Verfahren zur zellfreien Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen Gegenstand der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur zellfreien Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen vorzugsweise aus Pilzen und/oder genetisch veränderten Varianten davon unter Einsatz eukaryontischer Zellextrakte, vorzugsweise von Pilzen, insbesondere filamentöser Pilze, und dessen Verwendung. Stand der Technik Es besteht ein erhebliches Interesse an Herstellungsverfahren für unspezifische Peroxygenasen, also im Sinne dieser Erfindung Enzyme mit Peroxidase- und Peroxygenaseaktivität, die unter der EC-Nummer 1.11.2.1 zusammengefasst werden [BRENDA-Datenbank, Stand September 2021] (nachstehend „UPO“ genannt), um diese effektiv als Biokatalysatoren für die pharmazeutische und chemische Industrie, zum Beispiel in der Herstellung von Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmitteln, Klebstoffen, Farbstoffen oder in Sensortechnik oder biologischen Assays einsetzen zu können. UPOs gehören zu den Häm-Thiolat-Proteinen und katalysieren selektiv Sauerstofftransferreaktionen von Hydroperoxiden, bevorzugt Wasserstoffperoxid, in organischen Molekülen, u.a. nicht-aktivierte Kohlenwasserstoffe und erzeugen dabei u.a. Hydroxylierungen und Epoxidierungen. Dabei arbeiten UPOs im Vergleich zu anderen Sauerstofftransfer-katalysierenden Enzymen unabhängig von Elektronendonatoren, Transportproteinen und zusätzlichen Cofaktoren. Die klassische Chloroperoxidase aus Leptoxyphium fumago gehört ebenfalls in diese Proteinfamilie. Die Mehrheit der bisher bekannten pilzlichen UPOs gehören zu dem Unterreich der Dikarya, insbesondere aus der Abteilung der Basidiomycota und Ascomycota. Phylogenetisch teilen sich die UPO-Sequenzen in zwei große Proteinfamilien, genannt lange und kurze UPOs. Die Identifizierung der UPO-Gene erfolgt durch konservierte Aminosäuren, die für die katalytische Funktionalität essentiell sind. Das Motiv PCP-EGD ist typisch für lange UPOs, wie zum Beispiel die UPO von Agrocybe aegerita (syn. Cyclocybe aegerita, Gen APO1), das Motiv PCP-EHD eher typisch für kurze UPOs, wie zum Beispiel die UPO von Chaetomium globosum (Gen CHGG_00319; Hofrichter et al. 2015, Kiebist et al., 2017). Für viele der putativen UPO-Gene wurde bioinformatisch das Vorhandensein von Signalpeptiden vorhergesagt, womit sie zu sekretierten Proteinen zählen, die im Allgemeinen glykosyliert vorliegen. Weiterhin ist zum Beispiel für die UPOs aus Agrocybe aegerita und aus Marasmius rotula bekannt, dass sie intra- beziehungsweise intermolekulare Disulfidbrücken besitzen. Bei der Expression sind daher (viele) UPOs auf posttranslationale Modifikationen angewiesen. Eine Auswahl von UPOs konnte bereits für die Umwandlung verschiedener Pharmazeutika und zur Synthese von Fein- und Spezialchemikalien eingesetzt werden (Hofrichter et al., 2020, Kiebist et al., 2019). Es gibt jedoch ein Problem bei der universellen Verfügbarkeit der UPOs. Die Diskrepanz zwischen der Anzahl an tatsächlich herstellbaren UPOs und der Anzahl an bioinformatisch annotierten putativen UPO-Genen aus Genomsequenzierungen ist groß. Daraus leitet sich ab, dass es noch keinen zuverlässigen Zugang zu dem vollen Spektrum an UPO-katalysierten Reaktionen gibt und damit das volle industrielle Potential dieser Enzymklasse nicht ausgeschöpft werden kann. Im Stand der Technik ist keine zellfreie Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen, vor allem unter Nutzung eukaryontischer Zellextrakte, z.B. von Pilzen, beschrieben. Im Stand der Technik erfolgt die Synthese von UPOs homolog oder heterolog in entsprechenden Organismen. Die erste UPO wurde 2004 im Südlichen Ackerling (Agrocybe aegerita) entdeckt (Ullrich et al., 2004). Weitere UPOs konnten seither u.a. aus den Wildtypen Coprinellus radians, Marasmius rotula, Chaetomium globosum und Marasmius wettsteinii isoliert werden. Die Ausbeuten lagen zwischen 10 und 450 mg Protein/L. Die Dauer zur Herstellung der UPOs beträgt mehrere Tage bis Wochen, wobei das Herausfinden geeigneter Bedingungen zur Induktion der UPO-Produktion im Allgemeinen längere Zeit in Anspruch nimmt. EP2468852B1 beschreibt die Isolierung eines Polypeptids mit Peroxygenase-Aktivität, jedoch hergestellt in zellbasierten Systemen. WO2016207373A1 beschreibt Polypeptide mit Peroxygenase- Aktivität und deren Herstellung, jedoch in zellbasierten Systemen. Im Stand der Technik ist nachteilig, dass trotz bioinformatisch identifizierter UPO-Gene im pilzlichen Genom, selten die Expression und Isolierung der entsprechenden Enzyme in diesen Organismen möglich ist. Daher können putative UPOs durch homologe Herstellung nicht in ausreichender Vielfalt und Ausbeute und ohne großen zeitlichen Aufwand produziert werden. Nachteilig ist weiterhin, dass bei vielen Wildtypen keine gentechnischen Methoden zur Verfügung stehen, so dass die Erzeugung von genetisch veränderten UPO-Varianten mit gewünschten geänderten Eigenschaften (Protein Engineering) nicht möglich ist. Im Stand der Technik wurde die heterologe Herstellung von UPOs erstmals 2014 für AaeUPO in Saccharomyces cerevisiae beschrieben und später als Tandem-Expressionssystem mit Pichia pastoris erweitert (Molina-Espeja et al., 2015). WO2017081355A1 beschreibt Polypeptide mit Peroxygenase- Aktivität und deren heterologe Herstellung, jedoch in zellbasierten Systemen. Die erste heterologe Expression von UPOs im bakteriellen System gelang 2018 mit MroUPO in Escherichia coli. Nachfolgend konnten einige Varianten und weitere UPOs wie Collariella virescens UPO exprimiert werden. EP3594332A1 beschreibt ein Verfahren zur heterologen Expression aktiver Peroxygenase aus Pilzen und/oder Varianten in bakteriellen Zellen, vorzugsweise Escherichia coli, jedoch in zellbasierten Systemen. Im Stand der Technik zur heterologen Expression in eukaryontischen Zellsystemen ist nachteilig, dass es bis zu einer erfolgreichen Expression einer UPO und deren Anpassung zumeist Jahre dauert. Die Ausbeuten liegen bei etwa 300 mg Protein/L. Seit der erstmaligen Beschreibung 2014 konnte lediglich eine UPO sowie deren Varianten produziert werden. Im Stand der Technik zur heterologen Expression in prokaryontischen Zellsystemen ist nachteilig, dass die Ausbeuten im ein- bis unteren zweistelligen mg/L Bereich liegen und der Zeitraum von der Herstellung eines Nukleinsäuretemplats mit der genetischen Information für die UPO bis zur erfolgreichen Expression der UPO im besten Fall mehrere Tage beträgt. Zudem gibt es in prokaryontischen Zellsystemen im Allgemeinen keine posttranslationale Modifikation, wodurch die Herstellung nativer UPOs nicht möglich ist. Die Erfindung stellt sich die Aufgabe native und genetisch veränderte UPOs zellfrei vorzugsweise in weniger als 24 h herzustellen und auf diese Weise neue oxyfunktionalisierende Biokatalysatoren bereitzustellen. Die Durchführung des reinen Herstellungsprozesses der UPO muss vorteilhaft nicht in Laboren mit mindestens Sicherheitsstufe 1 (nach DE-BioStoffV) durchgeführt werden. Besonders effektiv können die Biokatalysatoren in der pharmazeutischen Industrie (z.B. zur Synthese von Wirkstoffen und Wirkstoffmetaboliten) und chemischen Industrie (z.B. zur Synthese von z.T. chiralen Spezial- und Feinchemikalien) sowie in Sensortechnologien oder biologischen Assays eingesetzt werden. Diese gestellte Aufgabe wird durch mindestens einen Patentanspruch gelöst. Vorliegende Erfindung Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur zellfreien Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen aus Pilzen und/oder genetisch veränderten Varianten davon unter Einsatz eukaryontischer Zellextrakte, vorzugsweise von Pilzen, insbesondere filamentöser Pilze. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die universelle Herstellung unspezifischer Peroxygenasen in aktiver Form mit einem geringen verfahrenstechnischen und apparativen Aufwand in einem Batch- oder Dialyseverfahren möglich. Die Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet die zellfreie Proteinsynthese mit eukaryontischen Extrakten. Die zellfreie Proteinsynthese hat sich als effiziente Alternative zur zellbasierten Proteinexpression etabliert. Die für die Proteinsynthese notwendigen hochmolekularen Komponenten aus Zellen werden dabei durch die eingesetzten Zellextrakte gewonnen und mit niedermolekularen Komponenten, solche wie Aminosäuren, energiereiche Triphosphate (ATP, GTP) und verschiedenen Ionen versetzt. Weiterhin sind durch das Herstellungsverfahren der Zellextrakte funktionale Mikrosomen in diesen Extrakten vorhanden. Diese sind Vesikel des Endoplasmatischen Retikulums, die für die zellfreie Proteinsynthese von sekretorischen Proteinen (dazu zählen viele UPOs) essentiell sind. In diesen Mikrosomen können posttranslationale Modifikationen wie zum Beispiel N- Glykosylierungen oder Disulfidbrückenbildung stattfinden. Die endogene mRNA in den eukaryontischen Zellextrakten kann durch verschiedene Verfahren, insbesondere Zugabe von Nukleasen, insbesondere RNasen, entfernt werden. Abschließend erfolgt die Zugabe des Nukleinsäuretemplats zur zellfreien Proteinsynthese des spezifischen Zielproteins, und zwar kodierend für ein oder mehrere UPOs. Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von unspezifischen Peroxygenasen (UPO) in zellfreien Systemen unter Verwendung von eukaryontischen Zellextrakten, das folgende Schritte umfasst: i. Herstellung von eukaryontischen Zellextrakten zur Verwendung in der zellfreien Proteinsynthese, ii. Bereitstellung eines Nukleinsäuretemplats, dass die genetischen Informationen für die UPO enthält, iii. Bereitstellung weiterer Komponenten, die für die Translation von Proteinen notwendig sind, insbesondere Aminosäuren, energiereiche Triphosphate, Salze, RNA Polymerase, oder mindestens eine oder mehrere Komponenten ausgewählt aus der Gruppe Aminosäuren, energiereiche Triphosphate, Salze, RNA Polymerase, iv. Zusammenfügen des Zellextraktes aus i.), des Nukleinsäuretemplats aus ii.) und der weiteren Komponenten aus iii.). Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen in der Herstellungsgeschwindigkeit der UPOs von wenigen Stunden bis unter zwei Tagen, der hohe Durchsatz, mit dem viele verschiedene UPOs parallel hergestellt werden können, die Variabilität in Bezug auf das Verändern der genetischen Informationen der UPOs (Einführen von Mutationen, Protein Engineering) und die Offenheit des Systems, welche z.B. die Möglichkeit zur Zugabe exogener Komponenten wie z.B. Hämin ermöglicht. Zudem wird die Herstellung von potentiell cytotoxischen Proteinen ermöglicht sowie eine effiziente Markierung von Proteinen erleichtert. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ihre universelle Anwendbarkeit für die Herstellung von spezifischen oder nativen UPOs. Dadurch, dass für das zellfreie System insbesondere Zellextrakte von filamentösen Pilzen verwendet werden, die selbst (putative) UPO-Gene im Genom tragen, ist davon auszugehen, dass in den Zellextrakten alle für die UPO Expression notwendigen Faktoren (z.B. Chaperone) vorhanden sind. Daher können neue putative UPO-Gene ohne großen Aufwand und zeitaufwendige Adaptionen in Form eines Nukleinsäuretemplats dem System zugegeben und folglich zellfrei hergestellt werden. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter einem „zellfreien System“ ein solches verstanden, welches nicht die Integrität einer lebenden Zelle benötigt, und eine zellfreie Proteinsynthese erlaubt. Erfindungsgemäß kommen bei der zellfreien Proteinsynthese zwei Verfahren zum Einsatz. In Batch-Systemen findet die Proteinsynthese in einem abgeschlossenen System statt, in welchem sich alle notwendigen Komponenten befinden. Eine kontinuierliche Zufuhr oder Entnahme von Komponenten ist nicht möglich, sodass die Synthese nach Verbrauch der Komponenten zum Erliegen kommt. Im Dialyse-Verfahren ist eine ständige Zufuhr von Edukten und Abfuhr von Produkten möglich, wodurch die Syntheseleistung über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten wird. Verschiedene Translationssysteme sind bekannt, sowohl aus prokaryontischen Organismen wie Extrakte von Escherichia coli als auch eukaryontischen Organismen wie Weizenkeimextrakte, Kaninchen-Retikulozytenextrakte, Insektenzellextrakte und CHO- Zellextrakte (engl. Chinese Hamster Ovary). Der erfindungsgemäß eingesetzte eukaryontische Extrakt ist nicht limitiert, solange dieser alle zur in vitro / ex vivo Translation des exogenen Nukleinsäuretemplats notwendigen Komponenten zur Synthese einer unspezifischen Peroxygenase enthält. Die für die vorliegende Erfindung bevorzugten eukaryontischen Extrakte stammen von Pilzen, vorzugsweise filamentösen Pilze, besonders bevorzugt von Aspergillus spp. und Neurospora spp., insbesondere Aspergillus niger und Neurospora crassa. In der speziellen Ausführungsform stammen die eingesetzten Pilzzellextrakte aus Aspergillus niger und Neurospora crassa. Die Organismen werden in Flüssigkulturen kultiviert, vorzugsweise zwischen 50 mL und 30 L, besonders bevorzugt zwischen 100 mL und 1 L, insbesondere in 200 mL Medium. Das Kultivierungsmedium setzt sich aus Glukose und Hefeextrakt zusammen, bevorzugt zwischen jeweils 5 und 50 g/L, im Fall von Neurospora crassa besonders bevorzugt bei 10 g/L, im Fall von Aspergillus niger besonders bevorzugt bei 20 g/L. Die Kultivierungstemperatur der filamentösen Pilze liegt bevorzugt zwischen 10 °C und 50 °C, besonders bevorzugt zwischen 20 °C und 40 °C, insbesondere bei 34 °C für Neurospora crassa und 30 °C für Aspergillus niger. Die Kultivierungszeit liegt bevorzugt zwischen 6 h und 96 h, besonders bevorzugt zwischen 12 h und 60 h, insbesondere bei 48 h für Neurospora crassa und 24 h für Aspergillus niger. Die erzeugte Biomasse kann mit verschiedenen Methoden aufgeschlossen werden. In der speziellen Ausführungsform wurde der Aufschluss mittels Hochdruckzelle durchgeführt. Das jeweilige Mycel wird nach der Ernte durch filtrieren und mehrmaligem Waschen mit Mannitol-Puffer in Lysepuffer suspendiert. Der Aufschluss des Mycels erfolgt bei Temperaturen um die 4 °C mittels Hochdruckzellaufschluss bei Drücken zwischen 1.000 und 20.000 psi, bevorzugt bei 5.000 psi für Neurospora crassa und 10.000 psi für Aspergillus niger. Das aufgeschlossene Mycel wird vor dem Einsatz mehrfach bei 5.000 - 10.000 g (vorzugsweise 6.500 g) zentrifugiert. Die endogene mRNA des Rohlysats kann mit verschiedenen Methoden entfernt werden. Im speziellen Ausführungsbeispiel wurde eine Micrococcale Nuklease eingesetzt. Das Nukleinsäuretemplat, welches die genetische Information für die unspezifische Peroxygenase enthält, kann aus DNA oder RNA bestehen und in linearer oder zyklischer Form vorliegen. Dabei kann die eingesetzte Sequenz vom Wild-Typ sein oder gezielte oder randomisierte Mutationen enthalten sowie in Form von Chimären eingesetzt werden. Die protein-kodierenden Nukleinsäuren sind aus Sequenzierungsstudien bekannt und werden in Datenbanken gesammelt, welche kontinuierlich erweitert werden, sodass für selektierte UPOs geeignete Expressionskonstrukte mit entsprechenden Promotoren (zum Beispiel T7 RNA Polymerase-Promotor) und regulatorischen Sequenzen (zum Beispiel 5‘-untranslatierter Bereich eines hoch exprimierten Gens) konstruiert und flexibel variiert werden können. Der Reaktionsansatz zur zellfreien Synthese von UPOs enthält erfindungsgemäß neben dem eukaryontischen Zellextrakt und dem gewählten Nukleinsäuretemplat weitere zumeist niedermolekulare Komponenten wie Aminosäuren und energiereiche Triphosphate (ATP, GTP). Zudem können weitere für die Synthese oder Proteinstabilität notwendige Zusätze wie Hämin oder Detergenzien enthalten sein. Ist das zugegebene Nukleinsäuretemplat eine DNA, wird dem System eine entsprechende RNA Polymerase, insbesondere T7 RNA Polymerase zugegeben, um die Synthese als eine gekoppelte Transkription/ Translation ablaufen zu lassen. Die Reaktionsansätze können sowohl im Batch- als auch im Dialyse-Verfahren durchgeführt werden. Die Reaktionssätze können zwischen 30 min und 48 h durchgeführt werden (vorzugsweise 4 h). Mit den erfindungsgemäß zellfrei hergestellten UPOs können Einzel- bis Hochdurchsatz-Screenings mit Substraten durchgeführt werden, die relevant sind, zum Beispiel für die Verwendung in der pharmazeutischen und chemischen Industrie. Dabei kann die zellfrei hergestellte UPO gereinigt oder ungereinigt eingesetzt sein. Die erfindungsgemäß zellfrei hergestellten Proteine UPOs können mit bekannten proteinchemischen Verfahren wie hydrophobe Interaktionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie oder mit speziellen Tags über Affinitätschromatographie isoliert und gereinigt werden. Erfindungsgemäße UPOs katalysieren ähnliche Reaktionen wie die P450-Monooxygenasen, insbesondere den Einbau eines Sauerstoffatoms in das Substrat in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels, vorzugsweise in gepufferten wässrigen Lösungen. Die katalysierten Reaktionen umfassen Sauerstofftransferreaktion von Hydroperoxiden in organischen Molekülen vom Kohlenwasserstofftyp bestehend aus aromatischen, aliphatischen, linearen, zyklischen, und verzweigten Kohlenwasserstoffen sowie Strukturanaloga. Bevorzugt sind erfindungsgemäß Verfahren zur oxidativen Umsetzung von Substraten, insbesondere Hydroxylierung und Epoxidierung, um Produkte mit verbesserten oder gewünschten Eigenschaften zu erhalten, wie die Synthese von Agrochemikalien, Herbiziden, Insektiziden, Medikamenten, Kosmetika, Klebstoffe, Farbstoffe. Als Cosubstrat für die Oxyfunktionalisierungsreaktion wird lediglich ein Hydroperoxid (R-OOH), bevorzugter Weise Wasserstoffperoxid (H ₂ O ₂ ) benötigt. Die durch das vorliegende Verfahren hergestellten UPOs werden in einer geringen Konzentration von 0,01 U mL ^-1 bis 10 U mL ^-1 eingesetzt, wobei eine Konzentration zwischen 1 und 5 U mL ^-1 für die Oxyfunktionalisierung von organischen Verbindungen optimal ist (1 Unit setzt 1 µmol Veratrylalkohol pro Minute um). Die Konzentration des Substrates liegt im vorliegenden Verfahren zwischen 0,1 und 10 mM, wobei zwischen 0,2 und 5 mM, besonders zwischen 0,5 und 2 mM bevorzugt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in wässrigen, gepufferten Lösungen durchgeführt. Dem Reaktionsgemisch können hierbei zur Stabilisierung des pH- Wertes Puffer wie Phosphate oder organische Säuren, vorzugsweise Zitronensäure, zugesetzt werden. Die Pufferkonzentration liegt dabei bevorzugt zwischen 1 mM bis 100 mM, insbesondere zwischen 10 bis 20 mM. Das Reaktionsverfahren wird bei pH-Werten von 3 bis 10, vorzugsweise bei 5 bis 8, insbesondere bei pH 7 durchgeführt. Zur Verbesserung der Löslichkeit des Substrates können dem Reaktionsgemisch organische Lösungsmittel zugesetzt werden. Bevorzugt sind dabei mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie Alkohole, Aceton und Acetonitril. Die Konzentration des Lösungsmittels liegt dabei in den Bereichen von 1-90 % (v/v), besonders bevorzugt von 2-50 % (v/v), insbesondere von 5-30 % (v/v). Als Oxidationsmittel wird vorzugsweise Wasserstoffperoxid (H ₂ O ₂ ) verwendet. Dadurch kann im vorliegenden Verfahren auf kostenintensive Cosubtrate, wie NADH oder NADPH als Elektronendonor, verzichtet werden. Zusätzliche Elektronen- Transportproteine und regulatorischen Proteine (Flavin- Reduktasen, Ferredoxine), wie im P450-System, werden nicht benötigt. In Reaktionen mit durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten UPOs kann das Cosubstrat einmalig, stufenweise oder kontinuierlich dosiert werden. Die dosierte H ₂ O ₂ - Konzentration liegt dabei zwischen 0,1 und 20 mM pro Stunde, bevorzugt zwischen 0,5 mM und 5 mM, ganz besonders zwischen 1- 3 mM pro Stunde. Alternativ können organische Hydroperoxide (R-OOH, z. B. tert- Butylhydroperoxid), Peroxycarbonsäuren (R-COOOH, z. B. meta- Chlorperbenzoesäure) oder Wasserstoffperoxid-Addukte (z. B. Carbamidperoxid) eingesetzt werden. Die Verwendung von UPOs ermöglicht eine Ausführungsform bei Normaldruck und Temperaturen von 4 - 40 °C, besonders bei 15 - 35 °C, insbesondere bei 20 – 30 °C. Die enzymatische Umsetzung ist in der Regel innerhalb von 24 Stunden beendet, bevorzugt innerhalb von 5 Minuten bis 4 Stunden, besonders bevorzugt in 30 Minuten bis 3 Stunden. Reaktionen mit durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten UPOs können in einer Einstufen-Reaktion durchgeführt und die erhaltenen Produkte gegebenenfalls gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Filtration, Destillation, Rektifikation, Chromatographie, Behandlung mit Ionenaustauschern, Adsorbentien oder Kristallisation. Bevorzugt werden die Produkte mittels Flüssig-Flüssig- Extraktion und chromatographischer Trennverfahren isoliert und gereinigt. Die Erfindung soll nachstehend anhand der Beispiele und Abbildungen näher erläutert werden, ohne jedoch die Erfindung auf diese Beispiele und Abbildungen zu begrenzen. Beispiele und Abbildungen Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlicher unter Bezugnahme auf Beispiele und Abbildungen erläutert. Die Beispiele beinhalten die zellfreie Herstellung einer langen UPO aus Agrocybe aegerita (syn. Cyclocybe aegerita; kurz AaeUPO), die zellfreie Herstellung einer genetisch modifizierten Variante der erstgenannten UPO (AaeUPO PaDa-I), sowie die zellfreie Herstellung einer kurzen UPO aus Marasmius rotula (MroUPO). Bezugsbeispiel 1 – Herstellung der Zellextrakte 1) Kultivierung der Pilze Beispiel 1 Aspergillus niger Die Kultivierung von Aspergillus niger (DSM 11167) erfolgte in 500 mL Erlenmeyerkolben, die jeweils 100 mL 2HA-MS Medium (nach Nieland et al, 2021; jedoch ohne Antischaummittel) enthielten. Nach der Inokulation mit je einem Tropfen Sporensuspension (3*10 ⁸ Sporen/mL Glycerol) wurden die Kolben auf dem Rotationsschüttler bei 30 °C für 24 h bei 150 rpm inkubiert. Beispiel 2 Neurospora crassa Die Kultivierung von Neurospora crassa (DSM 1257) erfolgte in 500 mL Erlenmeyerkolben, die jeweils 200 mL HA-Vollmedium (Nieland und Stahmann, 2013; 10 g/L Glukose und 10 g/L Hefeextrakt) enthielten. Nach der Inokulation mit je einem Tropfen Sporensuspension (10 ⁷ Sporen/mL Glycerol) wurden die Kolben auf dem Rotationsschüttler bei 34 °C für 48 h bei 120 rpm inkubiert. 2) Herstellung der Zellextrakte für die zellfreie Proteinsynthese Beispiel 1 Aspergillus niger Geerntet wurde das, wie unter (1) kultivierte, Mycel durch Abnutschen mit einem Büchnertrichter (bestückt mit VWR Filterpapier 413) und zweimaligem Waschen mit jeweils 50 mL 4 °C kaltem Mannitolpuffer A (Hodgman und Jewett, 2013). Aus 200 ml Medium wurden von A. niger 5,14 g Biomasse (Frischgewicht) geerntet. Hiernach wurde das Mycel jeweils mit 1,5 mL Lysepuffer A (Hodgman und Jewett, 2013) pro g Frischgewicht suspendiert und anschließend bei 4 °C mittels Hochdruckzellaufschluss (HTU Digi-F-Press, Hersteller G. Heinemann Ultraschall- und Labortechnik) mit 10.000 psi aufgeschlossen. Bei allen Schritten wurde möglichst zügig und so weit wie möglich auf Eis gearbeitet. Das aufgeschlossene Mycel wurde bei 4 °C und 6500 g für 5 Minuten zentrifugiert. Mit dem Überstand wurde erneut auf die gleiche Weise verfahren. Zur Entfernung der endogenen mRNA aus dem Überstand erfolgte anschließend eine Vorbehandlung des Rohlysates bei Zimmertemperatur für 10 min mit Micrococcal Nuclease (Thermo Scientific) in Anlehnung an Hodgman und Jewett, 2013. Der so behandelte Extrakt kann aliquotiert mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert werden. Beispiel 2 Neurospora crassa Geerntet wurde das, wie unter (1) kultivierte, Mycel durch Abnutschen mit einem Büchnertrichter (bestückt mit VWR Filterpapier 417) und zweimaligem Waschen mit jeweils 50 mL 4 °C kaltem Mannitolpuffer A (Hodgman und Jewett, 2013). Aus 200 mL Medium wurden von N. crassa 6 g Biomasse (Frischgewicht) geerntet. Hiernach wurde das Mycel jeweils mit 1,5 mL Lysepuffer A (Hodgman und Jewett, 2013) pro g Frischgewicht resuspendiert und anschließend bei 4 °C mittels Hochdruckzellaufschluss (HTU Digi-F-Press, Hersteller G. Heinemann Ultraschall- und Labortechnik) mit 5.000 Psi aufgeschlossen. Das weitere Vorgehen erfolgte analog zu Beispiel 1 Aspergillus niger. Bezugsbeispiel 2 – Herstellung von Nukleinsäuretemplat Beispiel 1 Herstellung von mRNA AaeUPO-His 1) Herstellung eines DNA-Templats für die in vitro Transkription Es wurde ein Plasmid generiert, das aus dem pYES2-Vektor und der Saccharomyces cerevisiae-Codon optimierten Sequenz für die Wildtyp-UPO AaeUPO mit Signal- und Propeptid und einem C- terminalen His ₆ -Tag (synthetisiert von GeneArt) besteht. Upstream vom AaeUPO-Gen befindet sich ein Promotor für die T7 RNA Polymerase. Für die Run-off Transkription wurde das Plasmid mit der Restriktionsendonuclease BstEII linearisiert und anschließend mittels Chromatographie gereinigt. 2) In vitro Transkription Das im obigen Abschnitt (1) hergestellte DNA-Fragment mit T7- Promotor und AaeUPO His-Gen wurde als Templat in einer in vitro Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs mit dem HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit (with tailing) durchgeführt. Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt. Auf diese Art wurden 26 µg 5‘-gecappte, polyadenylierte AaeUPO-His mRNA erhalten, verifiziert durch Extinktionsmessung bei 260 nm. Beispiel 2 Herstellung von mRNA AaeUPO PaDa-I-His 1) Herstellung eines DNA-Templats für die in vitro Transkription Es wurde ein Plasmid generiert, das aus dem pYES-DEST52-Vektor und der Saccharomyces cerevisiae-Codon optimierten Sequenz für die UPO-Mutante AaeUPO PaDa-I mit Signal- und Propeptid (Molina-Espeja et al., 2015; synthetisiert von GeneArt) besteht. Upstream vom AaeUPO PaDa-I-Gen befindet sich ein Promotor für die T7 RNA Polymerase. Mittels PCR (98 °C, 10 s, 63 °C, 20 s und 72 °C, 35 s über 30 Zyklen) wurde eine AaeUPO PaDa-I-Variante mit C-terminalen His ₆ -Tag unter Verwendung des zuvor genannten Plasmids, eines Primers (T7-PaDa_fw) mit einer in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Basensequenz und eines Primers (6HisPaDa_rev) mit einer in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Basensequenz hergestellt. Das DNA-Fragment wurde mittels Chromatographie gereinigt. 2) In vitro Transkription und Polyadenylierung Das im obigen Abschnitt (1) hergestellte DNA-Fragment mit T7- Promotor und AaeUPO PaDa-I-His-Gen wurde als Templat in einer in vitro Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs mit dem HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit durchgeführt. Die Transkriptionsreaktion wurde 2,5 h lang bei 37 °C inkubiert. Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt. Für die Polyadenylierung am 3‘-Ende der zuvor beschriebenen RNA wurden nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs E. coli Poly (A) Polymerase, 1x E. coli Poly(A) Polymerase Reaktionspuffers, 1 mM ATP und 53 µg der AaeUPO PaDa-I-His RNA verwendet. Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt. Auf diese Art wurden 73 µg polyadenylierte AaeUPO PaDa-I-His mRNA erhalten, verifiziert durch Extinktionsmessung bei 260 nm. Beispiel 3 Herstellung von mRNA MroUPO-His 1) Herstellung eines DNA-Templats für die in vitro Transkription Es wurde ein Plasmid generiert, das aus dem pYES2-Vektor und der Saccharomyces cerevisiae-Codon optimierten Sequenz für die Wildtyp-UPO MroUPO mit Signalpeptid und einem C-terminalen His ₆ -Tag (synthetisiert von GeneArt) besteht. Upstream vom MroUPO-Gen befindet sich ein Promotor für die T7 RNA Polymerase. Für die Run-off Transkription wurde das Plasmid mit der Restriktionsendonuclease BstEII linearisiert und anschließend mittels Chromatographie gereinigt. 2) In vitro Transkription Das im obigen Abschnitt (1) hergestellte DNA-Fragment mit T7- Promotor und MroUPO-His-Gen wurde als Templat in einer in vitro Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde nach den Vorgaben des Herstellers New England Biolabs mit dem HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit (with tailing) durchgeführt. Die gebildete RNA wurde mittels Chromatographie gereinigt. Auf diese Art wurden 30 µg 5‘-gecappte, polyadenylierte MroUPO-His mRNA erhalten, verifiziert durch Extinktionsmessung bei 260 nm. Bezugsbeispiel 3 – Herstellung von UPO im zellfreien System Für die zellfreie Herstellung von UPO wurden die nach Bezugsbeispiel 1 Beispiel 1 Aspergillus niger und Beispiel 2 Neurospora crassa gefertigten Zellextrakte und die nach Bezugsbeispiel 2 Beispiel 15‘-Cap/ Poly(A) AaeUPO-His, Beispiel 2 Poly(A) AaeUPO PaDa-I-His und Beispiel 35‘-Cap/ Poly(A) MroUPO-His gefertigten mRNAs und Poly(A) AaeUPO PaDa- I mRNA ohne C-terminalen His ₆ -Tag verwendet. Für die letztgenannte mRNA wurde das in Bezugsbeispiel 2 Beispiel 2 aufgeführte Plasmid mit der Restriktionsendonuclease PmeI für run-off Transkription linearisiert und gereinigt. Die anschließende in vitro Transkription und Polyadenylierung wurde wie in Bezugsbeispiel 2 Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. [Zusammensetzung der zellfreien Translationsreaktionen] - 25 % Translationsmix, bestehend aus: Energiemix (80 mM HEPES; 4 mM ATP; 0,4 mM GTP; 8 mM DTT; 80 mM Kreatinphosphat); 200 mM Kaliumacetat; 4,8 mM Magnesiumacetat; 0,24 mg/ml tRNA aus Hefe; Aminosäuremischung (jede Aminosäure 0,08 mM); 0,24 U/µl Kreatinphosphokinase; 3 U/µl RNase Inhibitor (Hersteller applied biosystems) - 28 nM mRNA - 50 % Zellextrakt - DEPC-behandeltes Wasser (Hersteller Carl Roth) Die Inkubation erfolgte bei 18 °C für 270 min. Experimentelles Beispiel Die Herstellung der Wildtyp-UPO AaeUPO, der AaeUPO-Variante PaDa-I mit His ₆ -Tag und der MroUPO nach Bezugsbeispiel 3 wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließendem Western Blot nachgewiesen. Die Proteinkonzentrationen in den Translationsreaktionen ohne mRNA, mit AaeUPO-His mRNA, mit AaeUPO PaDa-I-His mRNA beziehungsweise AaeUPO PaDa-I mRNA ohne C-terminalen His ₆ -Tag und mit MroUPO-His mRNA wurden mittels BCA-Assay bestimmt. Von jedem Reaktionsansatz wurden 20 µg Protein auf ein 10 %-iges BisTris-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit einem MES-Puffer durchgeführt. In einem Semidry Blot Verfahren wurden die Proteine auf eine PVDF Membran transferiert. Der Primärantikörper gegen den His ₆ -Tag war ein monoklonaler Maus 6x-His Tag Antikörper vom Hersteller Invitrogen. Die Detektion erfolgte über einen anti-Maus Sekundärantikörper, an den eine Meerrettichperoxidase gekoppelt war, deren katalytische Aktivität ein Chemilumineszenzsignal generiert (Abb. 1). Die Lokalisation der UPOs in den Mikrosomen wurde durch Fraktionierung der zellfrei-Reaktionsansätze mittels Zentrifugation bei 16.000 g, 4 °C für 10 min geprüft. Die Überstände wurden in neue Reaktionsgefäße überführt und das Pellet, das die Mikrosomen enthält, wurde in DEPC-behandeltem Wasser mit dem gleichen Volumen wie der Überstand resuspendiert. Das Vorhandensein von Glykosylierung an den zellfrei hergestellten UPOs wurde mittels Deglykosylierung mit dem Protein Deglycosylation Mix II des Herstellers New England Biolabs geprüft. Die unbehandelten und deglykosylierten Fraktionen wurden wie oben beschrieben mittels Western Blot analysiert (Abb. 2). Bezugsbeispiel 4 – Oxyfunktionalisierung von Propranolol Die selektive Oxyfunktionalisierung von Propranolol zu 5- Hydroxypropranolol (5-OHP) erfolgte mit zellfrei hergestellter UPO (Abb. 2). Für die enzymatische Synthese von 5-OHP wurden in einem 200 µL-Ansatz 20 µL Reaktionsmedium der zellfreien UPO-Synthese in 180 µL Reaktionslösung gegeben. Die Reaktionslösung enthielt folgende Komponenten: 800 µM Propranolol (Hydrochlorid), 1 mM Wasserstoffperoxid, 5 mM Ascorbat und 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0). Das Reaktionsgemisch wurde für 5 min bei 25 °C und 800 rpm im Thermoschüttler inkubiert. Nachfolgend wurden die Reaktionsansätze durch Zugabe von 200 µl Acetonitril (-20 °C) abgestoppt und für 10 min zentrifugiert. Die Überstände wurden mittels HPLC-MS und den folgenden Bedingungen analysiert: Die chromatografische Trennung für die LC-MS-Experimente erfolgte mit einem Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC-System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit einer Kinetex®-Säule (C18, 5 µm, 100 Å, 150 x 2,1 mm, Phenomenex). Das Injektionsvolumen betrug 1 µL und die Säule wurde bei einer Flussrate von 0,5 mL/min und 40 °C mit zwei mobilen Phasen A (diH2O, 0,1 % Ameisensäure) und B (Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) und folgendem Gradienten eluiert: 0 min 10 % B; 1 min, 10 % B; 6 min, 80 % B; 7 min, 80 % B; 7.1 min, 10 % B; 10 min, 10 % B. MS- und MS ² -Spektren wurden mit einem Thermo Scientific Q Exactive Plus Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Electron, Waltham, MA, USA), das mit einer beheizten Elektrospray-Ionisationsquelle im positiven Modus ([M+H] ⁺ ) gekoppelt ist, aufgenommen. Die Betriebsparameter waren wie folgt: Die Durchflussrate des Mantelgases und des Hilfsgases betrug 60 bzw. 15 (willkürliche Einheit); die Sprühspannung 4,0 kV; die Temperatur der Kapillare und des Hilfsgasheizers betrug 320 °C bzw. 400 °C; das hochauflösende MS wurde im Full-Scan-Modus mit einem Massenbereich von m/z 150-1.500 bei einer Auflösung von 70.000 (m/z 200) betrieben. Die MS ² -Daten mit einer Auflösung von 35.000 wurden im Modus der parallelen Reaktionsüberwachung (PRM) erhalten, ausgelöst durch eine Liste von den vorausgewählten Parentionen von Propranolol und 5-Hydroxypropranolol (C ₁₆ H ₂₂ NO ₂ ⁺ & C ₁₆ H ₂₂ NO ₃ ⁺ ). Die Kollisionsenergie lag bei CE15. Die detektierten Aktivitäten der in Bezugsbeispiel 3 zellfrei hergestellten UPOs cfAaeUPO, cfAaeUPO PaDa-I und cfAaeUPO PaDa-I-His sind in Abbildung 3 dargestellt. Bezugsbeispiel 5 – Substratscreening mit ungereinigter zellfrei hergestellter UPO Die enzymatische Umsetzung von analytischen UPO-Substraten (Veratrylalkohol; 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid [ABTS]; 5-Nitrobenzodioxol [NBD]; Naphthalen) und Pharmazeutika (Propranolol, Diclofenac and Clopidogrel) erfolgte mit ungereinigter, zellfrei hergestellter UPO. Für die Reaktionen mit den analytischen Substraten wurden in einem 200 µL-Ansatz 10 µL Reaktionsmedium der zellfreien UPO- Synthese in 190 µL Reaktionslösung gegeben. Die Reaktionslösung enthielt folgende Komponenten: 5 mM Veratrylalkohol oder 0,6 mM ABTS oder 0,5 mM NBD oder 1 mM Naphthalen, 2 mM Wasserstoffperoxid und 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0 oder pH 4,5 bei ABTS). Die gebildeten Produkte aus den analytischen Substraten wurden mit einem Mikrotiterplattenphotometer gemessen (CLARIOstar Plus, BMG Labtech, Ortenberg, Germany): Umsetzung von Veratrylalkohol zu Veratralaldehyd (ε310 = 9,300 M-1 cm-1); Bildung des ABTS Radikals (ε420 = 36,000 M-1 cm-1), Umsetzung von NBD zu 5- Nitrocatechol (ε425 = 9,700 M-1 cm-1) und Umsetzung von Naphthalen zu 1-Naphthtol (ε303 = 9,700 M-1 cm-1). Die Messung der Reaktionskinetik erfolgte über 30 sec bei Raumtemperatur. Die Reaktionen mit den Pharmazeutika und die Detektion der Reaktionsprodukte (Abb. 4) wurden, wie in Bezugsbeispiel 4 für Propranolol beschrieben, durchgeführt. Die detektierten Aktivitäten der in Bezugsbeispiel 3 mit N. crassa-Zellextrakt zellfrei hergestellten AaeUPO-His und MroUPO-His sind in Tabelle 1 gelistet. Die Enzymaktivitäten sind in U/ L angegeben, wobei 1 U der Bildung von 1 µmol Produkt pro min entspricht. Tab. 1 Die Tabelle zeigt die Enzymaktivität von zellfrei hergestellter AaeUPO-His und zellfrei hergestellter MroUPO-His mit verschiedenen Substraten. n.b. - nicht bestimmt Primer Sequenzen (PCR) SEQ ID Nr. 1 5‘-AGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGG-3‘ SEQ ID Nr. 2 5‘-TTTTTTTTCTCAATGGTGATGGTGATGATGATCTCTACCATATGGAAAAACTTGA G-3‘ Beschreibungen der Abbildungen Abb. 1 Anti-His-tag Western Blot Analyse von zellfrei und zellbasiert hergestellter Wildtyp-UPO AaeUPO-His, der UPO- Mutante AaeUPO PaDa-I mit C-terminalem His ₆ -Tag und der MroUPO. (1) Ni-NTA gereinigte AaeUPO PaDa-I-His aus S. cerevisiae Kulturüberstand (2)-(8) zellfreie Proteinsynthese: (2) Kontrolle ohne mRNA (3) AaeUPO PaDa-I-His mRNA (4) interne Kontrolle (5) AaeUPO PaDa-I mRNA-His (6) MroUPO-His mRNA (7) Wildtyp-UPO AaeUPO-His mRNA (8) Kontrolle ohne mRNA (9) MagicMark™ XP Western Protein. Abb. 2 Anti-His-tag Western Blot Analyse von zellfrei und zellbasiert hergestellter Wildtyp-UPO AaeUPO-His zur Analyse der Lokalisation und Glykosylierung. (1) MagicMark™ XP Western Protein; Überstand AaeUPO-His (2) unbehandelt, (3) deglykosyliert; Pellet AaeUPO-His (4) unbehandelt, (5) deglykosyliert; Kontrollansatz ohne mRNA (6) unbehandelt, deglykosyliert (7); Ni-NTA gereinigte AaeUPO PaDa-I-His aus S. cerevisiae Kulturüberstand (8) unbehandelt, (9) deglykosyliert. Abb. 3 Selektive Oxyfunktionalisierung von Propranolol durch zellfreie UPOs (cfUPO). Abb. 4 Das Diagramm zeigt die Peakflächen-Intensitäten im Extracted-Ion-Chromatogramm (EIC) für 5-Hydroxypropranolol (C ₁₆ H ₂₂ NO ₃ ⁺ ). Die zellfrei-Reaktionsansätze wurden wie im Bezugsbeispiel 4 für die Umsetzung von Propranolol eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden 50 mU/mL (Veratrylalkohol) AaeUPO eingesetzt. Abb. 5 Die Abbildung zeigt die Oxyfunktionalisierung von Diclofenac und Clopidogrel durch zellfreie UPO (cfUPO) beziehungsweise durch zellfreie AaeUPO (cfAaeUPO).