SUELO

En general, la presente invencion se refiere a una composicion fertilizante que incluye iones complejados con sustancias humicas para mejorar la fijacion biologica del nitrogeno por parte de microorganismos presentes en el suelo, en particular microorganismos fijadores de nitrogeno, facilitando con ello la absorcion del nitrogeno en forma de derivados amonicos, nitrito y nitrato por parte de las plantas.

Mas concretamente, la invencion proporciona una composicion fertilizante que incluye iones de cobalto, hierro y molibdeno complejados con sustancias humicas para mejorar la capacidad de los microorganismos fijadores de nitrogeno presentes en el suelo, tales como Clostridium, en particular Clostridium pasteurianum, Rhizobium y Azotobacter, de transformar el nitrogeno atmosferico, que dificilmente se combina con otros elementos, en metabolitos asimilables por las plantas y, con ello, aumentar la cantidad de nitrogeno asimilable por las plantas en el suelo, mejorando con ello su crecimiento o desarrollo. Esta composicion fertilizante, por tanto, facilita no solo el desarrollo y crecimiento de las plantas, sino tambien constituye un tratamiento para los suelos, mas concretamente para los microorganismos presentes en ellos, permitiendo igualmente combatir el problema de la acumulacion de nitrogeno en los suelos y disminuyendo la necesidad de fertilizarlos con abonos nitrogenados. El crecimiento de todas las plantas esta determinado de forma directa o indirecta por la disponibilidad de nutrientes minerales, en especial del nitrogeno. Una vez cubiertas las necesidades de agua, el factor limitante mas importante es el nitrogeno. Una planta con deficiencia de nitrogeno sufriria clorosis, manifestando una coloracion amarillenta de tallos y hojas, falta de desarrollo y debilidad. Por el contrario, cuando la planta tiene suficiente nitrogeno, sus hojas y tallos crecen rapidamente. En agricultura el nitrogeno es el principal nutriente para el crecimiento de las plantas y, asi, en suelos carentes de nitrogeno los rendimientos de los cultivos son bajos.

El nitrogeno es un elemento esencial para el crecimiento de todos los microorganismos. El nitrogeno esta presente en la atmosfera en forma de N ₂ en un 80% aproximadamente, sin embargo, debido a la fortaleza del enlace entre los dos atomos de nitrogeno, la reactividad de este es practicamente nula, lo que provoca que no sea asim liable por la mayoria de los organismos vivos.

Asi, los atomos de nitrogeno estan en continuo movimiento; se desplazan lentamente entre el aire, la tierra, el agua y los organismos, vivos o muertos. A este ininterrumpido ciclo cerrado se le conoce como ciclo del nitrogeno. La estabilidad del nitrogeno le dificulta la combinacion con otros elementos y, por tanto, es dificil de asimilar por los organismos y necesita una gran cantidad de energia para combinarse con otros elementos. Sin embargo, existe un grupo de microorganismos, que son capaces de aprovechar este nitrogeno a traves del proceso conocido como fijacion biologica del nitrogeno, y que, a grandes rasgos, consiste en la conversion del nitrogeno atmosferico a formas metabolizables, que puedan ser asimiladas por los seres vivos, en particular formas amonicas, nitritos y nitratos.

Todos los microorganismos capaces de realizar una fijacion biologica del nitrogeno, lo hacen gracias a la actividad del complejo enzimatico Nitrogenasa. Las nitrogenasas son enzimas oxidoreductasas que catalizan reacciones de tipo oxido-reduccion, especificamente la reduccion de nitrogeno molecular; siendo de especial importancia para las plantas, ya que en ellas llevan a cabo el proceso de fijacion de nitrogeno convirtiendolo en amoniaco facilmente asimilable. En general, las nitrogenasas estan formadas por dos componentes (Chan, Michael K.; Jongsun, Kim Rees, D. C, The Nitrogenase FeMo-Cofactor and P-Cluster Pair: 2.2 A Resolution Structures, Science, 260, 792-794, 1993):

• La proteina Fe-M, donde el metal (M) puede ser molibdeno, vanadio o hierro. Es un tetramero α2β2 constituido por 30 atomos de hierro y dos del metal correspondiente, distribuidos en dos tipos de cumulos: los empaques cubicos o tipo "P" (8Fe, 7S ^2" ) y el cofactor Fe-M. • La proteina solo hierro, sensible al oxigeno, contiene unicamente cumulos tipo 4Fe4S, asi como dos sitios de enlace MgATP.

Las nitrogenasas se encuentran en bacterias como Clostridium pasteurianum, Rhizobium y Azotobacterias. Las Rhizobia se encuentran en las raices de las leguminosas, de manera que la fijacion de nitrogeno se Neva a cabo en los nodulos de estas; alii, la bacteria degenera en bacterioides y en una hemoglobina especial, denominada leghemoglobina, que atrapa el oxigeno, protegiendo a la nitrogenasa y proveyendo de este al resto de la planta.

El cobalto es una coenzima precursora de la Leghemoglobina, enzima que mantiene las condiciones anaerobias en el entorno de la Nitrogensa. Una deficiencia en cobalto inhibe la sintesis de la Legheoglobina, lo que provocaria un flujo excesivo de oxigeno, inactivando la nitrogenasa (Biologia de las plantas, Volumen 2. Peter H. Raven, Ray F. Evert, Susan E. Editorial Reverte).

Hay varios factores ambientales que limitan la fijacion del nitrogeno. Por ejemplo, la nodulacion se ve afectada por el exceso o carencia de determinados elementos minerales. Un defecto de molibdeno influye negativamente en la fijacion del nitrogeno. Otro elemento mineral es el hierro, que sin embargo cuando escasea no tiene un efecto directo sobre la fijacion del nitrogeno. El hierro y el molibdeno son elementos constituyentes de la nitrogenasa, es por ello que la presencia de ambos elementos es esencial para el buen funcionamiento de la enzima.

Los microorganismos fijadores de nitrogeno pueden llegar a ser una solucion al problema medioambiental de nitrificacion de los suelos, prueba de ello es que existen diversos estudios y patentes relacionadas con la activacion de los mismos, por ejemplo la patente US 2004/0241847, donde se utilizan microorganismos modificados geneticamente para aumentar la actividad nitrogenasa de los microorganismos.

Asi, la composicion fertilizante objeto de invencion incluye iones de cobalto, hierro y molibdeno complejados con sustancias humicas para mejorar la capacidad de los microorganismos fijadores de nitrogeno presentes en el suelo, tales como Clostridium pasteurianum, Rhizobium y Azotobacter, de transformar el nitrogeno atmosferico en metabolitos asimilables por las plantas y, con ello, aumentar la cantidad de nitrogeno asimilable por las plantas en el suelo, mejorando con ello su crecimiento o desarrollo.

De la tecnica anterior son conocidas composiciones fertilizantes que comprende agentes bioactivos, en particular microorganismos que favorecen el crecimiento de las plantas. Por ejemplo, en la US 20140352376 se describe una composicion fertilizante NPK que incluye un vehiculo revestido con una mezcia de bacterias seleccionadas de entre el genero Bacillus, Pseuodomonas y Streptomyces y donde la mezcia de bacterias esta recubierta con el vehiculo en una proporcion de 10 ⁶ a 10 ¹¹ CFU por gramo de vehiculo. El objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion fertilizante que incluye iones de cobalto, hierro y molibdeno complejados con sustancias humicas para mejorar la capacidad de los microorganismos fijadores de nitrogeno presentes en el suelo, tales como Clostridium pasteurianum, Rhizobium y Azotobacter, de transformar el nitrogeno atmosferico, que dificilmente se combina con otros elementos, en metabolitos asimilables por las plantas y, con ello, aumentar la cantidad de nitrogeno asimilable por las plantas en el suelo, mejorando con ello su crecimiento o desarrollo.

En la presente invencion, el termino "composicion fertilizante" se refiere a cualquier composicion organica o inorganica, natural o sintetica, tanto en estado solido como liquido, que aporte a las plantas uno o varios de los elementos nutritivos indispensables para su desarrollo vegetativo normal, habitualmente macroelementos primarios (N, P, K), macroelementos secundarios (Ca, Mg, S) asi como microelementos (B, CI, Co, CU, Fe, Mn, Mo y Zn). Asi el termino "composicion fertilizante" abarca en particular fertilizantes minerales simples (contenido en uno solo de los macroelementos siguientes: nitrogeno, fosforo o potasio) y complejos (contenido en mas de uno de los macroelementos siguientes: nitrogeno, fosforo o potasio), fertilizantes organicos, organo-minerales, etc., tales como, fertilizantes P, fertilizantes K, fertilizantes N, fertilizantes NP, fertilizantes PK, fertilizantes NK o fertilizantes NPK. La composicion fertilizante incluye iones iones de cobalto, hierro y molibdeno complejados con sustancias humicas. Los acidos humicos son complejas agrupaciones macromoleculares que forman parte de la materia organica del suelo y que mejoran la absorcion de macronutrientes, estimulando asi el crecimiento vegetal. La extraccion, caracterizacion y propiedades de los acidos humicos se describe por ejemplo en los documentos US3398186 A, US3544296 A o EP0284339 B1 .

A este respecto, es de senalar que no todos los acidos humicos tienen las mismas capacidades de complejacion, por lo que en la presente invencion estos acidos humicos son modificados para adquirir esta capacidad, siendo esta caracteristica diferenciadora del resto de acidos humicos convencionales. Asi, los acidos humicos se modifican para potenciar aquellos grupos funcionales de los mismos que contribuyen en la complejacion, particularmente los grupos carboxilato y ester aromatico, aumentando la concentracion de estos grupos.

Por ejemplo, para obtener acidos humicos procedentes de leonardita, se realiza una doble extraccion. La primera extraccion se Neva a cabo por adicion de potasa a una disolucion acuosa de una leonardita de caracteristicas conocidas. La segunda extraccion se realiza en medio acido, ajustado por adicion de acido sulfurico a un pH entre 0 y 2, consiguiendose asi que precipiten las sustancias humicas. Por ultimo, las sustancias humicas, se redisuelven adicionando carbonato potasico y pirofosfato hasta un pH de aproximadamente 10. En la figura 1 se muestra un espectro infrarrojo que muestra las diferencias entre los acidos humicos modificados y otros existentes en el mercado. Este ensayo se llevo a cabo con tres muestras diferentes, dos productos ya existentes en el mercado (composicion comercial 1 y composicion comercial 2) y el correspondiente a la invencion, todos ellos en estado solido, empleando un aparato Carry 630 FTIR Spectromer de Agilent, a temperatura ambiente y presion atmosferica. De cada una de las muestras se peso la misma cantidad y se deposito sobre el cristal de diamante ATR del equipo, detectando las frecuencias de vibracion tipicas de cada uno de los grupos funcionales del acido humico en un rango comprendido entre 4000 cm-1 y 650 cm-1 . Una vez obtenidos los espectros de cada una de las muestras, y con el fin de comparar los resultados, los espectros se superpusieron para obtener asi el espectro de la figura 1 . En la fig. 2 se muestra un grafico de amplificacion-fluorescencia PCR obtenido con un sistema de deteccion con SYBR Green.

Como puede observarse en el espectro de la figura 1 , los picos que aparecen a 1400 y a 1010 cm-1 correspondientes a los grupos carboxilato y ester aromatico implican una concentracion claramente superior de estos grupos complejantes en los acidos humicos utilizados aqui. Como ya se ha mencionado estos son los responsables de la complejacion, por lo que, a mayor concentracion de estos, mayor capacidad de complejacion.

La concentracion de iones metalicos de cobalto, hierro y molibdeno complejados con sustancias humicas presente en la composicion se encuentra en el rango de entre el oscila entre el 0,01 % y el 50% en peso con respecto al peso total de la composicion.

Preferentemente, la concentracion de iones de cobalto, hierro y molibdeno complejados con sustancias humicas presente en la composicion fertilizante es la mostrada en la siguiente Tabla 1 , expresada en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composicion fertilizante:

Tabla 1

Se realizo un ensayo para estudiar el crecimiento y la evolucion de microorganismos con capacidad para fijar el nitrogeno para comprobar que la adicion de la composicion fertilizante segun la invencion conlleva un crecimiento de microorganismos fijadores de nitrogeno presentes en el suelo (Clostridium pasteurianum, Rhizobium y Azotobacter). Para ello, se prepararon cultivos conteniendo en cada caso tierra, un exceso de azucares para evitar que la fuente de carbono fuera un factor limitante y la composicion fertilizante de la invencion. Se preparo tambien un cultivo de control incluyendo la misma tierra y la misma concentracion de azucares, pero sin la composicion fertilizante de la invencion. Los cultivos se prepararon en camara de cultivo con agitacion y temperatura controlada durante un periodo de 3 a 5 dias.

Se recogio una muestra de estos cultivos tanto en el momento de su preparacion como tras el cultivo durante el tiempo citado y se llevo a cabo un analisis comparativo del numero de microorganismos con actividad nitrogenasa mediante PCR en tiempo real. Los resultados se muestran en la figura 2.

Tal como se observa en la figura 2, se puede comprobar que existe una mayor cantidad de microorganismos con capacidad para fijar nitrogeno en las muestras donde se anade la composicion fertilizante de la invencion. Se aprecian asi unas primeras curvas de fluorescencia entre los ciclos 22-23, que corresponden con la muestra de ensayo final que contiene la composicion fertilizante de la invencion, indicando un mayor numero de microorganismos con actividad enzimatica Nitrogenasa que la muestra que no la contiene, interpretado con las curvas que aparecen en el ciclo 33. A su vez, se ha realizado el analisis de las muestras recogidas inicialmente en el ensayo, tanto la muestra sin la composicion de la invencion, curvas ciclo 38, como con ella, que corresponde con las curvas en torno al ciclo 37. Queda asi reflejada la importancia que tiene la adicion de fertilizante en el crecimiento de microorganismos con la actividad enzimatica buscada. En las muestras de control, el crecimiento de microorganismos fijadores de nitrogeno es menor, curvas de fluorescencia en el ciclo 36. Las 4 ultimas curvas, ciclos 36-38, son las muestras iniciales de ensayo. Los ensayos fueron realizados por duplicado.

En la siguiente tabla 2 se indican los resultados en Cts de cada una de las curvas de amplificacion de los ensayos.

Tabla 2

Ct a lo largo del tiempo

Tiempo inicial (Oh) Tiempo final (120h)

Muestra de control 37,26 37,84 33,45 33,62

Muestra con la composicion 36,67 36,93 23, 1 1 22,87 fertilizante de la invencion