L'invention concerne des moyens pour améliorer les capacités fermentaires de levures actives. Elle a plus particulièrement pour objet des levures sèches actives (LSA en abrégé) ou des levures actives réhydratées, à teneur élevée en stérols et leur obtention. L'invention a également pour objet les applications de ces levures dans des processus de fermentation alcoolique, en particulier pour la fabrication de boissons alcooliques fermentées.

Les stérols sont des constituants importants de la membrane cellulaire des levures. La concentration en stérols doit être optimale pour assurer l'intégrité membranaire, garantie de l'activité des protéines membranaires, telles que les perméases.

En conditions fermentaires, si certaines de ces perméases ne fonctionnent plus, on observe une chute de la viabilité cellulaire, pouvant entraîner la mort de la cellule.

La composition en stérols des levures exerce donc un rôle primordial sur- leur capacité fermentaire.

Pour augmenter les concentrations en stérols des levures, on a proposé d'incorporer des stérols exogènes pendant la croissance des levures. Mais leur caractère insoluble en milieu aqueux constitue un facteur limitant.

Pour pallier cet inconvénient, on a préconisé l'utilisation d'agents tensio-actifs pour les solubiliser, ce qui limite les possibilités d'addition directe de stérols dans le milieu de culture.

Dans les cas de carences en facteurs lipidiques, l'ajout de bourbes fines au moût de fermentation a été recommandé afin d'apporter au milieu des nutriments tels que des stérols et des acides gras insaturés sous forme complexe. Un tel ajout n'est toutefois pas toujours facile à réaliser dans des caves.

Les inventeurs ont constaté que ces inconvénients pouvaient être surmontés en utilisant des levures inactivées à teneur élevée en certains types de stérols, soit naturellement,

soit par enrichissement, ou en utilisant des compositions de stérols sous forme soluble. Il s'est en effet avéré que l'addition de telles levures ou compositions dans le milieu de réhydratation des levures sèches actives ou aux levures actives dans un moût de fermentation, permet de stabiliser les stérols et de disposer de formes solubles capables d'être incorporées efficacement par les levures.

De manière surprenante, les capacités fermentaires des levures actives du milieu de fermentation sont particulièrement élevées, notamment pendant la phase stationnaire de la fermentation, la durée de la fermentation étant généralement plus courte.

L'invention a donc pour objet des levures sèches actives ou des levures actives réhydratées avec des capacités fermentaires améliorées. Elle vise également un procédé de mise en œuvre aisée pour leur obtention.

L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés fermentaires de ces levures actives pour la fabrication de boissons fermentées alcooliques, en particulier de vins, de bières et d'alcools forts comme la vodka ou le whisky.

L'invention vise ainsi des LSA utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, ayant une teneur en stérols présentant au moins deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B d'au moins 200 μg/g de poids sec, et plus spécialement d'au moins 900 μg/g de poids sec.

Par « levures utilisables en fermentation », on entend la crème de levures issue de leur production ou les levures congelées.

Il s'agit plus spécialement de levures œnologiques ou de levures de brasserie, ou encore de levures de distillerie, ce qui inclut des levures du genre Saccchromyces ou du genre non Saccchromyces. On citera en particulier des Saccharomyces appartenant aux espèces cerevisiae, uvarum et bayamis.

L'enrichissement de LSA en stérols est obtenu avantageusement par incorporation de compositions de stérols sous forme soluble à partir de micelles.

Avantageusement, ces micelles comprennent au moins 10 à 20 mg/g (poids sec) de stérols, en particulier au moins 15 mg/g (poids sec), et environ 600 à 800 mg/g (poids sec) de complexes lipopolysaccharides - protéines, précipitables par Péthanol à 80% (v/v), en particulier 660 à 670 mg/g (poids sec), d'un poids moléculaire moyen de 160 à

17O kDa environ.

Les stérols comprennent au moins 20 - 25% d'ergostérol et 20 - 25% de zymostérol, d'autres stérols étant présents, comme les fécostérol, lanostérol ou ergosta 5 - 7 diénols, sans que cette énumération soit limitative.

Une composition de telles micelles est donnée dans les exemples. Selon un mode de réalisation de l'invention, les LSA enrichies en stérols sont obtenues par addition dans leur milieu de réhydratation ou dans le moût de fermentation de levures inactivées, ayant elles-mêmes une teneur en stérols présentant au moins deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B d'au moins 200 μg/g de poids sec, et plus spécialement d'au moins 900 μg/g ( poids sec).

De telles levures inactivées sont des levures naturellement riches en stérols ou des levures enrichies en stérols, notamment en ergostérol, et/ou en zymostérol, et/ou ergosta 5-7 diénols, avantageusement selon les techniques connues de l'homme du métier.

De préférence, les levures utilisées ont avantageusement une teneur en stérols possédant deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B, de 900 à 1 250 μg/g de poids sec.

Les quantités de levures inactivées ajoutées dans le milieu de réhydratation sont de l'ordre de 20 à 500g/l, de préférence de 100 à 200 g/1, notamment de l'ordre de 150g/l.

L'enrichissement des LSA s'effectue grâce au transfert des stérols sous forme de micelles à partir des levures inactivées.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l' enrichissement des levures en stérols est obtenu par addition, à des LSA dans leur milieu de réhydratation ou à des LSA

ajoutées à des moûts de fermentation, d'une composition lipidique renfermant une fraction de stérols comprenant de Tergostérol et du zymostérol et un complexe de lipopolysaccharides — protéines précipitables par Péthanol .

Ces compositions renferment avantageusement de 10 à 70 % en poids sec d'ergostérol et de 10 à 70% en poids sec de zymostérol, à raison de 10 à 20 mg de stérols totaux par g. et de 500 à 1000 mg/g de complexe lipopolysaccharides-protéines.

Avantageusement, la fraction stérolique comprend en outre un ou plusieurs stérols tels que le fécostérol, le lanostérol, les ergosta 5 — 7 diénols (dihydroergostérol, méthylzymostérol, desméthyllanostérol, et ergosta-7,22-dièn-3-ol).

Les compositions lipidiques telles qu'utilisées dans le procédé ci-dessus constituent des produits nouveaux et, à ce titre, entrent également dans le champ de l'invention.

Ces compositions lipidiques possèdent notamment les propriétés physico-chimiques suivantes :

- elles correspondent à une forme colloïdale amphiphile sans solubilité vraie en suspension dans de l'eau pure à 4 ⁰ C, - elles ne peuvent pas traverser des membranes de filtrations d'un seuil de coupure de 0.2μm, elles présentent un effet tensio-actif qui ne se manifeste qu'au-dessus d'une concentration de 0.5g/l en poids sec en phase aqueuse,

- elles ont la propriété de s'auto agréger au-dessus d'une concentration de 0.05 g/1 en poids sec en phase aqueuse pour former des agrégats micellaires d'un diamètre moyen d'environ 380 nm (valeur obtenue par mesure de la diffraction de lumière laser) par technique PCS (Photo Corrélation Spetroscopy).

Pour obtenir un effet tensio-actif maximal des stérols, les compositions ci-dessus sont utilisées à raison de 1,5 à 3 g/1, de préférence de 2g/l de milieu de réhydratation ou de 20 à 1 OOg/hecto de moût de fermentation.

Les levures à teneur élevée en stérols, telles qu'obtenues par enrichissement pendant leur phase de réhydratation ou de fermentation, grâce au transfert et à l'incorporation des

stérols sous forme de micelles à partir des levures inactivées, ou par incorporation desdites compositions lipidiques, présentent un grand intérêt dans les processus fermentaires compte tenu de leurs capacités fermentaires élevées durant la phase stationnaire des fermentations.

En outre, cette teneur élevée en stérols diminue la production d'acides volatiles, ce qui permet d'améliorer les propriétés organoleptiques des produits de fermentation.

L'invention vise ainsi également l'utilisation, comme auxiliaires technologiques, de levures inactivées riches en stérols, comme défini ci-dessus, dans des milieux de réhydratation de LSA ou dans des milieux de fermentation alcoolique, pour la production de boissons fermentées alcooliques, en particulier de vins ou encore de bières, ou d'alcools de type whisky, vodka et autres.

. L'invention vise également un procédé de production de telles boissons comportant l'addition de levures sèches actives enrichies en stérols comme défini ci-dessus, à raison de

100 à 200 g/1 de milieu de fermentation, de préférence 150g/l. Ces levures sont soit des levures naturellement riches en stérols, réhydratées ou non, soit des levures enrichies comme défini ci-dessus, à savoir des levures actives réhydratées ou des LSA.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il sera fait référence aux figues 1 et 2, qui représentent, respectivement,

- la figure 1 la réhydratation d'une LSA en présence de préparations de stérols selon l'invention, à teneurs différents en stérols ; et - la figure 2, l'incorporation de stérols par des LSA pendant une phase de réhydratation en utilisant une préparation de stérols selon l'invention.

Exemple 1 : Formulation de stérols stabilisés sous forme soluble

On soumet 10 ml de suspension dans l'eau d'un échantillon de levures inactivées, à une concentration de 150 g/1 de poids sec, à une étape d'incubation, sous agitation, à 37°C, pendant 30 min.

Par centrifugation de la préparation à 11 300g, 15 min., on obtient un surnageant 1 et un culot L Le surnageant i est soumis à une étape d'ultracentrifugation à 85 000 g, 3h, à 4°C. On obtient un culot 2 un surnageant 2 et un colloïde blanc en surface. La fraction colloïdale

blanche est lyophilisée pour donner la préparation de stérols stabilisés sous forme soluble (environ 20 mg).

Exemple 2 : Effet de la formulation de stérols selon l'exemple 1 sur le profil de fermentation d'un moût synthétique

Ig de levure sèche active LALVIN ECl 118 ® est réhydraté dans 10ml d'un milieu de réhydratation constitué par l'eau additionnée de 50g/l de glucose. Les réhydratations sont

^• effectuées à 37°C pendant 30 min, en présence de 12 ou de 24mg de la formulation de stérols de l'exemple 1, et à titre de contrôle, en l'absence de formulation de stérol. Deux fermentations ont été conduites en parallèle et en duplicata sur un moût synthétique MS300-stigmastérol correspondant à un moût riche en azote (300 mg d' azote/1), carence en stérols et contenant 200g/l de sucres fermentescibles.

Quatre fermenteurs contenant 1.11 de moût synthétique MS300-stigmastérol sont inoculés avec 2.2ml de solution de réhydratation. La température est maintenue à 24 ⁰ C. La production de CO ₂ est relevée en fonction du temps.

Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 1. L'examen de cette figure montre que les fermentations conduites par les levures réhydratées en présence de formulation de stérols utilisée se terminent avant les fermentations témoins.

Globalement, les cinétiques observées pour les fermentations conduites par les levures réhydratées en présence de la formulation de stérols stabilisés sous forme soluble sont plus . rapides dès l'entrée en phase stationnaire.

Exemple 3 : Effet de la- formulation de stérols selon l'exemple 1 sur l'activation de l'incorporation de stérols par les LSA On opère comme dans l'exemple 1, mais on effectue la réhydratation en présence de 2 μl de [4- ¹⁴ C] cholestérol (50-60 mCi/mMol (Amersham CFA 128)), solubilisé dans 20 mμl de mélange tergitol/éthanol (v/v) en présence ou non de 24mg de la formulation de stérols dé l'exemple 1 pour la fabrication de boissons fermentées alcooliques.

On mesure la radioactivité incorporée au cours du temps par les LSA en procédant comme suit :

On filtre 300 μl de milieu sous vide partiel sur filtre en fibres de verre Whatman GF/C, on rince par 3ml d'eau distillée à 4 ⁰ C, on sèche et compte par scintillation liquide sur compteur Beckman LS 6500, après ajout de 20ml de liquide scintillant Fluoransafe 2® (BDH).

Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 2. On constate que pendant la réhydratation, la présence de la formulation de stérols selon l'invention permet une incorporation plus efficace des stérols du milieu par les LSA.

Exemple 4 : Enrichissement en stérols de levures inactivées

Les souches de levure sont cultivées sous une aération constante et forte. La température des propagations est de l'ordre de 15 à 40°C, de préférence de 25 à 35°C.

La culture des levures est effectuée par apport constant de sources de carbone et de sources d'azote, ainsi que par un apport intermittent en facteurs de croissance essentiels. Les sources de carbone dérivent généralement de molasses et peuvent être des molasses de sucre, de betterave ou leur mélange à des concentrations variables. La source d'azote peut provenir de divers dérivés ammoniaque, comme l'hydroxyde d'ammoniaque, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le phosphate de di-ammonium ou d'extraits protéiques bruts. La propagation de la levure est réalisée selon un programme comportant des variations des vitesses de croissance. Les vitesses de croissance maximales sont de 0.05/h à 0.25/h, de préférence de 0.15 à 0.2/h.

L'enrichissement de la levure en stérols peut être effectué en modifiant de manière spécifique les sources de carbone et d'azote afin de réduire le taux total d'azote par rapport à celui du carbone.

Il est également possible d'ajouter des précurseurs de stérols spécifiques de manière contrôlée. Des sources de précurseurs de stérols préférées comprennent l'éthanol, l'acide acétique, le squalène ou le lanostérol. Ces précurseurs peuvent être ajoutés sous forme purifiée ou brute. - .

Exemple 5 : Compositions lipidiques utilisées comme additifs dans des milieux de réhydratation de levures et/ou dans des moûts de fermentation

Ces compositions sont obtenues par un procédé comprenant les étapes : - d'incubation sous agitation d'une suspension dans l'eau de levures œnologiques inactivées dans des conditions permettant l'obtention de micelles formées de fractions spécifiquement enrichies en stérols incorporés dans des complexes de lipides - protéines,

- de séparation des fractions micellaires, suivie de lyophilisation.

L'étape de séparation, après l'incubation, des fractions micellaires est plus spécialement réalisée par centrifugation. Le surnageant recueilli est soumis alors à une étape d'ultracentrifugation pour augmenter l'enrichissement de la fraction en micelles de stérols, la fraction colloïdale qui surnage est isolée et lyophilisée.

Les compositions obtenues renferment une fraction de stérols composés de 10 à 70 %, notamment de 20 à 25% en poids sec d'ergostérol, de 10 à 70 %, notamment de 20 à 25 % en poids sec de zymostérol à raison de 10 à 20 mg de stérols totaux par g, et un complexe de lipopolysaccharides-protéines précipitables par Péthanol à 80% (v/v), d'un poids moléculaire moyen de l'ordre de 160-170 kDa, à raison de 600 à 800 mg/g.

La fraction stérolique comprend en outre un ou plusieurs stérols, tels que le fécostérol, le lanostérol, et les ergostastérols 5-7 diénols.

Dans le complexe de lipolysaccharides - protéines, les polysaccharides, les lipides et les protéines sont avantageusement présents à raison de

. 20 à 34%, notamment de 27% pour les polysaccharides, . 55 à 70% notamment 61% pour les lipides, et . 10 à 15%, notamment 12% pour les protéines.

Des polysaccharides préférés ont un PM moyen de l'ordre de 30-35 kDa, en particulier de 30 à 32 kDa et contiennent du mannose du glucose et de l'inositol. Des proportions respectives appropriées correspondent à

. 55 à 70%, notamment 61% pour le mannose, . 30 à 40%, notamment 33% pour le glucose, . 0,5 à 1%. notamment 0,9% pour l'inositol.

La fraction lipidique comprend, en quantités variables, de préférence des acides gras Cl 7 :1, C16 :0 et Cl 8 :0. Cette fraction lipidique est liée aux polysaccharides par l'intermédiaire d'un groupe phosphatidylinositol.

Le restant de la préparation est formé de fragments membranaires solubles dans l'éthanol ) 80% (v/v).

Les micelles formées sont par exemple composés de :

1) Au moins 15 mg/g (poid sec) de stérols, composés d'au moins 20-25% d'ergostérol, 20-25% de zymostérol et des quantités variables d'autres stérols (fécostérol, lanostérol, ergosta 5-7 diénols, etc.). 2) 667 mg/g (poids sec) de complexes lipopolysaccharides-protéines, précipitables par l'éthanol à 80% (v/v), d'un poids moléculaire moyen de 167 kDa, composés de 27% de polysaccharides, 61% de lipides en poids et 12% de protéines. Les polysaccharides ont un poids moléculaire moyen de 31,7 kDa, et contiennent 61% de mannose, 33% de glucose et 0,9% d'inositol. La fraction lipidique est formée des acides gras C17 :1, C16 :0 et C18 :0 en quantités variables. La fraction lipidique est liée aux polysaccharides par le biais d'une ancre phosphatidyl inositol. 3) 333 mg/g (poids sec) de substances diverses solubles dans l'éthanol à 80% (v/v).