La présente invention concerne une nouvelle lignée cellulaire de monocytes humains, et son utilisation en tant que modèle cellulaire de la phagocytose.

La phagocytose est le processus cellulaire par lequel certaines cellules regroupées sous la dénomination générale de phagocytes peuvent ingérer des particules étrangères solides d'échelle micrométrique. On considère habituellement que la phagocytose est une forme particulière d'endocytose.

Elle se distingue d'autres processus d'internalisation cellulaire (endocytose, pinocytose) par au moins deux critères généraux :

- la phagocytose est induite par le contact physique avec la particule-cible ;

- la particule-cible de la phagocytose a une taille supérieure à 0,5 pm.

Bien que la phagocytose ait été observée expérimentalement dans plusieurs types cellulaires, elle est généralement fortement associée avec certaines catégories de leucocytes, tels les macrophages, les cellules dendritiques ou les neutrophiles. Son action est essentielle dans la réponse immunitaire. Qu’elle soit innée ou adaptative, la phagocytose est impliquée dans l’élimination des pathogènes. En effet, elle constitue la première ligne de défense face à une infection. Cependant, elle joue également un rôle important dans le maintien de l’homéostasie des tissus ainsi que dans le remodelage et la réparation de ces derniers.

La rate est un organe mou du système lymphatique. Il joue un rôle déterminant dans l’immunité et le processus de renouvellement cellulaire du sang. La rate est composée de deux principaux types de tissu, chacun ayant une fonction différente : la pulpe blanche et la pulpe rouge.

La pulpe blanche est une composante du système de défense contre les infections (système immunitaire). Elle contient des globules blancs appelés lymphocytes, qui à leur tour produisent des anticorps (protéines spécialisées qui luttent contre l’envahissement par une substance étrangère).

La pulpe rouge filtre le sang et élimine les éléments indésirables. Elle contient d’autres globules blancs, les macrophages, qui ingèrent les micro-organismes, comme les bactéries, les champignons et les virus. De plus, elle contrôle également les globules rouges, en détruisant ceux qui sont anormaux, trop vieux ou ceux qui ne fonctionnent plus correctement. Enfin, elle sert de réservoir pour différents éléments sanguins : essentiellement les globules blancs et les plaquettes (particules pseudo-cellulaires impliquées dans la coagulation). L’élimination de ces éléments n’est cependant qu’une fonction mineure de la pulpe rouge.

Les macrophages résidant de la pulpe rouge de la rate jouent également un rôle majeur dans la clairance des cellules sanguines opsonisées par des immunoglobulines G (IgG), comme dans le purpura thrombopénique immunologique (PTI) ou dans l’anémie hémolytique autoimmune (AHAI). Les cellules sanguines sont phagocytées via les récepteurs Fc gamma (FcyRs).

Ces macrophages spléniques sont distincts chez l’homme des monocytes spléniques et des macrophages circulants dérivés de monocytes en termes d’expression des FcyRs et d’autres marqueurs de surface. En effet, les macrophages humains de la pulpe rouge expriment de manière prédominante les récepteurs de faibles affinité CD32a (ou FcRylla) et CD16a (ou FcyRIIIa). Ils n’expriment pas le CD32b (ou FcyRIIb) et expriment très faiblement le récepteur de haute affinité CD64 (FcyRI).

Le processus de phagocytose tel que définit aujourd’hui est caractérisé par trois étapes principales ;

- la phase d’adhésion qui s’effectue grâce à des récepteurs des micro-organismes étrangers ou de cellules sénescentes présents à la surface du macrophage, ou par l’intermédiaire des récepteurs aux opsonines,

- la phase d’internalisation ou ingestion qui aboutit à la formation du phagosome et

- la phase de dégradation par divers enzymes qui s’accumulent dans le phagosome suite à sa fusion avec les lysosomes.

C’est la reconnaissance de la particule qui permet d’enclencher la cascade de signaux qui aboutissent à la polymérisation de l’actine, la production de divers produits toxiques et la synthèse de cytokines et de chimiokines anti-inflammatoires.

La phagocytose est également impliquée dans de nombreuses pathologies, et notamment dans la thrombocytopénie immunitaire associée au purpura (ITP) et dans l’anémie hémolytique autoimmune (AHAI) ; deux maladies autoimmunes pour lesquelles l’efficacité des concentrés d’immunoglobulines G comme traitement d’immunothérapie a été démontré lors d’essais cliniques. La phagocytose peut également représenter le mécanisme d’action de certains médicaments, tels que l’anti-D et les immunoglobulines G, dans le cas de déficiences immunes (remplacement des anticorps antibactériens ou antiviraux).

Actuellement, il n'existe pas de modèle cellulaire stable et établi de phagocytose médiée par les récepteurs Fcy notamment par le CD16 (FcyRIII), en particulier par le CD16a, permettant d’obtenir un résultat fiable et reproductible. C’est pourquoi, les inventeurs ont mis au point une nouvelle lignée cellulaire de monocytes destinée à être utilisée comme modèle cellulaire de phagocytose, notamment pour la phagocytose de complexes anticorps/entité cible, par exemple anti-D/hématies, anticorps/ plaquettes et immunoglobulines G/bactéries.

Ainsi, la présente invention porte sur une lignée cellulaire de monocytes humains exprimant de manière stable et fonctionnelle les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains à leur surface.

Par «lignée cellulaire», on entend, au sens de la présente invention, un ensemble de cellules provenant d'une même cellule mère et possédant les mêmes caractéristiques génétiques que cette cellule mère. Une lignée cellulaire se caractérise en outre par sa capacité à se multiplier dans un milieu de culture de façon stable in vitro pendant un grand nombre de générations.

Par « exprimant de manière stable», on entend au sens de la présente invention, que la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains à leur surface après un nombre important de passages en culture cellulaire, en particulier après au moins 20 passages, avantageusement au moins 25 passage, avantageusement au moins 30 passages. Par « exprimant de manière stable», on entend également au sens de la présente invention, que la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains à leur surface sans évolution notable du niveau d’expression au cours du temps.

Par « exprimant de manière fonctionnelle », on entend, au sens de la présente invention, la capacité des récepteurs Fc gamma (FcyR) humains ainsi exprimés comme étant capables de fixer la région Fc, portion constante, des immunoglobulines, afin d’induire la phagocytose. Par « exprimant de manière fonctionnelle», on entend également au sens de la présente invention, que la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer suffisamment de récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains, afin d’obtenir une activité de phagocytose médiée par l’un ou la combinaison des récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64, lors des tests fonctionnels en bloquant les autres récepteurs.

La lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention exprime de manière stable et fonctionnelle les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains.

Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est choisie parmi le groupe comprenant une lignée dérivée d’un lymphome histiocytaire, une lignée dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie aigüe monocytaire, une lignée dérivée d’un épanchement pleural d’un patient atteint d’une leucémie myéloïde chronique en crise blastique, une lignée dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie myéloïde aigüe, une lignée dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie lymphoblastique aigüe et une lignée dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie aigüe myélo-monocytaire.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie aigüe myélo-monocytaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient masculin âgé d’un an atteint d’une leucémie aigüe myélo-monocytaire. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules THP1. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules THP1 , déposée auprès de l’ECACC sous le numéro 88081201 .

Dans un autre mode de réalisation, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée d’un lymphome histiocytaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée d’un lymphome histiocytaire d’un patient masculin âgé de 37 ans. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules U-937. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains peut être dérivée de la lignée de cellules U-937, déposée auprès de l’ATCC sous le numéro CLR-1593.2™.

Dans un autre mode de réalisation, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie aigüe monocytaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient masculin âgé de 64 ans atteint de leucémie aigüe monocytaire. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Mono-Mac-6. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Mono-Mac- 6, déposée auprès de la DSMZ sous le numéro ACC124.

Dans un autre mode de réalisation, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée d’un épanchement pleural d’un patient atteint d’une leucémie myéloïde chronique en crise blastique. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée d’un épanchement pleural d’un patient féminin âgé de 53 ans atteint d’une leucémie myéloïde chronique en crise blastique. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules K-562. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules K-562, déposée auprès de l’ATCC sous le numéro CLR-243™. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules K-562, déposée auprès de la DSMZ sous le numéro ACC10.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie myéloïde aigüe. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient féminin âgé de 35 ans atteint d’une leucémie myéloïde aigüe. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules HL-60. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules HL-60, déposée auprès de la DSMZ sous le numéro ACC3.

Dans un autre mode de réalisation, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie lymphoblastique aigüe. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient masculin âgé de 19 ans atteint de leucémie lymphoblastique aigüe. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Molt-4. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Molt-4, déposée auprès de la DSMZ sous le numéro ACC362.

Dans un autre mode de réalisation, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie lymphoblastique aigüe. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée du sang périphérique d’un patient masculin âgé de 14 ans atteint de leucémie lymphoblastique aigüe. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Jurkat. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Jurkat, déposée auprès de la DSMZ sous le numéro ACC282.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée d’une lignée de cellules choisies parmi les cellules U-937, les cellules Mono-Mac-6, les cellules K-562, les cellules HL-60, les cellules Jurkat et les cellules THP1.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules THP1. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules THP1 , l’expression des récepteurs CD32 et CD64 est endogène à la lignée avant transfection.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules U-937. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules U-937, l’expression des récepteurs CD32 et CD64 est endogène à la lignée avant transfection.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Mono-Mac-6. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Mono-Mac-6, l’expression des récepteurs CD32 et CD64 est endogène à la lignée avant transfection.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules K-562. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules K-562, l’expression des récepteurs CD32 et CD64 est endogène à la lignée avant transfection.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules HL-60. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules HL-60, l’expression des récepteurs CD32 et CD64 est endogène à la lignée avant transfection.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Jurkat. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la lignée cellulaire de monocytes humains est dérivée de la lignée de cellules Jurkat, l’expression des récepteurs CD32 et CD64 est endogène à la lignée avant transfection.

Dans un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention exprime de manière stable et fonctionnelle au moins 50 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 60 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 70 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 80 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 90 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 95 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 96 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 97 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 98 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 99 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 100 000 récepteurs CD16a, avantageusement au moins 105000 récepteurs CD16a après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention exprime de manière stable et fonctionnelle au moins 5 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 6000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 7 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 8 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 9 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 10 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 11 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 12 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 13 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 14 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 14 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 16 000 récepteurs CD32, avantageusement au moins 17 000 récepteurs CD32 après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention exprime de manière stable et fonctionnelle au moins 20 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 21 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 22 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 23 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 24 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 25 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 26 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 27 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 28 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 29 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 30 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 31 000 récepteurs CD64, avantageusement au moins 32 000 récepteurs CD64 après au moins 30 passages de culture cellulaire.

Dans un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 50 000 et 105000 récepteurs CD16a, entre 5 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 20 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 60 000 et 105 000 récepteurs CD16a entre 6 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 21 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 70 000 et 105 000 récepteurs CD16a, entre 7 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 22 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 80 000 et 105000 récepteurs CD16a, entre 8 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 22 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 90 000 et 105 000 récepteurs CD16a, entre 9 000 et 17000 récepteurs CD32 et entre 23 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 95 000 et 105000 récepteurs CD16a, entre 10 000 et 17000 récepteurs CD32 et entre 24 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 96 000 et 105 000 récepteurs CD16a, entre 11 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 25 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 97 000 et 105000 récepteurs CD16a, entre 12 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 26 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 98 000 et 105 000 récepteurs CD16a, entre 13 000 et 17000 récepteurs CD32 et entre 27 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 99 000 et 105 000 récepteurs CD16a, entre 14 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 27 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire. Avantageusement, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention est capable d’exprimer de manière stable et fonctionnelle entre 100 000 et 105 000 récepteurs CD16a, entre 15 000 et 17 000 récepteurs CD32 et entre 30 000 et 32 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire.

Dans un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention exprime de manière stable et fonctionnelle 102 000 récepteurs CD16a, 16000 récepteurs CD32 et 31 000 récepteurs CD64 à sa surface après au moins 30 passages de culture cellulaire.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur lentiviral comprenant au moins un acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 ou un variant de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1.

Par « transfection » ou « transduction », on entend, au sens de la présente invention, un procédé par lequel des cellules incorporent un acide nucléique exogène et intègrent cet acide nucléique dans leur génome. Au sens de la présente invention, la transfection est une transfection stable, permettant à l’acide nucléique exogène d’être présent continuellement dans la cellule transfectée. Dans le cas d’une transfection stable, l’acide nucléique exogène est transmis à la descendance et le niveau d’expression de l’acide nucléique exogène est constant dans le temps. Avantageusement, le niveau d’expression de l’acide nucléique exogène est stable après un nombre important de passages en culture cellulaire, en particulier après au moins 20 passages, avantageusement au moins 25 passage, avantageusement au moins 30 passages.

Au contraire, une transfection est dite transitoire, si l’acide nucléique exogène n’est présent que de manière transitoire dans la cellule. De ce cas, le niveau d’expression de l’acide nucléique exogène diminue progressivement dans le temps.

Par « acide nucléique », on entend, au sens de la présente invention, un oligomère ou un polymère, simple ou double brin, de bases nucléotidiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'. Le terme «acide nucléique » peut se référer à une molécule d'ADN, d'ARN ou à une molécule hybride ARN/ADN, d'origine naturelle ou synthétique. Dans la notation nucléotidique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d'une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5'.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’acide nucléique de SEQ ID No.1 code pour une protéine correspondant au domaine extracellulaire du récepteur Fc gamma CD16 (FCYRIII) humain, en particulier pour une protéine correspondant au domaine extracellulaire du récepteur Fc gamma CD16a (FCYRIII) humain.

Acide nucléique de SEQ ID No.1 : atg cg g actg aag atctcccaaag g ctg tg g tg ttcctg g ag cctcaatg g tacag g g tg ctcg ag aag g acag tg tg actct g aag tg ccag g g ag cctactcccctg ag g acaattccacacag tg g tttcacaatg ag ag cctcatctcaag ccag g cctc g ag ctacttcattg acg ctg ccacag tcg acg acag tg g ag ag tacag g tg ccag acaaacctctccaccctcag tg accc g g tg cag ctag aag tccatatcg g ctg g ctg ttg ctccag g cccctcg g tg g g tg ttcaag g ag g aag accctattcacctg a g g tg tcacag ctg g aag aacactg ctctg cataag g tcacatatttacag aatg g caaag g cag g aag tattttcatcataatt ctg acttctacattccaaaag ccacactcaaag acag cg gctcctacttctg cag g g g g ctttttg g g ag taaaaatg tg tcttc ag ag actg tg aacatcaccatcactcaag g tttg g cag tg tcaaccatctcatcattctttccacctg g g .

Par " variant de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1", on entend au sens de la présente invention, un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport à l'acide nucléique de SEQ ID No.1. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturel, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénèse. En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'acides aminés codées par ledit acide nucléique variant.

Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter dans des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport à la protéine codée par l'acide nucléique de SEQ ID No.1. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'acides aminés. De préférence, les acides nucléiques variants de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 selon l'invention codent pour des protéines qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que les protéines codées par l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les protéines codées par l'acide nucléique initial. Avantageusement, les acides nucléiques variants de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 selon l’invention conservent la même capacité de fixation du récepteur CD16 (FCYRIII) humain, ou présente une capacité de fixation du récepteur CD16 (FCYRIII) humain augmentée ou diminuée. Avantageusement, les acides nucléiques variants de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 selon l’invention conservent la même capacité de fixation du récepteur CD16a (FCYRIII) humain, ou présente une capacité de fixation du récepteur CD16a (FCYRIII) humain augmentée ou diminuée.

À titre d’exemple de variant de l’acide nucléique de SEQ ID No.1 selon l’invention, on peut notamment citer l’acide nucléique de SEQ ID No.2.

Acide nucléique de SEQ ID No.2 : atg cg g actg aag atctcccaaag g ctg tg g tg ttcctg g ag cctcaatg g tacag g g tg ctcg ag aag g acag tg tg actct g aag tg ccag g g ag cctactcccctg ag g acaattccacacag tg g tttcacaatg ag ag cctcatctcaag ccag g cctc g ag ctacttcattg acg ctg ccacag tcg acg acag tg g ag ag tacag g tg ccag acaaacctctccaccctcag tg accc g g tg cag ctag aag tccatatcg g ctg g ctg ttg ctccag g cccctcg g tg g g tg ttcaag g ag g aag accctattcacctg a g g tg tcacag ctg g aag aacactg ctctg cataag g tcacatatttacag aatg g caaag g cag g aag tattttcatcataatt ctg acttctacattccaaaag ccacactcaaag acag cg gctcctacttctg cag g g g g cttg ttg g g ag taaaaatg tg tcttc ag ag actg tg aacatcaccatcactcaag g tttg g cag tg tcaaccatctcatcattctttccacctg g g .

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, un variant de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 est l’acide nucléique de SEQ ID No.2.

Avantageusement, l’acide nucléique de SEQ ID No.2 code pour une protéine correspondant au domaine extracellulaire du récepteur CD16a (FCYRIII) humain, dans lequel l’acide aminé en position 158 a été remplacé par la valine.

Par «vecteur», on entend, au sens de la présente invention, un véhicule de transit à base d'acides nucléiques, une molécule d'acide nucléique adaptée pour livrer de l'acide nucléique ou une molécule d'ADN capable de réplication autonome dans le monocyte, par exemple un plasmide, un cosmide, un phagemide, un génome (chromosome) viral, un génome (chromosome) phagique, et qui permet le clonage de molécules d'ADN. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le vecteur utilisé est un vecteur lentiviral.

Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans la lignée cellulaire de monocytes humains. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans le monocyte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion des protéines traduites. À cet effet, la séquence d'acide nucléique peut être insérée dans des vecteurs à réplication autonome au sein de la lignée cellulaire de monocytes humains, ou des vecteurs intégratifs de la lignée cellulaire de monocytes humains.

De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans la lignée cellulaire de monocytes humains par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.

La transduction dans la lignée cellulaire de monocytes humains du vecteur peut être réalisée au moyen de quantité équimolaire par les procédures standard du type précipitation au phosphate de calcium ou par la lipofectine. Ensuite, les lignées transfectées sont sélectionnées dans les milieux de culture adéquats.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le vecteur lentiviral comprend en outre un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3.

Acide nucléique de séquence SEQ ID No.3 : cctcag ctctgctatatcctg g atg ccatcctg tttctg tatg g aattg tcctcaccctcctctactg tcg actg aag g taatccaag t g cg aaag g cag ctataaccagctatg ag aaatcag atg g tg tttacacg g g cctg ag caccag g aaccag g ag acttacg ag actctg aagcatg ag aaaccaccacag .

Avantageusement, l’acide nucléique de SEQ ID No.3 code pour une protéine correspondant aux domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain.

Dans un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes humains exprimant de manière stable et fonctionnelle les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et CD64 humains à leur surface selon l’invention est obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur lentiviral comprenant au moins un acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 ou un acide nucléique de séquence SEQ ID No.2 et un acide nucléique de séquence SEQ ID No.3.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur lentiviral comprenant au moins un acide nucléique codant pour une protéine correspondant au domaine extracellulaire du récepteur CD16a et au moins un acide nucléique codant pour une protéine correspondant aux domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain.

Les inventeurs ont montré de manière surprenante que la co-transfection d’au moins un acide nucléique codant pour une protéine correspondant au domaine extracellulaire du récepteur CD16a et au moins un acide nucléique codant pour une protéine correspondant aux domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain, permet d’obtenir une expression stable et fonctionnelle du récepteur CD16a. Plus particulièrement, les inventeurs ont montré que les domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain permet l’ancrage dans la membrane du monocyte de la protéine chimérique comprenant le domaine extracellulaire du récepteur CD16a (FcyRIN) humain et les domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain, permettant ainsi l’expression à la surface du monocyte du récepteur CD16a et la transduction des signaux de phagocytose.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, le vecteur lentiviral comprend un acide nucléique de séquence SED IQ No.4 constitué de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.2 et de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3.

Acide nucléique de séquence SEQ ID No.4 : atg cg g actg aag atctcccaaag g ctg tg g tg ttcctg g ag cctcaatg g tacag g g tg ctcg ag aag g acag tg tg actct g aag tg ccag g g ag cctactcccctg ag g acaattccacacag tg g tttcacaatg ag ag cctcatctcaag ccag g cctc g ag ctacttcattg acg ctg ccacag tcg acg acag tg g ag ag tacag g tg ccag acaaacctctccaccctcag tg accc g g tg cag ctag aag tccatatcg g ctg g ctg ttg ctccag g cccctcg g tg g g tg ttcaag g ag g aag accctattcacctg a g g tg tcacag ctg g aag aacactg ctctg cataag g tcacatatttacag aatg g caaag g cag g aag tattttcatcataatt ctg acttctacattccaaaag ccacactcaaag acag cg gctcctacttctg cag g g g g cttg ttg g g ag taaaaatg tg tcttc ag ag actg tg aacatcaccatcactcaag g tttg g cag tg tcaaccatctcatcattctttccacctg g gcctcag ctctg ctata tcctg g atg ccatcctg tttctg tatg g aattg tcctcaccctcctctactg tcg actg aag g taatccaag tg cg aaag g cagct ataaccag ctatg ag aaatcag atg g tg tttacacg g g cctg ag caccag g aaccag g ag acttacg ag actctg aag cat gagaaaccaccacag

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, le vecteur lentiviral comprend un acide nucléique de séquence SED IQ No.5 constitué de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 et de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3.

Acide nucléique de séquence SEQ ID No.5 : atg cg g actg aag atctcccaaag g ctg tg g tg ttcctg g ag cctcaatg g tacag g g tg ctcg ag aag g acag tg tg actct g aag tg ccag g g ag cctactcccctg ag g acaattccacacag tg g tttcacaatg ag ag cctcatctcaag ccag g cctc g ag ctacttcattg acg ctg ccacag tcg acg acag tg g ag ag tacag g tg ccag acaaacctctccaccctcag tg accc g g tg cag ctag aag tccatatcg g ctg g ctg ttg ctccag g cccctcg g tg g g tg ttcaag g ag g aag accctattcacctg a g g tg tcacag ctg g aag aacactg ctctg cataag g tcacatatttacag aatg g caaag g cag g aag tattttcatcataatt ctg acttctacattccaaaag ccacactcaaag acag cg gctcctacttctg cag g g g g ctttttg g g ag taaaaatg tg tcttc ag ag actg tg aacatcaccatcactcaag g tttg g cag tg tcaaccatctcatcattctttccacctg g gcctcag ctctgctata tcctg g atg ccatcctg tttctg tatg g aattg tcctcaccctcctctactg tcg actg aag g taatccaag tg cg aaag g cagct ataaccag ctatg ag aaatcag atg g tg tttacacg g g cctg ag caccag g aaccag g ag acttacg ag actctg aag cat gagaaaccaccacag

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur lentiviral comprenant :

- un acide nucléique de séquence SED IQ No.4 constitué de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.2 et de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3, ou

- un acide nucléique de séquence SED IQ No.5 constitué de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 et de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3.

Dans un mode de réalisation particulier, les acides nucléiques de séquences SEQ ID No.4 et SEQ ID No.5 code respectivement pour une protéine chimérique comprenant le domaine extracellulaire du récepteur CD16a (FcyRI 11) humain et les domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain.

Avantageusement, l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.4 code pour une protéine chimérique comprenant le domaine extracellulaire du récepteur CD16a (FcyRI 11) humain dans lequel l’acide aminé en position 158 a été remplacé par la valine et les domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain.

Avantageusement, l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.5 code pour une protéine chimérique comprenant le domaine extracellulaire du récepteur CD16a (FcyRI 11) humain dans lequel l’acide aminé en position 158 est la phénylalanine et les domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne gamma des récepteurs FcsRI humain.

Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur lentiviral comprenant un acide nucléique de séquence SEQ ID No.6. Acide nucléique de séquence SEQ ID No.6 : atg tg g cag ctg ctg ctgccg accg cg ctg ctg ctgctg g tg ag cgcg g g catg cg caccg aag atctg ccg aaagcg g tg g tg tttctg g aaccg cag tg g tatcg cg tg ctg g aaaaag atag cg tg accctg aaatg ccag g g cg cg tatag cccg g aa g ataacag cacccag tg g tttcataacg aaag cctg attag cag ccag g cg agcag ctattttattg atg cg g cg accg tg g atg atag cg g cg aatatcg ctgccag accaacctg agcaccctg ag cg atccg g tg cag ctg g aag tg catattg gctg g et g ctg ctg cag g cg ccg egetg g g tg tttaaag aag aag atccg atteatetg cg ctg ccatag ctg g aaaaacaccg cg ctg cataaag tg acctatctgcag aaeg g caaag gccg caaatattttcatcataacag cg atttttatattccg aaag cg accctg aaag atag cg g cag ctatttttg ccgcg g cctg tttg g cag caaaaacg tg ag cag cg aaaccg tg aacattaccattaccc ag g g cctg g cg g tg ag caccattag cag cttttttccg ccg g g ctatcag g tg ag cttttg cctg g tg atg g tg ctg ctg tttg cg g tg g ataccg geetg tattttag cg tg aaaaccaacattcgcag cag cacccg cg attg g aaag atcataaatttaaatg g cg caaag atccg cag g ataaa

Avantageusement, l’acide nucléique de SEQ ID No.6 code pour une protéine correspondant au récepteur CD16a (FcyRIII) humain natif.

Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention constitue un modèle cellulaire de phagocytose splénique. Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention constitue un modèle cellulaire de phagocytose dans la pulpe rouge de la rate.

Un autre aspect de l’invention concerne un procédé d’obtention de la lignée de monocytes humains telle que décrite précédent, comprenant les étapes suivantes : a) isoler les monocytes humains du sang périphérique d’un patient atteint d’une leucémie aigüe myélo-monocytaire, b) transduction des monocytes humains de l’étape a) avec un vecteur lentiviral comprenant un acide nucléique de séquence choisie parmi séquence choisie parmi SEQ ID No.1 , SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 ou un variant de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 , c) sélectionner les monocytes humains issus de l’étape b) exprimant les récepteurs au CD16a, CD32 et CD64 avec un milieu de sélection, et d) vérifier les niveaux d’expression des récepteurs au CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c).

Un autre aspect de l’invention concerne un procédé d’obtention de la lignée de monocytes humains telle que décrite précédent, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir une lignée monocytaire humaine établie b) transduction des monocytes humains de l’étape a) avec un vecteur lentiviral comprenant un acide nucléique de séquence choisie parmi séquence choisie parmi SEQ ID No.1 , SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 ou un variant de l’acide nucléique de séquence SEQ ID No.1 , c) sélectionner les monocytes humains issus de l’étape b) exprimant les récepteurs au CD16a, CD32 et CD64 avec un milieu de sélection, et d) vérifier les niveaux d’expression des récepteurs au CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c).

Avantageusement, l’étape c) de sélection des monocytes humains est réalisée par cytométrie de flux en utilisant une combinaison d’anticorps spécifiques des FcyRs selon la combinaison suivante : CD16A-FITC, CD32-PE et CD64-PC7.

Dans un mode de réalisation de l’invention, l’étape d) de vérification des niveaux d’expression des récepteurs CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c) est réalisée en comparant les niveaux d’expression des récepteurs au CD16CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c) par rapport aux niveaux d’expression de ces mêmes récepteurs dans les monocytes spléniques et/ou des macrophages circulants dérivés de monocytes. Dans un mode de réalisation de l’invention, l’étape d) de vérification des niveaux d’expression des récepteurs CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c) est réalisée en comparant les niveaux d’expression des récepteurs au CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c) par rapport aux niveaux d’expression de ces mêmes récepteurs dans les monocytes humains non transfectés de l’étape a). Dans un mode de réalisation de l’invention, l’étape d) de vérification des niveaux d’expression des récepteurs CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c) est réalisée en comparant les niveaux d’expression des récepteurs au CD16a, CD32 et CD64 dans les monocytes humains sélectionnés à l’étape c) par rapport aux niveaux d’expression de ces mêmes récepteurs dans la lignée monocytaire humaine non transfectée de l’étape a)..

Un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation de la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention comme modèle cellulaire de la phagocytose notamment pour la phagocytose de complexes anticorps/entités cibles.

Par « entités cibles », on entend au sens de la présente invention, des organismes et des particules disposant d’un antigène de surface susceptible de fixer un anticorps. Avantageusement, les organismes peuvent être des organismes vivants ou des organismes morts, lesdits organismes vivants ou morts contenant de l’ARN ou de l’ADN. Dans un mode de réalisation particulier, les organismes sont choisis parmi les virus, les bactéries, les champignons, les mycoplasmes, les virions, les levures, les cellules vivantes, en particulier les cellules vivantes modifiées et les cellules vivantes non modifiées, les précurseurs cellulaires, et les fragments de ceux-ci. Dans un autre mode de réalisation particulier, les particules disposant d’un antigène de surface susceptible de fixer un anticorps peuvent être des particules chimiques synthétiques, en particulier les nanoparticules.

Dans un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention peut être utilisée comme modèle cellulaire de la phagocytose du complexe anti- D/hématies. Dans un autre mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention peut être utilisée comme modèle cellulaire de la phagocytose des plaquettes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention peut être utilisée comme modèle cellulaire de la phagocytose de cellules cancéreuses.

Un autre aspect de l’invention concerne un procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains comprenant les étapes suivantes : a) marquage et sensibilisation des entités cibles avec des anticorps dirigés contre lesdites entités cibles, b) mise en contact des entités cibles issues de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains telle que décrite précédemment, c) mesure de l’activité phagocytaire médiée par les anticorps dirigés contre lesdites entités cibles par cytométrie de flux, et d) détermination de la phagocytose

Un autre aspect de l’invention concerne un procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains comprenant les étapes suivantes : a) marquage et sensibilisation des entités cibles avec des anticorps dirigés contre lesdits entités cibles, b) pré-incubation de la lignée cellulaire de monocytes humains telle que définie précédemment en présence d’un agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains à la surface de la lignée cellulaire de monocytes, c) mise en contact des entités cibles issus de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains issue de l’étape b), d) mesure de l’activité phagocytaire médiée par les anticorps dirigés contre lesdits entités cibles par cytométrie de flux, et e) détermination de la phagocytose.

La détermination de la phagocytose se fait au moyen de toute technique habituelle connue de l’homme du métier. En particulier, la détermination de la phagocytose peut être effectuée par exemple par une ou plusieurs méthodes différentes telles que la détermination du pourcentage de phagocytose, la mesure de l’intensité de fluorescence. En particulier, la détermination de la phagocytose peut être effectuée par différentes méthodes permettant d’analyser le processus de phagocytose dans son entièreté :

Reconnaissance et d’adhésion de l’organisme, entité ou particule cible. Par exemple, par l’analyse de la formation de rosette visible au microscope ou par toute technique habituelle connue de l’homme du métier,

- Activation de la voie de signalisation. Par exemple, par l’analyse de l’état de phosphorylation de protéines impliquées dans la voie de signalisation de la phagocytose par cytométrie, western blot ou toute technique habituelle connue de l’homme du métier

Ingestion. Par exemple, par l’analyse du pourcentage de cellules effectrices ayant phagocytées des cibles ou du nombre de cibles phagocytées par cytométrie, microscopie ou toute technique habituelle connue de l’homme du métier Relargage des composants cellulaire. Par exemple, par l’analyse des composés relargués dans le milieu par dosage immunologique en ELISA, cytométrie ou toute technique habituelle connue de l’homme du métier.

Le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains présente l’avantage d’être fiable, précis, sensible et reproductible. Ainsi, le procédé selon l’invention peut être utilisé comme modèle cellulaire de phagocytose.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les entités cibles sont choisies parmi les organismes et les particules disposant d’un antigène de surface susceptible de fixer un anticorps. Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, les organismes sont choisis parmi les organismes vivants et les organismes morts, lesdits organismes vivants ou morts contenant de l’ARN ou de l’ADN. Dans un mode de réalisation particulier, les organismes sont choisis parmi les virus, les bactéries, les champignons, les mycoplasmes, les virions, les levures, les cellules vivantes, en particulier les cellules vivantes modifiées et les cellules vivantes non modifiées, les précurseurs cellulaires, et les fragments de ceux-ci. Dans un autre mode de réalisation particulier, les particules disposant d’un antigène de surface susceptible de fixer un anticorps peuvent être des particules chimiques synthétiques, en particulier des nanoparticules.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les cellules vivantes sont choisies parmi les plaquettes, les érythrocytes et les cellules cancéreuses.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les particules disposant d’un antigène de surface susceptible de fixer un anticorps sont des nanoparticules.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les anticorps dirigés contre lesdites entités cibles sont choisis parmi les anticorps anti-D, en particulier Roledumab, les immunoglobulines G, les anticorps anti-érythrocytes et les anticorps anti-plaquettes, en particulier l’anti-CD41. Avantageusement, les immunoglobulines G sont des immunoglobulines G polyvalentes.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les entités cibles sont préalablement marquées au PKH67.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains à la surface de la lignée cellulaire de monocytes est choisi parmi une immunoglobuline G polyvalente et/ou un fragment Fc recombinant. Avantageusement, tout concentré d’immunoglobulines G polyvalentes actuellement sur le marché peut être utilisé. À titre d’exemple, le produit Iqymune ^® (LFB) peut être utilisé.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention comprenant les étapes suivantes : a) marquage au PKFI67 et sensibilisation des érythrocytes avec un anticorps anti-D, b) mise en contact des érythrocytes issus de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains en présence d’immunoglobulines G, c) mesure de l’activité phagocytaire médiée par l’anticorps anti-D, par cytométrie de flux, et d) détermination de la phagocytose. Le procédé selon l’invention utilisant les hématies comme organismes cibles constitue un modèle cellulaire fiable précis, sensible et reproductible du mécanisme d’action de Roledumab.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention comprenant les étapes suivantes : a) marquage au FITC et sensibilisation d’au moins une bactérie avec une solution d’mmunoglobulines G, b) mise en contact de l’au moins une bactérie issue de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains, c) mesure de l’activité phagocytaire médiée par les immunoglobulines G, par cytométrie de flux, et d) détermination de la phagocytose.

Avantageusement, l’au moins une bactérie peut être choisie parmi les bactéries à Gram positif ou les bactéries à Gram négatif. Selon un mode de réalisation particulier, les bactéries à Gram positif peuvent être choisies parmi les bactéries de genre Staphylococcus, les bactéries de genre Enterococcus, les bactéries de genre Micrococcus, les bactéries de genre Lactococcus, les bactéries de genre Lactobacillus, les bactéries de genre Clostridium, les bactéries de genre Bacillus, les bactéries de genre Streptococcus, les bactéries de genre Listeria et les bactéries de genre Enterococcus, la liste n’étant pas limitative.

Selon un mode de réalisation particulier, les bactéries à Gram négatif peuvent être choisies parmi les bactéries de genre Escherichia, en particulier Escherichia coli, les bactéries de genre Pseudomonas, les bactéries de genre Acinetobacter, les bactéries de genre Bordetella, les bactéries de genre Salmonella, les bactéries de genre Yersinia, les bactéries de genre Vibrio, les bactéries de genre Agrobacterium, les bactéries de genre Rhizobium, la liste n’étant pas limitative. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’au moins une bactérie est Escherichia coli.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention comprenant les étapes suivantes : a) marquage au FITC et sensibilisation de bactéries Escherichia coli avec une solution d’mmunoglobulines G, b) mise en contact des bactéries issus de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains, c) mesure de l’activité phagocytaire médiée par les immunoglobulines G, par cytométrie de flux, et d) détermination de la phagocytose.

Avantageusement, les immunoglobulines G sont des immunoglobulines G polyvalentes.

Le procédé selon l’invention utilisant les bactéries Escherichia.coli comme entités cibles constitue un modèle cellulaire fiable précis, sensible et reproductible du mécanisme d’action des immunoglobulines G en tant que thérapie de substitution dans le cas d’une immunodéficience primaire et/ou secondaire.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention comprenant les étapes suivantes : a) marquage au PKH67 et sensibilisation d’érythrocytes de lapin, possédant des sites antigéniques de type glycanique similaires à certaines bactéries, avec des immunoglobulines G, b) mise en contact des érythrocytes issus de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains, c) mesure de l’activité phagocytaire médiée par les immunoglobulines G, par cytométrie de flux, et d) détermination de la phagocytose.

Le procédé selon l’invention utilisant les érythrocytes de lapin comme entités cibles constitue un modèle cellulaire fiable précis, sensible et reproductible du mécanisme d’action des immunoglobulines G en tant que thérapie de substitution dans le cas d’immunodéficience primaire et/ou secondaire.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention comprenant les étapes suivantes : a) marquage au PKH67 et sensibilisation des plaquettes avec un anticorps anti-CD41 , b) pré-incubation de la lignée cellulaire de monocytes humains telle que définie précédemment en présence d’une immunoglobuline G polyvalente et /ou un fragment Fc recombinant, c) mise en contact des plaquettes issus de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains issue de l’étape b), d) mesure de l’activité phagocytaire médiée par un anticorps anti-plaquettes, en particulier l’anticorps anti-CD41 , par cytométrie de flux, et e) détermination de la phagocytose.

Le procédé selon l’invention utilisant les plaquettes comme organismes cibles constitue un modèle cellulaire fiable précis, sensible et reproductible de la thrombocytopénie immunitaire associée au purpura (ITP).

Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé d’évaluation in vitro de l’activité phagocytaire d’une lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention comprenant les étapes suivantes : a) marquage au PKH67 et sensibilisation des érythrocytes avec un anticorps anti érythrocytes, b) pré-incubation de la lignée cellulaire de monocytes humains telle que définie précédemment en présence d’une immunoglobuline G polyvalente et /ou un fragment Fc recombinant, c) mise en contact des érythrocytes issus de l’étape a) avec la lignée cellulaire de monocytes humains issue de l’étape b), d) mesure de l’activité phagocytaire médiée par un anticorps anti-érythrocytes, par cytométrie de flux, et e) détermination de la phagocytose.

Avantageusement, l’anticorps anti-érythrocytes est choisi parmi l’anticorps anti-D, l’anticorps anti-A et l’anticorps anti-B. Avantageusement, l’anticorps anti-D permet de cibler les érythrocytes rhésus +. Avantageusement, l’anticorps anti-A permet de cibler les érythrocytes appartenant aux groupes sanguins A et/ou AB. Avantageusement, l’anticorps anti-B permet de cibler les érythrocytes appartenant aux groupes sanguins B et/ou AB.

Le procédé selon l’invention utilisant les érythrocytes comme organismes cibles constitue un modèle cellulaire fiable précis, sensible et reproductible de l’anémie hémolytique autoimmune (AHAI) et du mécanisme d’action des immunoglobulines G comme traitement d’immunothérapie. Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de sélection d'anticorps à forte activité ADCP médiée par les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains.

La phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) est le mécanisme par lequel les anticorps (par leur fragment Fc) vont agir en tant qu'opsonines pour favoriser l'ingestion des entités cibles par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention.

Par « anticorps à forte activité ADCP », on entend au sens de la présente invention, un anticorps présentant une forte capacité à induire la phagocytose des entités cibles par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention.

Avantageusement, le procédé de sélection d'anticorps à forte activité ADCP médiée par les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains comprenant les étapes suivantes : a) pré-incubation de la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention en présence d’un agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains à la surface de la lignée cellulaire de monocytes, b) mise en contact de la lignée cellulaire de monocytes humains issue de l’étape a) avec lesdits anticorps à sélectionner, lesdits anticorps étant liés à leurs entités cibles, c) détermination de la phagocytose, et d) sélection des anticorps à forte activité ADCP médiée par le CD16a et/ou CD32 et/ou CD64.

Dans un mode de réalisation particulier, l’agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR) humains à la surface de la lignée cellulaire de monocytes est choisi parmi une immunoglobuline G polyvalente et/ou un fragment Fc recombinant. Avantageusement, toute immunoglobuline G polyvalente actuellement sur le marché peut être utilisée. À titre d’exemple, le produit Iqymune® (LFB) peut être utilisé.

Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de sélection d’un inhibiteur de l’ADCP médiée par les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains.

Par « inhibiteur de l’ADCP », on entend au sens de la présente invention, toute molécule, en particulier anticorps, capable d’inhiber la phagocytose des entités cibles par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention. Avantageusement, le procédé de sélection d’un inhibiteur de l’ADCP médiée par les récepteurs Fc gamma (FcyR) CD16a, CD32 et/ou CD64 humains comprenant les étapes suivantes : a) opsonisation des entités cibles avec un anticorps à forte activité ADCP dirigés contre lesdites entités cibles, b) mise en contact de la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention avec les entités cibles opsonisées lors de l’étape a) et lesdits inhibiteurs à sélectionner, c) détermination de la phagocytose, et d) sélection des inhibiteurs de l’ADCP médiée par le CD16a et/ou CD32 et/ou CD64.

FIGURES

La figure 1 représente la carte de restriction du vecteur lentiviral comprenant un acide nucléique de SEQ ID No.1.

La figure 2 représente le profil d’expression des récepteurs Fc gamma (FcyR) humains (CD16a, CD32 et CD64) de la lignée cellulaire de monocytes humains de l’invention. Le profil d’expression a été obtenu par cytométrie de flux en utilisant les anticorps fluorescents spécifiques suivants : CD16-FITC, CD32-PE et CD64-PC7.

La figure 3A représente le pourcentage de phagocytose des plaquettes, provenant d’un donneur 1 , sensibilisées avec l’anticorps anti-CD41 par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en utilisant des concentrations croissantes d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant (LFBD192-DS AY, LFBD192-DS EY et LFBD191-DS AY) (agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR)), de 6,66x10 ⁵ M, 6,66x10 ^e M, 6,66x10 ⁷ M, à 6,66x10 ⁸ M. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 3B représente l’intensité de fluorescence moyenne (MFI pour Mean Fluorescence Intensity) associée à la quantité de plaquettes ingérées par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention en utilisant des concentrations croissantes d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant (LFBD192-DS AY, LFBD192-DS EY et LFBD191-DS AY) (agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR)), de 6,66x10-5 M, 6,66x10-6 M, 6,66x10-7 M, à 6,66x10-8 M, lesdites plaquettes provenant d’un donneur 1 , et ayant été sensibilisées avec l’anticorps anti-CD41. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 3C représente le pourcentage de phagocytose des plaquettes, provenant d’un donneur 2, sensibilisées avec l’anticorps anti-CD41 par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en utilisant des concentrations croissantes d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant (LFBD192-DS AY, LFBD192-DS EY et LFBD191-DS AY) (agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR)), de 6,66x10 ^® M, 6,66x10 ^e M, 6,66x10 ⁷ M, à 6,66x10 ⁸ M. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 3D représente l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) associée à la quantité de plaquettes ingérées par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention en utilisant des concentrations croissantes d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant (LFBD192-DS AY, LFBD192-DS EY et LFBD191-DS AY) (agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR)), de 6,66x10-5 M, 6,66x10-6 M, 6,66x10-7 M, à 6,66x10-8 M, lesdites plaquettes provenant d’un donneur 2, et ayant été sensibilisées avec l’anticorps anti-CD41. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 3E représente le pourcentage de phagocytose des plaquettes, provenant d’un donneur 3, sensibilisées avec l’anticorps anti-CD41 par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en utilisant des concentrations croissantes d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant (LFBD192-DS AY, LFBD192-DS EY et LFBD191-DS AY) (agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR)), de 6,66x10 ^® M, 6,66x10 ^e M, 6,66x10 ⁷ M, à 6,66x10 ^® M. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 3F représente l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) associée à la quantité de plaquettes ingérées par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention en utilisant des concentrations croissantes d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant (LFBD192-DS AY, LFBD192-DS EY et LFBD191-DS AY) (agent bloquant les récepteurs Fc gamma (FcyR)), de 6,66x10-5 M, 6,66x10-6 M, 6,66x10-7 M, à 6,66x10-8 M, lesdites plaquettes provenant d’un donneur 3, et ayant été sensibilisées avec l’anticorps anti-CD41. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 4A représente le pourcentage de phagocytose des hématies sensibilisées avec l’anticorps anti-D (Roledumab) par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en utilisant des concentrations croissantes d’anticorps anti-D (Roledumab), de 0,04 à 5 pg/ml et en présence d’IglV à une concentration de 0,25 mg/ml. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 4B représente l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) associée à la quantité d’hématies ingérées par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en utilisant des concentrations croissantes d’anticorps anti-D (Roledumab) allant de 0,04 à 5pg/ml en présence de 0,25 mg/ml d’IglV, lesdites hématies ayant été préalablement sensibilisées avec l’anticorps anti-D (Roledumab). Les résultats ont été obtenus par cytométrie de flux. La figure 4C représente le pourcentage de phagocytose des hématies sensibilisées avec l’anticorps anti-D (Roledumab) par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en l’absence d’anticorps anti-D (Roledumab), en présence d’anticorps anti-D (Roledumab ) à une concentration de 5 pg/ml ou en présence d’anticorps anti-D (Roledumab ) à une concentration de 5 pg/ml et de 5 pg/ml d’anticorps anti-CD16. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 4D représente l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) associée à la quantité d’hématies ingérées par la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention, en l’absence d’anticorps anti-D (Roledumab), en présence d’anticorps anti-D (Roledumab ) à une concentration de 5 pg/ml ou en présence d’anticorps anti-D (Roledumab) à une concentration de 5 pg/ml et de 5 pg/ml d’anticorps anti-CD16. Les résultats sont obtenus par cytométrie de flux.

La figure 5 représente les résultats du test de phagocytose des hématies sensibilisées avec un anticorps anti-D (RhD+RBC) par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention (THP1 CD16+) avec des concentrations croissantes de 0,04 à 5 pg/ml d’anticorps anti-D (Roledumab) en présence de 0,25 mg/ml d’IgIV. Les graphiques A et B ont été obtenus avec une gamme de 50% d’anticorps anti-D et les graphiques C et D ont été obtenus avec une gamme de 150% d’anticorps anti-D. Les résultats sont présentés en pourcentage de phagocytose (A et C) et en intensité de fluorescence moyenne (B et D) et représente la moyenne d’une seule expérience réalisée en double.

La figure 6 représente les résultats du test de phagocytose des hématies sensibilisées avec un anticorps anti-D (RhD+RBC) par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention (THP1 CD16+) avec des concentrations croissantes de 0,04 à 5 pg/ml d’anticorps anti-D (Roledumab) en présence de 0,25 mg/ml d’IgIV. Les graphiques A et D ont été obtenus après application d’un stress thermique à 40°C pendant 3 mois, les graphiques B et E ont été obtenus après application d’un stress thermique à 50°C pendant 3 semaines, et les graphiques C et F après application d’un stress thermique à 50°C pendant 6 semaines. Les résultats sont présentés en pourcentage de phagocytose (A, B et C) et en intensité de fluorescence moyenne (D, E et F) et représente la moyenne d’une seule expérience réalisée en double.

La figure 7 représente les résultats du test de phagocytose des hématies sensibilisées avec un anticorps anti-D (RhD+RBC) par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention (THP1 CD16+) avec des concentrations croissantes de 0,04 à 5 pg/ml d’anticorps anti-D (Roledumab) en présence de 0,25 mg/ml d’IgIV. Les graphiques A et D ont été obtenus après application d’un stress chimique utilisant du H ₂ 0 ₂ à une concentration de 10 mM, les graphiques B et E ont été obtenus après application d’un stress chimique utilisant du H ₂ 0 ₂ à une concentration de 50 mM, et les graphiques C et F après application d’un stress chimique utilisant du H ₂ 0 ₂ à une concentration de 10 mM. Les résultats sont présentés en pourcentage de phagocytose (A, B et C) et en intensité de fluorescence moyenne (D, E et F) et représente la moyenne d’une seule expérience réalisée en double.

La figure 8 représente les résultats du test de phagocytose des hématies sensibilisées avec un anticorps anti-D (RhD+RBC) par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention (THP1 CD16+) avec des concentrations croissantes de 0,04 à 5 pg/ml d’anticorps anti-D (Roledumab) en présence de 0,25 mg/ml d’IgIV. Les graphiques A et D ont été obtenus avec le DF5, les graphiques B et E ont été obtenus avec l’anticorps anti-D (Roledumab) traité avec l’EndoS2 pendant 2 heures à 37°C, et les graphiques C et F ont été obtenus avec l’anticorps anti-D (Roledumab, lot CB04) chauffé. Les résultats sont présentés en pourcentage de phagocytose (A, B et C) et en intensité de fluorescence moyenne (D, E et F) et représente la moyenne d’une seule expérience réalisée en double.

La figure 9 (graphiques A et C) représente les résultats du test de phagocytose des hématies sensibilisées avec un anticorps anti-D (RhD+RBC) par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention (THP1 CD16+) avec des concentrations croissantes de 0,04 à 5 pg/ml d’anticorps anti-D (Roledumab) en présence de 0,25mg/ml d’IglV après 3 passages ou 29 passages de culture cellulaire. La figure 9 ( B et D) représente les résultats du test de phagocytose des hématies sensibilisées avec un anticorps anti-D (RhD+RBC) par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention (THP1 CD16A+) avec des concentrations croissantes de 0,04 à 5 pg/ml d’anticorps anti-D (Roledumab, lot 304) ayant réussi un ou deux cycles F/T en présence de 0,25 mg/ml d’IgIV. Les résultats sont présentés en pourcentage de phagocytose (A et B) et en intensité de fluorescence moyenne (C et D) et représente la moyenne d’une seule expérience réalisée en double.

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation d’une lignée cellulaire de monocytes (THP1 CD16+)

Les cellules de monocytes humains THP1 ont été transfectée deux fois à MOI 100 avec 4pg/ml de polybrène en utilisant les vecteurs lentiviraux exprimant l’acide nucléique de SEQ ID No.1 (Figure 1).Les cellules ont été amplifiées et une sélection de clone a été réalisée par dilution limite. Les clones amplifiés ont été préalablement caractérisés.

1. Décongélation et début de la culture cellulaire

Les cellules en culture ont été obtenues à partir d'une banque de cryotubes en décongelant rapidement à 37°C et en les diluant dans 10 ml de milieu de croissance préchauffé IMDM (Iscoves Modified Dulbecco's Medium) + 20% de Sérum de Veau Foetal (SVF) à 37°C. Le DMSO a été éliminé par centrifugation des cellules à 270 g pendant 5 minutes à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans un milieu de culture frais à 0,5x10 ⁶ cellules/ml et incubées à 37°C dans des incubateurs humidifiés avec une atmosphère de 5% de C02 dans l'air.

2. Maintien et expansion des cellules

Pour amplifier la lignée cellulaire THP1 , les cellules ont été cultivées dans du milieu IMDM (Iscoves Modified Dulbecco's Medium) + 10% de Sérum de Veau foetal en les repiquant dans le volume de culture souhaité à 4x10 ⁵ cellules/ml pendant 3 jours et à 3x10 ⁵ cellules/ml pendant 4 jours.

Les cultures de cellules ont été incubées à 37°C dans des incubateurs humidifiés avec une atmosphère de 5% de C0 ₂ dans l'air.

3. Concentration cellulaire et viabilité cellulaire

Les densités cellulaires totales et viables ont été déterminées par comptage automatique avec le système NC-200 de Chemometec. Un échantillon, éventuellement dilué, de 0,2 ml a été analysé par coloration automatisée au DAPI et à l'acridine orange, suivie d'une série de photographies. Une analyse au moyen du logiciel associé (NucleoView) a été réalisée permettant de déterminer les concentrations de cellules totales et viables. Le pourcentage de viabilité a été calculé en multipliant par 100 le nombre de cellules viables par rapport au nombre total de cellules (cellules vivantes et mortes).

4. Cryoconservation

Des cellules en phase de croissance exponentielle précoce ou moyenne et une viabilité supérieure à 80% ont été utilisées. Les cellules ont été recueillies par centrifugation et remises en suspension dans un milieu de congélation (95% de Sérum de veau foetal - 5% de DMSO), pré-refroidies à 4 °C. La suspension cellulaire a ensuite été distribuée dans le nombre approprié de tubes cryogéniques, avec 1 ml de suspension par tubes cryogéniques, contenant 5 x 10 ⁶ cellules. Les tubes cryogéniques ont été immédiatement placés dans un congélateur à -80°C. Le lendemain, les cryotubes ont été transférés dans un cryoconteneur et stockées enazote liquide par immersion.

5. Immunophénotypaae

Les lignées cellulaires de monocytes humains THP1 CD16+ selon l’invention (durant 30 passages) ont été caractérisées par cytométrie de flux après une incubation de 15 minutes à la température ambiante, à l'abri de la lumière de 1x10 ⁵ cellules avec différents anticorps spécifiques des FcyRs selon la combinaison suivante: CD16-FITC (20 pL) / CD32-PE (20 pL) / CD64-PC7 (10 pL).

Des contrôles isotypiques (anticorps non pertinents du même isotype IgG et marqués du même fluorochrome) ont été réalisés dans les mêmes conditions expérimentales.

La Figure 2 présente le profil d’expression des récepteurs CD16, CD32 et CD64 de la lignée cellulaire de monocytes humains THP1 CD16+.

La lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention présente donc une expression stable des récepteurs membranaires CD16a, CD32 et CD64.

6. Détermination du nombre de récepteurs CD 16a, CD32 et CD64 dans la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention.

Le nombre de récepteurs CD16a, CD32 et CD64 exprimés par la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention a été déterminé en utilisant le kit QIFIKIT de la société DAKO. A titre de comparaison, la présence de ces récepteurs CD16a, CD32 et CD64 a également été testée dans les cellules THP 1 non transfectées (THP1 WT) et les monocytes classiques.

Plus particulièrement, 100 pL d’une suspension de cellules à une concentration de 2x10 ⁶ cellules/mL dans du PBS + 1%BSA ont été incubées à une température de 4°C pendant 30 à 60 minutes avec 1 pg of trois anticorps monoclonaux de souris primaires non- conjugués anti-CD16a, anti-CD32 et anti-CD64 ou avec un anticorps monoclonal de souris non pertinent du même isotype et ajusté à la même concentration utilisé comme contrôle négatif. Les échantillons ont ensuite été lavés deux fois avec 3 mL de PBS + 1%BSA par centrifugation à 270 x g pendant 5 minutes. Dans le même temps, 100 mI_ de billes de montage et de calibration remises en suspension (vortex), respectivement, ont été placées dans deux tubes à essai séparés et lavées avec 3 ml_ de PBS + 1% de BSA par centrifugation à 270 x g pendant 5 minutes.

Les culots de cellules et de billes ont été incubés dans l’obscurité à 4°C pendant 45 minutes avec 100 pL de conjugué FITC, dilués à 1/50 dans du PBS.

Les échantillons sont lavés deux fois avec 3 mL de PBS + 1% de BSA par centrifugation à 270 x g pendant 5 minutes.

Les culots sont resuspendus dans 500 pL of PBS + 1%BSA avant d’être analysés par cytométrie de flux.

Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Détermination du nombre de récepteurs CD16a CD32 et CD64 4/ Stabilité de la lignée

Afin de valider l'utilisation de la lignée cellulaire selon l’invention (THP1 CD16+) pour environ 30 passages de culture cellulaire, correspondant à 3 mois de culture cellulaire, un test a été réalisé pour comparer les cellules THP1 aux passages 3 (P3) et 29 (P29) (Figure 9 A/C). Le pourcentage de phagocytose et le MFI en fonction de la concentration en CB04 ont été analysés pour comparer les valeurs EC50 et Top. Les résultats sont présentés à la figure 9.

La figure 9 montre une activité de phagocytose comparable entre les cellules THP1CD16+ aux passages P3 et P29. Ces résultats valident l'utilisation de cellules THP1 CD16+ pour environ 30 passages de culture cellulaire Ces résultats montrent que la lignée cellulaire de monocytes humains selon l’invention exprime de manière stable les CD16a, CD32 et CD64.

Exemple 2 : Inhibition de la phagocytose des plaquettes médiée par l’anticorps anti-

CD41

1/ Préparation des plaquettes

Les plaquettes ont été isolées à partir de sang périphérique de groupe sanguin O humain (EFS, Les Ulis) stocké à 22°C ±2°C toute la nuit puis marquées au PKH67 (Sigma) à une concentration finale de 2x10 ⁶ M et sensibilisées à 37 °C pendant 30 min sous agitation avec 1 pg/ml d'un anticorps monoclonal anti-CD41 (anticorps absolu) ou tampon de dilution (contrôle plaquettaire non sensibilisé) pour une suspension de plaquettes de 2x10 ⁷ plaquettes/m L

La lignée cellulaire de monocytes humains THP1 selon l’invention (lignée cellulaire THP1 CD16+) (1x10 ⁶ cellules) a été pré-incubée pendant 30 min à 37°C avec des concentrations croissantes allant de 6,66x10 ⁵ M, 6,66x10 ^e M, 6,66x10 ⁷ M, à 6,66x10 ⁸ M d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) ou des fragments Fc recombinant obtenus selon la méthode décrite dans la demande internationale WO 2019/115773 (rFc AY068, rFc EY069 et rFc AY070), correspondant à 10, 1 , 0,1 et 0,01 mg/mL pour d’IglV à 10% (Iqymune, LFB) et 3,33 ; 0,33 ; 0,03 et 0,003 mg/mL pour les fragments Fc recombinant (rFc AY068, rFc EY069 et rFc AY070).

Le fragment Fc recombinant (rFc AY070) a été produit dans une lignée de chèvre transgénique alors que les fragments Fc recombinants (rFc AY068 et rFc EY069) ont été produit dans des cellules CHO recombinantes. Les fragments ont été conçus avec plusieurs mutations afin d’augmenter leurs affinités pour les récepteurs FcRn et CD16.

Les variant rFc AY068 et rFc AY070 contiennent 5 mutations (K334N; P352S; A378V; V397N; N434Y et 1 -N glycosylation site (N297)).

Le variant rFc EY069 contient 6 mutations (Y296W, K334N; P352S; A378V; V397N; N434Y, et 1 -N glycosylation site (N297)).

2/ Phagocytose

Les plaquettes marquées et sensibilisées avec un anticorps anti-plaquettes (2x10 ⁷ plaquettes) ont été ajoutées à la lignée cellulaire de monocytes humains THP1 CD16+ (ratio 1 :20) et incubées pendant 1 heure à 37°C. Après incubation, les cellules THP1 ont été incubées avec du bleu trypan pour masquer la fluorescence des plaquettes marquées qui ne seraient pas internalisées de plus, la lignée cellulaire de monocytes humains THP1 a été marquée avec un anticorps fluorescent anti- CD45 (Beckman Coulter). La phagocytose médiée par des anticorps anti-plaquettes a été mesurée par cytométrie de flux (cytomètre de flux Galios, Beckman Coulter). Les résultats sont présentés aux Figures 3A à 3F.

Lors de l'analyse du pourcentage de phagocytose, une moyenne de 20% de phagocytose des plaquettes non sensibilisées a été obtenue (données non présentées) et a été déduite des résultats de la phagocytose des plaquettes sensibilisées.

Lorsque les plaquettes sont incubées avec 1 pg/mL d'anti-CD41 , on observe en moyenne 55% de phagocytose spécifique. Les résultats ont été normalisés sur des graphiques afin de comparer l'efficacité du produit sur les trois donneurs indépendamment de la phagocytose initiale sans produit.

Une inhibition dose-dépendante de la phagocytose a été observée de manière reproductible avec les produits testés.

Ainsi la lignée cellulaire constitue un modèle cellulaire fiable précis, sensible et reproductible de la thrombocytopénie immunitaire associée au purpura (ITP) permettant de discréminer l’efficacité thérapeutique in vitro de différents produits.

Exemple 3 : Phagocytose des hématies médiée par l’anticorps anti-D

1/ Préparation des hématies

Des hématies commerciales papainées (RBC) ont été lavés deux fois dans du NaCI à 0,9% pendant 5 minutes à 1730g et le culot a été mis en suspension dans 400mI_ de NaCI à 0,9%. La suspension est tout d’abord mélangé avec 2ml de diluent C et ensuite avec 2ml de solution de PKH67 à 4x10 ⁶ M dans le diluent C (concentration finale : 2x10 ⁶ M). Après un rapide mélange, la suspension a été incubée pendant 5 minutes dans l’obscurité. 4ml de sérum de veau foetal (SVF) ont été ajoutés, le surnageant a été éliminé et le culot lavé trois fois dans du NaCL à 0,9%. Le marquage par PKH67 a été contrôlé par cytométrie. Toutes les hématies présentent une fluorescence.

2/ Phagocytose

La phagocytose a été étudiée avec des hématies sensibilisées avec des quantités connues d’anticorps anti-D et des cellules THP1 CD16+. Les hématies (RBC) marquées avec le PKH67 sont lavées deux fois dans NaCI à 0,9% pendant 5 minutes à 1730 g et 50 pL d'une dilution 1 :30 de culots d’hématies dans du NaCI à 0,9% ont été mélangés avec 50 mI d’une suspension de microbilles fluorescentes (flowcount fluorospheres) et 2 ml de NaCI 0,9%.

La concentration d’hématies est déterminée par cytométrie de flux. Les hématies ont ensuite été remises en suspension dans du NaCI 0,9% à 2x10 ⁸ hématies/ml (± 15%).

Les cellules THP1 CD16+ (lignée cellulaire de monocytes selon l’invention) sont comptées puis remises en suspension dans un milieu IMDM + 10% de sérum de veau foetal (SVF) à 1 x 10 ⁶ cellules/ml (± 15%).

Les hématies à une concentration de 2x10 ⁸ hématies/mL dans NaCI 0,9% sont incubées avec des préparations d'anticorps anti-D (Roledumab) à 0,04, 0,08, 0,16, 0,31 , 0,62, 1 ,25, 2,5 et 5 pg/mL (v/v) ou avec du NaCI à 0,9% (hématies non sensibilisées (NS-RBC)) pendant 30 minutes à 37°C. Les échantillons sont lavés deux fois dans du milieu IMDM + 10% de FCS et les culots sont suspendus à 1x10 ⁸ hématies/mL dans du milieu IMDM + 10% de SVF.

100 pL d’hématies à 1x10 ⁸ hématies/mL sont mélangées à 100 pL de cellules THP1 CD16 + à 1x10 ⁶ cellules/mL (soit un ratio cellule THP1/hématies de 1/100) en présence de 0,25 mg/mL d'immunoglobulines humaines normales (IVIG). Les essais ont été réalisés avec 10 échantillons, chacun en double exemplaire. Un échantillon de contrôle de la spécificité CD16a est réalisé avec des hématies sensibilisées en utilisant une concentration d’anti-D à 5 pg/mL et une concentration d'anticorps anti-CD16 à 5 pg/mL. L'incubation est effectuée à 37°C pendant 1 heure. À la fin de l'incubation, le marquage PKH67 est éteint en ajoutant 100 pL de bleu trypan, afin d’éliminer le signal des hématies collées aux cellules THP1 CD16+.

Après une étape de lavage dans du NaCI 0,9%, les cellules THP1 CD16 + sont marquées avec un anticorps anti-CD45 fluorescent pendant 15 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Les échantillons sont lavés à nouveau et les hématies sont lysées avec 500 pL de solution de Versalyse Lysing pendant 20 minutes à la température ambiante, à l'abri de la lumière, afin d'éliminer les hématies non phagocytées (les hématies phagocytées par les cellules cibles ne sont pas sensibles à ces traitements). Les échantillons sont lavés à nouveau et fixés avec 500 pL de solution de fixation diluée au 1/40 avant analyse. Le pourcentage de cellules THP1 CD45+ contenant les hématies PKFI67 (pourcentage de phagocytose) et leur intensité de fluorescence moyenne PKFI67 (MFI) sont mesurés par cytométrie de flux avec un cytomètre Galios Flow de la société Beckman Coulter. Les résultats sont ensuite analysés avec le logiciel Kaluza Analysis. Les résultats sont présentés aux Figures 4A à 4D.

Conclusions :

L'activité de la phagocytose (pourcentage (Figure 4A) et MFI (Figure 4B)) est proportionnelle à la concentration en anti-D avec un maximum de 91% de phagocytose. Le contrôle négatif sans anti-D (NS-RBC) et avec l'anticorps anti-CD16 (S-RBC + Anti- CD16) présente respectivement 2% et 4% (Figure 4C) de phagocytose. Les signaux de phagocytose sont spécifiquement médiés par la liaison des hématies revêtus d' anti-D au récepteur CD16a.

La lignée cellulaire selon l’invention exprime donc, en plus des CD32 et CD64, des CD16 fonctionnels.

Exemple 4 : Méthode de sélection d’anticorps à forte activité de phagocytose (ADCP)

1/ Sensibilité

Une dégradation forcée a été effectuée sur l’anticorps anti-D (Roledumab, lot CB04), afin d'examiner la sensibilité de la méthode et de déterminer si elle indique la stabilité.

Le lot a été fourni dans des seringues pré remplies à une concentration en protéines de 0,3 mg/mL dans la formulation suivante : citrate trisodique dihydraté (8,82 g / L) à pH 6,5, chlorure de sodium (3,25 g / L), mannitol (17 g / L) et Polysorbate 80 à 400 ppm.

Les contraintes de dégradation se concentreront sur le stress thermique, l'oxydation et la déglycosylation. Les échantillons préparés sont décrits dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau lot CB04). 1.1/ Sensibilité au stress thermique

Le stress thermique est utilisé pour accélérer les phénomènes de dégradation chimique ou physique.

Roledumab (anticorps anti-D - lot CB04) est connu pour être sensible à la température; un stress thermique induit une agrégation, une modification structurelle (fragmentation, modification chimique...) et une perte d'activité (activité de CD16a). Les flacons de Rroledumab seront placés à + 40 ° C pendant 3 mois, à + 50 ° C pendant 3 semaines et 6 semaines.

Le pourcentage de phagocytose et le MFI en fonction de la concentration en anticorps anti-D (Roledumab - lot CB04) ont été analysés pour comparer les valeurs EC50 et la valeur maximale de l'échantillon chauffé. Les résultats sont présentés à la figure 6.

La figure 6 montre une diminution significative mais légère du pourcentage de phagocytose après chauffage pendant 6 semaines à + 50 ° C (EC50: 77%, en haut: 86%). En revanche, une diminution très importante du MFI Top a été observée après chauffage pour atteindre 40%, après 6 semaines à + 50 ° C. Le stress thermique et la dégradation associée semblent avoir un impact négatif significatif sur l'activité de la phagocytose, en particulier sur la quantité d’hématies ingérées.

1.2/ Sensibilité chimique : oxydation par Fl _? 0 _?

La dégradation oxydative qui se produit dans les traitements biothérapeutiques est l’une des voies de dégradation chimiques des anticorps monoclonaux recombinants (AcM). Les anticorps monoclonaux sont exposés à des conditions de traitement et de stockage susceptibles d’influencer le taux et l’ampleur de ces modifications. L'oxydation de la méthionine (primaire), ainsi que de la cystéine, de l'histidine, du tryptophane et de la tyrosine peut être induite par une incubation avec des agents oxydants tels que Fl ₂ 0 ₂ .

Les sources potentielles d'oxydation comprennent l'utilisation d'excipients contenant des quantités infimes d'espèces oxydantes (par exemple, le polysorbate 80) ou le contact de la substance médicamenteuse avec des résidus d'agents désinfectants ou dépyrogénisants possédant un certain potentiel oxydant.

La contrainte d'oxydation a été réalisée en ajoutant 10 mM, 50 mM et 100 mM de Fl ₂ 0 ₂ avec une durée d'incubation de 24 heures à + 25 ° C. Un contrôle négatif avec le même volume que Fl ₂ 0 ₂ a été réalisé avec de l'eau. Le pourcentage de phagocytose et le MFI en fonction de la concentration en anticorps anti-D (Roledumab - lot CB04) ont été analysés pour comparer les valeurs EC50 et la valeur maximale de l'échantillon oxydé. Les résultats sont présentés à la figure 7.

La figure 7 ne montre aucune diminution de l'activité de la phagocytose après un traitement avec H ₂ 0 ₂ 10 mM. Une légère diminution du pourcentage de phagocytose (EC50) après un traitement à 50 mM et à 100 mM a été observée (respectivement 87% et 79%).

En revanche, comme pour le stress thermique, une diminution plus importante et comparable du sommet MFI a été observée après traitement avec 50 mM et 100 mM de H ₂ 0 ₂ : 75% et 77% respectivement.

Le stress d'oxydation et la dégradation associée (fragmentation, oxydation...) semblent avoir un impact négatif significatif sur l'activité de la phagocytose, en particulier sur la quantité de globules rouges ingérée.

1.3/ Déalvcosylation

DF5 est un anticorps monoclonal anti-D lgG1 produit par une lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines. Cet anticorps hautement fucosylé présente une faible affinité de liaison pour FcyRIIIa (CD16a).

La déglycosylation a été effectuée en ajoutant 3 pg d'EndoS2 à 150 pg d’anticorps anti-D (Roledumab, lot CB04, appelé « CB04 ») avec un temps d'incubation de 2 heures à + 37 ° C. Un contrôle négatif avec le même volume que Fl ₂ 0 ₂ est réalisé avec de l'eau.

Le pourcentage de phagocytose et le MFI en fonction de la concentration en Aanti-D ont été analysés pour comparer les valeurs EC50 et Top de DF5 et de l’anticorps anti-D (Roledumab, lot CB04). Les résultats sont présentés à la figure 8.

La figure 8 montre que l'anticorps hautement fucosylé DF5 présente une faible activité en phagocytose (A / D) et que l’anticorps anti-D (Roledumab, lot CB04) déglycosylé n'a pas été capable d’induire la phagocytose des hématies (B / E). Le contrôle négatif (C / F) est comparable à l’anticorps anti-D (Roledumab, lot CB04) non traité.

La méthode permet donc la sélection d’anticorps selon leur capacité à phagocyter (ADCP : Antibody-Dependent Cell Phagocytosis).

2/ Précision

La précision est l'étroite concordance entre les mesures d'échantillons multiples d'un échantillon homogène dans les conditions recommandées. La précision a été étudiée à l'aide de l’anticorps anti-D (Roledumab) lot CB04.

Vingt-cinq dosages de deux séries indépendantes de 8 déterminations de l’anticorps anti- D (Roledumab) lot CB04 ont été effectués.

L’EC50, le maximum de phagocytose et l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) de chaque série (2 valeurs / paramètre / dosage, soit 50 valeurs / paramètre) sont utilisés pour calculer l'écart type (DS), le coefficient de variation (C V) et l'intervalle de confiance (IC) afin de déterminer la précision intermédiaire de la méthode (IP ou CVR).

Pour cette étude, 3 cryotubes de lignée cellulaire THP1 CD16 +, 9 préparations de hématies (marquage PKH67) et différents lots de réactifs, dont 3 lots de kit PKH67, ont été utilisés. L'analyse statistique est présentée dans le tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3 : Précision intermédiaire de la méthode

Légende: ^* Variance IP= S ² _R = S ² _r + S ² _g CV _R = S _R /p x 100

Cl = résultat ± t x S _R

La précision intermédiaire est de 14% pour le paramètre EC50 quel que soit le signal lu (% de phagocytose ou MFI) et de 4% pour le pourcentage maximum de phagocytose (%Top). Pour le MFI Top, ce signal étant directement dépendant de la fluorescence des hématies, cela diffère d’un test à l’autre, seule la répétabilité a été calculée, elle est de 8%.

La méthode est donc suffisamment précise pour permettre de sélectionner des anticorps selon leur capacité ADCP. Conclusions :

Le test de phagocytose développé pour les hématies sensibilisées par l’anticorps anti-D utilisant la lignée cellulaire de monocytes selon l’invention (cellules THP1 CD16 +) est:

- Précis et reproductible : la variation maximale de 14% a été obtenue lors de l'analyse statistique de 25 analyses indépendantes.

- Sensible, car une évolution de l’EC50 et du Top en fonction du type de la dégradation et proportionnelle à l'intensité de la dégradation a été observée, avec le paramètre Top de fluorescence, qui semble être le plus pertinent pour l'étude d'échantillons stressés/modifiés structurellement.

Exemple 5 : Phagocytose de bactérie Escherichia coli (E. Coli) médiée par les immunoglobulines polyvalentes G

Ce mode opératoire décrit les étapes à réaliser pour évaluer la capacité d’immunoglobulines polyvalentes à induire la phagocytose de bactéries E. Coli par des cellules monocytaires humaines THP1 exprimant les récepteurs Fc (FcyRs) CD32, CD64 et transfectées avec le récepteur CD16a.

In vivo, le phénomène de phagocytose a pour but la destruction d’agents pathogènes ayant pénétrés dans l’organisme. La phagocytose se déroule en 2 phases :

- phase de reconnaissance entre les cellules phagocytaires et les antigènes du microorganisme par l’intermédiaire d’opsonines. L’opsonisation est une liaison entre les immunoglobulines recouvrant spécifiquement les antigènes du microorganisme et leurs récepteurs présents à la surface des phagocytes (CD16a, CD32 et CD64) associée à une liaison avec le complément (C3b).

- phase d’endocytose : le microorganisme est ensuite ingéré par déformation membranaire de la cellule phagocytaire et se retrouve dans une vésicule cytoplasmique appelée phagosome. La fusion du phagosome avec les lysosomes entraîne sa digestion et sa destruction. Les débris sont rejetés à l’extérieur de la cellule.

Des bactéries E. Coli marquées par un fluorochrome et opsonisées avec des immunoglobulines polyvalentes, sont incubées avec les cellules THP1 CD16+ à +37°C. La présence de bactéries fluorescentes internalisées par les cellules phagocytaires est recherchée par cytométrie en flux. 1/ Etape d’opsonisation

Différentes concentration de solutions d’immunoglobulines sont testées : 5 mg/mL en eau physiologique, 2,5 mg/mL en eau physiologique, 1 ,25 mg/mL en eau physiologique, 0,625 mg/mL en eau physiologique, 0,31 mg/mL en eau physiologique, 5 mg/mL en eau physiologique, 0,15 mg/mL en eau physiologique et 0 mg/mL en eau physiologique.

20 pl de bactéries E. Coli marquées FITC non opsonisées sont incubées pendant une heure à +37°C au bain-marie, à l’abri de la lumière, avec 100 pl de solution d’immunoglobulines polyvalentes G à tester dans un tube de cytométrie.

Deux tubes témoin négatif (bactéries non opsonisées) sont préparés par addition de 100 pl d’eau physiologique à 20 pl de bactéries E. Coli non opsonisées marquées FITC.

Après l’incubation, les tubes sont lavés deux fois en ajoutant 3 ml d’eau physiologique/tube et centrifugé pendant 5 minutes à +4°C et à 250 g. Les surnageant sont ensuite éliminés et les culots repris dans 20 pL de milieu IMDM (Iscoves Modified Dulbecco's Medium) + 10% Sérum de veau foetal

2/ Etape de phagocytose :

20 mI_ de bactéries-FITC opsonisées sont mélangées à 100 pL de cellules THP1 CD16 + à 1x10 ⁶ cellules/m, avec des concentrations croissantes d'immunoglobulines G polyvalentes. Les essais ont été réalisés en double exemplaire. Un échantillon de contrôle négatif est réalisé avec 20mI bactéries non opsonisées-FITC auxquelles sont ajoutées 100 mI de cellules THP1 CD16+ à 1x10 ⁶ cellules/mL. L'incubation est effectuée à 37°C pendant 1 heure. À la fin de l'incubation, le marquage FITC est éteint en ajoutant 100 pL de bleu trypan dilué au 1/20 et maintenu à 4°C, afin d’éliminer le signal des bactéries collées aux cellules THP1 CD16+. Un lavage est ensuite effectué en ajoutant 3 ml d’eau physiologique et en centrifugeant les tubes pendant 3 minutes à +4°C et à 600 g.

Après une étape de lavage, les cellules THP1 CD16 + sont marquées avec un anticorps anti-CD45 fluorescent pendant 15 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Les échantillons sont lavés à nouveau par ajout de 3 ml d’eau physiologique et en centrifugeant les tubes pendant 3 minutes à +4°C et à 600 g.

Les échantillons sont lavés à nouveau et fixés avec 500 pL de solution de fixation diluée au 1/40 dans le PBS avant analyse. Le pourcentage de cellules THP1 CD45+ contenant lesbactéries FITC (pourcentage de phagocytose) et leur intensité de fluorescence moyenne FITC (MFI) sont mesurés par cytométrie de flux avec un cytomètre Galios Flow de la société Beckman Coulter. Les résultats sont ensuite analysés avec le logiciel Kaluza Analysis.

Exemple 6 : Phagocytose des hématies de lapin médiées par les immunoglobulines polyvalentes G

Ce mode opératoire décrit les étapes à réaliser pour évaluer la capacité d’immunoglobulines polyvalentes à induire la phagocytose d’hématies de lapin, possédant des sites antigéniques de type glycanique similaire à certaines bactéries, par des cellules monocytaires humaines THP1 exprimant les récepteurs Fc (FcyRs) CD32, CD64 et transfectées avec le récepteur CD16a.

In vivo, le phénomène de phagocytose a pour but la destruction d’agents pathogènes ayant pénétrés dans l’organisme. La phagocytose se déroule en 2 phases :

- phase de reconnaissance entre les cellules phagocytaires et les antigènes du microorganisme par l’intermédiaire d’opsonines. L’opsonisation est une liaison entre les immunoglobulines recouvrant spécifiquement les antigènes du microorganisme et leurs récepteurs présents à la surface des phagocytes (CD16, CD32 et CD64) associée à une liaison avec le complément (C3b).

- phase d’endocytose : le microorganisme est ensuite ingéré par déformation membranaire de la cellule phagocytaire et se retrouve dans une vésicule cytoplasmique appelée phagosome. La fusion du phagosome avec les lysosomes entraîne sa digestion et sa destruction. Les débris sont rejetés à l’extérieur de la cellule.

Des hématies de lapin marquées par un fluorochrome et opsonisées avec des immunoglobulines polyvalentes, sont incubées avec les cellules THP1 CD16+ à +37°C. La présence d’hématies fluorescentes internalisées par les cellules phagocytaires est recherchée par cytométrie en flux.

1/ Lavage des hématies de lapin

Les hématies de lapin (2mpl) sont fraîchement prélevées le jour du test à l’aide d’une seringue stérile contenant un anticoagulant (citrate). Les hématies sont ensuite laver trois fois avec 10 mL d’eau physiologique par centrifugation à 1730 g pendant 5 minutes. Après 3 lavages successifs, les culots globulaires sont repris avec 400 pL d’eau physiologique.

2/ Marquage des hématies de lapin au PKH67

La suspension est tout d’abord mélangé avec 2ml de diluent C et ensuite avec 2ml de solution de PKH67 à 4x10 ^® M diluée au 1/250 en diluent C (concentration finale : 2x10 ^® M). Après un rapide mélange, la suspension a été incubée pendant 5 minutes dans l’obscurité. 4ml de sérum de veau foetal (SVF) ont été ajoutés, le surnageant a été éliminé par centrifugation pendant 5 min à 1730g et le culot lavé trois fois dans de 15 ml eau physiologique. Le marquage par PKH67 a été contrôlé par cytométrie. Toutes les hématies présentent une fluorescence. Réajuster la suspension d’hématies de lapin à 200 x 10 ^® cellules/mL par ajout d’eau physiologique.

3/ Sensibilisation des hématies de lapin :

Différentes concentration de solutions d’immunoglobulines G sont testées : 5 mg/mL en eau physiologique, 2,5 mg/mL en eau physiologique, 1 ,25 mg/mL en eau physiologique, 0,625 mg/mL en eau physiologique, 0,31 mg/mL en eau physiologique, 5 mg/mL en eau physiologique, 0,15 mg/mL en eau physiologique et 0 mg/mL en eau physiologique. Incuber pendant une heure à +37°C au bain-marie, à l’abri de la lumière, 150 pL de suspensions globulaires à 200 x 10 ⁶ hématies de lapin/mL marquées au PKH-67 avec 150 pL de solution d’immunoglobulines à tester dans un tube de cytométrie.

Deux tubes témoin négatif (hématies non opsonisées) sont préparés par addition de 150 pL d’eau physiologique à 150 pL de suspensions globulaires à 200 x 10 ⁶ hématies de lapin/mL marquées au PKH67.

Après l’incubation, les tubes sont lavés deux fois en ajoutant 3 ml de milieu IMDM+ 10%SVF par tube et centrifugé pendant 5 minutes à 1730 g. Les surnageant sont ensuite éliminés et les culots repris dans 300 pL de milieu IMDM+ 10%SVF (100x10 ⁶ hématies/m L)

4/ Etape de phagocytose :

La phagocytose a été étudiée avec des hématies sensibilisées avec des quantités connues d’immunoglobulines G et des cellules THP1 CD16+. Les hématies de lapin marquées avec le PKH67 sont mélangées à 100 pL de cellules THP1 CD16 + à 1x10 ⁶ cellules/ml, avec des concentrations croissantes d'immunoglobulines G polyvalentes. Les essais ont été réalisés en double exemplaire. Un échantillon de contrôle négatif est réalisé avec 10OmI d’hématies de lapin marquées au PKH67 auxquelles sont ajoutées 100 mI de cellules THP1 CD16+ à 1x10 ⁶ cellules/mL. L'incubation est effectuée à 37°C pendant 1 heure. À la fin de l'incubation, le marquage PKH67est éteint en ajoutant 100 pL de bleu trypan dilué au 1/20 et maintenu à 4°C, afin d’éliminer le signal des hématies de lapîn collées aux cellules THP1 CD16+. Un lavage est ensuite effectué en ajoutant 3 ml d’eau physiologique et en centrifugeant les tubes pendant 3 minutes à +4°C et à 600 g.

Après une étape de lavage, les cellules THP1 CD16 + sont marquées avec 5pl anticorps anti-CD45 fluorescent dans 500pl de PBS par tube pendant 15 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Les échantillons sont lavés à nouveau par ajout de 3 ml d’eau physiologique et en centrifugeant les tubes pendant 3 minutes à +4°C et à 600 g.

Les échantillons sont lavés à nouveau et les hématies sont lysées avec 500 pL de solution de Versalyse Lysing pendant 20 minutes à la température ambiante, à l'abri de la lumière, afin d'éliminer les hématies non phagocytées (les hématies phagocytées par les cellules cibles ne sont pas sensibles à ces traitements). Les échantillons sont lavés à nouveau et fixés avec 500 pL de solution de fixation diluée au 1/40 avant analyse. Le pourcentage de cellules THP1 CD45+ contenant les hématies PKH67 (pourcentage de phagocytose) et leur intensité de fluorescence moyenne PKH67 (MFI) sont mesurés par cytométrie de flux avec un cytomètre Galios Flow de la société Beckman Coulter. Les résultats sont ensuite analysés avec le logiciel Kaluza Analysis. Lecture des tubes au cytomètre Gallios (Beckman Coulter) (Conservation à l’abri de la lumière avant la lecture) : expression de PKH-67 en FL1 avec une fenêtre sur les cellules CD45+.

Exemple 7 : Inhibition par des immunoglobulines G polyvalentes de la phagocytose d’hématies opsonisées

Ce mode opératoire décrit les étapes à réaliser pour évaluer la capacité d’immunoglobulines polyvalentes à inhiber la phagocytose d’hématies humaines opsonisées par des anticorps anti-hématies (modèle d’Anémie Hémolytique Auto- Immune), par des cellules monocytaires humaines THP1 exprimant les récepteurs Fc (FcyRs) CD32, CD64 et transfectées avec le récepteur CD16. L’Anémie Hémolytique Auto-Immune (AHAI) est une maladie auto-immune médiée par des auto-anticorps anti-hématies induisant la destruction des hématies. Le mécanisme d’action majoritaire impliqué dans la clairance des hématies opsonisées est la phagocytose par les macrophages de la pulpe rouge de la rate de phénotype CD16+/CD32+/CD64+.

Des essais cliniques ont montré l’efficacité des immunoglobulines polyvalentes dans le traitement de cette pathologie. Cette efficacité thérapeutique serait médiée par le blocage des FcyRs exprimées par les macrophages spléniques.

Des hématies humaine RhD-i- marquées par un fluorochrome et opsonisées avec un anticorps anti-D, jouant le rôle d’auto-anticorps, sont incubées avec les cellules THP1 CD16+ à +37°C en présence de concentrations croissantes d’immunoglobulines polyvalentes. La présence d’hématies fluorescentes internalisées par les cellules phagocytaires est recherchée par cytométrie en flux.

1/ Lavage des hématies humaines RhD+

Ajouter 5 mL d’eau physiologique sont ajoutés aux 10 mL d’hématies OR2R2, puis la suspension contenant les hématies est homogénéisé. La suspension contenant les hématies est ensuite lavée 2 fois avec 10 ml d’eau physiologique par centrifugation à 1730 g pendant 5 minutes. Après 2 lavages successifs, le culot globulaire est repris avec 400 pL d’eau physiologique.

2/ Marquage des hématies RhD+ au PKH67

Les 4000mI de culot sont mélangés avec 2ml de diluant C et ensuite avec 2ml de solution de PKH67 à 4x10 ⁶ M diluée au 1/250 en diluent C (concentration finale : 2x10 ⁶ M). Après un rapide mélange, la suspension a été incubée pendant 5 minutes dans l’obscurité. 4ml de sérum de veau foetal (SVF) ont été ajoutés, le surnageant a été éliminé par centrifugation pendant 5 min à 1730g et le culot lavé trois fois dans de 15 ml eau physiologique. Le marquage par PKH67 a été contrôlé par cytométrie. Toutes les hématies présentent une fluorescence. Réajuster la suspension d’hématies de lapin à 200 x 10 ⁶ cellules/mL par ajout d’eau physiologique.

3/ Sensibilisation des hématies humaines RhD+

La suspension d’hématies est incubée pendant une heure à +37°C au bain-marie, à l’abri de la lumière, 500 pL de suspensions globulaires à 200 x 10 ⁶ hématies/mL marquées au PKH-67 avec 500 pL de solution d’immunoglobulines à tester dans un tube de cytométrie. Un tube témoin négatif (hématies non opsonisées) est préparés par addition de 500 mI_ d’eau physiologique à 500 mI_ de suspensions globulaires à 200 x 10 ⁶ hématies de lapin/mL marquées au PKH67.

Après l’incubation, les tubes sont lavés deux fois en ajoutant 3 ml de milieu IMDM+ 10%SVF par tube et centrifugé pendant 5 minutes à 1730 g. Les surnageant sont ensuite éliminés et les culots repris dans 1 mL de milieu IMDM+ 10%SVF (100x10 ⁶ hématies/mL)

4/ Etape de phagocytose

Différentes concentration de solutions d’immunoglobulines G sont testées : 5 mg/mL en eau physiologique, 2,5 mg/mL en eau physiologique, 1 ,25 mg/mL en eau physiologique, 0,625 mg/mL en eau physiologique, 0,31 mg/mL en eau physiologique, 5 mg/mL en eau physiologique, 0,15 mg/mL en eau physiologique et 0 mg/mL en eau physiologique. 100 pL de cellules THP1 CD16+ à 1x10 ⁶ cellules/mL sont pré-incubées avec 50 pL des concentrations croissantes d’immunoglobulines à tester pendant 30 minutes à +37°C.

Les hématies marquées avec le PKFI67 sont mélangées à 100 pL de cellules THP1 CD16 + à 1x10 ⁶ cellules/ml, et sensibilisées avec une concentration saturante d’anticorps anti-D. Les essais ont été réalisés en double exemplaire. Un échantillon de contrôle négatif est réalisé avec 100mI d’hématies PKH67 non opsonisées auxquelles sont ajoutées 100 mI de cellules THP1 CD16+ à 1 x10 ⁶ cellules/mL.

L'incubation est effectuée à 37°C pendant 1 heure. À la fin de l'incubation, le marquage PKH67est éteint en ajoutant 100 pL de bleu trypan dilué au 1/20 et maintenu à 4°C, afin d’éliminer le signal des hématies de lapîn collées aux cellules THP1 CD16+. Un lavage est ensuite effectué en ajoutant 3 ml d’eau physiologique et en centrifugeant les tubes pendant 3 minutes à +4°C et à 600 g.

Après une étape de lavage, les cellules THP1 CD16 + sont marquées avec 5pl anticorps anti-CD45 fluorescent dans 500mI de PBS par tube pendant 15 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Les échantillons sont lavés à nouveau par ajout de 3 ml d’eau physiologique et en centrifugeant les tubes pendant 3 minutes à +4°C et à 600 g.

Les échantillons sont lavés à nouveau et les hématies sont lysées avec 500 pL de solution de Versalyse Lysing pendant 20 minutes à la température ambiante, à l'abri de la lumière, afin d'éliminer les hématies non phagocytées (les hématies phagocytées par les cellules cibles ne sont pas sensibles à ces traitements). Les échantillons sont lavés à nouveau et fixés avec 500 pL de solution de fixation diluée au 1/40 avant analyse. Le pourcentage de cellules THP1 CD45+ contenant les hématies PKFI67 (pourcentage de phagocytose) et leur intensité de fluorescence moyenne PKH67 (MFI) sont mesurés par cytométrie de flux avec un cytomètre Galios Flow de la société Beckman Coulter. Les résultats sont ensuite analysés avec le logiciel Kaluza Analysis. Lecture des tubes au cytomètre Gallios (Beckman Coulter) (Conservation à l’abri de la lumière avant la lecture) : expression de PKFI-67 en FL1 avec une fenêtre sur les cellules CD45+.