De nombreuses dynamines primaires et protéines apparentées ont été identifiées durant ces dernières années chez les eucaryotes. Il semble établi que ces protéines ont de nombreux représentants dans tous les organismes, de la levure à l'homme, et qu'elles sont localisées à différents sites cellulaires où elles remplissent des fonctions bien particulières (van der Bliek A. M., 1999, Trends Cell Biol., 9, pp. 96-102). Toutes sont de grandes GTPases (80 à 100 kDa), possédant outre le domaine catalytique GTPase, un domaine central caractéristique des dynamines et un ou deux domaines d'assemblage (domaines coiled-coil). Certaines dynamines comme Mspl/MGMl, se distinguent en outre par la présence d'un domaine amino-terminal fortement basique.

On peut classer les dynamines en trois groupes, selon les fonctions qui ont pu leur tre attribuées et/ou selon leur similitude structurale. Dans le premier groupe (famille des dynamines conventionnelles) on trouve les dynamines 1 et 2 des mammifères, la dynamine Vpslp de la levure bourgeonnante (Nothwehr S. F. et al., 1995, J. Cell. Biol., 129, pp. 35-46 ; Rothman J. H. et al., 1990, Cell, 61, pp. 1063-74), la dynamine dyn-1 du nématode C. elegans (Clark S. G. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 10438-43). Ces protéines sont décrites comme jouant un rôle dans la formation des vésicules et le transport.

Le second groupe (famille Dnml, Drpl) comprend les dynamines Dnmlp de la levure à bourgeons, DRP-1 de C. elegans et la Drpl des mammifères (Imoto M. et al., 1998, J. Cell Sci., 111, pp. 1341-49 ; Kamimoto T., 1998, J. Biol. Chem., 273, pp. 1044-51 ; Yoon Y. et al., 1998, J. Cell Biol., 140, pp. 779-93). Ce sont des protéines cytoplasmiques dont les fonctions sont impliquées dans le trafic vésiculaire et dans le contrôle de la distribution des

mitochondries.

Le troisième groupe (famille Mspl/MGMl) est formé uniquement des protéines MGM1 et Mspl qui ont été isolées dans deux levures divergentes, respectivement Saccharomyces cerevisiae (Jones B. and Fangman W., 1992, Genes and Dev., 6, pp. 380-389) et Schizosaccharomyces pombe (Pelloquin L. et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comun.

251, pp. 720-726 ; Pelloquia L. et al., 1999, J. Cell Sci., 112, pp. 4151-61). MGMl et Mspl sont des dynamines mitochondriales indispensables au maintien de l'ADN mitochondrial et à l'organisation du réseau mitochondrial.

Chez l'homme, seulement deux familles de dynamines ont été décrites. Celle des dynamines conventionnelles, DYN1 et DYN2 impliquées dans les processus d'endocytose, et celle de la famille Drpl impliquée dans la voie sécrétrice (Imoto M. et al., 1998, J. Cell Sci., 111, pp.

1341-49) et dans la maintenance du réseau mitochondrial (Smirnova E. et al., 1998, J ; Cell Biol., 143, pp. 351-8).

La présente invention a pour objet une nouvelle dynamine mitochondriale humaine appelée MSP1, orthologue à Mspl et MGM1 des levures, présentant plusieurs isofbrmes issues de l'épissage alternatif du gène codant, ainsi que les séquences d'ADNc issues d'épissages alternatifs codant pour ladite dynamine MSP1 et ses isoformes. De manière inattendue, il a été trouvé que des formes mutées de MSP1 sont impliquées dans une pathologie humaine d'origine génétique, à savoir l'atrophie optique dominante.

L'atrophie optique dominante, notée OPA1 selon la base de données Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, entrée 165500) est la plus fréquente des neuropathies optiques héréditaires non syndromiques. Elle se manifeste chez un individu sur 50 000 et conduit dans de nombreux cas à la cécité légale (acuité visuelle inférieure à l/20ème). Cette maladie progressive et irréversible est caractérisée par une perte de l'acuité visuelle dès la jeune enfance, une anomalie du sens visuel chromatique (dyschromatopsie) acquise et une lacune de perception dans le champ visuel se projetant à la fois sur le point de fixation et sur la tâche aveugle (scotome centrocoecal) avec maintien du champ visuel périphérique (Kjer P., 1959, Acta Ophthalmol. Scand., 37, suppl. 54, pp. 1-146). Malgré le fait que les études cytologiques ont mis en évidence chez tous les cas pathologiques la disparition des cellules ganglionnaires de la rétine, les variations phénotypiques sont importantes d'un malade à l'autre. Des études ont été menées pour décrire les manifestations physiologiques de la maladie et comprendre son développement (Brown J. et al., 1997, Arch. Ophthalmol., 115,

pp. 95-99). Malheureusement, seuls les symptômes cliniques en sont connus et les mécanismes biochimiques et cellulaires de l'OPAl n'ont pu à ce jour tre mis en évidence.

En particulier rien n'est connu du gène ou de la protéine responsable de la dégénérescence cellulaire, ni de leur structure, ni de leur fonction, ou de leur mode d'action. Aucun traitement des symptômes de la maladie n'a pu tre mis au point jusqu'à présent.

Une démarche pour élucider les mécanismes responsables de cette maladie génétique et y porter remède est d'en rechercher les origines génétiques. Par analogie avec la Neuropathie Optique Héréditaire de Leber (LOS) dont les symptômes sont comparables à ceux de l'OPAl, l'hypothèse d'une implication des mitochondries a été formulée. Des travaux ont montré que dans le cas de la pathologie LHON, des mutations particulières de l'ADN mitochondrial pouvaient provoquer la dégénérescence du nerf optique (Howell N., 1997, J.

Bioe7 ? erg. Biomembr., 29, pp. 165-173). Dans le cas de l'OPAl, la région 3q28-q29 du chromosome 3 a été proposée pour porter le locus responsable de cette pathologie (Lunkes A. et al., 1995, Am. J Hum. Genet., 57, pp. 968-970).

Partant de cette hypothèse, l'équipe de U. E. A. Pesch a tenté de déterminer la structure d'un gène candidat pour l'OPAl (Pesch U. E. A. et al., 1999, American Journal of Human Genetics, 65-4, pp. A3 78 XP000993287). Le fragment d'ADNc KIAA0567, susceptible de coder de grosses protéines in vitro et supposé correspondre à des gènes de fonction inconnue de la région 3q28-q29 du chromosome 3, disponible sur la base de données DATA EMBL en ligne (Nagase T. et al., 1998, DNA res., 5, pp. 31-39) a été étudié. 16 liaisons introns/exons ont été identifiées, mais sans réussir à établir la séquence complète du gène.

Ainsi la structure génique impliquée dans l'OPAl n'est pas décrite et aucune protéine ne lui est associée, ce qui rend impossible de prédire une quelconque activité fonctionnelle, et à plus forte raison une implication dans une pathologie déterminée.

En fin de compte, jusqu'à présent le gène impliqué dans l'atrophie optique dominante n'a pas été identifié. La présente invention montre que des séquences d'ADN correspondant au gène MSPl/OPAl portent des mutations qui sont à l'origine de l'atrophie optique dominante. Ces mutations sont décrites ainsi que les protéines correspondantes. Au total, ce sont 14 mutations affectant l'activité des 8 isoformes de la dynamine MSP1 qui ont été identifiées.

Ainsi, aucune hypothèse de travail ne permettait jusqu'à présent d'incriminer une protéine particulière comme étant responsable de l'apparition des symptômes de l'OPAl. De mme, aucune pathologie n'avait à ce jour été associée à un dysfonctionnement lié à une dynamine.

De manière inattendue, la présente invention a su établir une relation directe entre une rétinopathie et la dynamine mitochondriale MSP1. Il devient de ce fait possible de disposer d'outils biochimiques et génétiques utiles à la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante.

DESCRIPTION : La présente invention a pour objet une protéine humaine appartenant à la famille des dynamines et comprenant plusieurs isoformes, les formes mutées de ladite protéine ainsi que les séquences nucléotidiques codant ladite protéine, y compris ses isoformes et ses mutants.

L'invention concerne également les vecteurs capables d'exprimer ladite protéine et/ou ses isoformes et/ou ses formes mutées, dans tout type de cellules hôtes, ainsi que les cellules transformées par lesdits vecteurs et les procédés les utilisant. Enfin l'invention a pour objet des procédés d'identification de composés biologiques ou pharmacologiques modulant l'activité de la protéine selon l'invention, de ses isoformes et de ses mutants, et l'utilisation desdits composés à des fins thérapeutiques.

La présente invention a pour objet un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi SEQ ID N°1, une séquence homologue de ladite SEQ ID N°1, un fragment biologiquement actif de ladite SEQ ID N°1 ou de ses séquences homologues, ledit polypeptide étant désigné par MSP1.

La séquence SEQ ID N°1 est la séquence d'acides aminés de la dynamine MSP1 identifiée chez l'humain. C'est une protéine ubiquitaire dotée d'une activité GTPase en relation avec le fonctionnement mitochondrial et la division cellulaire.

Par polypeptide homologue, on entend tout polypeptide résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID N°1, c'est-à-dire mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'au moins un acide aminé. Lesdits polypeptides homologues présentent préférentiellement une homologie de séquence supérieure à 80%, avec la séquence SEQ ID Nui l complète.

Les polypeptides homologues ou les fragments polypeptidiques de la séquence SEQ ID N° 1 selon l'invention présentent des propriétés biologiques identiques ou analogues aux propriétés biologiques du polypeptide de séquence SEQ ID N°1.

Constituent aussi un objet de la présente invention les polypeptides isoformes du polypeptide

MSP1, de désignation générale MSP1-X. Les polypeptides isoformes entre eux sont les polypeptides qui résultent de la transcription d'une séquence nucléique portée par un gène unique mais dont les séquences codantes (exons) sont retenues et combinées de manière différente par le jeu d'épissages alternatifs de la séquence transcrite. Les polypeptides isoformes MSP1-X selon l'invention sont également des dynamines ayant une activité catalytique GTPase.

En particulier, sont revendiqués les polypeptides isofbrmes dont la séquence d'acides aminés est représentée respectivement par SE ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°S, SEQ ID N°6, SEQ ID N°7, SEQ ID N°e, SEQ ID N°9. Sont également revendiquées les séquences homologues desdites SEQ ID N°3 à 9, les fragments biologiquement actifs desdites SEQ ID N°3 à 9 et de leurs séquences homologues.

Les 7 protéines isofbrmes décrites par les séquences SEQ ID N°3 à 9 ci-dessus sont désignées respectivement MSP1-B, MSP1-C, MSP1-D, MSP1-E, MSP1-F MSP1-G, et MSP1-H, le 8ème isoforme MSP1-A étant la forme dominante c'est-à-dire MSP1.

Les 7+1 dynamines MSP1-X isoformes sont codées à partir de 8 ARNm matures résultant d'épissages alternatifs de 3 exons du gène MSPI/OPAI, à savoir l'exon 4, l'exon 4b et l'exon 5b. La description détaillée de ces variants d'épissage est présentée dans l'exemple N°4.

La présente invention a également pour objet un polypeptide homologue d'un polypeptide MSP1 ou MSP1-X et s'en distinguant par le fait qu'il porte une ou plusieurs mutations induisant une modification, voire une perte totale, de l'activité biologique dudit polypeptide MSP1 ou MSP1-X. Les formes mutées de MSP1 et de MSP1-X sont désignées MSP1-m et MSP1-X-m, respectivement. Ces polypeptides mutés peuvent tre responsables de troubles associés au dysfonctionnement mitochondrial et aux troubles de la division cellulaire. Ils sont en particulier impliqués dans des maladies neurodégénératives telles que les neuropathies optiques et tout particulièrement l'atrophie optique dominante OPA1.

La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique comprenant au moins une séquence choisie parmi a)-SEQ ID N°2, une séquence homologue de ladite SEQ ID N°2, un fragment de ladite SEQ ID N°2, lesdites séquences codant pour un polypeptide MSP1 selon l'invention ; b)-SEQ ID N°10, SEQ ID N°e 1, SEQ ID N°12, SEQ ID N°-13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16, une séquence homologue de l'une desdites SEQ ID NO 10 à 16, un

fragment de l'une desdites SEQ ID N°10 à 16, lesdites séquences codant pour un polypeptide MSP1-X selon l'invention ; et c)-les séquences complémentaires desdites séquences nucléotidiques.

La séquence SEQ ID N°2 est la séquence d'ADNc (ADN complémentaire) comprenant la phase codante, ou phase de lecture, correspondant à la protéine MSP1 identifiée chez l'humain. Les séquences SEQ ID N°10, SEQ ID N°11, SEQ ID N°12, SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16 sont les séquences d'ADNc comprenant respectivement la phase codante correspondant aux protéines MSP1-X identifiées chez l'humain.

Les séquences d'ADNc représentées par SEQ ID N°2 et SEQ ID N°10 à 16 ci-dessus sont donc les séquences images des séquences isoformes d'ARNm codant directement les protéines MSP1 et MSP1.-X. Lesdites séquences isoformes d'ARNm résultent de la transcription d'une séquence d'ADN issue d'un gène unique mais dont les séquences codantes sont retenues et combinées de manière différente par le jeu d'épissages alternatifs de la séquence transcrite.

Par séquence nucléotidique"homologue", on entend toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide homologue de MSP1 ou MSP1-X tel que défini précédemment, c'est-à- dire une séquence résultant d'une modification de la séquence SEQ ID N°2 ou des séquences SEQ ID ? 10 à 16, notamment par mutation, délétion, addition ou substitution d'au moins un nucléotide. Sont en particulier comprises les séquences déduites de la séquence SEQ ID N°2 ou des séquences SEQ ID N°10 à 16, par dégénérescence du code génétique.

Une telle séquence homologue présente préférentiellement une homologie supérieure à 70% avec les séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°10 à 216, respectivement.

La séquence nucléotidique selon l'invention comprend entre autres les séquences homologues de SEQ ID N°2 portant une mutation qui affecte l'activité biologique du polypeptide MSP1 et qui code pour la séquence d'acides aminés d'un polypeptide MSP1-m selon l'invention.

De manière analogue, la séquence nucléotidique selon l'invention comprend entre autres les séquences homologues des séquences représentées par SEQ ID N°10 à 16, portant une mutation qui affecte l'activité biologique du polypeptide MSP1-X et qui code pour la séquence d'acides aminés d'un polypeptide MSPl-X-m selon l'invention. Des mutations

MSPl-m et MSPl-X-m sont décrites dans l'exemple N°6.

Dans la suite de la description, et sauf indication contraire, le terme"MSP1"désigne indifféremment les 8 dynamines isoformes MSP1 et MSP1-X selon l'invention. De mme, le terme"MSPl-m"désignera indifféremment MSPl-m et MSP1-X-m.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent tre utilisées pour la production d'une protéine ou d'un fragment de,,, protéine recombinante MSP1 ou MSPl-m selon l'invention, selon les techniques de'production de produits recombinants connues de l'homme du métier.

Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.

L'invention concerne les vecteurs de clonage et d'expression contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, et les cellules hôtes transfectées (ou transformées) par ces vecteurs.

Le vecteur peut comporter un promoteur, et des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription et de la traduction. Il peut comprendre un ou plusieurs marqueurs de sélection selon les besoins. Il peut tre intégré dans la cellule et éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.

Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent tre insérées dans des vecteurs de réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou dans des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent tre intégrés dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple l'électroporation.

De tels vecteurs d'intért sont par exemple les plasmides des familles pBlueScript, pREPI, pCDNA oupRK171.

Ces vecteurs peuvent tre utilisés tels quels directement pour la synthèse in vitro du polypeptide selon l'invention ou introduits dans une cellule hôte.

L'hôte cellulaire peut tre choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, dont les levures, les bactéries, les cellules de mammifères telles que les cellules HeLa humaines. Ces cellules transformées peuvent tre obtenues par la transfection d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique

transfectée.

Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.

Un mode de réalisation de la présente invention consiste en un procédé de fabrication dudit polypeptide, caractérisé en ce que l'on cultive les cellules transfectées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. En particulier, il est utile de pouvoir détecter et produire de manière ectopique un polypeptide selon l'invention.

L'association de la phase codante du polypeptide selon l'invention avec la phase codante d'une protéine étiquette permet d'exprimer dans un hôte adapté une protéine chimère composée du polypeptide selon l'invention et de ladite protéine étiquette.

Une fonction de ladite protéine étiquette peut tre sa reconnaissance par des anticorps spécifiques. La présence de la protéine étiquette est alors le signe de la présence du polypeptide d'intért. Une telle étiquette est qualifiée d'étiquette antigénique.

La présente invention a donc pour objet un procédé permettant de détecter le polypeptide MSP1 ou MSPl-m consistant à : -associer la phase codante du polypeptide MSP 1 ou MSP 1-m selon l'invention à la phase codante d'une étiquette antigénique dans une cellule hôte ; -exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans l'hôte choisi ; -mettre en contact ledit hôte avec un anticorps reconnaissant spécifiquement ladite étiquette ; -détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide MSP1 ou MSP1-m.

Une telle étiquette antigénique est une protéine choisie de telle sorte que soient connus et disponibles la séquence codante, et au moins un anticorps spécifique et détectable de ladite protéine. Elle peut tre par exemple la protéine verte fluorescente (Green Fluorescent Protein), l'épitope Myc, l'épitope Haemagglutinine. La cellule hôte peut tre n'importe quelle cellule hôte selon l'invention. L'anticorps associé à la protéine chimère obtenue par le procédé selon l'invention peut tre détectée par tout moyen à la disposition de l'homme de l'art.

Il est également intéressant de produire la protéine d'intért pure et dans des quantités utilisables industriellement, c'est-à-dire de l'ordre du mg. Dans ce cas on peut utiliser une protéine étiquette dont la fonction est de permettre la fixation spécifique de la protéine

chimère étiquette+polypeptide sur un support ayant une affinité spécifique de l'étiquette choisie. Une telle étiquette est alors qualifiée d'étiquette d'affinité.

La présente invention a donc aussi pour objet un procédé permettant de purifier le polypeptide MSP1 ou MSPl-m consistant à : -associer la phase codante du polypeptide MSP1 ou MSPl-m selon l'invention à la phase codante d'une étiquette choisi pour son affinité à un support, -exprimer la protéine chimère : codée par ladite association de phases codantes dans l'hôte choisi, -obtenir un extrait par lyse de l'hôte, -mettre en contact l'extrait avec le support choisi, -récupérer le polypeptide selon l'invention par élution.

Une étiquette d'affinité est une protéine choisie de telle sorte que soient connus et disponibles la séquence codante, et au moins un support ayant une affinité spécifique avec ladite protéine. Elle peut tre par exemple, la Glutathion S-transférase, la protéine liante du maltose (Maltose Binding Protein), des polymères d'histidines. Le support d'affinité spécifique peut tre par exemple constitué de microbilles d'un métal tel que le nickel fixant les hexamètres d'histidine.

Les procédés utilisant une étiquette antigénique et une étiquette d'affinité peuvent bien entendu tre combinés. Il suffit pour cela d'associer à la phase codante de la protéine d'intért la phase codante d'une étiquette antigénique et la phase codante d'une étiquette d'affinité. Les procédés seront mis en oeuvre successivement, comme décrit précédemment pour détecter et/ou purifier la protéine d'intért.

L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, obtenus à partir d'un polypeptide selon l'invention administré à un animal, et capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention. L'invention a en outre pour objet l'utilisation de ces anticorps pour la purification ou la détection d'un polypeptide MSP1 ou MSPl-m dans un échantillon biologique.

Les anticorps monoclonaux peuvent tre obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Köhler et Milstein (Nature, 1975,256, pp. 495-497).

Les anticorps peuvent tre des anticorps chimériques, ou également se présenter sous la forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement utiles pour détecter la présence de MSP1 ou de MSPl-m.

La présente invention a donc pour objet un procédé de détection immunologique de MSP1 ou MSP1-m dans un échantillon biologique comprenant les étapes consistant à : -mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps selon l'invention, détectable ; -détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide MSP1 ou MSP1-m.

Par"anticorps détectable", on entend soit un anticorps marqué par un groupement détectable, tel que par exemple un groupement radioactif, enzymatique, fluorogène ou fluorescent, soit un anticorps auquel se lie un autre anticorps lui-mme marqué de manière détectable.

Par échantillon biologique on entend toute cellule animale y compris humaine, normale ou transformée, tout micro-organisme normal ou transformé, et de manière générale tout tissus comprenant de telles cellules.

Les anticorps selon l'invention peuvent ainsi permettre d'évaluer la localisation cellulaire, le niveau d'expression ou l'activité des protéines MSP1 et MSPl-m, ce qui peut tre une indication importante pour la détection de l'atrophie optique dominante OPA1.

L'invention a également pour objet un procédé de détection de l'activité GTPase de MSP1 ou de MSP1-m dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à : -mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps détectable selon l'invention -purifier le complexe anticorps-antigène, -mettre ce complexe en présence de substrat GTP (guanosine triphosphate), -doser le GDP (guanosine diphosphate) formé, indicateur de l'activité GTPase de MSP1 ou MSP 1-m.

Les échantillons biologiques susceptibles d'tre ainsi testés sont notamment des extraits de cellules'sanguines humaines, ou d'autres extraits tissulaires. Un échantillon biologique peut aussi tre constitué de cellules normales ou transformées par un vecteur selon l'invention, dans lesquelles l'activité GTPase due à MSP1 ou MSP1-m doit tre mesurée. La mesure de l'activité GTPase sur de telles cellules en présence de différents composés biologiques ou pharmacologiques permet de mettre en évidence l'éventuel caractère inhibiteur ou activateur desdits composés.

La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés susceptibles de moduler l'activité de MSP1 ou de MSPl-m, au cours duquel on met en contact lesdits composés avec lesdits polypeptides MSP1 ou MSPl-m et l'on évalue le taux de modification de l'activité GTPase de ces polypeptides. Par"modulation"de l'activité, on entend stimulation ou inhibition à des degrés variés incluant les variations juste perceptibles par les

moyens à la disposition de l'homme de l'art, jusqu'à des variations importantes pouvant aller jusqu'à la disparition totale de l'activité. On peut en particulier rechercher par ledit procédé des molécules ayant un effet stimulateur de l'activité de MSP1, ou des molécules ayant une action inhibitrice de l'activité de MSP1-m, ou inversement. Les composés modulateurs obtenus sont en principe de bons candidats en tant que principe actif d'un médicament en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.

L'invention a par ailleurs pour objet un procédé de criblage de protéines susceptibles de posséder une activité pharmacologique, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur un polypeptide selon l'invention.

Un autre objet de l'invention est un procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologique, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule transformée selon l'invention.

Le polypeptide MSP1 selon l'invention peut tre particulièrement utile pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles affectant la structure du réseau mitochondrial.

Un tel médicament peut tre employé dans le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier les neuropathies optiques et préférentiellement l'OPAl. Les polypeptides MSP1- m selon l'invention pourraient aussi servir à la mise au point d'un traitement anti-prolifératif utile pour soigner les dysfonctionnement de la division cellulaire, tels que le cancer.

Enfin, un vecteur plasmidique selon l'invention portant toute séquence codante pour MSP1 ou MSPl-m peut tre utilisé pour la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante par thérapie génique.

LISTE DES FIGURES Figure 1 : Fig 1 (A) : Organisation et comparaison de la structure primaire de MSP1 avec celle des protéines Mspl et MGM1 des levures Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces cerevisiae.

Fig 1 (B) : Pourcentage d'identité entre les autres représentants de cette famille de dynamines.

Figure 2 : Localisation chromosomique du gène MSPI/OPAl par hybridation fluorescence in situ (FISH) montrant le double marquage unique de la région 3q28-29.

Figure 3 : Séparation sur gel SDS-PAGE et exposition sur film radiosensible.

-échantillon IVT : transcription et traduction in vitro de la protéine MSP1 ; -échantillon P : immuno-précipitation de la protéine par des anticorps spécifiques.

Figure 4 : Production de la protéine MSP1 étiquetée Ha-6his dans la bactérie E. coli (EX : extrait total) et purification sur colonne de nickel (EL : éluat de la colonne de nickel).

Figure 5 : Production de la protéine MSP1 dans les levures Schizosaccharomyces pombe et dosage de son activité GTPase en présence ou en l'absence de composés A et B testés pour leur activité éventuelle. Les échantillons sont les suivants : -Tem : immuno-précipité de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant MSP1 dosé seul, -+A : immuno-précipité de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant MSP1 dosé en présence du produit A, -+B : immuno-précipité de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant MSP1 dosé en présence du produit B, -Con : immuno-précipité réalisé sur une souche de S. pombe ne produisant pas MSP1.

Figure 6 : Localisation cellulaire de la protéine MSP1 dans des cellules HeLa.

Fig 6 (A-1) : sur des cellules transfectées par le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his en utilisant des anticorps anti-Haemagglutinine, Fig 6 (B-1) : sur des cellules non transfectées en utilisant des anticorps spécifiques de MSP1, Fig 6 (A-2) : sur des cellules transfectées par le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his en utilisant l'anticorps anti-hsp60-LK2, spécifique d'une protéine mitochondriale, Fig 6 (B-2) :

sur des cellules non transfectées en utilisant les mmes anticorps LK2 que Fig 6 (A-2).

Les 4 échantillons ont été préparés selon le mme mode opératoire. La localisation de MSP 1 est visualisée sur les clichés A-1 et B-1. Le réseau mitochondrial est révélé sur les clichés A- 2 et B-2.

EXEMPLES Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. Ils montrent qu'il est possible de synthétiser une protéine selon l'invention in vitro, comme in vivo dans tous les organismes modèles classiques ; et de purifier, doser ou localiser ladite protéine, ses isoformes, ou leurs mutants.

EXEMPLE 1 : Identification des séquences nucléotidiques et protéiques.

La recherche d'un orthologue humain des dynamines Mspl/MGMl a été réalisée dans la banque de données GENBANK. Nous avons sélectionné une séquence d'ADNc d'une longueur de 5 821 pb (fragment N° KIAA0567, code d'accès AB011139, Nagase T. et al., 1998, DNA res., 5, pp. 31-39) dont le fragment compris entre le nucléotide 56 et 2935 code pour une protéine de 960 acides aminés ayant 19 % d'identité avec Mspl et 17 % d'identité avec MGM1. Ceci représente une homologie significative étant donné que le degré d'identité avec les autres dynamines est de l'ordre de 10 à 12 % seulement. Par ailleurs l'organisation de cette protéine est fortement analogue à celle de Mspl et MGM1, en particulier par la présence d'un domaine amino-terminal basique caractéristique des protéines importées dans les mitochondries. La séquence comprises entre +56 et 2935 a donc été identifiée comme codant pour la dynamine mitochondriale MSP1 orthologue à Mspl et MGM1 des levures (Figure 1).

EXEMPLE 2 : Caractérisation du polypeptide MSP1.

Une protéine codée par un segment de 2880 pb a été sélectionnée dans le fragment d'ADNc KIAA0567. Elle est constituée de 960 acides aminés (SEQ ID N° 1). L'étude de sa structure primaire montre que la protéine comporte un domaine amino-terminal très basique (acides

aminés 1 à 120), un premier domaine d'assemblage (acides aminés 121 à 259), un domaine catalytique GTPase (acides aminés 260 à 505), un domaine central de type dynamine (acides aminés 505 à 787), et un deuxième domaine d'assemblage dans la zone carboxy-terminale.

Ces domaines caractéristiques se retrouvent également dans les dynamines de levures Mspl et MGM1. Les ressemblances dans la séquence et dans la structure entre le peptide humain décrit et les protéines de levures Mspl et MGM1 concourent à montrer que le fragment AB011139 d'ADNc code pour l'orthologue humain de Mspl/MGMl des levures, qui sera appelée MSP1.

EXEMPLE 3 : Identification du gène MSPI/OPAI et, localisation chromosomique.

Le gène MSP1/OPS1 a une taille supérieure à 69kb et est composé d'au moins 29 exons avec des liaisons introns-exons suivant la règle AG-GT. Il code pour un ARN messager dont la séquence codante complète est présentée sous la forme de 1ADN complémentaire et décrite par SEQ ID N° 2. Le gène MSPIIOPAI a été localisé par hybridation fluorescente in situ (FISH) en utilisant les méthodes conventionnelles avec comme sonde l'ADNc complet incluant le cadre ouvert de lecture de la protéine MSP1 et l'extrémité 3'non traduite. Les résultats montrent clairement un double marquage unique dans la région 3q28-29 (Figure 2).

EXEMPLE 4 : 4. A)-Identification d'exons supplémentaires dans le gène MSP1/OPA1.

L'analyse de l'ARNm extrait des leucocytes humains et de différents tissus a permis de mettre en évidence l'existence de 8 produits codant pour huit formes différentes de MSP1, résultant de la transcription du gène MSPIIOPAI, qui se sont avérés tre les produits obtenus par épissages alternatifs de l'exon 4 et de 2 nouveaux exons 4b et 5b. Il a été procédé de la manière suivante : Des fragments d'ADNc obtenus à'partir d'ARN humain ont été amplifiés par PCR inverse à l'aide d'amorces permettant d'amplifier les exons 3 à 9.

Extraction : Les ARN ont été extraits de 11 types de tissus ou cellules : leucocytes, rétine, thyroïde, rein,

poumon, ovaire, muscle squelettique, foie, coeur, colon, cerveau foetal, par Stratagène (La Jolla, USA).

Les leucocytes ont été isolés à partir de 20 ml de sang additivé d'héparine. L'ARN total a été extrait selon la méthode AGPC en une étape (Chomczynski P. et Sacchi N., 1987, Anal.

Biochem., 162, pp. 156-159), et purifié sur billes de verre. La rétine de deux yeux humains a été prélevée et l'ARN a été extrait à l'aide du Kit RNeasy (R) (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon les indication du fabriquant.

Transcription inverse et amplification : Un mélange de 2 microg de l'ARN total, 200 unités de transcriptase inverse SuperScript II (R) (Gibco-BRL, Carlsbad, USA) en solution tampon, et 150 ng d'oligonucléotides aléatoires (Proméga, Madison, USA). Une transcription inverse sans transcriptase inverse a été effectuée pour servir de témoin. La séquence codante du gène MSP1/OPA1 comprise entre les exons 3 et 9 a été ensuite amplifiée à l'aide des amorces suivantes : K5S 5'-GGATTGTGCCTGACATTGTG-3' K5AS 5'-CACTCAGAGTCACCTTAACTGG-3' Les conditions de mise en oeuvre de la PCR sont 94°C pendant 3 mn, puis 35 cycles de 94°C pendant 30 s, 66 °C pendant 30 s et 72°C pendant 1 mn, puis 72°C pendant 10 mn.

Tous les produits de la PCR ont été séparés par électrophorèse sur agarose GTC à 3% (NuSieve (R), FMC Bioproducts, USA) purifiés par le kit Gel Extraction Kit (R) (QIAGEN, Courtaboeuf, France), clonés dans le vecteur pTOPOII (INVITROGEN) et séquencés Dans tous les tissus testés, 8 produits de PCR ont été obtenus, incluant le fragment de 597 pb attendu et 7 fragments supplémentaires de 498 à 762 pb. Le séquençage des 8 fragments clonés montre qu'ils résultent de la combinaison des alternatives absence/présence de trois exons, à savoir l'exon 4 et deux nouveaux exons appelés 4b et 5b codant respectivement des fragments de 18 et 37 acides aminés. Les séquences des nouveaux exons sont telles que le cadre de lecture n'est pas altéré et qu'elles possèdent les signaux consensus d'épissage conformément à la règle GT/AG. De mme, la soustraction de l'exon 4 n'altère pas non plus le cadre de lecture. C'est donc par un mécanisme d'épissage alternatif de 3 exons que 8 ARNm codant sont obtenus. Aucun autre épissage alternatif n'a été rencontré ailleurs dans la' séquence codante.

4. B)-Caractérisation des dynamines isoformes MSP1-X.

Les deux nouveaux exons 4b et 5b codant respectivement des portions de 18 et 37 acides aminés ne présentent pas d'homologie significative avec d'autres protéines connues.

Cependant, l'analyse des structures secondaires potentielles suggère que la séquence d'acides aminés déduite de l'exon 5b pourrait participer aux relations protéine-protéine par le biais de structures coiled-coil.

Les 8 produits de transcription sont exprimés dans les 11 types de tissus testés, avec quelques variations dans le niveau d'expression.

Les séquences d'ADNc correspondant aux 7 ARNm isofbrmes supplémentaires et les séquences des 7 polypeptides isoformes MSP1-X qui en sont issus sont représentés par : protéine épissage séquence polypeptidique séquence nucléotidique MSP1-B 356 SEQ ID N°3 SEQ ID N°10 MSP1-C 344b56 SEQIDN°4 SEQIDN°11 MSP1-D 34b56 SEQ ID N°5 SEQ ID N°12 MSP1-E 3455b6 SEQ ID N°6 SEQ ID N°13 MSP1-F 355b6 SEQ ID N°7 SEQ ID N°14 MSP1-G 34b55b6 SEQ ID N°8 SEQ ID N°15 MSP1-H 344b55b6 SEQ ID N°9 SEQ ID N°16 EXEMPLE 5 : Relation entre le gène MSPIIOPAI et la pathologie OPA1.

La concordance entre la localisation du locus OPA1 et la localisation chromosomique du gène MSPI/OPAl en 3q28-29 faisait de MSPI/OPAI un gène candidat pour l'atrophie optique dominante OPA1. A cette région du chromosome 3 sont associées plusieurs maladies héréditaires, néanmoins aucune anomalie caryotypique caractéristique n'avait été décrite à ce jour. Le séquençage du gène MSP1/OPA1 à partir d'ADN purifié a été réalisé sur des cellules sanguines de personnes atteintes d'atrophie optique dominante. Il a permis d'établir de manière inattendue, que les malades atteints d'OPAl portaient une mutation du

gène MSPIlOPAl.

EXEMPLE 6 Mutations de MSPI/OPAl jouant un rôle dans la pathologie OPA1.

Plusieurs types de mutations ont été identifiées chez 18 personnes souffrant de la pathologie OPA1 : mutations d'épissage, délétions, insertions, mutations non-sens, mutations faux-sens.

Mutations d'épissage : Une première mutation d'épissage concerne le dernier nucléotide de l'intron 9, supprimant ; le site d'excision de l'intron (IVS9-1G>A). Cette mutation a pour effet de ne pas reconnaître le début de l'exon 10 et de sauter directement au niveau de l'exon 11 sans décalage du cadre de lecture, ce qui induit une délétion de 27 acides aminés dans la protéine dans le domaine GTPase.

Quatre autres nouvelles mutations des sites d'épissage affectant les séquences consensus de sites d'épissage ont été identifiées. L'une d'elles est un changement du premier nucléotide de l'intron 12 (IVS 12+1 G>T), qui est une partie de la séquence GT canonique.

La deuxième mutation est un changement du 5ème nucléotide de l'intron 8 (IVS+5G>A).

Les deux autres sont des substitutions du dernier nucléotide de Fexon en amont. L'une affecte l'exon 9 (c. 984G>A) sans provoquer de modification de l'acide aminé codé (Lys328Lys) et l'autre se situe dans l'exon 26 (c. 2707G>C) ce qui conduit à une substitution d'acide aminé conservée (Vall903Leu). Bien que ces deux dernières mutations ne doivent pas avoir d'effet pathogène, la guanine en position 1 appartenant à la séquence consensus du site d'épissage ; un épissage inefficace avec un ARNm anormal est probable.

C'est pourquoi deux fragments ont été amplifiés par PCR inverse pour chacune de ces deux mutations. Pour la mutation c. 984G>A, deux produits de transcription ont été obtenus. Le plus long ne portait pas de mutation, alors que le plus court était privé de l'exon 9. Pour la mutation c. 2707G>C, deux produits de transcriptions ont été aussi obtenus, dont l'un n'avait pas de mutation et l'autre n'avait pas l'exon 26. L'absence de l'exon 9 conduit à la délétion de 38 acides aminés dans le domaine GTPase sans décalage du cadre de lecture. Le saut de l'exon 26 entraîne un décalage du cadre de lecture aboutissant à l'addition de trois nouveaux acides aminés après le codon 871 (NH2-LCD-COOH) suivi d'un stop prématuré au codon 875 avec perte des derniers acides aminés C-terminaux, soit 9,27% de la protéine.

Délétions et insertions Une mutation correspondant à une délétion de 4 paires de bases concerne les bases AGTT en position 2823 de l'ADNc (c. 2823delAGTT), qui se traduit par le remplacement des 19 derniers acides aminés de la partie carboxy terminale de la protéine, par 24 nouveaux acides aminés dont la séquence est la suivante : NH2-EKFKKNLMLSLKLFIRRNKLKSYS-COOH.

Dans l'exon 8 une délétion de 4 pb a été trouvée : c. 794delTTGA. Elle provoque un changement de 41 acides aminés du codon 265 au codon 305 et un stop prématuré au codon 306, soit la perte de 68,23% de la protéine du côté C-terminal incluant la majeure partie du domaine GTPase.

Une autre délétion a été trouvée. dans l'exon 21, notée c. 2029delC. Le. cadre de lecture est décalé après le codon 676 par le remplacement de 8 acides aminés (NH2-YKKNFPAL- COOH-) avant un codon stop en position 685, correspondant à la perte de 29,58% de la partie C-terminal de la protéine.

Deux nouvelles insertions ont été identifiées. L'une est située dans l'exon 26, c. 2681insT, correspondant la substitution de 8 acides aminés des codons 894 à 901 (NH2-FKATTYKY- COOH) avant un codon stop en position 902 avec perte de 6,98% de la partie C-terminale de la protéine. L'autre est située dans l'exon 28, c. 2853insT provoquant la substitution d'un acide aminé (Ile953His) suivi par un codon stop en position 954 ayec perte des 7 derniers acides aminés côté C-terminal.

Enfin, une mutation notée c. 2708delTTAG a été trouvée dans l'exon 27 correspondant à une délétion de 4 paires de bases T, T, A et G en position 2708 de l'ADNc, qui se traduit par la substitution de la valine par la glycine en position 903, de l'arginin par l'asparagine en position 904 et par un codon stop anticipé au niveau du codon 905. On obtient alors une protéine tronquée de 56 acides aminés en C-terminal.

Mutations non-sens Une première mutation est située dans l'exon 9 faisant partie du domaine catalytique GTPase. La base G, en position 899 de l'ADNc est remplacée par A (c. 899G>A), ce qui conduit au remplacement de la glycine par l'acide glutamique à la position 300 dans la protéine MSP1 correspondante. La glycine en position 300 correspond à un motif conservé du domaine catalytique GTPase des dynamines.

Une nouvelle mutation non-sens a été détectée dans l'exon 21, notée Arg711Stop, du fait d'une transition C>T en position c. 2131. Cette mutation conduit à la perte de 26,04% de la protéine en C-terminal.

La mutation c. 1096C>T déjà décrite a également été retrouvée (Alexander C. et al., 2000,

Nature Genet., 26, pp. 211-215).

Mutations faux-sens Trois mutations faux-sens ont été identifiées. L'une d'elles, Arg290Gln dans l'exon 8 a été décrite par Alexander (Alexander C. et al., 2000, Nature Genet., 26, pp. 211-215). Les deux autres sont Gln785Arg dans l'exon 23 et Leu939Pro dans l'exon 27.

L'ensemble de ces mutations est de nature à affecter la fonction de MSP1/MSPl-X, du fait qu'elles affectent soit le site catalytique GTPase à proprement parler, soit le domaine d'assemblage carboxy-terminal.

EXEMPLE 7 : Production de la protéine MSP 1 in vitro et reconnaissance par des anticorps spécifiques. a) Origine moléculaire de l'ADN correspondant à la phase de lecture de MSP1 : La phase de lecture de MSP1 a été obtenue par purification de l'ARN total (kit QIAGEN) prélevé sur des cellules sanguines chez des sujets sains. Une réaction de transcriptase réverse (New England Biolabs, NEB) a été réalisée en utilisant l'amorce MSP1-3'. La phase de lecture a été ensuite amplifiée par PCR en utilisant les amorces MSP1-3'et MSP1-5' décrites ci-après et la TAQ polymerase (NEB) dans des conditions standards d'amplification.

La séquence de l'amorce MSP1-3'est : 5'-CCTGTCGGATCCTTATTTCTCCTGATGAAGAGCTTCAATGAAAGC-3' La séquence de l'amorce MSP1-5'est : 5'-CTCCCCTCGAG-CATATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCT-3' b) Construction du vecteur d'expression pBS-MSPl Le fragment d'ADN obtenu après amplification par PCR de MSP1 et le plasmide pBlueScript (Stratagene Cloning System) ont été digérés par les enzymes de restriction Xhol et BamHl (NEB), purifiés sur gel d'agarose puis ligués 12 heures. Les produits de ligation sont transformés dans E. coli DH5 (supE44 hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl). Les clones pBS-MSPl ainsi obtenus sont analysés par profil de restriction de l'ADN plasmidique purifié selon le protocole de MiniPrep (Qiagen). Pour confirmer l'absence de mutation liée à la réaction d'amplification, le fragment d'ADN correspondant à la phase de lecture de MSP 1 a été séquence dans son intégralité (MilGen).

c) Production in vitro de la protéine MSP1 et reconnaissance par les anticorps anti-MSPl.

Une réaction de transcription couplée à la traduction a été réalisée en utilisant 1 microgr du clone pBS-MSPl, le kit TNT-T7 Quick Transcription-Translation Coupled (Promega) et 5 microl de L-méthionine 35S (Amersham), le tout incubé à 30°C pendant une heure. Une réaction d'immuno-précipitation est ensuite réalisée dans du tampon de lyse LB (Lyse Buffer) contenant 50 mM de Tris pH7.4,250 mM de NaCl, 50 mM fluorure de sodium, 5 mM d'EDTA, O, 1 mM d'orthovanadate de sodium, 1 mM de dithiotréitol (DTT), 0.1% de solution Triton X100, 1 microgr/ml de. PMSF, 10 microgr/ml de leupeptine et 10 microgr/ml d'inhibiteur de la trypsine du soja. Puis, le produit de la réaction de transcription-traduction obtenu est séparé en deux fractions : l/5ème du volume réactionnel est conservé pour servir de témoin, tandis que les 4/5èmes restant sont repris et sont additionnés de 5 microl d'anticorps anti-MSP 1 (Eurogentec) et incubés pendant deux heures à 4°C, puis incubés en présence de 20 microl de. protéine A-Sépharose (Pharmacia) durant une heure supplémentaire à 4°C. Après 3 lavages par du tampon LB, l'échantillon et le témoin sont séparés sur gel SDS-PAGE (PolyAcrylamine Gel Electrophorese) puis exposés sur film radio-sensibles (Kodak) (Voir la figure 3).

EXEMPLE 8 Production de MSP1 dans la bactérie E. coli et purification sur colonne d'affinité.

Cet exemple concerne la protéine MSP1 étiquetée Haemagglutinine (Ha) + 6 histidines, produite dans la bactérie E. coli et purifiée sur colonne d'affinité au nickel.

A partir du plasmide précédent pBS-MSPl une réaction d'amplification par PCR a été réalisée en utilisant les amorces suivantes : MSPl-3bis et SPI-PST : La séquence de l'amorce MSPl-3'bis est : 5'-CCTGTCGGATCCTTAGCGGCCGCGCTCCTGATGAAGAGCTTC-3' La séquence de l'amorce MSP1-PST1 est : 5'-CAGCAATGGGATGCAGCTAT-3' Le fragment amplifié a été digéré par les enzymes Pstl et BamHl (NEB) et sous-cloné dans le plasmide pBS-MSPl digéré également par Pstl et BamHl. Après vérification de la séquence un fragment d'ADN codant pour 2 exemplaires de l'épitope Haemagglutinine associés à 6 exemplaires d'histidine (McGowan et Russel, 1993, EMBO Journal, vol. 12, pp. 75-85) a été inséré en phase entre les sites Notl et BamHl à l'extrémité de la phase codante de MSP1, créant le plasmide pBS-MSPl-Ha-6his. Le fragment codant pour la protéine chimère MSPl-Ha+6his a été sous-cloné dans le vecteur pRK171 (Invitrogen) entre

les sites Ndel et BamHl. Le plasmide résultant pRK171-MSPl-Ha-6his a été transformé dans la souche E. coli BL21DE3 (hsdS gal (lcIts857 indlSam7 nin5 lacW5-T7 genel)).

Après pré-culture et culture jusqu'à une densité optique de 0,1 à 600 nm dans du milieu Luria Broth Ampicilline à 100 microgr/ml (Sigma), l'activité productrice bactérienne est induite par addition de 100 micro d'IPTG (Isopropylthio-beta-D-galactoside, Sigma) pendant 3 heures. Les cellules sont alors récupérées par centrifugation et lysées dans le tampon suivant : 50 mM Na2HP04 pH8,10 mM Tris pH8, 250 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,1 mM NaVn04, 5 mM PMSF, 0,05% 2-mercaptoethanol, 0,1% Tween 20,10 mg/ml lysozyme, 1 mg/ml DNAse (Sigma), pendant 1 heure à 37°C. Le mélange réactionnel est ensuite centrifugé à 15000g pendant 5 minutes. Le surnageant est mélangé avec des billes de nickel (Ni-NTA, Sigma) préconditionnées dans du chlorure de guanidium à pH5,5 puis pH8, et lavées 3 fois dans 50 mM Na2HP04 à pH8. Puis le mélange billes-surnageant est chargé dans un tube (ou colonne) et est incubé. 1 heure à 4°C. Les billes sont lavées dans le tampon de départ (dépourvu de lysozyme et DNAse), puis dans 50 mM de solution Na2HP04, pH6. Les billes sont éluées 3 fois par 250mM d'imidazole à pH7,2. On fait alors migrer sur gel SDS- PAGE, d'une part une fraction de la solution chargée sur la colonne et contenant l'extrait total (EX) et d'autre part l'éluat contenant la protéine déplacée de l'étiquette par l'imidazole (EL). Le gel est fixé et coloré au Bleu de Commassie (Figure 4).

EXEMPLE 9 : Production de MSP 1 dans la levure Schizosaccharomyces pombe et dosage de son activité GTPase.

La phase de lecture codant pour la protéine MSP1 a été clonée à partir du plasmide pBS- MSP1 tel que décrit à l'exemple 6 dans le vecteur pREPl (K Maundrell, J. Biol. Chem., 1990, 265, pp. 10857-64) entre les sites Ndel et BamHl. Ce vecteur contient le promoteur nmtl inductible par l'absence de thiamine. Le plasmide pREPl-MSPl ainsi obtenu est introduit dans la souche sauvage T199 (leul-32, ura4-dl8, h-) de la levure Schizosaccharomyces pombe par électroporation, et les cellules contenant le plasmide sont sélectionnées sur milieu sans leucine : EMMA (BIO101), uracyle 4 mg/ml, thiamine 20 microM. Après culture liquide et induction du promoteur nttf pendant 24 heures par incubation dans un milieu EMMA + Uracyle à 4 mg/ml, mais sans thiamine, les cellules sont récoltées par centrifugation, puis lysées physiquement dans le tampon de lyse LB. Puis les protéines MSP1 sont immunoprécipitées comme décrit dans l'exemple 6. Leur activité GTPase est mesurée par le protocole suivant : les immunoprécipités sont repris dans le milieu

tampon suivant : 20 mM Tris pH7,9,4 mM MgC12, 50 microg/ml BSA, 1 mM DTT (Sigma), 50 microM GTP et additionnés de 1 microCurie de GTP alpha 32P (Amersham) par échantillon. Ce mélange est incubé 2 heures à 30°C puis la réaction est arrtée par addition de 2 microl d'EDTA 0. 5M. Les échantillons migrent 2 à 3 heures sur plaque de PEI (Sigma) immergée dans 50ml de solution de LiCI 0. 5M et d'acide formique 1M dans une cuve de migration étanche. Après séchage de la plaque PEI, celle-ci est exposée dans un appareil Phosphor-Imager (Molecular Dynamics) et la radioactivité proportionnelle à l'activité GTPase de MSP1 est comptée.

L'effet de composés pharmacologiquement actifs est réalisée par l'addition dans le mélange réactionnel d'un composé candidat, noté ici A ou B, et mesure de l'activité GTPase résultante (Figure 5).

EXEMPLE 10 : Production et détection immunologique de la protéine MSP1 étiquetée Haemagglutinine dans les cellules HeLa.

Cet exemple concerne la protéine MSP1 étiquetée Haemagglutinine (Ha) exprimée ectopiquement dans les cellules HeLa.

A partir du plasmide pBS-MSPl-Ha-6his tel que décrit dans l'exemple 8, le fragment codant pour MSPl-Ha-6his a été introduit dans le plasmide pCDNA entre les sites Kpnl et BamHl. Puis, le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his a été transfecté dans des cellules HeLa, selon le mode opératoire décrit par le fabriquant (ExGen-500, Euromedex), et les cellules incubées 24 heures dans un milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco- BRL) additionné de glucose 4 mg/1, pyruvate de sodium 4 mM, glutamin 4 mM (Seromed), pénicilline 100 U/ml (Seromed), streptomycine 100 microg/ml (Seromed) et sérum de veau foetal à 10% (Eurobio). La détection spécifique de la protéine MSPl-Ha-6his a été réalisée en utilisant les anticorps primaires de souris anti-Ha 12CA5 (Boehringer) et l'anticorps secondaire anti-souris Alexa 594 (Molecular Probes), par le protocole d'immuno- fluorescence suivant : les cellules ont été fixées dans une solution à 3,7% de formaldéhyde pendant 20 minutes à 4°C, perméabilisées par un traitement au méthanol 100% à-20°C pendant 10 minutes, puis traitées 5 minutes au Triton X100 à 0,25% dans du tampon PBS (Phosphate Buffer Saline). Puis les échantillons ainsi obtenus sont incubés 2 heures en présence des anticorps anti-Ha 12CA5 dilués au 1/700ème dans du tampon PBS additionné de 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) à 37°C, puis avec l'anticorps secondaire Alexa 594 dilué au l/500ème bans du tampon PBS additionné de BSA (Albumine de Serum Bovin) à

1%. Les cellules sont observées au microscope à fluorescence (Leitz), la fluorescence correspondant spécifiquement à l'expression de la protéine MSPl-Ha-6his (Figure 6A-1).

La localisation de cette protéine produite ectopiquement correspond parfaitement à celle observée pour des cellules HeLa non transfectées, en utilisant l'anticorps spécifique de la protéine MSP1 (Figure 6B-1) et à la localisation obtenue en utilisant des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques des mitochondries humaines autres que MSP1, comme par exemple l'anticorps anti-hsp60-LK2 (Sigma). (Voir figures 6A-2 et 6B-2).

Les exemples décrits précédemment illustrent les moyens de produire la protéine MSP1 in vitro comme in vivo. Ces protocoles décrivent aussi des méthodes de production et de purification de la protéine MSP1 basées sur l'utilisation d'anticorps spécifiques ou de colonnes d'affinité, et du dosage de son activité. Ils sont applicables quelle que soit la nature des échantillons biologiques, et peuvent tre répétées pour les mutants MSP1-m de la protéine MSP1, en utilisant les phases codantes correspondantes, ainsi que pour l'ensembles des isofbrmes MSP1-X et leurs mutants.