La présente invention concerne l'enzyme myélo- eroxydase humaine (hMPO) sa préparation par génie génétique et son utilisation à titre de médicament. Elle concerne donc également son utilisation pour la fabrica¬ ^t ion de compositions pharmaceutiques en contenant ainsi que les compositions pharmaceutiques elles-mêmes.

Plus précisément, l'application thérapeutique visée a pour objet le traitement des i munodéficients en thérapie humaine par le renforcement de l'activité anti- niicrobienne au niveau des macrophages, et ceci dans tous les cas d'immunodéficiences qu'elles soient occa¬ sionnées notamment par le SIDA, les brûlures ou les ir¬ radiations.

La résistance à l'infection par les micro- organismes met en oeuvre des fonctions non-spécifiques (action d'enzymes, pH, paroi épithéliale) et des ré¬ ponses immunitaires adaptatives des cellules lympho¬ cytes B et '!•

Les fonctions non spécifiques empêchent l'in¬ vasion de la majorité des agresseurs. Cependant, lors- que cette première ligne de défense cède, le système phagocytaire entre en jeu, détruit les agents infec¬ tieux et stimule les fonctions, d'immunité conférées par les cellules 3 et T.

Toute anomalie, héréditaire ou acquise, du système phagocytaire a des conséquences graves pu sque

ême les micro-organismes normalement peu pathogènes y échappent et déclenchent des infections récurrentes.

Par ailleurs, toute déficience du système immunitaire lui-même, au niveau des cellules T ou B, conduit à une susceptibilité exacerbée aux infections virales et bactériennes intra- ou extracellulaires. Ces déficiences peuvent être héréditaires ou acquises (ex : SIDA » déficience élective en cellules T). La plupart des personnes souffrant de ces déficiences su- bissent l ¹ in ec ion d'organismes opportunistes (bacté¬ ries, protozoaires, etc.).

Dans l'ensemble des cas d'immunodépression, il est donc souhaitable que le système phagocytaire soit aussi efficace que possible pour limiter les consé- quences des agressions extérieures. Accessoire en condi¬ tions normales, la phagocytose revêt un caractère essen¬ tiel lorsque la réponse imnrune B et T s'affaiblit.

Parmi les cellules associées à la réponse im¬ munitaire, les leucocytes polymorphonucléaires repré- sentent un intérêt particulier dans le contexte de la lutte contre les infections. Ces cellules contiennent une enzyme, la myéloperoxydase, dont l'action microbi- cide est bien documentée. Les polynucléaires ne pré¬ sentent aucune spécificité vis-à-vis d'un antigène, mais jouent un rôle essentiel en cas d'inflammation aiguë, avec les anticorps et le système du complément, dans la défense de l'hôte contre les micro-organismes. Leur fonc¬ tion principale est la phagocytose- Au cours de ce pro-- cessus, les micro-organismes sont inclus dans des va- cuoles (phagosomes) qui fusionnent avec les granules con¬ tenant la myéloperoxydase pour former les phagolysosomes. Au cours de la phagocytose, l'activité enzymatique de la myéloperoxydase conduit à la formation d'HOCl, un com¬ posé hactéricide (acide hypochloreux) puissant; cette activité requiert , qui apparaît dans

le polymorphonucléaire lors de sa stimulation par di¬ vers agents et notamment par les réactions immunologi- ques provoquées par les micro-organismes. L'acide hypo- chloreux est oxydant par lui-même, mais produit des dé¬ rivés plus oxydants encore, les chloramines. Enfin, réagissant avec B^^, dont il est issu, il produit une forme d'oxygène extrêmement oxydante, l'oxygène singulet.

Le problème majeur se situe toutefois au ni¬ veau des macrophages. En effet le macrophage est une très grande cellule, plus robuste que le polymorphonu¬ cléaire, capable, à l'instar de ce dernier, de phagocy¬ ter les micro-organismes. Il possède également un sys¬ tème générateur d'H^O , mais n'est cependant pas capable de produire la myéloperoxydase. Cette déficience diminue son efficacité défensive. On a découvert toutefois selon l'invention, que les macrophages peuvent incorporer et utiliser la myéloperoxydase qui reste active après péné¬ tration dans les macrophages, acquisition complétant ef¬ ficacement leur arsenal cytolytique et bactériolytique, en particulier pour la destruction d'agents infectieux divers affectant les patients i munodéprimés.

Quoique la myéloperoxydase une fois dans le plasma soit très vite captée par les macrophages, des systèmes d'ad¬ ministration spécifiques délivrant de façon optimale l'enzyme dans les macrophages, peuvent être utilisés selon l'invention, réalisant des conjugués de la myélo¬ peroxydase par couplage covalent avec un transporteur présentant une affinité pour les macrophages. On peut citer à ce titre des transporteurs tels que l'albumine humaine mannosylée mais aussi des anticorps ou fragments d'anticorps tels que la partie constante Fc dirigés contre des récepteurs présents sur les macrophages.

D'autres systèmes consistent à coupler par complexation non covalente ou par manipulation d'ADN un anticorps ou fragment d'Ac spécifique du macrophage à l'enzyme myéloperoxydase humaine pour obtenir un"com¬ plexe im un'i

L'administration de tels conjugués ou com¬ plexes immuns conduit au ciblage de la MPO humaine vers le macrophage, à son ingestion par phagocytose et à la libération de l'enzyme sous forme active à l'intérieur du macrophage, son site d'action privilégié, où elle participe à la lutte contre les infections.

Dans le cas des complexes immuns préparés par génie génétique, l'ADIT codant pour la MPO active ou sous forme de précurseur naturel est couplé à l'ADH ^* codant pour un fragment d'immunoglobuline reconnaissant spécifi¬ quement les macrophages.

-?-

La présente invention a donc pour objet, à titre de médicament, un composé consistant dans l'enzyme myéloperoxydase humaine.

L'invention a également pour objet, à titre de médicament, un composé consistant dans un conjugué de la myéloperoxydase par couplage covalent ou comple- xation avec un transporteur présentant une affinité pour les macrophages, tels que l'albumine humaine manno- sylée ou un anticorps ou fragments d'anticorps comme la partie constante Fc dirigée contre des récepteurs pré¬ sents sur les macrophages.

Un autre composé, objet de la présente inven¬ tion, délivrant la myéloperoxydase de façon optimale vers les macrophages, consiste également dans des lipo- somes, notamment des liposomes biopolymerises, dans les¬ quels la myéloperoxydase se trouve encapsulée. ^*

Les médicaments selon l'invention sont en par¬ ticulier utiles pour lutter contre les infections à l'intérieur des macrophages. De préférence, l'enzyme myéloperoxydase hu¬ maine, utilisée selon l'invention, est d'origine recom- binante, c'est-à-dire préparée par génie génétique.

En outre, la présente invention a pour objet l'utilisation des composés selon l'invention pour la fabrication de compositions pharmaceutiques utiles no¬ tamment pour le traitement des immunodéficiences occa¬ sionnées en particulier par le SIDA, les brûlures ou les irradiations.

Enfin, la présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant, à titre de principe actif, les composés selon l'invention.

Les compositions pharmaceutiques selon l'in¬ vention peuvent se présenter sous différentes formes appropriées pour des formes d'administration diverses notamment par voie parentérale, systémique ou topique eu

-o—

^p ar in ^j ection intra-veineuse dans la mesure où les macrophages cibles sont présents non seulement dans le san ^g* mais aussi dans les autres zones de l'organisme.

Les compositions pharmaceutiques selon l'in- vention comportent alors outre le principe actif,des supports pharmaceutiques acceptables pour la forme d'ad¬ ministration en cause.

L'administration parentérale de la myéloperoxydase -ou de cαrçsésselon l'invention est très appropriée pour les divers syndromes im unodépressifs.

La diminution ou la suppression des barrières naturelles et immunitaires favorise l'apparition d'infections dues à des germes pathogènes ou opportunistes.

Les déficiences du système immunitaire (par exemple déficiences en cellules T, SIDA, irradiation, chimiothérapie anti¬ cancéreuse...) sont souvent associées à des infections généralisées (bactéries, mycoses, viroses, protozoaires ...) très difficiles à contrôler avec les seuls agents antibiotiques et chimiothérapeutiques existants. Dans ces conditions, la myéloperoxydase peut aussi être employée par voie svstémiσue afin de renforcer l'activité antiseptique des macrophages, au cours de la phagocytose. En effet, les résultats expérimentaux indiquent que les macrophages et les monocytes ont une activité cytolyucue et bactériolytique accrue en présence de l'enzyme.

La myéloperoxydase, ou un composé selon l'inven- tion, peut également être administré(e) par applica¬ tion topique sur notamment des ulcères torpides, où la icrovascularisation est déficiente (ulcère variqueux).

Pour cette application topique la myéloperoxy¬ dase sera incorporée par exemple dans de la pâte à l'eau selon une formulation dermatologique connue. Au moment de l'emploi on pourra procéder à un mélange exte porané de la suspension de myéloperoxydase avec

- soit une solution diluée de peroxyde d'hydrogène (con¬ centration 0,3 % par exemple)

- soit une autre enzyme telle que la xanthine oxydase.

Dans ce cas il convient d'ajouter à la suspension de myéloperoxydase une concentration 10 -3l d'hypoxanthine et éventuellement de chlorure d'ammonium. Ce mélange de pâtes produit un dégagement de HCIO et une formation de chlorure d'aminé, particulièrement efficace pour le net¬ toyage des plaies torpides.

D'autres indications thérapeutiques sont envisageables par voie topique :

l . L'utilisation de la myéloperoxydase est intéressante dans la prévention et le traitement des infections intercurrentes au cours des brûlures thermiques, chimiques ou par irradiation.

2. La fonction phagocytaire apparaît déficitaire au cours de l'eczéma atopique. Dans ce cas, l'application locale de l'enzyme peut avoir une action stimulante bénéfique sur les macrophages et les monocytes cutanés.

3. La myéloperoxydase peut avoir un rôle adjuvant dans le traitemen t des infections gingivales, que ce soit chez les sujets immunodépπmés ou au cours des parodontoses.

Selon l'invention la myéloperoxydase peut être obtenue par purification analytique à partir de leucocytes polymorphonucléaires.

Néanmoins avantageusement l'enzyme myéloperoxydase humaine utilisée sera produite par génie génétique avec la technologie de l'ADN recombi- nant.

Pour ce faire, les étapes essentielles sont :

1 ) construction d'un banque de clones d'ADNc représentative des produits synthétisés dans les cellules leucocytaires et criblage de cette banque avec une sonde appropriée caractéristique de la myéloperoxydase humaine. A l'issu de cette opération, on obtient un clone ADNc codant pour l'enzyme.

2) l'ADNc myéloperoxydase doit alors être manipulé pour permettre son expression dans divers système hôtes/vecteurs. Une construction modulaire s'impose si l'on veut être capable d'évaluer l'expression dans les systèmes aussi variés que E. coli, la levure, les cellules de mammifères ou les cellules d'insectes. L'obtention d'une enzyme active, correctement assemblée et processée, est fait avantageusement dans des systèmes de cellules eucaryotes.

La présente invention a donc également pour objet la hMPO produite par culture de cellules de prokaryotes ou d'eukaryotes transformées par un vecteur d'expression de la hMPO dans lesdites cellules.

Avantageusement, la hMPO selon l'invention est produite par cultures de cellules d'eukaryotes supérieurs notamment par des cellules d'insectes ou de mammifères. Pour ce faire, la présente invention a pour objet :

1) une cassette d'expression HindIII/SnaBI, HindIII/EcorV ou HindIII/Hpal de 2261 pb portant la séquence codante pour la hMPO telles que représentées sur la figure 1, ainsi que le plasmide pNIV2702 contenant lesdites cassettes,

2) un vecteur d'expression dans des cellules de prokaryotes ou de d'eukaryotes comportant ladite cassette, et en particulier

3 ) un plasmide de transfert recom binant pour Baculovirus contenant l 'ADNc de hMPO sous le contrôle du promoteur de polyhédrine, notamment . ) le plasmide pNIV270 de la figure 5,

5) les cellules d'insectes, notamment de spodoptera frugiperda tels que les cellules Sf9 co-transfectées par un vecteur selon l'invention avec de l'ADN viral sauvage et notamment co-transfecfectées par le plasmide pNIV270Ψ, 6) des cellules d'insectes, notamment de spodoptera frugiperda tels que Sf 9 infectées par un Baculovirus recombinant obtenu par un vecteur selon l'invention, notamment à partir du plasmide pNIV270 , 7) la hMPO produite par culture de cellules d'insectes notamment de spodoptera frugiperda tels que Sf 9 modifiées par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon l'invention,

S) un vecteur d'expression dans des cellules de mammifères, notamment des cellules CHO contenant la cassette HindIII/SnaBI de la figure 1 , notamment 9) un plasmide pNIV2703, 10)des cellules de mammifères, notamment des cellules CHO transfectées par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon l'invention, notamment par le plasmide pNIV2703, l l )la hMPO produite par culture de cellules de mammifères, notamment de CHO transfectées par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon l'invention.

La description détaillée qui va suivre est destinée à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.

La figure 1 représente la cassette HindIII/Hpal de 226 1 pb contenant les séquences codant pour la myéloperoxydase humaine et cassette HindIII/SnaBI.

La séquence codante commence à l'ATG spécifiant la méthionine N-terminale (Met) et se termine par le codon stop TGA (* ^* **).

Les séquences en gras représentent les oligonuciéotides synthétiques ajoutés en 5' et en 3' de l'ADNc de la hMPO. La figure 2 représente la fixation de sérums de lapins en

ELISA sur MPO.

La figure 3 représente la fixation de sérums de souris en ELISA sur MPO.

La figure représente une courbe standard de test ELISA de détection de la myéloperoxydase humaine.

La figure 5 représente la construction du vecteur pAcYM l/ MPO 1 1 selon l'invention (plasmide de transfert pour Baculovirus).

La figure 6 représente la carte du vecteur Tnd à partir duquel est construit le plasmide pNIV2703 selon l'invention. Les 3 cassettes dirigent respectivement l'expression des

R marqueurs de sélection DHFR et Neo , ainsi que celle d'un ADNc étranger

(dans le cas illustré ci-dessus, Il s'agit du t-PA). Cette dernière cassette peut être substituée par une cassette codant pour tout ADNc approprié, en tirant parti des sites de restriction uniques flanquant la cassette t-PA. Abréviations :

SV early : promoteur précoce de 5V 0 ;

5 : extensions non codantes en 5' ;

3 : extensions non codantes en 3' ;

SV : région de polyadenylation de SV40 ; Rous LTR : séquence répétée terminale (longue) dérivée du virus du sarcome de Roux ; bGH : région de polyadenylation du gène de l'hormone de croissance bovine ;

Betablopro : promoteur principal de la j3-globuiine murine.

ExemDle 1 : Dréπaration de la hMPO oar σénie géréti-.iu-

A. Construction d'une cassette contenant 1 'eπr.iprêté des séquences rodar,,

PQUf la myéloperoxydase humaine flanquée de sites de restriction—absent de l'ADNc de la myéloperoxydase (MPO).

1. But : Obtention d'une cassette Hindlll/Hpal contenant les séquences codant pour la MPO humaine et insérable dans différents vecteur d'expression.

2. Matériel de départ : - le plasmide bactérien pMP062 contenant un ADN de la MPO humaine complet (Johnson et al., 1987. Nucleic Acids Research 1 2013-2026);

- un vecteur de clonage quelconque contenant de sites de restriction adéquats. Notre choix s'est porté sur le plasmide pTNDPC2, un plasmide dérivé du pTND (Connors et al.,1988, DNA 7 , ό51-66llL

plasmide pTNDPC2 n'est pas essentiel à l'obtention de la dite cassette; il aurait été parfaitement possible d'utiliser un autre vecteur de clonage contenant les sites de restriction nécessaires tel que le plasmide pJRDl84 (Heusterspreute et al., Gène 39 (1985) 29 -309).

3 • Obtention d'oligonucléotides par synthèse chimique.

- Pour obtenir un site HindlII directement en amont de l'ATG de la hMPO, nous avons choisi de synthétiser, grâce à des méthodes chimiques bien connues dans notre domaine, une paire dOligonucléotides qui une fois réhybridés entre eux, contiennent, dans le sens 5 ' - ' de la fibre codante, un site de restriction Hindlll , les bases ACC, les séquences codant pour les 11 premiers acides aminés et la 1ère base du triplet du douzième acide aminé de la hMPO, qui est à cheval sur un site Λ ^' sil. Ces oligonucléotides sont dénommés MP0III et MP0IV (schéma 1 ci-apres ^j .

- Pour obtenir un site Hpal en aval du codon stop de la h.MPO, une deuxième paire dOligonucléotides a été synthétisée, une fois réhybrides, ceux-ci

présentent, dans le sens 5'~5' sur la fibre codante. .es deux ernières bases du triplet de l'acide aminé 731, la séquence codant pour les 14 derniers acides aminés de la hMPO, un codon stop (TGA) différent du codon ,s op naturel de la hMPO et quinze bases contenant un site EcoRV, un site SnaBÏ et le complément d'un site ffpαl. Ces oligonucléotides sont dénommés MPOI et MPOII (schéma 1 ci-après) .

4. Sous-clonages. Sous-clonage 1 Un fragment Nsll/Bglll de 2053 pb (paires de bases) a été extrait du plasmide pMP062. Ce fragment et le fragment synthétique HindlII.'Nsil de 42 pb obtenu par réhybridation des oligonucléotides MPOIII et MPOIV ont été ligués à un fragment HindlII; Bg 111 de 6755 b du pTNDPC2. Le plasmide pscMPOl résultant a été introduit dans la souche d ' Escherichia co l i MM294, suivant une méthode bien connue, dans le but de produire le plasmide pscMPOl en plus grande quantité. Le plasmide pscMPOl contient ainsi un fragment de 2095 pb allant d'un site HindlII à un site 3σlII situé approximativement à l'acide aminé 696 de la hMPO.

Sous-clonage 2

Un fragment Xbal/Pstl de 1825 pb a été extrait du plasmide pMP062. Ce fragment et le fragment synthétique Pstl/Hpal de 62 pb obtenu par réhybridation des oligonucléotides MPOI et MPOII ont été ligués à un fragment Xbal/Hpal de 3283 pb du TNDPC2. Le plasmide pscMP02 résultant a été introduit dans la souche d ' Escherichia coli MM294 dans le but de le produire en plus grande quantité.

Le plasmide pscMP02 contient donc un fragment de 1887 pb allant d'un site Xbal débutant par la première base de l'acide aminé 123 e la hMPO à un site ffpαl.

5- Construction du plasmide PNIV2702 à partir des pscMPOl et sc P02 Pour finalement obtenir la cassette hMPO f indlll, fpαl , un fragme Hinά II/Xi αl de 374 pb contenant la séquence codant pour les acides amin 1 à 122 de la hMPO et un fragment Xbal/Hpal de 188? pb contenant séquence codant pour les acides aminés 123 à 745 de la hMPO ont é extraits respectivement des plasmides pscMPOl et ρsc.MP02. Ces de fragments ont ensuite été religués à un fragment HindlII/ Hpal de 516 du TNDPC2 pour obtenir le plasmide pNIV2702.

Le plasmide pNIV2702 contient donc une cassette HindlII /Hpal de 2261 portant 1 'entièreté des séquences codant pour la hMPO (Fig.1). Cet cassette peut aisément être extraite et transférée dans différen vecteurs d'expression pour cellules d'ovaires de hamster (CHO) ou po cellules d'insectes [ Spodopteτa frugiperda ) via le baculovirus.

MPOI

GTACACTTCCTGCATTGAACCTGGCTTCCTGGAGGGAAGCCTCCIGATATCTACGTA TGGTT 3' 3 ' ACGTCATGTGAAGGACGTAACTTGGACCGAAGGACCTCCCTTCGGAGGACTATAGATGCA TACCAA 5 ' MPOII PstI EcoR\ ^: SnaBI Hpal

3' terminus MPO

MPOIII Mai 5' AGCTTACCATSGGGGTTCCCTTCTTCTCTTCTCTCAGATGCA 3' 42-mer

3' ATGGTACCCCCAAGGGAAGAAGAGAAGAGAGTCT 5' 34-mer

MPOIV HindlII s il

5 ' terminus MPO

Schéma 1

B . Mise au point d ' un test ELISA pour la détection de myéloperoxydase naturelle et recombinante .

a) Obtention d'anticorps anti-MPO

Des sérums anti-MPO ont été obtenus chez le lapin et la souris. Ils ont été testés en ELISA sur MPO. (La plaque est coatée avec MPO et saturée à la BSA. On y ajoute les anticorps à tester, puis un conjugué phosphatase alcaline anti-Ig) . Dans les deux cas, on obtient un titre d'anticorps anti-MPO au moins 8.000 fois plus élevé dans le sérum immun que dans un sérum normal (Figs.2 et 3) .

b) Mise au point du test

Un test "en sandwich" a été réalisé en utilisant des Ig de lapin anti-MPO (Prosan-Dakopatts A398) et un de nos sérums de souris anti-MPO. La plaque est coatée avec les Ig de lapin à 7.6 gamma/ml dans PBS pH 7-8, une nuit à 4°C. Elle est saturée par 1% BSA dans PBS pH 7.8 Tween 20 0,05 lh40 à température ambiante. Les échantillons à tester sont laissés 2h température ambiante, puis le sérum de souris, dilué 1000 fois dans l solution de saturation, 2h à température ambiante, enfin le conjugué Fab de lapin anti-Ig de souris-phosphatase alcaline (Prosan-Dakopatts D3l4) dilué 1000 fois dans du tampon TBS (Tris-HCl 0.05M pH 7-5. NaCl 0.15M) contenant 1% BSA et 0,0 2 Tween 20. Entre chaque étape la plaque est lavé 5 fois avec soit TBS Tween 20 0,05% (avant et après la mise du conjugué), soit PBS Tween 20 (autres étapes) . La révélation se fait grâce à un solution de para-nitrophényl phosphate 1 mg/ml dans 10'» diéthanolamine, 0,01?.' MgCla 6H2O, 0,02% NaN ₃ pH 9-8, et l'arrêt de la réaction par NaOH 3M. La lecture se fait à 410 n . La figure 4 montre une courbe de fixatio d'une MPO pure (Green Cross Corporation) diluée dans un surnageant d culture de cellules d'insecte SFMJ (milieu TC100 avec 10% FCS) . On voi que le test est utilisable pour doser la MPO dans une =amme d concentrations comprises entre 0,1 ng/ml et 100 ng/ml.

C) Clonage de l'ADNc MPO dans le plasmide de tranfert pour

Baculovirus L'ADN du plasmide de transfert pAcYMI (Baculovirus (réf. : Matsuura et al. J. Gen. Virol (1987) _β_8_, 1233-1250 a été li- néarisé par BainHI et mélangé au fragment d'ADN Hpal-HindIII de 2261 pb correspondant à la MPO. Le mélange a été traité à la T4 ADN polvmérase, ligué et utilisé pour transformer des cellules compétentes E. coli MM294. La sélection des clones a été faite par croissance sur arnpicilline . Après plusieurs restrictions enzy atiques contoles sur 48 clones, le clone 11 a été identifié pour avoir 1 ' insert MPO dans la bonne orientation par rapport au promoteur de la polyhédrine (pNIV2704) (figure 5) . Les jonctions oligonucléotides synthétiques/MPO additionnées en ' et 3' au cDNA MPO lors des constructions précédentes ont été confirmées p séquençage de ces régions. La méthode de séquençage sur ADN double br avec la séquenase a été utilisée.

"Co-transfection" et "plaoue assav"

Le plasmide recombinant 11 a été utilisé en conjonction avec 1 'ADN vir sauvage pour co-transfecter des cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) e culture (Le protocole est bien connu et est détaillé dans le manuel M.D. Summers et G.E. Smith, "A Manual of Methods for Baculovirus Vecto and Insect Cell Culture Procédures, Texas ϋniversity, Collège Statio

1987).

Les surnageants de cotransfection de jours 5 et 7. après recombinais homologue, ont été utilisés en "plaque assay" de manière à avoir 100 1000 plages de lyse par boite. Les virus recombinants ne contenant pas polyhédrine ont été identifiés 5 jours plus tard visuellement ou p hybridation d'ADN. 13 candidats ont été repiqués et purifiés.

Test de production de MPO recombinante

Deux Baculovirus recombinants, dénommés MP01.1 et MP05.2 ont été utilisés pour infecter des cellules Sf9 et mesurer la capacité de celles-ci d produire de la myéloperoxydase. Dans les deux cas, les cellules infectée sécrètent dans le milieu de culture une protéine reconnue spécifiquemen par les anticorps anti myéloperoxydase et dont la quantité a été évalué par test ELISA à i 0,2 μg/ml . (Les cellules infectées ont été récoltées la densité de 10 ⁶ cellules/ml) . Le produit recombinant a été retrouv aussi dans l'extrait cellulaire brut à raison de z 0,06 μg/ 10- cellules. . Co-transfection des cellules d'insectes Sf9 (.SpσάσPterα frugiperda) . Utilisation du vecteur recombinant construit (pNIV2704) pAcYMI/MPO 11 contenant la MPO en aval du promoteur de la polyhédrine, 100 μg utilisés en conjonction avec 1 μg d'ADN viral. Technique de transfection au chlorure de calcium.

Utilisation du surnageant de 5 j de co-transfection pour le "plaqu assay" . Dilutions de -1 à -J ; 5 boites par dilution.

. Utilisation du surnageant de 7j. dans les mêmes conditions.

Les surnageants récoltés ont été utilisés pour produire des plages d lyse dans des monocouches de cellules Sf9 (infection des cellules - millions par boite - par des dilutions du surnageant de co-transfection pendant 60' . Enlever 1' inoculum et couler une couche d'agar à bas point d fusion 1, final. Recouvrir de milieu EX-Cell 400 J.R.Scientific addi tionné d'antibiotiques et laisser à l'étuve à 28°C pendant 4 jours). Coloration des boites au rouge neutre après 4 j d'infection et hybridatio des filtres avec un fragment d'ADN MPO marqué au c<3 ² P f.TP. Repiquages de 13 candidats d'après l'autoradiographie. Deux "plaque assay purification" ont été réalisés ensuite successivement.

D. Clonage de l'ADNc hMPO dans le vecteur d'expression pTDN pour cellule de mammifères (CHO) et introduction dans les cellules.

1. Protocole a- Obtention du vecteur d'expression pNIV2703 :

; Dans le but de faire produire la hMPO par des cellules ovariennes d hamster chinois (CHO), nous avons introduit la cassette HindIII/SnaBI d

2253 pb du pNIV2702 portant les séquences codant pour la hMPO entre le sites HindlII et SnaBI du vecteur d'expression mammifère pTDN. Le vecteu pTDN, dont le principe d'utilisation est identique au vecteur pTN

(Connors et al., 1988) dont il est issu, porte 2 gènes encodant de marqueurs de sélection [résistance à la néomycine nècphosphctransféras bactérienne, Neo") et dihydrofolate réductase (DHFR)] et une cassett d'expression de la molécule d'intérêt, dans ce cas, le ht-PA (activateu tissulaire du plasminogène humain). La manipulation décrite précédemment consiste donc à remplacer la cassette HindIII/SnaBI portant l'entièret des séquences codant pour le ht-PA par celle encodant la hMPO. Ce remplacement une fois effectué, le plasmide recombinant obtenu, pNIV2703, a été introduit dans la souche d'E.coli MM294 dans le but d'en purifier une quantité suffisante pour la transfection des cellules de CHO. La fig. décrit schématiquement le vecteur d'expression pTND (Connors et al., 1988) . Le vecteur pTDN correspond au vecteur pTND excepté le fait que la cassette DHFR a un ordre de lecture inverse et est localisée entre la cassette néo et la cassette t-PA. b- Transfection par électroporation des cellules CHO :

Grâce à une digestion par l'enzyme de restrictionNot l les s ^é quences d'origine bactérienne (PUC19 sur la fig. S on été séparées du fragment portant les 3 cassettes d'expression pour cellules de mammifères. Une fois

digéré, le vecteur îîIV2703 est introduit par électroporation, une méthode de transfection, dans des cellules de CHO DHFR ^" suivant une méthode analogue à celle décrite par Zerbib et al. (1985, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129 , 611-618) . Les cellules ont ensuite été placées dans un milieu de croissance contenant du G418, lequel ne permet pas aux cellules n'exprimant pas la néophosphotransférase de survivre. Ainsi, après une période de 1 à 3 semaines, seules les cellules ayant acquis le gène de sélection adéquat porté par le vecteur pNIV2703 survivent ≈ se multiplient. Les clones de cellules ainsi obtenus ont finalement été testés pour l'expression de la hMPO. Pour cela, le surnageant de culture et un extrait cellulaire de chacun de ces clones a été analysé grâce à un test ΞLISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) permettant de qualifier et quantifier spécifiquement la hMPO. Les résultats indiquent que les clones recombinants sécrètent, dans le milieu de culture de la MPO recombinaπte. Le taux de production, estimé par ELISA, est compris entre 0.1 et 1 mg par cil de surnageant.

Exemple 2 : Application thérapeutique de la hMPO Rôle de la myéloperoxydase leucocytaire

La défense de notre organisme contre des mi¬ croorganismes étrangers est assurée par les globules blancs ou leucocytes parmi lesquels on trouve les lym¬ phocytes qui produisent des anticorps, les macrophages, les éosinophiles et les neutrophiles (ou polymorphonu- cléaires) qui détruisent le microorganisme étranger par phagocytose. Au cours de celle-ci les neutrophiles génèrent des espèces oxygénées très toxiques et bacté¬ ricides : l'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène, le radical hydroxyle, l'oxygène singulet.

L'action bactéricide du peroxyde d'hydrogène (H O ) est augmentée de mille fois par la myéloperoxy¬ dase (MPO), enzyme localisée dans les granules azuro- philes (ou primaires) des neutrophiles. En effet, cette enzyme catalyse, en présence d'H C^, l'oxydation d'ion chlorure (Cl~) pour générer de l'acide hypochloreux (H0C1) (1_) qui présente des propriétés bactéricides.

MPO

H ₂ O ₂ + Cl ^" > H0C1 + H ₂ O

Les onocytes qui sont les précurseurs des macrophages possèdent un mécanisme d'activité antimi- crobienne semblable aux neutrophiles mais ils ne pro¬ duisent que peu d'H C^ et de plus ils possèdent environ trois fois moins de myéloperoxydase que les neutrophiles (2). D'autre part, des expériences in vitro ont montré que, au cours de leur maturation en macrophages, ils perdent totalement leur contenu en myéloperoxydase, ce qui se traduit également par une décroissance de l'ac¬ tivité antibactérienne (3)» Ainsi des monocytes fraî¬ chement isolés ont-ils une cytotoxicité de 90 % vis-à- vis de Toxoplasmes gondii ingérés tandis que les _ acro- phages (10 jours de culture) ne présentent plus que 12 % de cytotoxicité.

Ce endant nlusieurs travaux ont montré eue

les macrophages pouvaient phagocyter des débris cellu¬ laires de neutrophiles (4, 5) et acquérir ainsi une activité yéloperoxydasique, avec comme conséquence une augmentation de la toxicité de la faible quantité de pero yde d'hydrogène produite par les macrophages. D'autres études ont souligné l'importance de l'augmen¬ tation de l'activité poroxydasique des macrophages puisque, si les T gondii sont préalablement incubés avec de la peroxydase d'éosinop iles de chevaux, les macrophages retrouvent alors une cytotoxicité de 90 %, équivalente à celle des monocytes (3, 6). Les mêmes observations ont été faites avec S. aureus (7),le T. cruzi (8) ou des cellules tumorales (9)«

MATERIELS ET METHODES Purification des monocytes humains.

50 ml de sang d'un sujet normal sont prélevés sur Calciparine (0,3 ml à 5000 U/ml) puis dilués de moitié avec du tampon PBS 0,01M pH 7,2. 35 ml de sang dilué sont alors déposés un gradient de densité cons- titué de 15 ml de Picoll-Paque (Pharmacia).

Après une centrifuga ion à température am¬ biante à 1800 t/min pendant 30 minutes, les lymphocytes et les monocytes situés à l'interface du gradient sont récupérés et conservés sur glace. Les cellules sont en- suite lavées une première fois avec du tampon PBS puis centrifugées à 2000 t/min pendant 10 minutes à -°C. L'opération est encore répétée deux fois puis les cel¬ lules sont mises en culture.

Culture des monocytes humains. !<es monocytes sont purifiés par adhérence sur verre. Dans des alvéoles d'un diamètre de 2,5 cm (Li bro), les cellules sont mises en contact avec 1 ml de milieu de culture MEM contenant 10 % de sérum humain. Après une incubation à 37°C pendant 2 hsures dans une atmosnhère à

5 % C _Q ~, les cellules non-adhérentes (lymphocytes) sont éliminées en enlevant le surnageant. Les monocytes adhé¬ rents sont remis en contact avec 1 ml de ÏÏEM contenant également 10 % de sérum humain puis laissés en culture.

I. Mise en évidence par microscopie de l'incorporation de la myéloperoxydase dans les monocytes 1.1 Méthode

Les monocytes sont mis en présence de 980 ng/ml de myéloperoxydase leucocytaire Humaine semi- purifiée. Après -- heures d'incubation à 37°C,le milieu de culture MEM est enlevé et les monocytes sont lavés soigneusement avec du tampon PBS. Les monocytes sont ensuite décrochés par agitation forte avec 1 ml de tampon PBS puis centrifugés de façon à former un dépôt sur une lame de microscope.

Les lames sont fixées par une solution d'é- thanol-formaldéhyde (9:1) à température ambiante, la¬ vées ensuite avec de l'eau puis séchées à l'air. L'ac¬ tivité peroxydasique des monocytes est mise en évidence en déposant sur la lame quelques gouttes d'un mélange de benzidine 1 % (30 ml), de nitroprussiate de sodium % dilué au dixième (0,3 ml) et 0,3 ml d'H ₂ 0 ₂ dilué 80 fois.

Après un contact de 2 minutes à température ambiante, les lames sont lavées abondamment avec de l'eau puis séchées à l'air.

Dans une dernière étape, les lames sont colo¬ rées avec du Giemsa pour la mise en évidence des cel¬ lules.

Les lames sont ensuite visualisées au icros- cope.

1.2 Résultats

Des monocytes témoins ne présentent que très peu de réaction positive à la benzidine.

Seuls quelques monocytes développent une coloration légèrement brunâtre, démontrant bien ainsi que la myélo¬ peroxydase n'est présente qu'en faible quantité dans ces cellules. Par contre, des monocytes en culture depuis

24 heures et mis en contact avec de la myéloperoxydase réagissent positivement et de manière très nette à la benzidine • ^c es premiers résultats confirment une incorporation de la myéloperoxydase par simple phagocytose dans les monocytes.

II. Mise en évidence par radioi ^* mππrπoessai de l'incor¬ poration de la myéloperoxydase par les monocytes II.1 Méthode

Après une mise en contact des monocytes adhé- rents avec 1 ml de tampon MOM contenant de la myélope¬ roxydase semi-purifiée ou des débris de neutrophiles obtenus par sonication (le protocole de quatre expé¬ riences est décrit en détail dans les résultats), le surnageant est récupéré puis centrifugé à 2000 t/min pendant 10 minutes afin de récupérer les monocytes qui se seraient éventuellement décrochés (culot 1).

Les monocytes adhérents sont décrochés par agitation efficace avec 1 ml de tampon PBS. Ils sont ajoutés au culot 1 puis centrifugés à 2000 t/min pen- dant 10 minutes à -°C. Après trois lavages avec du tampon PBS, les cellules sont comptées puis diluées afin d'obtenir 3 millions de monocytes par ml.

La myéloperoxydase des monocytes est solubi¬ lisée en traitant les cellules avec du bromure de cetyl- triméthylammonium (0,01 %) et par deux congélations suc¬ cessives.

Après le retour à température ordinaire, 100 ul du milieu sont prélevés pour la quantification

de l'enzyme selon une technique de radioimmunoessai spécifique (10).

II.2 Résultats Expérience 1

Trois millions de monocytes en culture depuis 24- heures sont mis en contact pendant 2 heures avec 1 ml de milieu de culture MEM contenant : a) MPO 1 = myéloperoxydase se i-purifiée à une concen¬ tration de 980 ng/ml. b) MPO 2 = 50 ul d'une suspension concentrée de débris de neutrophiles soniqués.

Le taux basai de monocytes n'ayant pas été mis en contact avec de la myéloperoxydase est de 80 ng/ml. Après une incubation de 2 heures avec de la myéloperoxydase semi-puri iée, le taux intracellulaire en myéloperoxydase des monocytes reste inchangé. Par contre, une forte augmentation ( 7 % du taux basai) de la concentration intracellulaire en myéloperoxydase est observée lorsque les monocytes sont mis au contact de débris de neutrophiles. Cette dernière obs.ervation montre que les monocytes sont bien capables de phagocy¬ ter des débris de neutrophiles.

Expérience 2

Les conditions sont identiques que dans l'ex¬ périence 1, excepté que le temps d'incubation est de 4 heures. On constate cette fois une nette augmentation (440 %) du contenu intracellulaire en myéloperoxydase des monocytes ayant été mis en contact avec l'enzyme. De même, les débris de neutrophiles sont encore mieux phagocyter que dans l'expérience précédente puisqu'il y a une augmentation de 2070 % du contenu intracellulaire en myéloperoxydase. myélo¬ % augmen-] peroxy¬ tation du! dase contenu ng/ml intracel¬ lulaire

Monocytes 24h (3 millions) 5

Monocytes 24h + MPO 238 440

Monocytes 24h + MPO 1120 2070

Expérience 3

Le tableau ci-dessous montre que des monocytes en culture depuis 48 heures incorporent mieux la myélo¬ peroxydase ou les débris de neutrophiles après 2 heures d'incubation que des monocytes en culture depuis 24 heu¬ res.

myélo¬ % augmen¬

3 peroxy¬ tation du

_* dase contenu ng/ml intracel¬ lulaire

Monocytes 48h (3 mil

Monocytes 48h + MPO 220

Monocytes 48h + MPO 772

Expérience 4

Des monocytes en culture depuis 24 heures sont mis cette fois en contact pendant 2 heures et

6 heures avec 1 ml de tampon de culture contenant

3920 ng/ml de myéloperoxydase semi-purifiée (MF03).

Après 2 heures de mise en contact avec l'en¬ zyme, les monocytes augmentent leur contenu intracellu¬ laire de 15 °° alors que dans l'expérience 1, ce conte¬ nu était resté inchangé. L'augmentation est encore plus nette après 6 heures de mise en contact. Dans cette ex¬ périence, on a également mesuré dans les monocytes l'activité enzymatique de la myéloperoxydase déterminée par l'oxydation de l'o-dianisidino en présence d'H _p O . Le taux basai de 0,6 U/ml augmente au fur et à mesure que le temps de mise en contact augmente (valeur dou¬ blée après 6 heures). Cette constatation est la preuve que la myéloperoxydase exogène incorporée dans le mono- cyte reste bien enzymatiquement active. III. Cytotoxicité des monocytes ayant incorporé de la myéloperoxydase vis-à-vis de schistoso ules III.1 Méthode

Les schistosomules sont isolés à partir de cercaires par une technique artificielle (filtration à travers un morceau de peau de souris). Le protocole

expérimental suivant a été retenu : des monocytes de 24 heures sont incubés pendant 2 heures avec de la myéloperoxydase puis lavés soigneusement avec du milieu de culture MEM. Ensuite, les monocytes traités ou non avec de la myéloperoxydase sont incubés pendant 6 heures avec du sérum d'un sujet atteint de bilharziose (10 %) ou avec un sérum d'un sujet sain (10 %) qui sert de con¬ trôle (effet propre du sérum). Des schistosomules préa¬ lablement traités ou non avec de la myéloperoxydase sont ensuite ajoutés au milieu de culture. Après 16 heures, les schistosomules vivants et morts sont comptés et un % de cytotoxicité des monocytes est ainsi déterminé. Monocytes : 100 à 200000 cellules en culture depuis 24 heures

0 2h 8h 24h i -m 1 l

MPO 1 sérum sain schistosomules lecture ou MPO 2 sérum bilharzien

Expérience 5 Ces résultats montrent que la cytotoxicité des monocytes ayant préalablement incorporés MPO 1 ou MPO 2 vis-à-vis des schistosomules en présence de sérum de bilharzien est augmentée de 50 % par rapport aux mo¬ nocytes témoins. Le pourcentage réel de cytotoxicité est obtenu en soustrayant la valeur obtenue avec le sérum sain (effet propre du sérum) de la valeur obtenue avec le sérum de bilharzien.

Expérience 6

Dans cette expérience, on a comparé la cyto¬ toxicité de monocytes ayant ou n'ayant pas incorporé de la myéloperoxydase vis-à-vis de schistosomules nor¬ maux (stimulus 1) et de schistosomules ayant été préa¬ lablement mis en contact pendant 2 heures avec 980 ng/ ml de myéloperoxydase (stimulus -2).

Les monocytes non traités avec de la myélo¬ peroxydase ont une cytotoxicité qui passe de 23,5 à 40,5 % lorsqu'ils sont mis en contact avec des schisto¬ somules recouverts de myéloperoxydase.

Bien que le modèle soit différent (dans ce cas, le monocyte ne tue pas le schistosomule par p ago-

cytose ma is par s imple adhérence avec lui) , cette ob _¬ servation rej oint les travaux antérieurs montrant αue la cytotoxicité des macrophages est augmentée lorsque l ' organisme infectieux ( T. gondii) phagocyté est recou- vert avec une peroxydase (3 ,6) .

La combinaison de monocytes ayant incorporé de la myéloperoxydase avec des schistosomules recouverts avec l ' enzyme pe rmet d ' obtenir une cytotoxic ité très élevée (64 %) .

Conclusions

Il était seulement montré dans la littérature que les monocytes peuvent acquérir une peroxydase ac¬ compagnée, c'est-à-dire associée à un support qui est un microorganisme et voir ainsi ieur cytotoxicité augmentée vis-à-vis de toute une série d'organismes infectieux. Dans ces expériences, il faut en effet remarquer que ia myéloperoxydase était d'abord liée à l'organisme infectieux qui était ensuite ingéré par le monocyte ou macrophage.

Selon l'invention il a été utilisé de la myé¬ loperoxydase granulocytaire humaine et on a découvert que : 1°) la myéloperoxydase peut être directement phagocytée sans l'intervention d'un activateur par le monocyte, 2°) l'enzyme ingérée reste enzymatiquement très active ainsi que le montrent les résultats de cytotoxicité vis-à-vis des schistosomules. Ces observations indiquent que de la myélope¬ roxydase exogène administrée dans l'organisme sera re¬ prise par les monocytes ou macrophages humains et dès lors peut être utilisée comme un moyen de thérapeutique chez des patients souffrant de déficiences héréditaires (agranulocytose) ou acquise (SIDA).

Références

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