist die Detektion der absoluten Streulichtintensität in verschiedenen Lösungen mit unterschiedlichen Teilchenkonzentrationen notwendig. Von Grenzflächen reflektiertes Licht kann die Messung dabei sehr leicht stören. Es ist bereits bekannt, dass der osmotische Virialkoeffizient für die Kristallisation von Proteinen von besonderer Bedeutung ist. Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Kristallisation ist in einem „Kristallisationsfenster" genannten Wertebereich des osmotischen Virialkoeffizienten besonders hoch und außerhalb dieses Kristallisationsfensters besonders niedrig.

Mit Hilfe von dynamischen Streulichtverfahren können Informationen über das Diffusionsverhalten gelöster Teilchen und damit die Teilchengröße erhalten werden. Diese Größen ändern sich durch einen Aggregationsvorgang empfindlich. Der der Kristallisation vorausgehende Vorgang der Keimbildung kann so erkannt werden.

Besonders für statische Streulichtmessungen ist es von zentraler Bedeutung, eine optimale Unterdrückung von unerwünschten Strahlungsanteilen zu erreichen.

Diese werden vor allem durch Reflexionen an Grenzflächen verursacht. Je näher

die Grenzflächen an dem Messvolumen liegen, desto schwieriger wird die effektive Unterdrückung.

Es ist bereits bekannt, Laserstreulichtverfahren zur Charakterisierung von Makromolekülen einzusetzen. Es stehen verschiedene Geräte zur Ermittlung von osmotischen Virialkoeffizienten oder von Molekulargewichten mittels statischer Lichtstreuung und auch zur Ermittlung hydrodynamischer Radienverteilungen mittels dynamischer Lichtstreuung zur Verfügung. Die heute verwendeten Geräte zur Durchführung von Streulichtmessungen arbeiten in der Regel mit Glasküvetten, in die Probenlösungen eingefüllt werden müssen. Meist wird dabei ein Laserstrahl in die Küvette hineinfokussiert, das von den untersuchten Teilchen gestreute Licht wird unter einem definierten Winkel relativ zur Einstrahlrichtung (z.B. 90°) detektiert. Es gibt auch Systeme, die es ermöglichen, den Detektionswinkel zu ändern oder simultan mit mehreren Detektoren unter verschiedenen Winkeln Streulicht zu sammeln, wie etwa in der EP 0867711 A2 beschrieben. Typischerweise werden für solche Systeme runde Küvetten eingesetzt, die zur weiteren Vermeidung von Reflexionsanteilen im Streulicht in einem Index-matching Bad (ein mit einer an den Brechungsindex angepassten Flüssigkeit gefülltes Gefäß) positioniert sind. Durch den geringen Unterschied im Brechungsindex zwischen der Badflüssigkeit und der Küvettenwand entsteht beim übergang des Laserstrahls in die Küvette nur ein vergleichsweise geringer Anteil an reflektierter Strahlung.

Allerdings lassen sich mit den bekannten auf Küvetten basierenden Geräten keine automatisierten Hochdurchsatz-Streulichtmessungen durchführen, da eine in der Regel manuelle Befüllung der Küvetten notwendig ist. Die eingesetzten Küvetten bestehen im Falle von Präzisionsmessungen aus poliertem Glas und sind teuer. Zur ökonomischen Nutzung müssen sie vielfach wiederverwendet und daher aufwendig gereinigt werden. Die hohen Anforderungen des Messverfahrens - problematisch ist etwa, dass Oberflächenverunreinigungen auf dem Glas sowie Partikel in der Lösung die Streulichtintensität verfälschen - machen auch diesen Schritt aufwendig und schlecht automatisierbar. Das Problem der Reinigung kann nicht durch den Einsatz von Einwegküvetten, etwa aus Plastik, gelöst werden, da dies aufgrund der schlechteren optischen Eigenschaften gerade für die statischen Streulichtmessungen, bei denen absolute Lichtintensitäten mit hoher Präzision

bestimmt werden müssen, durch das vom Plastik erzeugte Streulicht zu Verfälschungen führt. Insgesamt ist die Handhabung der Küvetten (Positionierung im Index-matching Bad, Reinigung, Wiederbefüllung) daher aufwendig und zeitraubend.

Die Volumina typischer Küvetten für Streulichtmessungen liegen in der Größenordnung von mindestens 5 -10 Mikrolitern, oft sogar noch wesentlich höher. Zwar wäre die Herstellung von Küvetten mit noch kleineren Volumina technisch grundsätzlich möglich, Streulichtküvetten mit Nanolitervolumina wurden bisher jedoch nicht verwendet und werden derzeit nicht angeboten. Die für die manuelle Durchführung von Einzelmessungen notwendige Handhabung der Lösungen (manuelles Pipettieren, Ansetzen der Lösungen, Einfüllen der Lösung in die Küvette etc.) erfordert ein Mindestvolumen, das typischerweise im Mikrolitermaßstab liegt. Eine starke Verkleinerung der Küvettenvolumina scheint für Einzelmessungen auch nicht erforderlich zu sein, hinzu kommt, dass die Anregungs- und Detektionsoptiken der kommerziellen Streulichtgeräte nicht auf extrem kleine Küvettenvolumina optimiert sind.

Im Falle von Reihenuntersuchungen mit hunderten oder tausenden von Messungen für die automatisierte Kristallisation von Proteinen ist jedoch eine weitere Minimierung des Probenvolumens und damit des Proteinverbrauches notwendig, da die Proteine oft aufwändig gewonnen werden müssen und nur in kleinen Mengen verfügbar sind. Auch der große Probenverbrauch verhindert bei den bekannten Streulichtmesssystemen somit systematische Untersuchungen zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen auf der Basis statischer Streulichtmessungen.

Proteinlösungen werden im Rahmen von Kristallisationsexperimenten oft in Form kleiner Tröpfchen, die entweder unter einem Glasplättchen hängen (sog. „hanging drop") oder auf dem Boden eines Probenträger sitzen („sitting drop") appliziert. Die durch die Tropfenform verursachten gekrümmten Grenzflächen verursachen bei Durchstrahlung mit einem Laserstrahl schwer kontrollierbare Reflexionen, weshalb statische Streulichtmessungen an Tropfen bislang nicht durchgeführt worden sind bzw. unmöglich erschienen.

Von der Wyatt Technology Corporation wird ein Streulichtmessgerät für den Einsatz in Mikrotiterplatten angeboten, mit dem jedoch nur dynamische Messungen und keine statischen Messungen möglich sind. Für die Aufnahme von dynamischen Streulichtmessungen werden Signalfluktuationen, die auf Teilchenbewegungen zurückzuführen sind, ausgewertet. Ein zeitlich konstanter Signaluntergrund, der auf Reflexe zurückzuführen ist, stört die dynamische Streulichtmessung nicht oder nur wenig. Statische Messungen hingegen basieren auf der Aufnahme von absoluten Streulichtintensitäten, hier verhindert die Beeinflussung der Streusignale durch Reflexionen die Messung. Das Gerät der Wyatt Technology Corporation ist jedoch nicht in der Lage, störende Reflexionen so stark zu unterdrücken, wie es für die Durchführung statischer Streulichtmessungen notwendig wäre.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, insbesondere auch absoluten Streulichtmessungen, bereitzustellen, womit eine besonders effektive Unterdrückung unerwünschter Strahlungsanteile erzielt wird, womit außerdem eine systematische und besonders weitgehend automatisierte und damit auch schnelle Untersuchung einer Vielzahl von Proben möglich ist, und wobei insbesondere auch Proben mit sehr kleinem Volumen untersucht bzw. verwendet werden können.

Darstellung der Erfindung

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch eine Vorrichtung, ein Messsystem, sowie ein Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen werden durch die abhängigen Ansprüche angegeben oder lassen sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ausführungsbeispielen entnehmen.

Die vorliegende Vorrichtung zur Durchführung von Streulichtmessungen weist mindestens ein Fokussierungselement auf, mit dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert werden kann, einen Detektor, sowie eine

Detektionsoptik, mit der von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung zu dem Detektor geleitet werden kann. Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass sich das technische Problem dadurch lösen lässt, dass bei der Vorrichtung zusätzlich ein Mittel zur Bildung eines Ringstrahls vorhanden ist, dass durch das mindestens eine Fokussierungselement eine Fokussierung des Ringstrahls auf einen Fokuspunkt innerhalb der Probe bewirkbar ist und dass durch die Detektionsoptik von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung erfassbar ist, welche sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitet.

Durch diese Merkmale wird ein konfokal-optisches System realisiert, mit dem statische oder dynamische Streulichtmessungen in einer Rückstreugeometrie ermöglicht werden. Das heißt, die Detektion der Streustrahlung erfolgt also näherungsweise in der gleichen Richtung, aus der der Anregungslaser (bzw. die zur Anregung verwendete Lichtquelle) eingestrahlt wird (Rückstreurichtung). Dies erleichtert insbesondere eine besonders kompakte Konstruktion der Vorrichtung und macht die Vorrichtung besonders flexibel in Bezug auf den verwendeten Probenträger. Insbesondere bietet dies die Möglichkeit, Streulichtmessungen in Messgeometrien mit nur einem optischen Zugang durchzuführen. Beispielsweise ist es möglich, Proben bzw. Probentropfen in Mikrotiterplatten mit Glasböden zu untersuchen. Damit kann erreicht werden, eine Vielzahl von Messungen mit einem einzigen Probenträger (z.B. Mikrotiterplatte) durchzuführen. Die Verwendung von Mikrotiterplatten vereinfacht den Einsatz von Pipettierrobotem zur automatischen Befüllung einzelner Probenpositionen. Dadurch lässt sich eine umfassende Automatisierung von Probenpräparation und Streulichtmessung erreichen. Dies bietet erhebliche ökonomische Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen, insbesondere auch, weil die Verwendung des Probenträgers als Einwegartikel aufgrund der großen Anzahl der mit einem Probenträger durchführbaren Messungen wirtschaftlich ist und somit eine komplizierte Reinigung, wie sie aus dem Stand der Technik für Küvetten bekannt ist, entfallen kann.

Dadurch, dass mit der Vorrichtung die Bildung eines Ringstrahls und eine Fokussierung dieses Ringstrahls möglich ist, lässt sich zudem zum einen eine vergleichsweise starke Fokussierung, und damit eine Minimierung des Messvolumens erreichen. Auf diese Weise ist es möglich, Messungen auch an

Proben mit besonders kleinen Volumina (unter 1 μl, bzw. in der Größenordnung von (wenigen) 100 nl) durchzuführen. Zusätzlich ist durch die vergleichsweise kleine Größe des Fokusvolumens des anregenden Strahls bei gegebener Gesamtleistung die Intensität der Bestrahlung besonders hoch. Somit ist pro Volumenelement eine besonders hohe Streustrahlung erzeugbar.

Zum anderen ist, indem Streustrahlung, insbesondere ausschließlich Streustrahlung, erfassbar ist, welche sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitet, gleichzeitig gewährleistet, dass eine vergleichsweise starke Unterdrückung von unerwünschter, von Grenzflächen der Probe bzw. des Probenträgers reflektierter Strahlung erfolgen kann. Die anregende Strahlung kann erfindungsgemäß unter einem sehr flachen Winkel in die Probe gestrahlt werden. Direkte Reflexionen an den Grenzflächen Luft- Probenträger und Probenträger-Probenflüssigkeit werden so auch unter einem sehr flachen Winkel zurückreflektiert. Die sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitende Streustrahlung verlässt das Detektionsvolumen dagegen unter einem spitzeren Winkel. Der Winkelunterschied zwischen anregendem Licht und Streustrahlung führt somit zu einer starken Unterdrückung der Reflexionen.

Der Ringstrahl wird aus einem kollimierten Strahl mit gaussförmigen Strahlprofil erzeugt, als Strahlquelle wird vorzugsweise ein Laser, insbesondere ein kontinuierlich betriebener Halbleiter-, Festkörper- oder Gaslaser verwendet. Die Formung des Ringstrahls lässt sich durch eine Strahlaufweitung in Verbindung mit einer Ringblende erreichen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sieht jedoch zur Formung des Ringstrahls eine Strahlformungsoptik vor, welche zwei auf der optischen Achse positionierte und mit ihren Spitzen zueinander weisende Axicone (Glaskegel) umfasst. Diese werden eingangsseitig vom Laserstrahl mittig beleuchtet. Eine derartige Anordnung weist besonders hohe Transmissionswerte auf, so dass die Verluste durch die Formung eines Ringstrahls vergleichsweise gering sind.

Das Fokussierelement ist vorzugsweise reflektierend und ringförmig ausgebildet. Dies ermöglicht eine vorteilhafte Anordnung der Detektionsoptik.

Vorzüge hat es, wenn das Fokussierelement derart ausgebildet ist, dass in der Probe ein annähernd radialsymmetrisch ausgebildeter (und möglichst kleiner) Fokus erzeugbar ist, da auf diese Weise eine besonders hohe Intensität pro Volumenelement erzielbar ist. Da durch die konfokale Detektion nur Signale aus der überlappungsregion aus Anregungs- und Detektionsfokus aufgenommen werden, sollten beide Foki die gleiche Größenordnung aufweisen. Naturgemäß kann ein Mikroskopobjektiv mit voll gefüllter Apertur einen kleineren Fokus erzeugen als ein Ringstrahl, daher wird der Anregungsfokus in der Regel größer als der Detektionsfokus sein. Aus diesem Grunde gewinnt man an Signalintensität, indem man einen möglichst kleinen Anregungsfokus erzeugt und eine möglichst hohe flächenbezogene Anregungsintensität bereitstellt, da nur der innere Teil des Fokus (aus dem überlappungsbereich) zum Signal beiträgt. Als Fokussierelement kann beispielsweise ein (ringförmiger) Parabolspiegel verwendet werden. Mit einem solchen ist es prinzipiell möglich, einen annähernd radialsymmetrisch ausgebildeten Fokus zu erzeugen. Zu beachten sind jedoch die von der Strahlung zwischen Fokussierelement und Probe zu durchlaufenden Grenzschichten, so dass ein optimales Fokussierelement gegenüber einem Parabolspiegel leicht in seiner Form modifiziert ist und dadurch den Effekt der Brechung am Glasboden bzw. beim Eintreten in die Probe korrigiert.

Das Fokussierelement sollte so ausgelegt sein, dass ein Fokusdurchmesser kleiner als 30 μm, vorzugsweise kleiner als 20 μm, erzeugt werden kann (wobei der Fokusdurchmesser so definiert sein soll, dass an seinen Grenzen die Laserintensität auf den 1/e-Teil der maximalen Intensität im Fokusmittelpunkt gesunken ist). Durch die geringe Größe des Fokusdurchmessers ist es möglich, auch extrem kleine Proben von unter 1 μl zu untersuchen und darüber hinaus steht dadurch eine besonders hohe Streustrahlung pro Volumenelement und damit insgesamt eine hohe Signalstärke zur Verfügung. Der starke Fokussierungsgrad erlaubt Messungen mit sehr geringem Abstand zu Grenzflächen.

Vorzugsweise ist die Detektionsoptik innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes angeordnet, insbesondere ist die Detektionsoptik zentrisch innerhalb dieses Raumes, bzw. im Zentrum der durch Ringstrahl bzw. Fokussierelement vorgegebenen optischen Achse angeordnet. Der Fokus der Detektionsoptik fällt

dabei mit dem Fokus der Anregungsoptik zusammen. Durch eine derartige Anordnung ist die Detektionsoptik in der Lage, einen möglichst großen Anteil der erzeugten Streustrahlung einzufangen und ohne große Verluste dem Detektor zuzuführen. Für die Sammlung der Streustrahlung kann ein Mikroskopobjektiv mit einer numerischen Apertur von mindestens 0.6, vorzugsweise mindestens 0.7 eingesetzt werden.

Für die Mehrzahl der für die Kristallisation interessanten Proteine gilt, dass die Moleküle wesentlich kleiner sind (typischerweise wenige nm) als die Wellenlänge des eingesetzten Laserlichtes (mehrere 100 nm). Daher ist die Streuintensität in erster Näherung unabhängig vom betrachteten Winkel und eine Sammlung der Streustrahlung über viele Winkel ist möglich und liefert prinzipiell daher keine anderen Ergebnisse als Experimente, in denen Streulicht nur unter einem Winkel gesammelt wird. Eine Detektionsoptik mit großer numerischer Apertur hat somit Vorteile, da eine größere Signalstärke erreichbar ist.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Detektionsoptik derart ausgebildet, dass sie das von der Probe ausgehende Streulicht sammelt und wiederum zu einem kollimierten Strahl formt. Dieser kollimierte Strahl wird dann mit einem weiteren optischen Element, beispielsweise einer Linse, auf eine kleine Eintrittsapertur des Detektionssystems, beispielsweise auf den Kern einer Lichtleiterfaser, vorzugsweise einer Single mode Faser, fokussiert. Das System ist dabei so ausgelegt, dass nur solche Strahlung einen kollimierten Strahl bildet und in der Ebene der kleinen Eintrittsapertur des Detektionssystems, also z.B. der Faserfrontfläche fokussiert wird, welche aus einem begrenzten Bereich innerhalb einer vorgegebenen Detektionsebene stammt. Die Detektionsebene entspricht der Fokusebene der Detektionsoptik bei umgekehrter Richtung des Strahlenganges. Der begrenzte Bereich hat eine Ausdehnung von weniger als 10 μm, vorzugsweise ca. 5 μm, insbesondere in der zur Detektionsachse senkrechten Richtung. Er liegt vollständig innerhalb des Fokus der anregenden Strahlung. Streustrahlung aus anderen Ebenen als der vorgegebenen Detektionsebene wird durch die Fokussieroptik vor oder hinter die Ebene der Faserfrontfläche fokussiert und kann daher nur zu einem sehr kleinen Anteil in die Faser eintreten. Damit das Verfahren funktioniert müssen die Foki von Anregungsoptik (Parabolspiegel) und

Detektionsoptik (Mikroskopobjektiv) möglichst gut in allen drei Raumrichtungen übereinander liegen.

Durch dieses Messprinzip erhält man eine weitgehende Unterdrückung unerwünschter Reflexionsanteile. Auf diese Weise werden sowohl gerichtete Reflexionen als auch diffus gestreute Strahlung, die beispielsweise an Kratzern und Fehlstellen im Glasboden des Probenträgers entsteht, wirksam unterdrückt.

Die Detektionsoptik kann etwa durch ein mehrlinsiges Mikroskopobjektiv mit angepasster numerischer Apertur gebildet sein bzw. ein solches umfassen. Hierbei muss der Sammelwinkel des Objektivs an den Winkel, unter dem beleuchtet wird, angepasst sein. Indem die Apertur des Mikroskopobjektivs möglichst groß, jedoch etwas kleiner als die innere Grenzapertur der Beleuchtung gewählt wird, stellt man sicher, dass einerseits ein möglichst hoher Signalanteil des Streulichtes erfasst wird, und dabei andererseits keine direkten Reflexionen von der Glasfläche in den Detektionsstrahlengang eintreten können.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Messsystem zur Durchführung von Streulichtmessungen mit einer Vorrichtung, welche mindestens ein Fokussierungselement, mit dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert werden kann, einen Detektor, sowie eine Detektionsoptik aufweist, mit der von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung zu dem Detektor geleitet werden kann. Darüber hinaus umfasst das Messsystem einen flächigen Probenträger, der so ausgebildet ist, dass eine aus einem einzelnen Tropfen bestehenden Probe mit ihm eine Grenzfläche ausbilden kann. Außerdem sind das mindestens eine Fokussierungselement und die Detektionsoptik so angeordnet, dass der Strahlengang der die Probe beaufschlagenden elektromagnetischen Strahlung und der von der Detektionsoptik erfassten Streustrahlung die Grenzfläche durchkreuzt.

Das Messsystem umfasst somit neben einer Vorrichtung, mit der elektromagnetische Strahlung abgegeben und Streustrahlung erfasst werden kann, einen flächigen Probenträger. Dieser kann im einfachsten Fall eine ebene Platte sein. Er muss in den für Proben vorgesehenen Bereichen zumindest im

wesentlichen transparent für die verwendete elektromagnetische Strahlung sein. Vorzugsweise besteht er aus Glas.

Anregung und Detektion erfolgt durch den flächigen Probenträger und die Grenzfläche, die die Probe mit dem flächigen Probenträger ausbildet. Der Strahlengang kreuzt somit nur ebene Grenzflächen und ist daher relativ leicht in Bezug auf unerwünschte Reflexionen kontrollierbar.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform definiert die Detektionsoptik eine optische Achse (z). Diese ist (zumindest im wesentlichen) senkrecht zu dem Probenträger (xy-Ebene) und bildet die Mittelachse für den Ringstrahl bzw. das Fokussierungselement. Die Detektionsoptik ist in der Lage, die ausgehend von dem Detektionsvolumen in Richtung der z-Achse sowie unter einem Winkel zur z- Achse (halber öffnungswinkel) von bis zu 48°, vorzugsweise von bis zu 44°, von der Probe abgestrahlte Streustrahlung zu erfassen. Ein halber öffnungswinkel von 44° führt zu einer numerischen Apertur von 0.7. Die vom Fokussierungselement in Richtung des Fokus geführte anregende Strahlung bildet mit der z-Achse einen Winkel zwischen 51 ° und 59°. Die anregende Strahlung kreuzt den Probenträger und die Grenzflächen somit unter einem flacheren Winkel als die von der Detektionsoptik erfasste, aus dem Detektionsvolumen stammende Streustrahlung.

Das Fokussierelement fokussiert den anregenden Ringstrahl unter einer oberen numerischen Grenzapertur von mindestens 0.84 (entspricht 57.1 °), vorzugweise 0.86 (entspricht 59.3°), bzw. unteren numerischen Grenzapertur von höchstens 0.82 (entspricht 55.1 °), vorzugweise 0.78 (entspricht 51.2°), auf die Probe. Dadurch wird ein ausreichender Winkelabstand zur Detektionsoptik sichergestellt.

Bei dem Probenträger handelt es sich vorzugsweise um eine Mikrotiterplatte, d.h. ein Standardbauteil mit einer Vielzahl voneinander isolierter Messfelder in Reihen und Spalten.

Mit dem erfindungsgemäßen Messsystem ist es möglich, eine große Zahl von Proben jeweils als einzelnen Tropfen auf einen einzigen flächigen Probenträger zu applizieren und damit eine Vielzahl von Messungen in kurzer Zeit und automatisiert durchzuführen.

Besondere Vorteile hat das Messsystem, wenn es zusätzlich eine automatisierte, bilddatengestützte Positioniereinheit aufweist, mit der der beugungsbegrenzte Laserfokus näherungsweise im Zentrum des geringen, vorzugsweise unter 1 μl großen Volumens der zu untersuchenden Proteinlösungen positionierbar ist. Dies erlaubt einen schnellen Wechsel von Probe zu Probe unter reproduzierbaren Messbedingungen und damit die Verwendung des Laserstreulichtverfahren in Form eines Hochdurchsatzverfahren zur systematisierten Proteinkristallisation.

Als Positioniereinheit kommt beispielsweise ein System mehrerer Präzisionsverschiebetische mit Spindelantrieb und mikroprozessorgesteuerten Schrittmotoren in Frage. Alternativ eignen sich auch piezogetriebene Tische. Die Positioniergenauigkeit sollte deutlich kleiner als die Dimension der Probentröpfchen sein, bewährt hat sich eine Positioniergenauigkeit von wenigen Mikrometern.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, bei dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert und von der Probe gestreute Strahlung detektiert wird, wobei die Probe als Tropfen vorliegt, welcher eine Grenzfläche zu einem flächigen Probenträger aufweist, und wobei die Beaufschlagung mit der elektromagnetischen Strahlung sowie die Detektion der Streustrahlung durch den flächigen Probenträger und die Grenzfläche hindurch erfolgt. Für das Verfahren bietet sich die Verwendung der vorab beschriebenen Vorrichtung bzw. des Messsystems an.

Die Probe liegt als einzelner, in Verbindung mit dem Probenträger gebrachter Tropfen vor. Das bedeutet, die Probe bildet eine in sich geschlossene Phasengrenzfläche, wobei ein Teil ihrer Oberfläche eine Grenzfläche mit dem Probenträger, der übrige Teil eine flüssig/gasförmige Phasengrenzfläche mit der gasförmigen Umgebung (Luft) ausbildet, wobei ein stabiler Zustand vorliegt. Die Form des Trofens wird dabei in bekannter Weise durch die Kohäsionskräfte innerhalb des Tropfens und die Adhäsionskräfte gegenüber der Oberfläche des Probenträgers bestimmt.

Vorzugsweise wird die Probe, d.h. das kleine wässrige Flüssigkeitströpfchen, in dem die zu untersuchenden Proteine gelöst sind, unter einer Schicht einer nicht

mit der Probe mischbaren Flüssigkeit, vorzugsweise einer öl- oder Paraffinschicht direkt auf den Glasbodens des flächigen Elements pipettiert. Der Tropfen verdrängt dabei das Paraffin bzw. das öl vom Glasboden und sitzt halbkugelförmig direkt auf dem Boden auf. Dies ist auch für kleinste Probenvolumina, etwa Volumen unter einem μl bzw. sogar für 100 nl realisierbar und automatisiert mit nadelbasierten Pipettierrobotem durchführbar. Durch die öl- oder Paraffinschicht sind die kleinen Flüssigkeitsmengen vor dem Eintrocknen geschützt. Weiterer Vorteil ist, dass der Probenträger darüber hinaus selbst für eine große Zahl von Tropfen einfach gefertigt sein kann. Er kann beispielsweise auch lediglich wenige größere separate Zellen aufweisen, da nicht jeder Einzeltropfen in ein eigenes Kompartiment des Probenträgers gegeben werden muss. Das den Tropfen umgebende öl oder Paraffin ersetzt gewissermaßen die Wände eines eigenen Probenkompartimentes und verhindert eine Vermischung der einzelnen Tropfen.

Die Pobe wird, insbesondere im Fall von Proteinlösungen im Rahmen von Kristallisationsexperimenten, häufig in Form kleiner Tröpfchen appliziert; diese können entweder auf dem Boden eines Probenträgers sitzen (sog. "sitting drop") oder aber unter dem Probenträger bzw. Glasplättchen hängen (sog. "hanging drop"). Die Erfindung bietet auch für eine derartige unkonventionelle Geometrie der Probe die Möglichkeit, Streulichtmessungen durchzuführen. Aufgrund der wirksamen Unterdrückung von unerwünschten Störungen können dabei auch die gekrümmten und nahe des Fokus befindlichen Grenzflächen der Tröpfchen toleriert werden.

Um eine weitere Reduktion unerwünschter Strahlung (Reflexionen an Grenzflächen u.a.) im detektierten Signal zu erreichen, weist gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung die auf die Probe fokussierte elektromagnetische Strahlung mehrere Strahlungsanteile unterschiedlicher Wellenlänge auf, insbesondere können dafür zwei verschiedenen Licht- bzw. Laserquellen gewählt werden. Außerdem werden unterschiedliche spektrale Anteile der Streustrahlung getrennt voneinander detektiert. Dies ermöglicht die Messung einer Differenzintensität. Damit diese Maßnahme eine hinreichende Steigerung der Genauigkeit bewirkt, sollte die elektromagnetische Strahlung

vorzugsweise zumindest zwei unterschiedliche Strahlungsanteile enthalten, deren Wellenlängen sich zumindest um 50 nm, vorzugsweise sogar um mindestens 120 nm unterscheiden.

Die Reflexion von Strahlung an einer Grenzfläche lässt sich mit Hilfe der Fresnelschen Gleichungen beschreiben. So berechnet sich der Reflexionsgrad einer Grenzfläche zwischen zwei Materialien mit den Brechungsindizes n und n' wie folgt:

R _ = -I±« An - n) I B (»' + »)

mit: R = Reflektivität, / _R = reflektierte Intensität (Einfall senkrecht zur Oberfläche), /E = eingestrahlte Intensität, n und n' Brechungsindizes der angrenzenden Materialien.

Für den übergang eines Laserstrahles von Luft (n = 1) in ein typisches Glas (n' = 1 ,5) ergibt sich so ein Reflexionsgrad von ca. 4%. Die Wellenlänge hat im Falle kleiner Verschiebungen nur einen sehr geringen Einfluss auf den Reflexionsgrad. Gleichzeitig geht die Wellenlänge jedoch mit der vierten Potenz in die Streuintensität kleiner Partikel ein, so dass sich kleine Wellenlängenunterschiede bereits deutlich in unterschiedlichen Streuintensitäten bemerkbar machen. Wird nun nicht die absolute Streuintensität bei einer Wellenlänge sondern die Differenz der Streuintensitäten bei zwei verschiedenen Wellenlängen als Grundlage für ein Streulichtexperiment verwendet, so erhält man eine Messgröße, die relativ unempfindlich gegenüber Verfälschungen des Messsignals durch Reflexionsanteile ist. Wenn bei aufeinander folgenden Messungen an derselben Probe verschieden große Anteile an reflektiertem Licht in die Detektionsoptik eintreten, werden die Messergebnisse in einem Experiment mit nur einer Wellenlänge stark verfälscht. In einem Experiment mit zwei Wellenlängen würden die Intensitäten beider Wellenlängen in gleicher weise verändert, die Differenz der beiden Intensitäten würde jedoch nur schwach gestört. Daher bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, selbst bei Anwesenheit von unerwünschten Reflexionen Streulichtmessungen mit hoher Genauigkeit durchzuführen.

Für die Ausführungsform mit zwei Strahlquellen, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem optischen Mittel zu erweitern, welches es ermöglicht, die Strahlen der beiden Strahlquellen zu überlagern, etwa mit einem dichroitischen Spiegel, der die Wellenlänge des einen Strahls reflektiert und die des anderen Strahls passieren lässt. Andere gleichwirkende optische Mittel sind denkbar. Diese überlagerung der beiden Strahlungsanteile kann besonders einfach der Strahlformungsoptik im Strahlengang vorgelagert erfolgen. Des weiteren ist zumindest ein weiteres optisches Mittel nötig, um die Strahlungsanteile im Detektionsstrahlengang voneinander zu trennen bzw. auf unterschiedliche Detektoren zu leiten, auch hierfür kann beispielsweise ein dichroitischer Spiegel eingesetzt werden.

Zu Beginn einer Messung wird die Leistung der beiden Laserstrahlquellen so einjustiert, dass bei Vermessung einer Standardprobe ohne Streupartikel, beispielsweise einer Blindlösung, die lediglich aus Lösungsmittel, Puffer etc. besteht aber keine Proteine enthält, die an beiden Detektoren registrierte Signalstärke identisch ist. Wird nun die Standardprobe bzw. Blindlösung durch eine "echte Probe", d.h. z.B. eine Lösung mit Proteinen als streuenden Partikeln ersetzt, so steigt die Signalstärke für den Detektionskanal mit kürzerer Wellenlänge stärker an als für den Detektionskanal mit längerer Wellenlänge. Die Differenz stellt ein der Streuintensität proportionales Messsignal dar, das nur sehr wenig von Reflexionseffekten verfälscht ist.

Möglich ist auch eine Ausführungsform der Erfindung mit mehr als zwei Lasern verschiedener Wellenlänge. Hierfür müssen lediglich Ein- und Auskopplungsoptiken sowie Detektoren für die weiteren Laser ergänzt werden. über verschiedene dichroitische Spiegel werden die einzelnen Wellenlängen überlagert und wieder getrennt. Um unterschiedliche Laserintensitäten und spektrale Empfindlichkeiten der Detektoren auszugleichen, muss wiederum zunächst eine Intensitätsmessung mit einer Probe ohne Streupartikel (z.B. ohne Proteine) durchgeführt werden. Alle weiteren Messungen mit den zu untersuchenden Substanzen werden auf diese Referenzmessung bezogen, durch Division wird eine relative Streuintensität erhalten. Wird ein lineares Detektorverhalten vorausgesetzt, ergibt sich für die verschiedenen Detektoren

eine Folge von relativen Streuintensitäten, die proportional zu v ⁴ (mit v = Frequenz der anregenden Laserstrahlung) ansteigen. Die Proportionalitätskonstante ist ein Maß für den Streuquerschnitt der untersuchten Probe und ist nur wenig von Reflexionsanteilen verfälscht.

Denkbar ist auch eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das anregende Licht eine kontinuierliche spektrale Verteilung aufweist. In diesem Fall wird als Detektor vorzugsweise ein Spektrometer eingesetzt. Vorausgesetzt, die Probe zeigt in dem betrachteten Wellenlängenbereich keine Absorption, kann - nach Referenzierung auf eine Messung an einer Probe ohne Streupartikel - ein relativer Intensitätsverlauf, der proportional zu v ⁴ ansteigt, erwartet werden. Das Streuspektrum einer Probe mit streuenden Partikeln wird durch das Streuspektrum einer Probe ohne streuende Partikel (z.B. ohne Proteine) dividiert. Durch eine mathematische Fit-Analyse (z.B. nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate) kann der Verlauf der relativen Streuintensität anschließend durch einen analytischen Ausdruck angenähert werden. Dabei ergibt sich ein Proportionalitätsfaktor k, der ein Maß für den Streuquerschnitt der Lösung ist.

Dabei sind / _re ι(v) die relative wellenlängenabhängige Streu intensität, / ₀ (v) und /p _r (v) die Intensitäten der Referenzprobe (ohne Streupartikel) und der zu untersuchenden Probe, v ist die Frequenz und k ist ein Proportionalitätsfaktor, der dem Streuquerschnitt der Probe entspricht.

Mit dem beschriebenen Verfahren können mittels Laserstreulichtmessungen Protein-Proteinwechselwirkungen in Lösung markierungsfrei bestimmt werden. Dabei gibt ein sehr eng umgrenzter Bereich schwach attraktiver Wechselwirkungen Grenzen vor, innerhalb derer sich Proteineinkristalle ausbilden können. Diese Wechselwirkungen werden durch die Eigenschaften der Lösung beeinflusst. Mithilfe der Laserstreulichtmessungen werden die Wechselwirkungen der Proteine unter verschiedenen Lösungsbedingungen gemessen. Dabei werden diejenigen Lösungszusammensetzungen ermittelt, die eine Proteinkristallisation

begünstigen. Mithilfe mathematischer Optimierungsalgorithmen können aus den ausgewählten Lösungsansätzen neue Lösungsbedingungen berechnet werden, von denen eine weitere Annäherung an das gesuchte Kristallisationsfenster zu erwarten ist. Ein Satz weiterer unterschiedlicher Proteinlösungen wird in den berechneten Zusammensetzungen automatisiert angesetzt und durch Laserstreulichtmessungen auf die Protein-Protein- Wechselwirkungen untersucht. Die Iteration der beschriebenen Vorgehensweise soll die Kristallisationsparameter mit jedem Durchlauf näher an das Kristallisationsfenster heranbringen, bis sich ein Protein-Einkristall ausbildet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen ohne Beschränkung des durch die Patentansprüche vorgegebenen Schutzbereichs nochmals näher erläutert. Hierbei zeigen:

Fig. 1 : eine Ausführungsform der Erfindung mit einer Lichtquelle

Fig. 2: eine Ausführungsform der Erfindung mit zwei Lichtquellen

Fig. 3: eine Ausführungsform der Erfindung mit drei Lichtquellen

Fig. 4: eine Ausführungsform der Erfindung mit einer polychromatischen Lichtquelle

Wege zur Ausführung der Erfindung

In Fig. 1 a sind die einzelnen Komponenten von Anregungs- und Detektionsoptik schematisch wiedergegeben, Fig. 1b stellt einen vergrößerten Ausschnitt von Fig. 1 a dar und zeigt eine Skizze des auf dem Boden der Mikrotiterplatte 10 aufsitzenden Probentropfens 11 sowie die Strahlengänge von beaufschlagender Strahlung 3 und detektierter Strahlung 15.

Ein kollimierter Laserstrahl 1 wird durch eine Strahlformungsoptik 2 in einen kollimierten Ringstrahl 3 umgewandelt. Dies kann durch eine Abfolge von zwei

identischen Axiconen (Glaskegeln), die jeweils mit ihren Spitzen zueinander angeordnet sind, erreicht werden. Der Laserstrahl 1 wird von einem temperaturstabilisierten Diodenlaser erzeugt, der in eine Single mode Faser eingekoppelt wird. Nach Auskopplung des Strahles aus der Faser weist die Intensitäts-Verteilung ein reines Gauss-Profil auf (TEM-OO Mode), der Strahldurchmesser beträgt beispielsweise 6 mm. Nach der Strahlformung durch die Axicone 2 ergibt sich ein ringförmiger Strahl 3 mit einem Innendurchmesser von 20 mm und einem Außendurchmesser von 26 mm.

Der kollimierte Ringstrahl 3 trifft auf den Parabolspiegel 4 und wird in die von einer nicht mit der Probe 1 1 mischbaren Flüssigkeitsschicht 14 überdeckten Probe 11 auf den Fokuspunkt 12 hineinfokussiert. Dabei durchtritt er den Glasboden einer

Mikrotiterplatte 10 und durchquert die von der Unterseite der Probe 11 und der

Mikrotiterplatte 10 ausgebildete Grenzfläche 13. Der anregende Ringstrahl 3 wird unter einem Winkelbereich zwischen 51° und 59° (halber öffnungswinkel) eingestrahlt, dies entspricht numerischen Grenzaperturen von 0,78 bis 0,86. Die erzeugte Streustrahlung 15 wird von dem mittig im Parabolspiegel 4 platzierten

Mikroskopobjektiv 5 unter einem Winkel zwischen 0° und 44° (halber

öffnungswinkel), dies entspricht einer numerischen Apertur von 0,7, gesammelt und wieder zu einem kollimierten Strahl 6 geformt. Dieser wird durch eine weitere Optik 7 auf eine Single mode Faser 8 fokussiert. Die Faser 8 leitet das

Streulichtsignal an einen empfindlichen Photodetektor 9, bei dem es sich um einen

Photomultiplier oder eine Avalanche-Photodiode handeln kann.

Die Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit zwei Strahlquellen 18,18'. Die beiden Laserstrahlquellen 18 und 18', (z.B. ein Diodenlaser bei 658 nm und ein frequenz-verdoppelter Nd:YAG Laser bei 532 nm) emittieren jeweils einen kollimierten Laserstrahl 1 ,1 '. über einen dichroitischen Spiegel 16, der die eine Wellenlänge reflektiert und die andere Wellenlänge passieren lässt, werden die beiden Strahlen 1 ,1 ' überlagert. In einer Strahlformungsoptik 2 werden beide Strahlen jeweils in einen kollimierten Ringstrahl 3 umgeformt. Die beiden überlagerten Ringstrahlen 3 werden durch den Parabolspiegel 4 ohne Auftreten eines chromatischen Fehlers in das Probenvolumen 11 fokussiert, Streustrahlung 15 wird durch das chromatisch korrigierte Mikroskopobjektiv 5 gesammelt und als kollimierter Strahl 6 über einen Auskoppelspiegel 17 auf einen weiteren

dichroitischen Spiegel 20 gelenkt. Hier erfolgt die Trennung der Wellenlängen, die über zwei separate Optiken 7,7' auf zwei single-mode Fasern 8,8' gelenkt und an zwei Detektoren 9,9' weitergeleitet werden. Als Detektoren 9,9' werden wiederum Photomultiplier oder Avalanche Photodioden eingesetzt.

Die Fig. 3 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit drei (oder mehr) Strahlquellen 18,18', 18". Im übrigen erhöht sich gegenüber Fig. 2 die Zahl der dichroitischen Spiegel 16,16\ 16" zur überlagerung der Strahlen der verschiedenen Laser, sowie die Zahl der dichroitischen Spiegel 20,20',20" zur Trennung der Strahlungsanteile der Streustrahlung 15, die Zahl der Optiken 7,TJ", die Zahl der Fasern 8,8',8" und die Zahl der Detektoren 9,9',9".

Die Fig. 4 zeigt eine mögliche Anordnung mit einer Anregung mit kontinuierlicher spektraler Verteilung. Diese weist eine polychromatische Lichtquelle 18 und als Detektor 9 ein Spektrometer auf. Die Strahlung der Lichtquelle 18 wird idealerweise über eine Faser (21) und eine Auskoppeloptik (19) in die Strahlformungsoptik 2 geführt. Bei der Lichtquelle 18 kann es sich um eine klassische Lichtquelle (Halogenlampe, Entladungslampe) oder aber um eine Laserquelle handeln (z.B. Selbstphasenmodulation eines Femtosekundenlasers in einer optischen Faser).

Bezugszeichenliste

1 Laserstrahl

2 Strahlformungsoptik

3 Ringstrahl

4 Parabolspiegel

5 Mikroskopobjektiv

6 kollimierter Streulichtstrahl

7 Fokussieroptik für den Streulichtstrahl

8 Lichtleitfaser

9 Photodetektor

10 Mikrotiterplatte

11 Probe

12 Fokus

13 Grenzfläche

14 Flüssigkeitsschicht

15 Streustrahlung

16 Dichroitischer Spiegel

17 Auskoppelspiegel

18 Strahlquelle

19 Auskoppeloptik

20 Dichroitischer Spiegel

21 Lichtleiterfaser