AISLAMIENTO, DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL, SINTESIS, ACTIVIDAD BIOLÓGICA Y APLICACIÓN COMO AGENTE DE CONTROL DE LA FEROMONA MARCADORA DE HOSPEDERO (Y SUS DERIVADOS) DE LAS MOSCAS DE LA FRUTA DEL GENERO ANASTREPHA (Diptera : Tephritidae).

ANTECEDENTES DEL INVENTO 1. Dominio del invento Este invento está relacionado con feromonas marcadoras de hospedero (FMH;"host marking pheromones"o HMPs, en inglés), también conocidas como feromonas disuasivas de oviposición (FDO; oviposition deterring pheromones"o ODPs, en inglés) en insectos. En particular se refiere a las feromonas marcadoras de hospedero en moscas de la fruta del género Anastrepha.

2. Descripción del estado del arte previo Las moscas de la fruta (Diptera : Tephritidae) están consideradas entre las plagas de mayor importancia comercial en todo el mundo (Aluja y Liedo 1993; McPheron y Steck 1996). Las especies plaga más notorias pertenecen a los géneros Anastrepha, Bactrocera, Ceratitis, Rhaaoletis, y Toxotrypana (Aluja, 1993). Entre las 184 especies de Anastrepha reportadas hasta la fecha (Aluja 1994), siete

resaltan por el daño que causan a frutas cultivadas comercialmente : A. fraterculus, A. qrandis, A. ludens, A. obliqua, A. serpentina, A. striata y A. suspensa. La distribución y los frutos atacados por éstas se presentan en la TABLA 1 (a partir de Hernández-Ortiz y Aluja 1993).

TABLA 1. Distribución y hospederos más comunes de las siete especies de _ Anastrepha de importancia comercial.

Especies de frutos Especies de Distribución atacados Anastrepha cultivados comercialmente A. fraterculus México a Argentina Guayaba, Naranja A. agrandis Sudamérica Cucurbitaceas comerciales A. ludens Sur de EUA a Costa Naranja, Mango, Rica Toronja A. obliqua México a Argentina Mango, Ciruela tropical A. serpentina México a Argentina Mamey, Chico Zapote A. striata México a Argentina Guayaba A. suspensa Florida e Islas Toronja, Guayaba del Caribe

El daño que causan estas especies de mosca es directo (la larva ataca la fruta) e indirecto (severas restricciones cuarentenarias que limitan el comercio internacional). Los niveles de infestación

(i. e., porcentaje de fruta infestada = pérdida) en un árbol pueden variar entre 0 y 90t dependiendo de la región de cultivo, la especie de fruta o cultivar, tamaño de la población de moscas, intensidad de manejo en el huerto, y grado de capitalización del dueño del huerto. Históricamente, el control de estas plagas se ha intentado a través de fumigantes, cebos tóxicos (un cebo alimenticio mezclado con un insecticida) y en ocasiones mediante el uso de la técnica del insecto estéril (TIE;"sterile insect technique"o SIT, en inglés) (Steiner 1955; Aluja 1994). A pesar de su alta eficacia, el uso a gran escala de cebos tóxicos ya no es aceptable debido a su impacto negativo en la entomofauna benéfica nativa (Asquith y Messing 1992; Humer y Dahlsten 1993). En años recientes, se han estado explorando una variedad de alternativas como son el uso de ácido giberélico para incrementar la resistencia innata de los cítricos al ataque de las moscas (Greany 1989), de reguladores de crecimiento en insectos como la ciromazina (Martínez y Moreno et al. 1991), de patógenos como Bacillus thuringiensis Berliner (Martínez et al. 1997) y de pigmentos fotoactivados como por ejemplo SureDyeM R (PhotoDye International, Inc., Boca Raton, USA). A pesar de ser prometedoras como alternativas viables a los cebos tóxicos, algunos de estos métodos podrían aún ser inaceptables debido a sus efectos perjudiciales en insectos benéficos (Aluja 1996). Lo anterior debido a que el

agente letal debe ser ingerido por un insecto adulto, y la única manera práctica de lograrlo es mezclándolo con un cebo alimenticio. Como en el caso de cebos alimenticios mezclados con insecticida, los cebos utilizados en combinación con pigmentos fotoactivados o los reguladores de crecimiento en insectos, no son específicos. Esto quiere decir, que atraen a un gran número de insectos benéficos (como es el caso de muchas especies del orden Diptera), que también son eliminados.

El uso de FMH sintéticas es una alternativa altamente selectiva al uso de insecticidas que ha sido probada recientemente en moscas de la fruta del género Rhagoletis, y que no requiere de un cebo para ser efectiva. Las moscas depositan FMH después de cada evento de oviposición y de esta manera inhiben la oviposición de coespecificos en el mismo fruto, dada una concentración suficientemente alta (Katsoyannos y Boller 1980). Basados en este conocimiento y en el trabajo químico de Hurter et al.

(1987a; 1987b) y Ernst y Wagner (1989), se pudo poner a prueba con éxito la FMH de Rhaqoletis cerasi como un agente reductor de infestación en frutos, en un huerto comercial de cereza en Suiza (Aluja y Boller 1992). La aplicación de FMH sintéticas en toda la copa del árbol redujo el nivel de infestación en un factor de 10, comparado con un árbol no tratado (0.226 vs. 0.021 pupas/fruta en árboles no tratados y

tratados, respectivamente). Se logró también una reducción significativa en la infestación de fruta tratando solo la mitad (superior o inferior) de la copa (Aluja y Boller 1992). Es relevante el hecho de que la conducta de marcaje de hospedero se ha reportado en varias especies de Anastrepha : A. suspensa (Prokopy et al. 1977), A. fraterculus (Prokopy et al. 1982), A. sororcula y A. obliqua (Simoes et al., 1978), A. pseudoparallela (Polloni y Da Silva 1986), A. striata (Aluja et al. 1993), A. bistrigata (Gomes-Da Silva 1991), A. grandis (Selivon 1991) y A. ludens (Papaj y Aluja 1993). Al igual que Hurter y colaboradores trabajando con R. cerasi (Hurter et al. 1987b), Santiago y colaboradores (1990; 1991), trabajando con A. ludens y A. serpentina, demostraron que las heces de estas dos especies contenian la feromona marcadora de hospedero. Al realizar un corrimiento en cromatografía de capa fina de extractos de heces de A. ludens, estos autores encontraron, en bioensayos de laboratorio, que una de las bandas presentó efecto disuasivo de la oviposición en las hembras de esta especie (Santiago et al. 1991). También demostraron, que extractos crudos de las heces de A. ludens aplicados a ramas de mango en el campo, redujeron el nivel de infestación en la misma especie. En general, aplicadas en frutos a una concentración suficientemente alta, las feromonas marcadoras de

hospedero (FMH) reducen la oviposición de las hembras de moscas de-la fruta (Averill y Prokopy 1989).

Aún existe la necesidad en el arte de una alternativa altamente selectiva (i. e., dirigida solo a moscas del género Anastrepha) y ambientalmente segura, al uso de métodos de control de Anastrepha que no dependa del uso de cebos alimenticios para que la sustancia tóxica o el agente letal sean efectivos.

El presente invento describe varias sustancias que reducen el daño ocasionado a frutos de valor comercial por moscas del género Anastrepha y que no requieren de cebos alimenticios para ser aplicadas o para ser efectivas.

COMPENDIO DE LA INVENCION De acuerdo al presente invento, se ha encontrado que el ácido 2-(2', 14'-Dimetil-pentadecanoilamino)- pentanedióico, de la fórmula (I),

aislado de las heces de Anastrepha ludens, funciona como disuasivo de oviposición en las moscas de la fruta (Diptera : Tephritidae) del género Anastrepha, tanto en aquellas de importancia comercial como en las que no la tienen. Esto es significativo, ya que las sustancias antes mencionadas pueden ser usadas para reducir el daño que estos insectos ocasionan a la fruta cultivada en huertos comerciales y semi comerciales, en huertos de traspatio y en árboles aislados en jardines residenciales.

El presente invento tiene que ver con un método para el aislamiento de la feromona marcadora de hospedero (feromona disuasiva de oviposición) de Anastrepha ludens, que es aplicable a todas las especies del género Anastrepha. El invento también se relaciona a un método de síntesis de disuasivos de oviposición que poseen la fórmula general (II).

Donde R1 es H, C1-C4 alquil, C3-C6 cicloalquil, C3-ó C4 alquenil, C3-ó C4 alquinil.

R2 y R3, independientes uno de otro, son H ó C1- C4'alquil, C3-C6 cicloalquil, C3-ó C4 alquenil, C3- ó C4 alquinil, bencil ó bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1- C4 alquil.

R4 es H ó C1-C4 alquil, C3-C6 cicloalquil, C3-ó C4 alquenil, C3-ó C4 alquinil, C1-C4 alquil carbonil, bencil ó bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1-C4 alquil.

Donde a se refiere a estereoisómeros (R) ó (S) (ó sus mezclas), con la premisa que R1 no es = H.

Donde n = un intervalo entre 0 y 15.

Donde * se refiere a la estereoquímica (L) ó (D) del aminoácido (ó sus mezclas).

Los grupos alquil, alquenil y alquinil en las definiciones antes mencionadas pueden ser cadenas rectas ó ramificadas. Los grupos alquil son por ejemplo : metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, sec-butil, iso-butil, y tert-butil.

Ejemplos de alquenilos son : vinilo, alilo, metalilo, 1-metil-vinil, but-2-en-1-il.

Los radicales cicloalquilos que son sustituyentes adecuados son por ejemplo : ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, y ciclohexil.

Alquil carbonil son por ejemplo, acetil, propionil y pivaloil.

La invención también incluye a las sales acidas mono-ó di-carboxilicas que el compuesto de la fórmula (II) puede formar con bases. Estas sales son : sales metálicas alcalinas (de sodio y potasio); sales metálicas alcalinoterreas, (de calcio y magnesio); sales de amonio (no sustituidas y mono ó polisustituidas, tales como : sales de trietilamonio y de metilamonio); ó sales con otras bases.

Los agentes formadores de sales, preferentemente metales alcalinos e hidróxidos de metales alcalinoterreos por ejemplo, hidróxidos de litio, sodio, potasio, magnesio o calcio y en particular aquellos de sodio y potasio.

Ejemplos de aminas que son adecuadas para la formación de sales de amonio incluyen al amonio, y las C1-C8 alquil-aminas primarias, secundarias y terciarias. Por ejemplo, metilamina, etilamina, n- propilamina, dietilamina y trietilamina, preferentemente trietilamina.

La posible presencia de al menos un carbón asimétrico en los compuestos de la fórmula (II) significa que los compuestos pueden presentarse como isómeros individuales, ópticamente activos y en forma de mezclas racémicas. En el presente invento, se debe entender que los compuestos activos de la fórmula (II) comprenden a los antípodas ópticamente puros y a los racematos ó diasteroisómeros.

Si un enlace alifático doble C=C se encuentra presente, puede existir isomería geométrica. El presente invento también comprende a estos isómeros.

Los compuestos preferidos de la fórmula (II) tienen la fórmula (IIa). en los que R1, R2, R3, n, a y * son como se definen bajo la fórmula (II).

En particular, los compuestos preferidos de la fórmula (IIa-) en que R1 es metil, y n es un intervalo entre 5 y 10.

Los compuestos que son especialmente preferidos son aquellos de la fórmula (IIa) en los que R2 y R3, independientemente uno de-otro, son H ó metil.

Los compuestos con preferencia especial poseen estereoquímica a (R) ó (S) ó son una mezcla de isómeros a- (R)/ (S).

Los compuestos de particular importancia tienen estereoquímica (L) en *.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Producción del material en crudo (feromona natural) El material en crudo se extrajo de heces de las moscas A. ludens, A. obliqua y A. serpentina criadas en laboratorio. Las heces se obtuvieron de la siguiente manera : En una jaula de vidrio de 30 X 30 X 30 cm, se colocaron 300 ml de pupas de moscas de la fruta (equivalente a ca. 11,000 moscas adultas). Se colocaron dos pedazos de vidrio de 13 X 25 x 0.3 cm dentro de la caja para incrementar la superficie expuesta a las moscas. En cada jaula se colocó

alimento (sacarosa y proteina hidrolizada en una proporción de 3 : 1 y agua). Las moscas se mantuvieron en las jaulas durante 30 días. Posteriormente se removieron todas las moscas vivas y muertas así como los huevos secos, alas y patas rotas. Hecho esto, se rasparon de las paredes los"desechos"restantes (que contenían mayormente heces de mosca) utilizando una espátula de metal. El rendimiento de cada jaula fue de ca. 10 g de heces. Las heces de mosca se conservaron en cajas de Petri de plástico a-15°C hasta el momento de ser utilizadas.

Para obtener extractos de feromona crudos para purificación y experimentación, se mezclaron lotes de 400 g de heces de Anastrepha con 1,000 ml de metanol y se sonicaron manualmente durante 15 minutos.

Después de esto, el líquido fue centrifugado a 12,000 RPM durante 20 minutos. El sobrenadante fue concentrado en un evaporador rotatorio (rotavapor) para obtener la solución primaria para uso posterior.

EXTRACCION, PURIFICACION Y DETERMINACION ESTRUCTURAL DE LA FEROMONA DE MARCAJE DE HOSPEDERO (FMH) DE Anastrepha ludens Procedimiento de extracción y purificación de la feromona disuasiva de oviposición ó feromona de marcaie de hospedero

Extracción.

Se suspendieron 167 g de heces de la mosca Anastrepha ludens en 5 1 de etanol, agitándose durante 17 horas a temperatura ambiente. El material sólido fue eliminado por filtración, enjuagado con 1 1 de etanol. Este proceso de extracción se repitió con 2 1 de etanol que contenian 3.5 ml de ácido trifluoro acético. Los extractos de etanol combinados se concentraron en un evaporador rotatorio a 50°C y 20 mbar hasta casi desecarlos. Después de 6 horas de liofilización, el residuo (33.8 g) se disolvió en 300 ml de metanol a 50°C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, el precipitado graso (10.5 g) fue eliminado por filtración y enjuagado con metanol. Posteriormente, la solución se dejó evaporar hasta que se secara, resultando 23.3 g de un residuo amarillo miel el cual, fue utilizado en cuatro lotes para Cromatografía Liquida de Alta Presión (CLAP).

Purificación.

Columna 1 : 50 x 250 mm, Lichrospher RP-18,7 ßm (Merck). Tasa de flujo : 0-60 min. : 75 ml/min., 60-90 min. : 100 ml/min. Fase móvil : 0-60 min., gradiente lineal de 100 W agua a 100 W metanol, 60-90 min. : 100 o metanol. Las fracciones se separaron de acuerdo con el tamaño de los picos del cromatograma.

Detección ultravioleta : 220 nm. La actividad

electrofisiológica se eluyó entre 47 y 60 minutos, conteniendo 2.43 g de materia seca.

Columna 2 : 50 x 250 mm, Kromasil KR100-C18, spher. 7 µm (Eka Nobel). Tasa de flujo 0-45 min. : 70 ml/min., 45-90 min. : 100 ml/min. Fase móvil : 0-45 min. : gradiente lineal de acetonitrilo al 50 W en agua a acetonitrilo al 100 %. Las fracciones se separaron de acuerdo con el tamaño de los picos del cromatograma. Detección ultravioleta : 200 nm. Se detectaron dos regiones electrofisiológicamente activas : (1) 12-18 min. que contenía 63 mg de materia seca, y (2) 36-42 min., que contenía 28 mg de materia seca.

Para investigaciones posteriores, solamente se purificó material de la región 1.

Las fases móviles consistieron en las siguientes soluciones : A : 100 W de agua con 0.1 Os de ácido fórmico.

B : 100 W de acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico.

Detection : UV a 195 nm.

Las columnas CLAP fueron provistas por : Macherey- Nagel.

Columna 3 : 10 x 250 mm, 10 µm Nucleosil CN 100.

Tasa de flujo : 4 ml/min. Inyección : 6.3 mg en 1.0 ml de agua (10 repeticiones). Fase móvil : 0-2 min. 80% de A y 20% de B; 2-25 min., gradiente lineal de 80%

de A y 20% de B a 60% de A y 40% de B; 25-35 min. 60% de A y 40% de B; 35-40 min., gradiente lineal de 60% de A y 40% de B a 100% de B. Volumen de las fracciones : 4 ml. Actividad electrofisiológica en la fracción 23-27, evaporada (Rotavap), disuelta en 1 ml de 50% de A y 50% de B.

Columna 4 : 10 x 250 mm, 7 µm Fenil Nucleosil 100.

Tasa de flujo : 4 ml/min. Inyección 200 Al (5 repeticiones). Fase móvil : 0-60 min. 68% de A y 32% de B. Volumen de la fracción : 4 ml. Actividad electrofisiológica en la fracción 36-42, evaporada y disuelta en 5 ml de 50% de A y 50% de B.

Columna 5 : 10 x 250 mm, 7 µm Nucleosil C-18 100.

Tasa de flujo : 4 ml/min. Inyección 1 ml (5 repeticiones). Fase móvil : 0-60 min. 65 % de A y 35 % de B. Volumen de las fracciones : 4 ml. Actividad electrofisiológica en la fracción 34-40, evaporada y disuelta en 1.0 ml de 50% de A y 50% de B.

Columna 6 : 4 x 250 mm, 7 µm Nucleosil OH (Diol) 100.

Tasa de flujo : 1.0 ml/min. Inyección : 200 ul (5 repeticiones). Fase móvil : 0-70 min., 65 % de A y 35 % de B. Volumen de la fracción : 1.0 ml. Actividad electrofisiológica en la fracción 9-11, evaporada y disuelta en 1.0 ml de 50% de A y 50% de B.

Columna 7 : 4 x 250 mm, 5 µm Nucleosil C-18 AB 100.

Tasa de flujo : 1.0 ml/min. Inyección : 250 yl (4 repeticiones). Fase móvil : 0-70 min. 65% de A y 35% de B. Volumen de la fracción : 1.0 mi. Actividad

electrofisiológica en las fracciones 49-52 y evaporadas hasta secarlas, para el análisis estructural.

Determinación estructural de la feromona disuasiva de oviposición (marcadora de hospedero) Espectroscopia de masas La espectroscopia de masas FAB (Fast Atom Bombardment-MS en inglés) da fuertes iones moleculares a m/z 400 (MH+) y 422 (M Na+), esto corresponde a un peso molecular para la feromona de 399. La masa exacta se ha determinado por medio de espectroscopia de masas de alta resolución en 422.2864 para M+Na y la fórmula molecular pudo deducirse en C22H41NO5 para la feromona con una diferencia de 1-8 uma entre la masa calculada y la observada.

La feromona se ha esterificado con diazometano dando un ion molecular a m/z 428 (MH+, APCI-MS). La diferencia de 28 unidades de masa indica la presencia de dos grupos carboxil metilados. Se observan fragmentaciones características para el ion molecular en el modo MS-MS. Todos los fragmentos registrados se pueden asignar a fracturas específicas (intensidades relativas en % del pico basal).

428 (77), 396 (31), 368 (8), 336 (1), 253 (6), 225 (5), 183 (2), 176 (100), 169 (6), 158 (45), 155 (4), 144 (42),

141 (4), 127 (6), 116 (19), 113 (4), 99 (4), 98 (17), 85 (3), 71 (4), , 57 (4), 43 (1).

Datos de Resonancia Macrnética Nuclear.

Corrimientos quimicos de la feromona natural aislada en ppm, 500 MHz, en CDCl3 : Carbono No. Corrimientos Multiplicidade Corrimientos de carbono s de protón 1 176. 8 COOH- 2 51. 3 CH2 4. 67 br. 3 26.5 CH2 4.67 br. 2.25 br. 4 29. 4 CH 2.53 br. 5 178. 8 COOH NH6.26br.-- CONH-1'177.2 21 41. 3 CH 2.28 br. 3'34.3 CH2 1.63,1.41 br. 4' - 12' 29.9, 29.7 CH2 1.25-1.26 (2x), 29.5, br. 29.2,29.0, 28.8,27.4, 27.2 CH21.14br.13'29.0 14'27. 9 CH 1.51 m 15', 14'-Me 22. 7 CH3 0.86 d 2'-Me 17. 7 CH3 1.15 d

Las señales de RMN en solventes metanólicos son marcadamente más agudas. Los corrimientos químicos de la feromona natural en CDC13/CD30D 1 : 1 son :

1H-NMR : 7.60 (s, 1 NH), 4.36 (dd, 1H), 2.32 (m, 2H), 2.27 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 1.52 (m, 1H), 1.42 (m, 1H), 1.29 (m, 1H), 1.18 (br., 18H), 1.07 (q, 2H), 1.03 (d, 3H), 0.77 (d, 6H).

13C-NMR (CDC13 77.0 ppm) : 177.99,175.04,173.5, 51.18,40.45,38.49,33.56, 29.76,29.29,29.05,29.00 (4x), 28.89,27.34,26.84,26.76, 26.32,21.71 (2x), 16.67.

Las conectividades carbónicas y protónicas están basadas en experimentos de RMN bidimensionales extendidos (COSY, HCCORR, HMBC, ROESY).

Determinación de quiralidad de la fracción del aminoácido La feromona natural hidrolizada en ácido se ha derivado al ácido glutámico N-trifluoroacetil isopropiléster. En la columna GC quiral (Chirasil-L- Val), el isómero L tuvo un tiempo de retención de 25.6 minutos, el isómero D, de 24.2 minutos, con base en los compuestos sintéticos. Programa de temperaturas : 70°C (3 min. isocrático, 2°C/min. a 190°C). Sorprendentemente, la muestra de producto natural purificado cromatográficamente consistió de un 21 t de ácido D-glutámico y un 79 t de ácido L- glutámico, lo cual se ha confirmado por coinyección de la muestra natural y sintética.

Determinación de quiralidad de la fracción de ácido graso a-metil Los cuatro estereoisómeros posibles se pueden describir como R-L, S-L, R-D, S-D, de los cuales R y S describen la quiralidad del ácido graso a-metil, mientras que L y D indican la quiralidad del ácido glutámico.

La síntesis total de todos los isómeros posibles se ha logrado por medio de rutas estereoselectivas análogas a los procedimientos en la literatura. Los dos pares diasteroméricos de enantiómeros se pueden distinguir bajo condiciones específicas de CLAP (Nucleosil-100-7um-Fenil, 10 x 250 mm, 4 ml/min, 40 % de acetonitrilo/60 % de agua, ácido fórmico al 0.1 , 195 nm detección ultravioleta). El tiempo de retención para R-L y S-D fue 46 minutos en tanto que R-D y S-L fue de 48 minutos. La feromona natural eluyó después de 46 minutos. Dado que la configuración del aminoácido del producto natural se determinó como L, la quiralidad del grupo a-metil de la parte del ácido isopalmítico fue asignada sin ambigüedad a R. Esto se ha confirmado mediante la coinyección de la feromona natural y del compuesto sintetizado.

Formula I. Estructura química de la feromona de marcaje de hospedero (FMH) natural de Anastrepha ludens indicando la numeración de carbonos.

Donde la estereoquímica en C-2 es 79 : 21 (L) : (D) I. SINTESIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FORMULA (II) De acuerdo al invento, el proceso de preparación de los compuestos de la fórmula (II) se realiza análogamente a los procedimientos reportados en la literatura y que incluye a) reacción de un compuesto de la fórmula (III)

donde R1, R2, R3, n y a se encuentran definidos bajo la fórmula (II), donde X es un grupo activado ácido, por ejemplo halógeno, en un solvente orgánico inerte presenciadeunabase,enla con un compuesto de la fórmula (IV)

en el que R4 y * son como se define en la fórmula (II), y donde R5 representa a grupos protectores desprendibles, para dar los compuestos de la fórmula (V)

en el que los grupos protectores R5 de esos compuestos son separados y remplazados por H, ó b) reacción de un compuesto de la fórmula (III)

donde R1, R2, R3, n y a son como se define en la fórmula (II), y X es un grupo activador ácido, por ejemplo halógeno, en un solvente orgánico inerte en presencia de una base y un agente solubilizador, por ejemplo cloruro de litio, con un compuesto de la fórmula (VI) en que R4 y * se definen como se ha hecho previamente.

Compuestos de fórmula (VI) son derivados de ácido glutámico y se encuentran ampliamente disponibles.

Compuestos de la fórmula (IV) conteniendo grupos protectores R5 que son grupos protectores típicos

usados en química de péptidos. Ejemplos de ellos son Cl--C4 alquil; bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1-C4 alquil; C3-ó C4 alquenil.

Los grupos alquil, alquenil y alquinil en las definiciones antes mencionadas, pueden ser cadenas rectas o ramificadas. Los grupos alquil son por ejemplo, metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, sec-butil, iso-butil, y tert-butil. Como un ejemplo de grupos alquenil protectores, se prefiere alilo.

Especialmente preferidos son los compuestos donde R5 es bencil.

Los grupos protectores pueden ser introducidos y eliminados por métodos conocidos (para ejemplos ver Greene, 1981). Por ejemplo, en un compuesto de la fórmula (V) donde R5 es bencil, la desprotección puede obtenerse por hidrogenación catalítica estandard, ó por hidrogenación por transferencia catalítica de hidrógeno como se describe en la literatura (Means et al, 1979).

Los grupos activadores usados para la unión del compuesto (III) con los compuestos (IV) y (VI) son por ejemplo, halógeno ó esters activados muy conocidos en la síntesis de péptidos (ver ejemplo en Geiger (1985)). Los métodos preferidos para la

activación de el ácido (Compuesto III, X=OH) son la formación de@ el ácido clorhídrico, usando por ejemplo cloruro de tionilo con una cantidad catalítica de dimetilformamida, ó formación de los esters activados usando, por ejemplo, N-etil-N-(3- dimetilaminopropil)-carbodimida (EDC) ó diciclohexilcarbodiimida. La reacción del compuesto (III) con el compuesto (IV) se lleva a cabo en un solvente orgánico inerte, por ejemplo un solvente hidrocarburo clorinado como el diclorometano, ó un solvente hidrocarburo aromático, como el tolueno, en presencia de una base, por ejemplo una alquil-amina como la trietilamina ó una amina aromática, por ejemplo 4-dimetilaminopiridina (DMAP), ó una combinación de bases. La reacción puede llevarse a cabo a temperaturas entre O y 120°C.

La reacción de los compuestos de la fórmula (VI) con compuestos de la fórmula (III) se lleva a cabo en presencia de una agente solubilizador como el LiY, donde Y es un halógeno, por ejemplo cloro, en un solvente éter inerte, como el tetrahidrofurano, a temperaturas entre O y 120°C. El uso de agentes solubilizadores en la química de péptidos es muy conocido en la literatura (e. g., Seebach et al, (1995)).

Los compuestos de la fórmula (III) conteniendo un grupo a-metilo pueden ser preparados de forma

racémica de acuerdo a los métodos descritos en la literatura (para ejemplos ver Hoefle et al., US 4,716,175 A (1987)). Los compuestos de fórmula (V) se forman subsecuentemente como mezclas de diastereoisómeros y pueden ser separados por ejemplo por métodos de CLAP.

Alternativamente, los compuestos de fórmula (III) (donde R1 no es H) pueden ser preparados de una manera estereoespecífica adhiriendo un grupo que contenga por lo menos un centro quiral (un auxiliar quiral) a un compuesto de fórmula (III) (donde R1 es H), que lleva a un compuesto quiral de la fórmula (VII), que puede entonces reaccionar con un compuesto R1-Y, donde R1 es como se definió previamente, con la premisa de que no sea H, y Y es halógeno, para obtener el compuesto de fórmula (VIII), y luego separándolos del auxiliar quiral, para dar compuestos de la fórmula (III). Subsecuentemente la activación y reacción de estos compuestos con compuestos de la fórmula (IV) ó (VI) permiten la obtención de compuestos de la fórmula (II) ó (V), donde R1 no es H, en forma no-racémica, como se ilustra en el esquema 1.

Esauema 1 R R2 R2 R3 Acoptamiento con Activación ei auxiliarquiral r (CH2) n (CH2) n (CH2) n O O O AUXILIAR QUIRAL OH X Vil III (X = Grupo activado) R2 R ?. R 3 R3 2. Alquilacion (CH2) n Hidrólisis 5 (CH2) n con R1-Y AUXILIAR QUIRAL + (X 0 a AUXILIAR QUIRAL RI NOH Ru p (X = OH) (R) or (S) Vill (R) or (S) 1. Activación 2. Compuesto IV o VI Compuestos de formula il o V E1 uso de auxiliares quirales en síntesis estereoespecificas es bien conocido (Ager et al., (1995)). Los auxiliares quirales son por ejemplo, 2- ó(R)- (S)-Bornane-10,2-sultams,- 2- (S)-Bornane-10, 2-Sultam 2- (R)-Bomane-10, 2-Sultam

que pueden unirse a los compuestos de la fórmula (III), donde X es un grupo activador por ejemplo cloro, donde R2, R3 y n son como se define en fórmula (II), y R1 es H, para dar los compuestos de la fórmula (VIIa) y (VIIb).

Los compuestos de la fórmula (VIIa) pueden ser deprotonados con una base fuerte, por ejemplo n-butil litio, en un solvente inerte, tal como el tetrahidrofurano, y un co-solvente dipolar aproteónico (aprotic en inglés), tal como la 1,3- -pirimidona(DMPU),ydimetil-tetrahidro-2-(1H) subsecuentemente reaccionar con un agente alquilador R1-Y, donde R1 se ha definido previamente, con la premisa de que no es H, y Y es un halógeno, por ejemplo iodo, para dar un compuesto (VIIIa), preferencialmente de la configuración R1-a ilustrada para (VIIIa). 2 Z R3 (CH2) n (CH2) 1. Base, eg. n-BuLi Solvente O a .-N2. Rt-Y oN R1 , Sss O oO O 0 0 O O Vlla Vlila

Análogamente, los compuestos de la fórmula (VIIb) pueden reaccionar con compuestos R1-Y para dar compuestos de tipo (VIIIb), donde la configuración R1-a esta predominantemente como se muestra en (VIIIb). Ru rus 1. Base, eg. n-BuLi (CH2) n (CH2) n Solvente C 2. R1-Y Ru O O O O 0 0 Vllb Vlllb

Alquilaciones selectivas de este tipo son predecibles y bien documentadas en la literatura (Oppolzer et al., (1989)).

Los auxiliares quirales pueden separarse de los compuestos de la fórmula (VIII) por ejemplo, por hidrólisis por una base, por ejemplo hidróxido de litio, en un solvente inerte, tal como tetrahidrofurano, y un solvente proteónico (protic en

inglés) como el agua, en la presencia de un peróxido inorgánico, tal como el peróxido de hidrógeno, de manera análoga a los procedimientos en la literatura (Evans et al., 1987). Después de la activación, los compuestos de fórmula (III), donde X es un grupo activador, por ejemplo cloro, pueden usarse para preparar compuestos de la fórmula (II) con estereoquimica a definida, basándose en las discusiones mecanísticas de Opollzer et al. (1989).

Un experto en la materia puede darse cuenta que los compuestos de la fórmula (II) pueden prepararse de acuerdo a este proceso con estereoquímica definida en las posiciones a y * por selección juiciosa del auxiliar quiral, y los isómeros L-ó D de los compuestos de las fórmulas (IV) ó (VI).

Los siguientes ejemplos (1-36) ilustran la síntesis estereoespecífica del invento sin limitaciones : Compuestos de las fórmulas VIIa y VIIb

Elemplo 1 : (Compuesto VIIbl, R2 = Me, R3 = Me, n=5) : Se disolvió una solución de 750 mg del ácido 14- methyl-pentadecanoico (preparado como lo describe C.

Djerassi et al. (J. Org. Chem., 51 : 2751,1986) en cloruro de tionilo (10ml) a temperatura ambiente y se trató con una o dos gota-s de dimetil formamida. La solución se agitó a temperatura ambiente hasta que cesó la evolución gaseosa (ca. 1 hr.). E1 exceso de cloruro de tionilo fue removido in vacuo y luego el residuo fue disuelto en tolueno anhidro (10ml). A continuación esta solución fue añadida a una suspensión de 2- (R)-Bornane-10,2-sal de sultam de sodio (que se preparó tratando 2- (R)-Bornane-10,2- sultam (692mg) disuelto en tolueno anhidro (40 ml) con hidruro de sodio (200 mg de 80t de hidruro de sodio en aceite mineral a temperatura ambiente). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que el análisis TLC (5 : 1 hexano : acetato de etilo) mostró que la reacción se había completado (ca. 1 hr.). A continuación la mezcla de reacción fue diluida con acetato de etilo y HC1 al 100, la capa decantada,lavadaconNaHCO3(10%fue en agua), y luego secada en Na2S04 y concentrada in vacuo. Los compuestos crudos fueron purificados por medio de cromatografía flash para resultar en los compuestos (VIIbl) (1.208 g) en forma de aceites pálidos.

Datos seleccionados de 1H RMN (en CDC13 en ppm) : 0.854,6H, d, (J = 5.7 Hz); 0.963,3H, s; 1.114,2H, m; 1.51,3H, s; 1.240, br s; 2.69,2H, m; 3.38-3.51, 2H, cuarteta AB (J = 22.3Hz y 14.1 Hz); 3.36,1H, t, (J = 6.1 Hz).

Los siguientes compuestos se prepararon de manera análoga : Eiemplo 2 : (Compuesto VIIb2, R2 = Me, R3 = H, n=5) : Datos seleccionados de 1H RMN (en CDC13 en ppm) : 0.873,3H, t, (J = 6.4 Hz); 0.963,3H, s; 1.150,3H, s; 1.240, br s; 2.69,2H, m; 3.38-3.51,2H, cuarteta AB (J = 22 Hz y 14.3 Hz); 3.37,1H, t, (J = 6. 0 Hz).

Ejemplo 3 : (Compuesto VIIal, R2 = Me, R3 = Me, n=5) : Enantiómero del ejemplo 1, RMN idéntica.

Ejemplo 4 : (Compuesto VIIa2, R2 = Me, R2 = H, n=5) : Enantiómero del ejemplo 2, RMN idéntica.

Compuestos Villa v VIIIb

Ejemplo 5 : (Compuesto VIIIbl, R1 = R2 = R3 = Me, a = Estereoquímica (R), n=5) : Se enfrío a -78°C en nitrógeno una solución de l. lg de VIIbl en tetrahidrofurano (THF) (15ml) y luego se trató por goteo durante 10 minutos con una solución. de n-butil litio (1.6 M en hexano, 1.6ml). Esta solución se agitó a-78°C y luego se trató con DMPU (3.83ml) durante 15 minutos. Posteriormente, se continuó agitando la solución a-78°C durante 1 hora y luego se trató con yoduro de metilo (5eq.) a la misma temperatura. Toda la reacción se monitoreó por medio de TLC (9 : 1 hexano : acetato de etilo) hasta que se completó (ca 4-6 hr). A continuación, la mezcla de reacción se trató a-78°C con HC1 al 10% y acetato de etilo y luego se dejó calentar a temperatura ambiente. Se decantó la fase orgánica, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo, y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, y luego con NaHCO3 acuoso al 10%. E1 secado en Na2S04 y la concentración in vacuo resultaron en los productos crudos en forma de aceites. El análisis 1H-RMN de los productos crudos (RMN integración de tripletas a 3.893 ppm (J = 6.3 Hz, isómero mayor) y 3.667 ppm (J 6.3 Hz, (isómero menor)) mostraron una diasteroselectividad de la alquilación de ca. 9 : 11.

Los diastereoisómeros se pudieron separar por medio de cromatografía y/o recristalización. La obtención del compuesto principal VIIIbl (R1 = R2 = R3 = Me,

a = (R) Estereoquímica, n=5) fue de 782mg (cristales blancos). tpf : 39.4-39.5°C.

(Compuesto VIIIbl) Datos seleccionados de 1H-NMR (CDC13 en ppm) : 0.854,6H., d, (J = 6.6Hz); 0.963,3H, s; 1.114,2H, m; 1.51,3H, s; 1.19,3H, d, (J = 6.9 Hz); 1.235, br s; 3.04,1H, m; 3.39-3.52,2H, cuarteta AB (J = 24 Hz y 12 Hz) ; 3.893,1H, t, (J = 6.3 Hz).

13C-NMR (n CDC13) : 18.895; 19.734; 20.681; 22.534,, 26.318; 27.171; 27.293; 27.831; 29.539; 29.488; 29.538; 29.567; 29.602; 29.818; 32.567; 32.686; 38.352; 38.947; 40.246; 44.513; 47.611; 48.135; 53.091; 64.996; 176.455.

Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga : Eiemplo 6 : (Compuesto VIIIb2, Rl = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R), n=5) : Diastereo selectividad >98 : 2 de tripletas a 3.893 (isómero mayor) y 3.730 ppm (isómero menor) : Purificación por medio de cromatografía flash y recristalización (- 20°C pentano, tpf : 39.5-40.6°C).

Datos seleccionados de 1H-NMR (en CDC13 en ppm) :

1.195,3H, d, (J = 6.6 Hz); 3.041,1H, m; 3.400- 3. 521, 2H, cuarteta AB (J = 22. 5 Hz y 13. 8 Hz) ; 3.893,1H, t, (J = 6.2 Hz).

Eiemplo 7 : (Compuesto VIIIal, R1 = R2 = R3 = Me, a = Estereoquímica (S), n=5) : Diastereoselectividad >98 : 2 (no se detectó el isómero menor). Purificación por medio de cromatografía flash y recristalización (pentano-20°C, tpf : 40.1-40.8°C).

1H-NMR : Como en el ejemplo 5 (enantiómeros).

Eiemplo 8 : (Compuesto VIIIa2, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (S), n=5) : Diastereo selectividad 97 : 3 (integración de tripletas a 3.893 (isómero mayor) y 3.667 ppm (isómero menor)).

Purificación por medio de cromatografía flash y recristalización (-20°C, pentano, tpf : 39.5-39.6°C).

1H-NMR : Como en el ejemplo 6 (enantiómeros).

Compuesto III

Eiemplo 9 : (Compuesto III1, X = OH, Rl = R2 = R3 = Me, a = Estereoquímica (R), n=5) : Se enfrió a 0°C una solución de (VIIIb1) (750 mg.) en THF : H20 4 : 1 (20 ml/mmol) y luego se trató con LiOH. H2O (8 eq.) y H202 acuoso al 30% (714 mg).

La suspensión se agitó a-0°C durante 1 hora y luego se dejó calentar a temperatura ambiente, agitándose a esta temperatura hasta que se completó la reacción (análisis TLC, 3 : 1 hexano : acetato de etilo, 6-18 hr.). A continuación, la mezcla de la reacción se NaHSO3acuosoal10%,seacidificóconHCltratócon acuoso al 10%, y se extrajo con acetato de etilo. La fase de acetato de etilo se lavó con H20, se secó en Na2SO4 y se concentró in vacuo. El residuo del producto crudo se trituró en pentano, los cristales blancos de 2- (R)-bornane-10,2-sultam fueron filtrados en la bomba, y el filtrado fue concentrado in vacuo resultando en el ácido (III1) el cual se pudo utilizar en el siguiente paso sin más purificación.

Las muestras analíticas se pudieron obtener del pentano por medio de recristalización a-20°C.

(Compuesto III1, OH,R1=R2=R3=Me,α== Estereoquímica (R), n=5) : tpf : 25.7-26.4°C.

1H-NMR (CDCl3 en ppm) : 0.856,6H, d, (J = 6.9Hz); 1.114,2H, m; 1.172,3H, d, (J - 7.2Hz) ; 1.249, br s; 1.42, 1H, m; 1.51,1H, m; 1.66,1H, m; 2.45, IH, m.

Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga : Eiemplo 10 : (Compuesto 1112, X = OH, Rl = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R), n=5) : tpf : 39.0-40.6°C.

1H-NMR (CDC13 en ppm) : 0.875,3H, t, (J = 7. 2Hz); 1.171,3H, d, (J = 6.9Hz); 1.249, br s; 1.42,1H, m; 1.66,1H, m; 2.45,1H, m.

Eiemplo 11 : (Compuesto III3, X = OH, Rl = R2 = R3 = Me, a = Estereoquímica (S), n=5) : tpf : 25.4-26.5°C.

1H-NMR : Como en el ejemplo 9 (enantiómeros).

:(CompuestoIII4,X=OH,R1=Me,R2=H,Ejemplo12 R3 = Me, a = Estereoquímica (S), n=5) : tpf : 39.5-39.6°C.

1H-NMR : Como en el ejemplo 10 (enantiómeros).

Eiemplo 13 : (Compuesto Vl, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a = Estereoquímica (R), * Estereoquímica (L), n=5) : Una muestra del ácido (III1) (6.77 g) en cloruro de metileno (300ml) se trató secuencialmente a temperatura ambiente con 13.86 g de (L)-H-Glu (OBn- OBn)-para-toluen-sulfonato, trietilamina (5.6 g) y enfriada a O°C. Esta solución se trató luego con N- etil-N'- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (5.3 g) y se dejó calentar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura hasta que el análisis TLC (5 : 1 hexano : acetato de etilo) mostró que se habia completado la reacción (4-6 hr.). La mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y luego se lavó sucesivamente con HC1 acuoso al 10%, H2O, y NaHCO3 acuoso saturado. El secado en Na2SO4 y la concentración in vacuo resultaron en los productos crudos, los cuales fueron purificados por medio de cromatografía flash (8 : 1 hexano : acetato de etilo)

para dar 9.1 g del compuesto del título como cristales blancos.

(Compuesto V1, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 <BR> <BR> <BR> <BR> α=Estereoquímica(R),*=Estereoquímica=Bencil, (L), n=5) : tpf : 74.2-76.4°C.

H-NMR (CDC13 en ppm) : 0.873,6H, d, (J = 6. 6Hz); 1.122,3H, d, (J = 6.9Hz); 1.145,2H, m; 1.238, br s; 3H, m; 2.02,1H, m; 2.12-2.52,4H, m; 4.68,1H, m; 5.11,2H, s; 5.18,2H, s; 6.14,1H, br d, (J = 7.6Hz); 7.38, 10H, br s.

13C-NMR (CDC13 en ppm) : 17.955; 22.53; 27.99; 27.328 ; 27.837; 29.487; 29.530; 29.588; 29.608; 29.824; 30.146; 34.115; 38.946; 41.299; 51.425; 66.465; 67.240; 128.15; 128.287; 128.316; 128.502; 128.581; 128.638; 135.255; 135.855; 172.955; 172.855; 177.855.

Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga : Ejemplo 14 : (Compuesto V2, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, <BR> <BR> <BR> <BR> H,R5=Bencil,α=Estereoquímica(R),*=R4= Estereoquímica (D), n=5) : tpf : 64.6-64.7°C.

H-NMR (CDCl3 en ppm) : 0.861,6H, d, (J = 6.6Hz); 1.122,3H, d, (J = 6.9Hz); 1.105,2H, m; 1.241, br s; 1.26-1.68,3H, m; 2.02,1H, m; m; 4.68,1H, m; 5.097,2H, s; 5.160,2H, s; 6.18,1H, br d, (J = 7.6Hz); 7.38,1OH, br s.

13C-NMR (CDC13 en ppm) : 17.566; 22.544; 27.069; 27.227; 27.306; 27.851; 29.393; 29.508; 29.522; 29.551; 29.579; 29.602; 29.838; 30.168; 34.062; 38.960; 41.262; 51.418; 66.493; 67.232; 128.272; 128.287; 128.351; 128.469; 128.609; 128.652; 135.222; 135.702; 171.935; 172.846; 176.805.

Ejemplo 15 : (Compuesto V3, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a= Estereoquímica (S), * Estereoquímica (L), n=5) : tpf : 64.5-64.9°C.

Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 14 (enantiómeros).

Eiemplo 16 : (Compuesto V4, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a= Estereoquímica (S), * = Estereoquímica (D), n=5) : tpf : 74.6-75.4°C.

Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 13

Eiemplo 17 : (Compuesto V5, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a = Estereoquímica (R), * = Estereoquímica (L), n=5) : tpf : 79.2-79.8°C.

1H-NMR (CDC13 en ppm) : 0.809,3H, t, (J = 6.9 Hz) ; 1.0385,3H, d, (J = 6.9 Hz); 1.166 br s; 1.28,1H, m; 1.54,1H m; 1.966,1H, m; 2.093-2.449,4H, m; 4.603, 1H, m; 5.026,2H, s; 5.088,2H, s; 6.078,1H, br d, (J = 7.2 Hz); 7.38,10H, br s.

13C-NMR (en ppm en CD30D : CDCl3, 9 : 1) : 14.417; 18.326; 23.647; 27.319; 28.581; 30.403; 30.539; 30.632; 30.697; 30.712; 30.726; 31.185; 32.992; 35.194; 41.706; 52.757; 67.409; 67.897; 137.06; 137.112; 173.042; 174.046; 180.013.

Eiemplo 18 : (Compuesto V6, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a = Estereoquímica (R), * = Estereoquímica (D), n=5) : tpf : 64.5-65.1°C.

1H-NMR (CDC13 en ppm) : 0. 809,3H, t, (J = 6. 9 Hz) ; 1.0384,3H, d, (J = 6.9 Hz); 1.167 br s; 1.28,1H, m; 1.54,1H m; 1.966,1H, m; 2.093-2.449,4H, m; 4.603, 1H, m; 5.026,2H, s; 5.09,2H, s; 6.078,1H, br d, (J = 7.2 Hz); 7. 38, 10H, br s.

13C-NMR (in CD30D : CHC13 9 : 1 en ppm) : Idéntico al ejemplo 18 con excepción de los siguientes picos : 28.388; 35.015; 52.872; 173.035; 174.117; 180.070.

Eiemplo 19 : (Compuesto V7, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, <BR> <BR> <BR> <BR> H,R5=Bencil,α=Estereoquímica(S),*=R4= Estereoquímica (L), n=5) : tpf : 62.2-62.7°C.

Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 18 (enantiómeros).

Eiemplo 20 : (Compuesto V8, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, <BR> <BR> <BR> <BR> H,R5=Bencil,α=Estereoquímica(S),*=R4= Estereoquímica (D), n=5) : tpf : 78.3-79.4°C.

Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 17 (enantiómeros).

Elemplo 21 : (Compuesto V9, R1 = H, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, * = Estereoquímica (L), n=5) : tpf : 62.2-62.7°C.

1H-NMR (CDC13 en ppm) : 0.867,6H, d, (J = 6. 6 Hz) ;

1H, m; 2.160,2H, t, (J = 7.9 Hz) : 2.160-2.51,2H, m; 4. 68, 1H, 2H, s : 5.18,2H, s : 6.17,1H, br d, (J = 7.2 Hz); 7.38,10H, br s.

13C-NMR (en CDCl3 en ppm) : 22. 48 ; 22. 509 ; 25. 371 ; 27.085; 27.264; 27.809; 29.100; 29.186; 29.322; 29.473;29.509;29.538;29.573;29.796;30.119 ; 36.315; 38.918; 51.469; 66.416; 67.190; 128.216; 128.223; 128.230; 128. 252; 128.295; 128. 467; 128.539; 128.560; 128.567; 135.173; 135.682; 171. 929; 172. 732 ; 173.241.

EiemDlo 22 : (Compuesto V10, R1 = H, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, * = Estereoquímica (D), n=5) : tpf : 62.3-63.4°C.

Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 21 (enantiómeros).

Eiemplo 23 : (Compuesto V11, R1 = H, R2 = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, * = Estereoquímica (L), n=5) : tpf : 45.5-46.0°C.

1H-NMR (CDC13 en ppm) : 0.867,3H, t, (J = 6.9 Hz); 1.243, br s; 1.48-1.66,2H, m; 2.603,1H, m; 2.160, 2H, t, (J = 7.9 Hz) : 2.160-2.51,2H, m; 4.68,1H, m;

5.11,2H, s; 5.18,2H, s; 6.17,1H, br d, (J = 7.4 Hz) ; 7.38, 1OH, br s.

Eiemplo 24 : (Compuesto V12, R1 = H, R2 = H, R3 = Me, H,R5=Bencil,*=Estereoquímica(D):R4= tpf : 47.0-48.10°C.

Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 23 (enantiómeros).

Compuesto Iia :(CompuestoIIa1,R1=Me,R2=Me,R3=Ejemplo25 Me, a = (R) Estereoquímica, * = Estereoquímica (L), n=5) : Una solución de (V1) (6.45) en MeOH : acetato de etilo (1 : 1,500ml) se agitó a temperatura ambiente y se 10%Pdsobrecarbón(150mg)enatmósferacon

completó. La suspensión fue filtrada sobre Hyflo Super Cella cual se lavó con acetato de etilo y concentrado in vacuo, para dar el producto crudo que se trituró con hexano. Esto produjo el compuesto del titulo (V1) (3.44g) como polvo blanco que fue analizado por RMN y CLAP (condiciones CLAP : Col. : Fenil RP Nucleosil 10 x 250 mm : Eluyente : 60 W H20 : 40 % CH3CN con 0.1 % ácido fórmico : Flujo : 4 ml/min. : Detección : Diodo, 195 nm.).

(Compuesto IIal, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, a = Estereoquímica (R), * = Estereoquímica (L), n=5) : tpf : 84-85°C.

1H-NMR (CD30D en ppm) : 0.880,6H, d, (J = 6.6Hz); 1.108,3H, d, (J = 6.6Hz); 1.91,2H, m; 1.286, br s; 1.32,1H, m; 1.54,1H, m; 1.61,1H, m; 1.953,1H, m; 2.180,1H, m; 2.394,2H, t, (J = 7.5Hz); 2.31-2.42, 1H, m; 4.413,1H, m; 8.13,1H, br d, (J = 7.4Hz).

13C-NMR (CD30D en ppm) : 18.170; 23.001; 28.503; 28.608; 29.110; 30.639; 30.696; 30.736; 30.785; 31.012; 35. 389 ; 40.228; 300 (br 2C); 179.7.

CLAP : Tiempo de retención (Tiempo de Ret.) : 46.0 min Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga :

Eiemplo 26 (Compuesto IIa2, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, Estereoquímica(S),*=Estereoquímica(L),= n=5) : 1H-NMR (CD30D en ppm) : 0.880,6H, d, (J=6.6Hz); 1.108,3H, d, 2H, m; 1.286, br s; 1.32,1H, m; 1.54,1H, m; 1.61,1H, m; 1.953,1H, m; 2.180,1H, m; 2.394,2H, t, (J = 7.5 Hz); 2.31-2.42, 1H, m; 4.413,1H, m; 8.13,1H, br d, (J=7.4Hz).

13C-NMR (CD30D en ppm) : 23.008; 27. 823 ; 28.422; 28.503; 30.639; 30.704; 30.744; 30.793; 31.011; 35.270; 40.228; 41.838; 52.940; 175.306; 176.68; 180.09.

CLAP : Tiempo de Ret. : 48.0 min.

:(CompuestoIIa3,R1=Me,R2=Me,R3=Ejemplo27 Me, a = Estereoquímica (S), * = Estereoquímica (D), n=5) : RMN idéntica a la del ejemplo 25 enantiómeros.

CLAP : Tiempo de Ret. : 46.0 min.

Ejemplo 28 : (Compuesto IIa4, R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me, a = Estereoquímica (R), * = Estereoquímica (D), n=5) :

RMN idéntica a la del ejemplo 26 (enantiómeros).

CLAP : Tiempo de Ret. : 48.0 min.

Ejemplo 29 : (Compuesto IIa5, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, Estereoquímica(R),*=Estereoquímica(L),= n=5) : tpf : 94-95°C.

H-NMR (CD30D en ppm) : 0.897,3H, t, (J = 7. 2 Hz) ; 1.103 3H, d, (J = 6.6 Hz); 1.286, br s; 1.32,1H, m; 1.61,1H, m; 1.953,1H, m; 2.180,1H, m; 2.394,2H, t, (J = 7.5 Hz); 2.31-2.42,1H, m; 4.413,1H, m; 8.13,1H, br d, (J = 7.4 Hz).

13C-NMR (CD30D en ppm) : 14.435; 18.212; 23.670; 28.037; 28.597; 30.447; 30.648; 30.705; 30.734; 30.748; 30.777; 31.445; 33.036; 41.893; 52.786; 176.870 (br 2C); 179.775.

CLAP : Tiempo de Ret. : 36.8 min.

Ejemplo 30 : (Compuesto IIa6, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R), * = Estereoquímica (D), n=5) :

1H-NMR (CD30D en ppm) : 0.897,3H, t, (J = 7.2 Hz); 1.103 3H, d, (J = 6.6 Hz); 1.286, br s; 1. 32, 1H, m; 1.61,1H, m; 1.953, 1H, m; 2.180,1H, m; 2.394,2H, t, (J = 7. 5 42,1H, m; 4.413,1H, m; 8.13,1H, br d, (J = 7.4 Hz).

13C-NMR (CD30D en ppm) : 14.435; 18.319; 23. 670 ; 28.037; 28.417; 30.447; 30.648; 30.705; 30.734; 30.748; 30.777; 31.955; 33.036; 41.893; 52.044; 176.870 (br 2C); 179.775.

CLAP : Tiempo de Ret. : 38.5 min.

Eiemplo 31 : (Compuesto IIa7, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquimica (S), * = Estereoquímica (D), n=5) : RMN idéntica a la del ejemplo 29 (enantiómeros).

CLAP : Tiempo de Ret. : 36.8 min.

Eiemplo 32 : (Compuesto IIa8, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (S), * = Estereoquímica (L), n=5) : RMN idéntica a la del ejemplo 30 (enantiómeros).

CLAP : Tiempo de Ret. : 38.2 min.

Eiemplo 33 : (Compuesto IIa9, R1 = H, R2 = R3 = Me, * = Estereoquímica (L), n=5) : 1H-NMR (CD30D en ppm) : 0.885,6H, d, (J=6.6 Hz); 1.

189,2H, m; 1.286, br s; 1.521,1H, m; 1.61,1H, m; 1.93,1H, m; 2.160,1H, m; 2.240,2H, t, (J=7.7 Hz); t, (J=7.7 Hz); 4.42,1H, m; 8.13,1H, br d, (J=7.4 Hz).

Ejemplo 34 : (Compuesto IIalO, R1 = H, R2 = R3 = Me, * = Estereoquímica (L), n=5) : RMN idéntica a la del ejemplo 33 (enantiómeros).

:(CompuestoIIa11,R1=R2=H,R3=Me,*Ejemplo35 = Estereoquímica (L), n=5) : 1H-NMR (CD30D en ppm) : 0.899,3H, t, (J=6.4 Hz); 1.282, br s; 1.61,2H, m; 1.94,1H, m; 2.18,1H, m; 2.240,2H, t, (J=7.7 Hz); 2.39,2H, t, (J=7.7 Hz); 4.42,1H, m; 8.12,1H, br d, (J=7.4 Hz).

:(CompuestoIIa12,R1=R2=H,R3=Me,*Ejemplo36 = Estereoquímica (D), n=5) : RMN idéntica a la del ejemplo 35 (enantiómeros).

A continuación se ilustra la síntesis no

separación resultante de la mezcla en los diasteroisómeros (ejemplos 38 y 39) Ejemplo 37 : (Compuesto IIal3, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R/S), * = Estereoquímica (L), n=6) : Una suspensión de ácido (L)-glutámico en 60ml de tetrahidrofurano fue tratada con LiCl anhidro (600mg) y luego, 2 g de cloruro racémico 2-metilhexadecanoil (preparado de acuerdo con Hoefle et al., 1987), disuelto en 40ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente. Después de agitar por 6 hr, el solvente se removió in vacuo y la goma restante fue triturada con hexano (4x200ml), para dar el compuesto (IIal3) (1.2 g) en forma de polvo blanco.

(Compuesto IIal3, R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, a = *=Estereoquímica(L),n=6):Estereoquímica(R/S), tpf : 133.0-135.0°C.

CLAP : Tiempo de Ret. : 52.6 (R) y 55.6 (S) min. (1 : 1 Ratio).

Las contrapartes diastereoméricas resueltas están conectadas con"y".

1H-NMR (en CD30D [# = 3. 30 ppm, 50 mg/ml, 300 MHz, temp. ambiente) :

4.44 y 4.42 (cada dd, J=8.4,4.8,1H), 2.40 (m, 3H), 2.17 (br. m, 1H), 1.94 (br. m, 1H), 1.60 (m, 1H), 1.29 (br., 25H), 1.10 (d, J=6.9,3H), 0.89 (t, J=6.6,3H).

13C-NMR (en CD30D 6 = 49.0 ppm, 50 mg/ml, 75 MHz, temp. ambiente) : 180.11 y 180.05,176.59-y 176.51,175.24 y 175.17, 52.82 y 52.78,41.86 y 41.83,35.39 y 35.28,33.04, 31.26 y 31.23,30.74 (5C), 30.69 (2C), 30.63,30.43, 28.60 y 28.41,27.75 y 27.71,23.67,18.34 y 18.22, 14.38-.

Los diastereómeros en el caso de los ejemplos 38 y 39, fueron separados por medio de CLAP (250/10 Nucleosil 100-7 C6H5; Acetonitrilo : agua + 0.1% ácido fórmico = 40 : 60).

Ejemplo 38 : (Compuesto IIal4, Rl Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R), * = Estereoquímica (L), n=6) : tpf : 99.0-100.0°C.

CLAP : Tiempo de Ret. : 52.6 min.

1H-NMR (en CD30D [# = 3. 30 ppm, 16 mg/ml, 300 MHz, temp. ambiente) : 4.39 (dd, J=8.4,4.8,1H), 2.38 (m, 3H), 2.15 (m, 1H), 1.94 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.28 (br., 25H), 1.10 (d, J=6.9,3H), 0.89 (t, J=6.6,3H).

13C-NMR (en CD3OD [# = 49, 0 ppm, 16 mg/ml, 75 MHz, temp. ambiente) : 179. 81,176.95,176.10,53.51,41.98,35.36,33.04, 31.54,30.75 (2C), 30.73 (3C), 30.69 (2C), 30.63, 30.42,28.60,28.22,23.67,18.18,14.36.

Eiemplo 39 : (Compuesto IIa15, Rl Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (S), * = Estereoquímica (L), n=6) : tpf : 131.0-133.0°C.

CLAP : Tiempo de Ret. 55.6 min.

1H-NMR (en CD30D 3.30 ppm, 15 mg/ml, 300 MHz, temp. ambiente) : 4.38 (dd, J=8.4,4.8,1H), 2.37 (m, 3H), 2.15 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.60 (m, 1H), 1.28 (br., m, 25H), 1.10 (d, J=6.9,3H), 0.89 (t, J=6.6,3H).

13C-NMR (en CD30D 6 = 49.0 ppm, 15 mg/ml, 75 MHz, temp. ambiente) : 179.89,177.05,175.99,53.51,41.97,35.36,33.04, 31.54,30.74 (7C), 30.63,30.43,28.44,28.25,23.68, 18.35,14.36. tpf : 131.0-133.0°C.

CLAP : Tiempo de Ret. 55.6 min.

ACTIVIDAD BIOLOGICA DE EXTRACTOS DE FMH, LA FMH NATURAL Y SUS DERIVADOS Los experimentos y estudios llevados a cabo arrojaron claras evidencias de que hay un reconocimiento cruzado (. i. e., interespecífico) de FMH entre siete especies de Anastrepha (bezzii, leptozona, ludens, obliqua, serpentina, striata, suspensa) y una especie de un género cercano de importancia económica (Toxotrypana curvicauda). Para los fines de esta patente, es importante el hecho de que estas siete especies respondan a la FMH de A. ludens descrita en este documento (ver TABLA 2).

Nuestros resultados indican que A. obliqua también responde a un compuesto sintético derivado de la feromona de A. ludens (descrito como ejemplo No. 29).

Todos estos hechos proporcionan evidencias claras de que la estructura química general de la FMH de todas las especies de Anastrepha debe ser homologa, y de que una fórmula general será suficiente para disuadir la oviposición en todas las especies de Anastrepha.

1. Métodos utilizados Bioensayos electrofisiolõaicos.

Las pruebas se llevaron a cabo en el laboratorio de electrofisiología de la Swiss Federal Research Station en Wádenswil, Suiza. Los procedimientos y técnicas usados fueron desarrollados por Städler y

colaboradores para estudios con Rhagoletis cerasi (Stadler et al., 1987). Ninguna modificación fue hecha a esta técnica. Básicamente, el estímulo (biológico) de la FMH en las moscas experimentales se puso a prueba con quimioreceptores localizados en sedas especificas de los tarsos de las moscas.

Bioensayos de laboratorio.

Los bioensayos de laboratorio se llevaron a cabo en la sede del Programa MoscaMed, Metapa de Domínguez, México. Seguimos una versión ligeramente modificada de los bioensayos descritos por Boller y Aluja (1992). En lugar de utilizar fruta fresca como substrato de oviposición, se utilizaron esferas de agar verdes de 2.5 cm de diámetro envueltas en Parafilm#. Se colocaron 30 de dichas esferas en tubos de cristal (12 mm diámetro x 60 mm altura) (una esfera por tubo). Los tubos se insertaron en orificios previamente hechos en un tablero de madera de 27 X 27 X 2 cm. El arreglo final de las esferas de agar fue hexagonal y la distancia entre las esferas fue de ca. 1.5 cm (ver Boller y Aluja 1992, para mayores detalles). El tablero se transfirió a una jaula de plexiglas de 40 X 30 X 30 cm, en cuyas paredes se habían colocado hojas de mango (para dar a las moscas suficientes sitios de reposo). La tarde anterior a realizar la prueba, se liberaron en la jaula (que contenía agua y alimento) 16 hembras

apareadas y grávidas, y se dejó que ovipositaran en esferas de agar limpias. A la manana siguiente, ca. una hora antes de la prueba, se retiró el tablero de madera con las esferas de agar.

El bioensayo consistió en introducir una arena fresca de preparación reciente (tablero de madera con esferas de agar) en una jaula con moscas (mantenidas como se describió) a las que se les dejó oviponer durante una hora en las esferas, de las cuales unas estaban tratadas con FMH y otras estaban solamente tratadas con el solvente (MeOH).

De las 30 esferas expuestas a las moscas, 15 no estaban tratadas (controles) y 15 estaban tratadas, por lo que la distribución de los tratamientos fue sistemática.

Durante el periodo experimental de 60 minutos, las moscas fueron monitoreadas continuamente y se registraron sus aterrizajes, intentos de oviposición y oviposiciones exitosas en esferas tratadas y no tratadas. Cada vez que una esfera control ó una esfera tratada era ovipositada y marcada, se reemplazaba inmediatamente con una esfera idéntica con el mismo tratamiento.

Con esta información sobre oviposiciones exitosas se calculó un coeficiente de discriminación basado en la siguiente fórmula (Boller y Hurter 1985) : A-B CD=X 100 A + B en donde A = oviposiciones en esferas no tratadas (control).

B = oviposiciones en esferas tratadas con FMH.

El CD puede variar entre-100 y +100. Un CD de- 100 indicaría que todos los huevos fueron puestos en sustrato de oviposición tratado. De no haber diferencia entre la sustancia probada y el control resultaría un CD de 0 y, por lo tanto, no se habría logrado ningún efecto disuasivo. Un CD de +100 indicaría que ningún huevo fue puesto en los sustratos de oviposición tratados y por lo tanto, se obtuvo un efecto disuasivo absoluto.

Pruebas de campo.

Las pruebas de campo se efectuaron en localidades de los estados de Veracruz y Chiapas, México. Se llevaron a cabo pruebas en condiciones naturales en huertos de ciruela tropical (Spondias purpurea), y

mango (Mangifera indica). Estas pruebas consistieron en aplicar los extractos naturales de la feromona de A. ludens (extracto 100 mg/ml MeOH diluido en agua hasta 10 mg/ml) a los frutales visitados por las moscas provenientes de poblaciones locales de tamaño intermedio, utilizando un bomba de mochila. Con el mismo método, también se aplicó la sustancia descrita como ejemplo 29 en la TABLA 3 (derivado sintético de la FMH de A. ludens; 100 ppm) a ramas con frutos de árboles de S. purpura y que eran visitadas por hembras de A. obliqua, y la sustancia descrita como ejemplo 37 en la TABLA 3 (derivado sintético de la FMH de A. ludens; 50 ppm) a ramas con frutos de árboles de M. indica, que eran visitadas por hembras de A. obliqua (también se observaron hembras de A. ludens y A. serpentina visitando los frutos).

2. Resultados Actividad de los extractos crudos de FMH.

Los extractos en metanol provocaron fuertes respuestas electrofisiológicas y conductuales en bioensayos tanto de laboratorio como de campo. Los resultados se resumen en la TABLA 2, y muestran claramente que las FMH producidas por seis diferentes especies de Anastrepha son percibidas por A. ludens y A. obliqua, y apoyan nuestros resultados en otros bioensayos de laboratorio que incluyen 3 especies de prueba y sus FMH. En el caso de T. curvicauda, se

demostró en pruebas electrofisiológicas y en bioensayos de laboratorio, que su feromona de marcaje (contenida en extractos de heces), es reconocida por A. ludens y A. obliqua (TABLA 2).

Actividad de FMH natural de A. ludens y sus derivados.

Tanto la FMH natural sintética como varios de sus derivados provocaron fuertes respuestas electrofisiológicas y conductuales en el laboratorio (TABLA 3). Los compuestos sintéticos descritos como ejemplo 29 (compuesto IIa5) y ejemplo 37 (compuesto IIal3) también resultaron ser efectivos reduciendo significativamente la oviposición de A. obliqua en condiciones de campo (TABLA 3, última columna).

TABLA 2. Actividad biológica de extractos crudos en metanol de FMH producidas por A. bezzii (AB), A. leptozona (ALZ) A. ludens (AL), A. obliqua (AO), A. serpentina (AS), A. suspensa (ASU), A. striata (AST), Toxotrypana curvicauda (TC) y probados con hembras de A. ludens, A. obliqua y A. serpentina. C (= KC1) se refiere a la sustancia control utilizada.

Pruebas de electrofisiologia y prueba de campo Electrofisiología Prueba Picos por msec. de campo Ef icaci a *6 (Abbott ) Concentración 1.0 mg/ml MeOH 10 del extracto mg/ml Especies A. ludens A. evaluadas obliqua Origen de la AO ASU AL AS TC AL FMH C (=KC1) Resultados 99 91 91 93 89 84.7% 5 Bioensayos de laboratorio Bioensayo de laboratorio 1 Especies Origen de la FMH evaluadas Coeficiente de discriminación CD AO AL AS AST ALZ AB TC A. ludens 100 100 82.9 79.4 79.6 100 88.6 A. obliqua 93.1 100 95.3 91.3 A. 100 100 100------------ serpentina lConcentración del extracto feromonal : 100 mg/ml MeOH

Actividad de la feromona (FMH) natural y sus derivados Los resultados se resumen en la TABLA 3. Los datos muestran actividad biológica en compuestos descritos en este documento como ejemplos 25,29,37, 38,39, respectivamente.

TABLA 3. Actividad biológica de compuestos descritos en. este documento como ejemplos 25,29,37,38,39, respectivamente. La electrofisiología y las pruebas conductuales de laboratorio se realizaron con hembras de A. ludens utilizando hospederos artificiales (esferas de agar cubiertas con parafilm). La pruebas de campo se realizaron en árboles de S. purpura (ciruela tropical) y M. indica (mango) infestados

naturalmente por A. obliqua. ActividadbiolóqicaCompuestoIsómero de prueba dePrue@asdeElectro-Pruebas fisiología conducta campo Ejemplo No. 1 ppm laboratori Eficacia % R1 R2 R3 * o(Abbott)α ppmPicos/msec100 PC MeMeMe@5R7682.3----(25)FMH Iial natura 1 (28) FMH Me Me Me D 5 R 50 23.2---- natura 1 (26) Me Me Me SL 5 S 16-------- Iia2 (27) Me Me Me D 5 S 6-------- Iia3 (29) Me H Me L 5 R 78 84.8 64.37 Iia5 (100 ppm, ciruela) (30) Me H Me D 5 R 23-------- Iia6 (33) H Me Me L 5-25 23.7---- Iia9 (35) H H Me L 5-12 8.3---- Iia1 1 (38) Me H Me L 6 R--84. 3---- lial 4 (39) Me H Me @ 6 S--61. 7---- Iia1 5 (37) Me H Me L 6 R/-78.4 77.15 Iial S- (50 ppm, 3 mango) Los valores con actividad biológica importante se

presentan en negrillas.

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