VLADIMIRSKIY MIKHAIL ALEKSANDROVICH (RU)
MANYKIN ANATOLIY ANATOLIEVICH (RU)
RU2214829C2 | 2003-10-27 | |||
RU2622755C1 | 2017-06-19 |
BOULANGER PASCALE ET AL.: "Purification of bacteriophages and SDS-PAGE analysis of phage structural proteins from ghost particles", BACTERIOPHAGES: METHODS AND PROTOCOLS, vol. 502, 2009, New York, pages 227 - 238, XP055687218
LIU KEYANG ET AL.: "Purification and concentration of mycobacteriophage D29 using monolithic chromatographic columns", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 186, no. 1-2, December 2012 (2012-12-01), pages 7 - 13, XP055687219
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Препарат для инактивации внутриклеточных микобактерий туберкулеза, представляющий собой микобактериофаг D29, включенный в бислойную фосфолипидную липосому размером 0,4 микрон. 2. Способ получения препарата по п. 1 заключающийся в выделении и очистке фаговых частиц из бактериальных лизатов M.smegmatis с последующим включением в фосфолипидные липосомы, отличающийся тем, что выделение и очистку фаговых частиц из бактериальных лизатов M.smegmatis проводят с помощью с помощью ионно-обменной хроматографии на колонке Q-sepharose, полученный очищенный микобактериофаг в концентрации не менее 108 pfu/ мл встряхивают с фосфолипидной пленкой в течение 5-10 минут, проводят экструзию полученных частиц через фильтр с порами 5 микрон и последующей 20-кратной экструзией с использованием фильтров размером пор 0,4 мк, концентрированием и отделением включенной в липосомы фракции микобактериофага с помощью центрифугирования при 13±2 тыс об/мин в течение 30±5 минут. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют фосфолипидную пленку полученную из фосфатидилхолина, холестерина и твин-80 взятых в массовом соотношении 5±1 : 1±0,8 : 1,2 ± 0,2. |
СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
Область техники
Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме лечения туберкулеза. Как известно, лечение туберкулеза требует очень длительных курсов специфической химиотерапии с использованием различных комбинаций противотуберкулезных препаратов, в основном, антибиотиков.
Уровень техники
Длительность курсов приема антибиотиков приводит возникновению лекарственной устойчивости возбудителя - микобактерий туберкулеза (МБТ). При этом, использование при лечении больных туберкулезом новых, вновь созданных противотуберкулезных препаратов также достаточно быстро приводит к появлению лекарственно-устойчивых штаммов МБТ. Кроме того, при туберкулезной инфекции значительная часть микобактерий находится - персистирует и размножается внутриклеточно - в тканевых макрофагах.
Известно, что применение бактериофагов для лечения различных микробных инфекции, в общем, рассматривается мировой научной общественностью в качестве альтернативы эры применения антибиотиков в связи с распространением лекарственной устойчивости к этим препаратам. Однако, практически, несмотря на имеющиеся публикации об успешном применении бактериофагов для лечения некоторых воспалительных заболеваний микробной природы, их применение в настоящее время ограничено (A. Nilsson. Phage therapy. Constraints and possibilities. Upsala J. of Med. Sciences, 2014,119, 192-198).
Известны также, экспериментальные работы от 70-х годов и до 1991 г., в которых были предприняты попытки лечения туберкулезной инфекции с помощью различных штаммов микобактериофагов. Однако, полученные результаты были ограниченными по эффективности и уступали применению традиционных противотуберкулезных лекарственных веществ (Козьмин-Соколов Б.Н. и др. Влияние микобактериофагов на течение экспериментальной туберкулезной инфекции у белых мышей. Проблемы туберкулеза 1975, N° 4, с. 75-79; Земскова З.С., Дорожкова И.Р. Патоморфологическая оценка лечебного действия микобактериофагов при туберкулезе. Проблемы туберкулеза 1991, N° 11, с. 63-66). В 2000-е годы интерес к применению микобактериофагов, в частности, к перспективе применения литического микобактериофага D 29 для лечения туберкулезной инфекции, вновь вырос и обсуждается в некоторых международных публикациях последнего времени (Gr. Hatfull. Mycobacteriophages: Windows into Tuberculosis. Plos patogens. 2014, n.10, issue 3). Обсуждаются вопросы доступности, транспорта микобактериофагов к зонам туберкулезного воспаления и к внутриклеточно расположенным микобактериям, а также к вероятной возможности элиминации микобактериофагов микро и макрофагами периферической крови.
Известны способы лекарственного транспорта с помощью различных микронных, субмикронных и наноносителей. Чаще всего используются полимеры молочной и гликолевой кислоты, альгинаты, а также частицы хитозана. (Y. Wang et al. Review. Manufacturing Techniques and Surface Engineering of Polymer Based Nanoparticles for Targeted Drug Delivery to Cancer. Nanomaterials 2016, 6, 26 p.1-18).
Липосомы также являются одним из наиболее известных методов лекарственного транспорта, а также в качестве перспективных антигенных носителей для получения вакцин, поскольку их фосфолипидная мембрана хорошо совместима с клетками эукариотов и может быть различным образом модифицирована, получением иммунолипосом и др. В этих целях их размер обычно не превышает 150-200 нм (R.Nisini et al.The Multirole of liposomes in therapy and prevention of infection diseases. Review. Frontiers in Immunology, 2018, v.9 art.l55, p.l- 23.). Экспериментальные исследования применения липосомальных антибиотиков для лечения туберкулезной инфекции проводились с начала 80-х годов прошлого века, первой из которых была публикация одного авторов настоящей заявки (Vladimirsky М.А. and Ladigina G.A. Antibacterial activity of liposomal-entrapped streptomycin mice infected with Mycobacterium tuberculosis. Biomedicine and Pharmacotherapy, 1982, v. 36, N. 8-9, p.375-377). Размеры этих липосом не превышали 100 нм. Эти работы в дальнейшем были подтверждены развивались, но препятствием к практическому применению липосомальных антибиотиков для лечения туберкулеза стало накопление препарата в печени, что позже несколько нивелировалось при использовании stealth липосом с полиэтиленгликолем. Липосомы, содержащие микобактериофаг, в качестве саморазмножающегося лекарства теоретически могли бы эффективно доставляться в мелкие бронхи дренирующие очаги специфического туберкулезного воспаления. Однако, идея использования липосом в качестве транспортного средства для применения микобактериофагов до сих пор сдерживалась размерами частиц микобактериофага, поскольку литический микобактериофаг имеет размер головки фага - 65 нм и размер фагового хвоста - ПО нм. Следовательно, липосомы, включающие частицы размером около 200 нм должны быть слишком большими для того чтобы быть фагоцитированными клетками эукариотов. Поэтому задача получения и применения липосом с включенными частицами микобактериофага не была тривиальной и до сих пор использование таких экспериментальных препаратов с целью их литического действия на микобактерии туберкулеза, в том числе, на внутриклеточную популяцию микобактерий не было описано.
Наиболее близким к заявляемому является препарат микобактериофага, получаемый способом по патенту Ю.Н.Курунова и сотр. 2001 г. «Способ фаготерапии туберкулеза» N° 2214829, 2001 г., который заключается в очищении микобактериофага от бактериального лизата при высокоскоростном (70-100 тыс g) центрифугировании в градиенте цезия, затем полученный препарат встряхивали вместе с фосфолипидной пленкой, получая таким образом многослойные липосомы и вводили их ректально мышам, инфицированным микобактериями туберкулеза.
Использованная в способе технология выделения микобактериофагов в градиенте цезия дает относительно низкий выход (Boulanger Р. Purification of bacteriophages and SDS-PAGE analysis of phage structural proteins from ghost particles. In: Clokie MR, Kropinksi AM, editors. Bacteriophages: Methods and Protocols. Humana
Press; New York: 2009. pp. 227-238), а также повреждает жизнеспособность фаговых частиц (Carlson К. Appendix: Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches. In: Kutter EM, Sulakvelidze A, editors. Bacteriophages: biology and application. CRC Press; Boca Raton, FL: 2005). Кроме того, приведенный авторами патента способ получения препарата микобактериофагов, позволяет получать только очень крупные многослойные липосомы размером 5-10 микрон
(«Липосомы в биологических системах» под ред Г.Грегориадиса пер. с англ.,
Москва 1983 г.). Также известный препарат не стерилизуется, поскольку его используют только для ректального введения. Препарат невозможно стерилизовать без повреждения жизнеспособности фаговых частиц, например, путем лиофилизации с последующим гамма облучением, что также приведет к повреждению ДНК микобактериофага. Кроме того, липосомы размером 5-10 микрон не могут фагоцитироваться клетками макроорганизма - макрофагами, что не позволит в полном объеме реализовать противотуберкулезный эффект препарата. Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является создание препарата на основе литического штамма микобактериофага, инактивирующего внутриклеточные микобактерии туберкулеза.
Поставленная задача решается с помощью препарата для инактивации (лизиса) внутриклеточных микобактерий туберкулеза, представляющего собой микобактериофаг D29, включенный в бислойную фосфолипидную липосому размером 0,4 микрон.
Также поставленная задача решается способом получения указанного препарата, заключающимся в выделении и очистке фаговых частиц из бактериальных лизатов M.smegmatis с помощью ионно-обменной хроматографии на колонке Q-sepharose. Полученный очищенный микобактериофаг в концентрации не менее 10 8 pfu/ мл встряхивают с фосфолипидной пленкой в течение 5-10 минут, экструзией полученных частиц через фильтр с порами 5 микрон и последующей 20- кратной экструзией с использованием фильтров размером пор 0,4 мк, концентрированием и отделением включенной в липосомы фракции микобактериофага с помощью центрифугирования при 13±2 тыс об/мин в течение 30±5 минут. Предпочтительно использовать фосфолипидную пленку, полученную из фосфатидилх олина, холестерина и твин-80 взятых в массовом соотношении 5±1 : 1±0,8 : 1,2 ± 0,2.
Преимуществом заявляемого технического решения является:
1. Для выделения микобактериофагов, в частности, микобактериофага D29 из бактериального лизата M.smegmatis , в суспензии которых производится размножение микобактериофага, используется альтернативная технология выделения и очистки микобактериофага: Evelien М. Adriaenssens, Susan М. Lehman et. al. CIM ® Monolithic Anion-Exchange Chromatography as a Useful Alternative to CsCl Gradient Purification of Bacteriophage Particles. Virology 2012, 434(2), p. 265-270., K.Liu et al. Purification an concentration of mycobacteriophage D29 using monolithic chromatographic columns. J. of Virological Methods, 2012, n.186, р.7-13, которая позволяет сохранить жизнеспособность частиц бактериофага.
2. Заявляемым способом были получены липосомальные частицы с включенными микобактериофагами оптимального размера - в основном с размером частиц около 400 нм, что обеспечивает возможность их фагоцитоза макрофагами, что, в свою очередь, позволяет в полном объеме реализовать противотуберкулезный эффект препарата.
3. Получение стерильного препарата, подтверждаемого размером фильтруемых частиц и сохранением стерильности в отношении банальной микрофлоры в течение 3-4-недельного периода культивирования инфицированных микобактериями макрофагов на агаровой питательной среде 7Н10, при котором определяли рост МБТ при отсутствии банальной микрофлоры.
4. Заявляемым способом достигается высокая - 80% эффективность включения частиц микобактериофага в липосомы, тогда как в ранее описанном способе не производилось отделение фракции липосом с включенным микобактериофагом и не изучалась эффективность его включения.
5. Полученный таким способом, заявляемый препарат на основе микобактериофага обеспечивает проникновение частиц микобактериофага в клетки перевиваемой культуры макрофагов не менее, чем в 4 раза более эффективно и обеспечивает е инактивацию микобактерий туберкулеза, инфицирующих макрофаги также не менее чем в 4-5 раз более эффективно.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами, где на фиг. 1 представлено негативное контрастирование бислойных липосом без фага.
На фиг. 2 показано позитивное контрастирование контрольного образца микобактериофага уранилцетатом. Видны ДНК головка фага и хвост.
На фиг. 3 показано позитивное контрастирование. Справа внизу - головка фага, включенного в липосому.
На фиг. 4 показано позитивное контрастирование. Головка фага, включенного в липосому.
На фиг. 5 показано негативное контрастирование разрушенной липосомы. При затекании контрастирующего вещества видны головки фагов.
Осуществление изобретения
Для получения липосом очищенный при ионно-обменной хроматографии на колонке Q-sepharose препарат микобактериофагов D29 (набор реагентов Fast Plaque ТВ, Biotec laboratories Ltd. Ipswich United Kingdom) в концентрации фаговых частиц не менее 10 8 плакобразующих единиц (рГи)/мл и диализованный против фагового буферного раствора, встряхивают в течение 5-10 минут с фосфолипидной пленкой. Полученные многослойные липосомы подвергают последовательной экструзии через фильтры с размером пор 5 микрон, а затем 20 кратной экструзии (продавливание) через фильтры с размером пор 0,4 микрон, после чего для концентрирования и отделения липосом с включившимися микобактериофагами от не включившихся частиц микобактериофага, а также для освобождения препарата от мелких липосомных частиц, препарат центрифугируют при 13±2 тыс. об/мин. в течение 30±5 мин. Далее концентрацию микобактериофага, включенного в липосомы измеряют с помощью количественной ПЦР в реальном времени и определяют процент включения частиц фага в липосомы, который составляет не менее 80%.
В качестве фосфолипидных пленок могут быть использованы пленки, образованные фосфотидилхолином, для укрепления мембраны получаемых липосом в состав пленки добавляют холестерин, взятый в массовом соотношении 1±0,8 к 5±1 фосфатидилхолина. Также для стабильности препарата в пленки дополнительно добавляют неионогенное поверхностно активное вещество - твин-80 в количестве 1,2 ± 0,2 мг на 5±1 мг фосфатидилхолина.
Размер и морфология получаемых бислойных липосом продемонстрированы с помощью электронной микроскопии при негативном и позитивном контрастировании уранилацетатом (фиг. 1-5).
Достижение литического действия микобактериофагов на внутриклеточно
МБТ, расположенные демонстрируется при использовании, в качестве примера, модели макрофагов мышей, в качестве которых были использованы клетки перевиваемой линии RAW 264.7 (АТСС - американская коллекция клеточных культур), инфицированных МБТ (музейный штамм H37Rv, получен из
Государственного института стандартизации и контроля биопрепаратов (ГИСК) им.
Л. А. Тарасевича). Для аналогичных исследований могут быть также использованы перевиваемая линия макрофагов человека ТНР (АТСС), а также возможно менее изученная модель микрогранулемы in vitro, состоящая из лимфоцитов и макрофагов крови человека, инфицированных микобактериями туберкулеза. Литическое действие микобактериофага D29, включенного в липосомы в отношении внутриклеточных микобактерий туберкулеза (МБТ), а также эффективность проникновения липосомного микобактериофага в клетки макрофагов сравнивается с микобактериофагом не включенным в липосомы при аналогичной фаговой активности. Литическое (антибактериальное) действие МБТ измеряется при посевах инфицированных макрофагов, после их двукратного замораживания и оттаивания на агаровую питательную среду 7Н10 Миддлбрук.
Способ получения препарата для литического действия в отношении внутриклеточной популяции микобактерий туберкулеза (МБТ) на основе микобактериофага D29 реализуется путем его размножения в культуре нетуберкулезных микобактерий M.smegmatis (АТСС 101), выделения и очистки с помощью ионно-обменной хроматографии, получением многослойных липосом при 5-10 минутном встряхивании препарата микобактериофага специфической активностью не менее 10 8 плакобразующих фаговых частиц (pfu) в мл фагового буферного раствора, Ph-7,5 с фосфолипидной пленкой, получаемой после выпаривания на роторном испарителе растворенного в 96° этанола фосфатидилхолина, холестерина и твин-80 в соотношении 5±1 : 1±0,8 : 1,2 ± 0,2 с экструзией через фильтр с порами 5 микрон и последующей 20-кратной экструзией с использованием фильтров с размером пор 0,4 мк, концентрированием и отделением включенной в липосомы фракции микобактериофага от не включенных фаговых частиц, а также отделением более мелких липосомных частиц с помощью центрифугирования при 13 тыс об/ мин в течение 30 минут, исследованием количественного (процентного) содержания включенных в липосомы частиц микобактериофага путем определения ДНК микобактериофага с помощью количественной ПЦР в реальном времени, составляющего не менее 80% от внесенного микобактериофага, контролем полученного препарата с помощью электронной микроскопии и анализом биологической активности в культуре макрофагов перевиваемой линии, инфицированных МБТ.
Пример осуществления изобретения.
1. Модель внутриклеточной инфекции микобактерий туберкулеза: макрофаги перевиваемой линии RAW 264.7 (АТСС), инфицировали МБТ музейного штамма H37Rv при инкубации в течение 24 часов; суспензия инфицированных макрофагов выделяли с освобождением от не включившихся микобактерий с помощью центрифугирования при 2 тыс обор/мин в градиенте плотности раствора Ficoll-Paque (GE Healthcare) на разделе сред и отмывали в питательной среде RPMI 1640 с последующим культивированием в лунках 6-луночного культурального планшета с использованием среды RPMI 1640 с 20% фетальной бычьей сыворотки,
L-глютамина, MEM Vitamins, MEM NEAA, Sodium Pyruvate PenStrep (0,1) mcg/ml); затем после суточной инкубации в лунках планшета вносили микобактериофаг D29 известной активности - 10 8 плакобразующих частиц (pfu) в мл в липосомальной форме и не включенного в липосомы в равных количествах, определяемых по числу pfu и концентрации ДНК фага.
2. Приготовление липосомального микобактерифага: 40 мг яичного фосфатидилхолина (фирма Lipoid, Германия), 8 мг холестерина (Sigma) и 8,8 мг твин 80 растворяли в 3 мл 96% этанола; высушивали на роторном испарителе до получения липидной пленки; вносили 3 мл хроматографически очищенного на ионнообменной колонке Q сефарозы препарата микобактериофага с активностью не менее 10 8 pfu/мл; встряхивали до образования суспензии, продавливали через стерильный фильтр 5,0 с размером пор 5 мк, а затем не менее 20 раз через стерильный фильтр с размером пор 0,4 мк; центрифугировали для освобождения от не включенного в липосомы микобактериофага и измеряли относительное количество ДНК фага в осадке в сравнении с общим количеством ДНК внесенного в препарат фага. Контроль полученного липосомального препарата микобактериофага проводили также при использовании электронной микроскопии фиг. 1-5.
3. Исследование эффективности антимикобактериального действия липосомального микобактериофага: после 24 часовой инкубации культуры макрофагов с внутриклеточными МБТ с препаратами микобактериофагов (липосомальный и свободный микобактериофаг) клетки отмывали однократно питательной средой; снимали инфицированные макрофаги с поверхности лунок в объеме 200 мкл; проводили двукратное замораживание и оттаивание материалов, после чего по 100 мкл из каждого образца засевали на чашки с питательной средой 7Н10 для определения жизнеспособности МБТ, а также по 100 мкл аналогичных материалов исследовали для определения количества ДНК микобактериофага с помощью ПЦР в реальном времени.
Результаты исследования: 1. Количество ДНК фага, включенного в липосомы, определяемого в клетках инфицированных макрофагов по данным количественного ПЦР -анализа в 4-8 раз (в разных экспериментах) превышало количество ДНК свободного, не включенного в липосомы фага.
2. Количество колоний МБТ выявленных в результате культивирования: в контрольных чашках без фага - 300 -500; в чашках с микобактериофагом не включенным в липосомы составляло - 15- 27 колоний, тогда как в чашках с после воздействия липосомального фага число колоний - 3-4 на чашку. Различия статистически значимы.