La presente invención consiste en la creación de una medicación constituida por liposomas cnn una RNΛsa y U o 5, somas con una proteaβa en su interior (mediante la técni¬ ca de evaporación en fase reversa u otro método alternatj. vo), recubriendo los lipoaomas con CD4 para BU adminiβ— tración en si infectado.

10. ESTADO ACTUAL DE LΛ TÉCNICA

El VIH tiene afinidad por la molécula CD4 (presente en la membrana de un determinado tipo de iinfocito T), — siendo esta la puerta de entrada del virus en los elemen- 15. tos celulares portadores de dicha molécula _*

La glucnproteina 120 (GP120) de la envoltura vírica interaccioraa con la molécula CD4 presente en la ambrana celular de la futura célula huésped; tras esta interac ción se produce la penetración del virus en la célula» y 20. posterior liberación del nucleocápaida en el citoplasma — de la misma. La decapsidación de éste libera el RNΛ víri¬ co y la enzima transcriptasa inversa (RT),

La trancriptasa inversa sintetiza DMA monocatenario y posteriormente bicateroario tomando como molde el RIMA vi

25, rico. El DNΛ bicatenario se integra en el genoma celular; aprovechando la energía y sustratos de la célula huésped, sintetiza las proteínas y el RNΛ de los futuros nucleocáj] aldea víricos "hijos". Las proteínas víricas son transpo^r tadas a la superficie celular (alguna, co n la GP120, BX-

30. presada en la propia membrana celular) donde, por mecani¿ mo de exocitosis, se forma la envoltura vírica. Esta en— voltura contiene moléculas víricas GP120, ηuβ aseguran la infectividad de los virionβs resultantes.

En la fig. 1, vemos en la parto derecha un WIII con - 35. la GP120 (1), en el momento da interaccionar con el rec ^β j ^j

tor CD4 (2); una vez que interacoiona, el virus penetra en la célula, liberando el RNA vírico (3); dicho RNA pasa me¬ diante la RT (4) a ONA bicatenario, éste se integra en el DNA de la célula huésped (6). Se sintetizan, a partir del 5. DNA vírico integrado, proteínas del nuclocápside (5), —- GP120 (que es incorporado a la membrana celular) y RT. Los viriones emergen, a la izquierda de la figura, median te exocitosis con todos los componentes para infectar una nueva célula. 10. Además de lo expuesto anteriormente, los linfocitos infectados, al poseer en BU membrana plasmática GP120, — son capaces de interaccionar con otros linfocitos sanos - (unión GP120-CD4 del linfocito sano) y formar sincitioβ letales (esto es, arrastran al destruirse a muchos llnfo- 15. citos sanos unidos a ellos).

Esto contribuye a la enorme inmunodeficiencia de los pacientes infectados.

El tratamiento contra el virus está hoy día centrado en la inhibición del enzima RT, mediante drogas del tipo 20. AZT; frente a esta droga el virus puede hacerse resisten¬ te. Se ha combinado AZT con CD4 soluble.

El tropismo del virus por la molécula CD4 ha sido la base de alguna concepción terapéutica.

Se administra CD4 recombinante intravenosa o βubcutá 25. neamente, pues es una proteina, oon la finalidad de que - compita con el CD4 de los linfocitos en la unión al virus, y de esta forma evitar que el virus infecte un nuevo lin¬ focito.

El VIH se puede unir tanto al C04 de la membrana de 30. los linfocitos como al CD4 soluble (administrado co o me¬ dicamento) ,

Esquemáticamente podemos representarlo como sigue: a) V/IH + CD4Lin *> VIH-C04Lin b) VIH + CD4 P- VI H-CD4

35. en donde ;

V/IH - Virus .

CD4 = CD4 soluble.

VIH-CD4 β Virus unido a CD4 soluble.

CD4Lin β CD4 de la membrana del linfocito. 5. VIH-CD4Lin = Virus unido al CD4 de la membrana del lin focito, a) y b) están relacionados,comparten el componente VIH. a) representa al paciente no tratado: el producto VIH-CD4Lin es letal, y por tanto desaparece. 10. CD4Lin (linfocitos con CD4) llegará a un momento en que sea tan bajo que comprometerá la vida del individuo.

El conjunto de a) + b) representa al individuo tratado con CD4 soluble.

El CD4 soluble une VIH para formar VIH-CD4, compitien- 15. do con los linfocitos sanos en la unión con el virus y de esta forma impedir que el virus se una a los linfocitos sa¬ nos; además, el CD4 se une a los linfocitos infectados (que poseen GP120 en su membrana) e impide que éstos formen sin- citios letales con otros linfocitos sanos. (Los linfocitos - 20. infectados que expresan la GP120, dentro de la nomenclatura que estamos utilizando, habría que considerqrlos como HIV; pues unen y aniquilan linfocitos CD4), Según la presente in vención lo importante, aparte de bloquear la GP120 del vi¬ rus y de los linfocitos infectados, es eliminar el producto 25, de la unión VIH-CD4 soluble y el producto linfocito infecta do-CD4 soluble de una manera eficaz.Esto es, si no conseguí oa una eliminación eficaz del complejo VIH-CD4 soluble y - del complejo linfocito infetado-CD4 soluble, estamos gene— rando probablemente un nuevo reservorio del virus. 30, Dicho motivo ha llevado a inventar una medicación que actúa sobre VIH y linfocito infectado sincrónicamente.

Se comprenderá mejor el objeto de la presente invención con la siguiente descrpición:

La manera de eliminar el virus consiste en una medica- 35. ción de lipoβomas con la molécula CD4 ahsorbida; liposomas que llevan en su interior bien una proteasa (Ej. Tripsina)

o bien una RNAaa (Ej. Ribonucleasa T).

Cuando un liposoma hace coalescencia con una partícu¬ la HIV la proteasa destruye su nucleocápside; al hacer COJJ lescencia con un liposoma que lleva en su interior RNAsa, 5. ésta destruye su RNA.

Las células infectadas (portadoras de GP120) serán — destruidas al hacer coalescencia con liposomas, que están cargados con proteasa.

En la figura 2 se representa un esquema de las inte— 10. racciones del liposoma con virus y célula infectada.

(7) Representa una célula infectada, que expresa

GP120 (1) (fig. 1) en su membrana.

(θ) Representa el liposoma con moléculas de proteasa (rectángulos) encapsuladas, y en su cara externa moléculas 15. de CD4 adsorbidas (2) (Fig. 1).

(9) Representa el liposoma con moléculas de ribonu— cleasa (hexágonos) encapsuladas, y en su cara externa mol culas da CD4 adsorbidas (2) (Fig. 1).

(10) Representa una partícula vírica VIII, con molécu— 20. las de GP120 (1) (Fig. 1) en su envoltura,

PROCESO DE FABRICACIÓN

1.- Composición lipidies del lipsoma: 25. - Ratio molar: 9,7: 5: 0,15: 0,2 de PC/CH/PE/PDP-PE en donde:

PC es fos atidilcolina de huevo, CH es colesterol,

PE es trioleilfosfatidiletanolamina y 30. PDP-PE es N-f3-(2-piridilditio) propionil] dipal itoil fosfatidiletanolamina. 2.- Producción del liposoma y eπcapsulación de proteja sa (tripsina) y RNAsa (ribonuclβasa T) mediante evapora—- ción en faβe reversa por ejemplo: 35. Los liposomas son preparados mediante evaporación en fase

reversa, en tampón 20 mM Mes, 20 mM Plops, 125 mM de CINa, 1 mM EDTA (pH 6,7), tripsina B mg/mL o bien ribonucleaaa T ^Q mg/mL y extrusión a través de membranas de policarbo- nato doble (0,1 micrometro de diámetro de poro, variando 5. el tamafo de poro de la membrana podemos obtener liposo— mas de superior tamaño) bajo presión de argón en un extr _j j sor de acero de alta presión.

3.- Eliminación de tripsina, o bien ribonucleasa T - no encapsulada:

10. Los dos tipos de liposomas se purifican en gradiente de flotación discontinuo de metrizamida, seguido de diálJL sis "overnight" (Spectrapor 2) contra cantidades co o mí¬ nimo de 1000 volúmenes de tampón (20 mM Mes, 20 mM Mops, 125 M NaCl (pH 6.7) bajo atmósfera da argón, a 40C.

15. 4.- Acoplamiento del receptor CD4 recombinante solu¬ ble: raCD^.

Se puede realizar de múltiples formas, como por eje pío mediante el método de tiolación (SATA), bien mediante el método MBPH (hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil

2Q. butírico), que es el que pasamos a describir.

5,4 mg/mL de rsCD. en 0,1 mM de acetato sódico, pH 5,5, - oxidado 30' con periodato sódico 10 mM a temperatura —— ambiente (finalmente eliminado con filtración en Sβphadex G-25, equilibrado con acetato sódico 0,1 M, pH 5,5).

25. MPBH en dimetilformamida se añade a rsCD^ oxidado, duran¬ te 2 horas a temperatura ambiente (concentraciones fina¬ les 1 M y 2,7 mq/mL , respectivamente); se elimina el

MPDH por filtración en Sephadex G-25 (equilibrado con ace tato sódico 10 mM/cloruro sódico 150 M, pH 5,5). Concen-

30. tramos el conjugado a 10 mg/mL en un concentrador de pro- teína (ej. Centricon 10 (Amicon)).

Los liposomas se reducen con 12 mM de DTT (ditiotre . tol), a temperatura ambiente durante 1 h. , bajo atmósfera de argón, y el exceso de ditiotreitol se elimina por fil-

35. tracióπ en Sephadex G-75 equilibrado con buffer (20 M —

Mes, 20 M Mops, 125 mM ClNa, 1 mM de EDTA (pH 6.7)), ba jo chorro constante de argón.

Inmediatamente antes de mezclar rsCD^-MBPH con los liposomas, ajustamos su pH a 7.0 (con 500 mM de Mes/500 5. M de Mops, pll 8,0). El acoplamiento se consigue para — concentraciones finales de rsCD. 2,4 mg/mL y liposomas - 10 M de lípido, bajo atmósfera de argón, temperatura — ambiente, con agitación suave durante toda la noche.

Para la purificación final de los liposomas acopía¬ lo, dos nos referimos al punto 3.

A la fracción con tripsina encapsulada, le añadimos

1 mg de Inhibidor de Tripsina por cada mililitro de solu ción de liposomas, evitando así que el "leakage" de la - proteaβa del liposoma dañe al receptor CD4 de la βuperfi

15. cié del liposoma.

Obtenemos así la medicación consistente en liposo— mas de un tamaño oscilante entre 100 y 400 nanomβtros, - recubiertoβ en su superficie con CD4 y en su interior — una proteasa, o bien liposomas con CD4 en su superficie 20. y una RNAsa en su interior.

25.