Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe- nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschal- tet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Ge- ne in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Pro- ben. Das Verfahren kann gleichzeitig auch zum Nachweis von Punktmutationen und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) genutzt werden.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei- spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti- on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese.

Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Inte- resse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewan- delt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch"normale"molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersu- chende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit rea- giert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs-und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996,24, 5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen un- tersucht werden, was das Potential der Methode veran- schaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regio- nen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine glo- bale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese ge- hen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden : Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998,26,2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997,5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett se- quenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997,17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997,25,2529-2531, WO 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997,25,2532-2534) nachgewiesen. Zu- dem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrie- ben worden (Olek et al., WO 9928498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi- sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind : Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25,2532 ; Gonzalgo, M. L. und Jones, P.

A. (1997), Nucl. Acids Res. 25,2529 ; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16,431 ; Zeschnik, M. et al.

(1997), Human Molecular Genetics 6,387 ; Teil, R. et al.

(1994), Nucl. Acids Res. 22,695 ; Martin, V. et al.

(1995), Gene 157,261 ; WO 9746705 und WO 9515373.

Eine Obersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 er- schienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Gene- tics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Es existieren verschiedene Verfahren um DNA zu immobili- sieren. Das bekannteste Verfahren ist die Festbindung ei- ner DNA, welche mit Biotin funktionalisiert ist, an eine Streptavidin-beschichtete Oberfläche (Uhlen, M. et al.

1988, Nucleic Acids Res. 16,3025-3038). Die Bindungs-

stärke dieses Systems entspricht der einer kovalenten chemischen Bindung ohne eine zu sein. Um eine Ziel-DNA kovalent an eine chemisch vorbereitete Oberfläche binden zu können, bedarf es einer entsprechenden Funktionalität der Ziel-DNA. DNA selbst besitzt keine Funktionalisie- rung, die geeignet ist. Es gibt verschiedene Varianten, in eine Ziel-DNA eine geeignete Funktionalisierung einzu- führen : Zwei leicht zu handhabende Funktionalisierungen sind primäre, aliphatische Amine und Thiole. Solche Amine werden quantitativ mit N-Hydroxysuccinimidestern umge- setzt, und Thiole reagieren unter geeigneten Bedingungen quantitativ mit Alkyliodiden. Eine Schwierigkeit besteht im Einführen einer solchen Funktionalisierung in eine DNA. Die einfachste Variante ist die Einführung durch ei- nen Primer einer PCR. Gezeigte Varianten benutzen 5'- modifizierte Primer (NH2 und SH) und einen bifunktionalen Linker.

Ein wesentlicher Bestandteil der Immobilisierung auf ei- ner Oberfläche ist ihre Beschaffenheit. Bis jetzt be- schriebene Systeme sind hauptsächlich aus Silizium oder Metall. Eine weitere Methode zur Bindung einer Ziel-DNA basiert darauf, eine kurze Erkennungssequenz (z. B. 20 Basen) in der Ziel-DNA zur Hybridisierung an ein oberflä- chenimmobilisiertes Oligonukleotid zu verwenden. Es sind auch enzymatische Varianten zur Einführung von chemisch aktivierten Positionen an eine Ziel-DNA beschrieben wor- den. Hier wird an einer Ziel-DNA enzymatisch eine 5'-NH2- Funktionalisierung durchgeführt.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden.

Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein

Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Neuere Verfahren zum Nachweis von Mutationen sind im fol- genden aufgeführt : Als ein Spezialfall der Sequenzierung ist die Einzelba- sen-Primer-Erweiterung (Genetic Bit Analysis) erwähnen- wert (Head, SR., Rogers, YH., Parikh K., Lan, G., Ander- son, S., Goelet, P., Boycejacino MT., Nucleic Acids Re- search. 25 (24) : 5065-5071,1997 ; Picoult-Newberg, L., Ge- nome Res. 9 (2) : 167-174,1999). Eine kombinierte Amplifi- kation und Sequenzierung wird in US-A1 5928906 beschrie- ben, wo eine basenspezifische Terminierung auf Matrixmo- lekülen eingesetzt wird. Ein weiteres Verfahren setzt ei- ne Ligase/Polymerasereaktion für die Identifikation von Nukleotiden ein (US-A1 5952174).

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons.

Anal. Chem. 60 : 2299-2301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten er- reicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt.

Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

Maldi eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Mat- rix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectro-

metry. Molecular Biology : Current Innovations and Future Trends 1 : 147-157.) Für Nucleinsäuren ist die Empfind- lichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab.

Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Mat- rix wesentlich ineffizienter. Für MALDI spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorpti- on von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation er- geben. Für DNA gibt es zwar mittlererweile einige anspre- chende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlich- keitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeits- unterschied kann verringert werden, indem die DNA che- misch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnli- cher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylie- rungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23 : 1367-1373). Die Kopplung eines"charge tags,, an diese modifizierte DNA resultiert in der Steige- rung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging"ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe-oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.

Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning : A Laborato- ry Manual, 1989.

Gemeinsamkeiten zwischen Promotoren bestehen nicht nur im Vorkommen von TATA-oder GC-Boxen sondern auch darin, für welche Transkriptionsfaktoren sie Bindestellen besitzen und in welchem Abstand diese sich zueinander befinden.

Die existierenden Bindestellen für ein bestimmtes Protein stimmen in ihrer Sequenz nicht vollständig überein, es finden sich aber konservierte Folgen von mindestens 4 Ba- sen, die durch das Einfügen von"Wobbles", d. h. Positio- nen, an denen sich jeweils unterschiedliche Basen befin- den, noch verlängert werden können. Des weiteren liegen diese Bindestellen in bestimmten Abständen zueinander vor.

Die Verteilung der DNA im Interphase-Chromatin, das den größten Teil des nuklearen Volumens einnimmt, unterliegt jedoch einer ganz speziellen Ordnung. So ist die DNA an mehreren Stellen an die nukleare Matrix, eine filamentöse Struktur an der Innenseite der nuklearen Membran, ange- heftet. Diese Regionen bezeichnet man als matrix attach- ment regions (MAR) oder scaffold attachment regions (SAR). Das Anheften hat wesentlichen Einfluß auf die Transkription bzw. die Replikation. Diese MAR-Fragmente weisen keine konservativen Sequenzen auf, bestehen aller- dings zu 70t aus A bzw. T und liegen in der Nähe von cis- agierenden Regionen, die die Transkription allgemein re- gulieren, und Topoisomerase II-Erkennungsstellen.

Neben Promotoren und Enhancern existieren weitere regula- torische Elemente für verschiedene Gene, sogenannte Insu- lators. Diese Insulators können z. B. die Wirkung des En- hancers auf den Promotor inhibieren, wenn sie zwischen Enhancer und Promotor liegen, oder aber, zwischen Hete- rochromatin und einem Gen gelegen, das aktive Gen vor dem Einfluß des Heterochromatins schützen. Beispiele für sol- che Insulators sind : 1. sogenannte LCR (locus control re- gions), welche aus mehreren gegenüber DNAase I hypersen-

sitiven Stellen besteht ; 2. bestimmte Sequenzen wie SCS (specialized chromatin structures) bzw. SCS', 350 bzw.

200 bp lang und hoch-resistent gegen Degradierung durch DNAase I und auf beiden Seiten von hypersensitiven Stel- len flankiert (Abstand je 100 bp). An scs'bindet das Protein BEAF-32. Diese Insulators können auf beiden Sei- ten des Gens liegen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitstellen, welches sich zum gleichzeitigen Detektie- ren von Cytosin-Methylierungen und SNPs in genomischen DNA-Proben besonders eignet. Dabei soll bevorzugt eine Vielzahl von Fragmenten gleichzeitig untersucht werden können.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin in genomischen DNA-Proben gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausführt : (a) man setzt eine genomische DNA aus einer DNA-Probe mit einem Reagenz chemisch um, wobei 5-Methylcytosin und Cy- tosin unterschiedlich reagieren und diese somit nach der Reaktion ein unterschiedliches Basenpaarungsverhalten in der DNA Duplex zeigen ; (b) man amplifiziert vorbehandelte DNA unter Verwendung einer Polymerase und mindestens einem Oligonukleotid (Typ A) als Primer ; (c) man hybridisiert die amplifizierte genomische DNA an mindestens ein Oligonukleotid (Typ B) mit bekannter Se- quenz von n Nucleotiden unter Ausbildung einer Duplex, wobei besagte hybridisierte Oligonukleotide des Typs B mit ihrem 3'-Ende teilweise oder vollständig an die Posi- tionen hybridisieren, die hinsichtlich ihrer Methylierung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind ; (d) man verlängert das Oligonukleotid (Typ B), sofern es mit seinem 3'Terminus zuvor ohne Basenfehlpaarungen an der zu untersuchenden Position hybridisierte, mittels ei-

ner Polymerase mindestens um ein Nukleotid, wobei mindes- tens ein Nukleotid eine nachweisbare Markierung trägt und die Verlängerung vom Methylierungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe abhangt ; (e) man untersucht die verlängerten Oligonukleotide wer- den auf das Vorhandensein der Markierung.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Oligo- nukleotide (Typ B) an definierten Stellen an eine Fest- phase bindet oder dass man die Amplifikate an definierten Stellen an eine Festphase bindet.

Bevorzugt ist es ferner, dass man unterschiedliche Oligo- nukleotidsequenzen auf einer ebenen Festphase in Form ei- nes rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet.

Weietrhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Alu- minium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

Bevorzugt ist auch, dass die an den verlängerten Oligo- nukleotiden angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz be- findet, identifizierbar sind.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass bei der Amplifika- tion mindestens ein Primer (Typ A) an eine Festphase ge- bunden ist.

Außerdem kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, dass man unterschiedliche Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters anordnet.

Ganz besonders bevorzugt ist es, dass man die Behandlung der DNA vor der Amplifikation mit einer Bisulfitlösung (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.

Insbesondere ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt.

Es ist ferner erfindungsgemäß besonders bevorzugt dass die verwendeten Oligonukleotide des Typs A entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten.

Bevorzugt ist es ferner, dass die Markierungen der Nukle- otide Fluoreszenzmarkierungen sind.

Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Mar- kierungen der Nukleotide Radionuklide sind.

Besonders bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Nukleotide ablösbare Massenmarkierungen sind, die in ei- nem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

Weietrhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die verlängerten Oligonukleotide insgesamt im Massenspektro- meter nachweist und somit durch ihre Masse eindeutig mar- kiert sind. Besonders bevorzugt ist es auch, dass man je- weils ein Fragment der verlängerten Oligonukleotide im Massenspektrometer nachweist.

Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass man das Fragment des verlängerten Oligonukleotids durch Verdau mit einer oder mehrerer Exo-oder Endonukleasen erzeugt.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es ferner, dass zur besse- ren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten

Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettola- dung aufweisen.

Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Detektion der verlängerten Oligonukleotide mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Mas- senspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Mas- senspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.

Es ist weiterhin erfindungsgemäß ein Verfahren bevorzugt, wobei die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen sind.

Bevorzugt ist erfindungsgemäß auch ein Verfahren, wobei man zusätzlich zur DNA-Methylierung auch SNPs detektiert und visualisiert.

Es ist ferner ein Verfahren bevorzugt, wobei die einge- setzten Nukleotide terminierende (Typ C 2) und/oder ket- tenverlängernde Nukleotide (Typ C 1) sind.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner ein Verfahren, wobei man die Nukleotide (Typ C 1 und C2) aus einer Gruppe aus- wählt, die entweder die Nukleobasen A, T und C oder aber die Basen G und A und T enthält.

Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reak- tionsgefäß durchführt.

Ganz besonders ist ein Verfahren erfindungsgemäß bevor- zugt, wobei die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhal- ten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.

Schließlich ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man Methylierungsanalysen des oberen und unteren DNA-Stranges in einem Experiment durchführt. Die Durchführung der Ana- lysen erfolgt bevorzugt gleichzeitig.

Beschrieben wird also ein Verfahren zum Nachweis von Me- thylcytosin in genomischen DNA-Proben : Die Methode beinhaltet die Amplifikation, Hybridisierung und Verlängerungsreaktion einer gesamten DNA oder eines Fragments hiervon. Die Methode kann benutzt werden zum Nachweis von Methylcytosin und auch gleichzeitig von Sin- gle Nucleotide Polymorphisms (SNPs) und Mutationen.

Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologi- sche Objektträger und alle möglichen Kombinationen hier- von.

Im ersten Schritt des Verfahrens wird die eingesetzte DNA bevorzugt mit Bisulfit, (= Disulfit, Hydrogensulfit) oder aber einer anderen Chemikalie derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosinba- sen so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Ba- senpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, wäh- rend die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Die an- schließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwand- lung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Ura- cil.

Im zweiten Schritt des Verfahrens wird die vorbehandelte DNA bevorzugt unter Verwendung einer hitzebeständigen Po- lymerase und mindestens einem Primer (Typ A) amplifi- ziert.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Amplifikation mit Primern des Typs A mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Amplifikation von mehreren DNA-Fragmenten in einem Reak- tionsgefäß durchgeführt. Dies kann entweder eine soge- nannte Multiplex PCR sein, in der verschiedene Primer je- weils definierte Fragmente erzeugen. Es werden verschie- dene definierte Amplifikationen in einem Reaktionsgefäß durchgeführt. In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens amplifizieren Primer gezielt und reproduzierbar jeweils mehrere Fragmente. Dies kann ent- weder dadurch erzielt werden, dass sie beispielsweise an repetitive Elemente im Genom binden. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens binden die Primer an Transcription Factor Binding Sites, an Promotoren oder andere regulatorische Elemente in Genen. In einer beson- ders bevorzugten Variante des Verfahrens findet die Amplifikation durch Verlängerung von Primers statt, die an eine Festphase gebunden sind. Eine Multiplex-PCR im weiteren Sinne kann dadurch ausgeführt werden, dass un- terschiedliche Primer an verschiedenen, definierten Orten einer Festphase gebunden sind.

In einer wiederum bevorzugten Variante des zweiten Ver- fahrensschrittes ist die Festphase eben, wobei die unter- schiedlichen Oligonukleotidsequenzen in Form eines recht- winkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind. Das hat zur Folge, dass auch die unterschiedlichen Amplifika- te auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder

hexagonalen Gitters angeordnet sind. Wie bereits oben be- schrieben, werden in diesem Fall mehrere Amplifikate di- rekt auf der Festphase erzeugt.

Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Ni- ckel, Silber oder Gold.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthalten die Oligonukleotide des Typs A entweder nur die Basen T, A und C oder nur die Basen T, A und G.

Im dritten Verfahrensschritt wird die amplifizierte geno- mische DNA an mindestens einen Primer (Typ B) unter Aus- bildung einer Duplex hybridisiert. Die hybridisierten 0- ligonukleotide des Typs B binden jeweils an ihrem 3'-Ende an die Positionen, die hinsichtlich ihrer Methylierung in der genomischen DNA-Probe zu untersuchen sind. Dabei kön- nen zwei Fälle unterschieden werden : entweder ist die zu untersuchende Sequenz zu dem Primer auch an seinem 3'- Ende vollständig komplementär, in diesem Fall ist eine Verlängerung des Primers im nächsten Schritt in einer Po- lymerasereaktion möglich, oder aber die Sequenz ist zu der des Primers am 3'-Ende nicht vollständig komplemen- tar, in diesem Fall kann keine Verlängerung des Primers erfolgen. Ist eine bestimmte CpG Position auf Methylie- rung hin zu untersuchen, so gibt es zwei mögliche Zustän- de. Nach der chemischen Vorbehandlung, bevorzugt mit Bi- sulfit, ergibt sich bei Methylierung ein CG, bei Vorlie- gen eines unmethylierten Cytosins ein UG bzw. nach der Amplifikation ein TG. Bevorzugt wird das Experiment in diesem Fall mit zwei unterschiedlichen Primern durchge- führt, die jeweils für einen der Zustände eine vollstän- dige Komplementarität und damit die Möglichkeit zur Ket- tenverlängerung in jeweils einem der beiden möglichen Fälle ergeben.

Sind nicht bereits die Amplifikate an eine Festphase ge- bunden, so können die an die Amplifikate hybridisierten Oligonukleotide mit ihrem 5-Ende oder an einer anderen Base oder über ihr Rückgrat mit einer Festphase verbunden sein, nicht aber über ihr 3-Ende. Bevorzugt erfolgt eine Bindung über das 5-Ende. In einer bevorzugten Variante ist die Festphase eben, wobei die unterschiedlichen Oli- gonukleotidsequenzen (Typ B) in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Ni- ckel, Silber oder Gold.

Im vierten Verfahrensschritt wird das entstandene Oligo- nukleotid mit einer hitzebeständigen Polymerase um min- destens ein bis maximal zehn Nukleotide verlängert, wobei zumindest ein Nukleotid eine nachweisbare Markierung trägt. Die Art der Verlängerung hängt dabei vom Methylie- rungsstatus des jeweiligen Cytosins in der genomischen DNA-Probe ab, oder aber auch von eventuell vorhandenen SNPs, Punktmutationen oder Deletionen, Insertionen und Inversionen.

Prinzipiell sind nur terminierende Oligonuleotide (Typ C2) erforderlich. Je nach Sequenz können jedoch auch ket- tenverlängernde Oligonukleotide verwendet werden, sofern es im jeweiligen Sequenzkontext möglich ist.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens sind die eingesetzten Nukleotide terminierende (Typ C2) und/oder kettenverlängernde Nukleotide (Typ C1). In einer beson- ders bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Nu- kleobasen des Typs Cl und/oder des Typs C2 aus einer

Gruppe ausgewählt, die die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthält.

Die Markierung der verlängerten Oligonukleotide des Typs B erfolgt bevorzugt über absorbierende Farbstoffe und/oder über Chemilumineszenz und/oder über radioaktive Isotope und/oder über Fluoreszenzmarkierungen, die über die im vierten Verfahrensschritt angefügten Nukleotide eingeführt werden. Bevorzugt ist ebenfalls die Markierung über die Molekülmasse des verlängerten Oligonukleotids.

Vorzugsweise wird der Fluoreszenzmarker durch ein fluo- reszenzmarkiertes Nukleotid wie z. B. Cy5-dCTP einge- führt.

Im fünften Verfahrensschritt werden die verlängerten Oli- gonukleotide auf das Vorhandensein einer Markierung un- tersucht. Wird eine ebene Festphase verwendet, so erfolgt eine Analyse an jedem Ort auf der Festphase, an dem ur- sprünglich ein Oligonukleotid immobilisiert wurde.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt der Nachweis der verlängerten Oligonukleotide ü- ber ihre Fluoreszenz.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden Frag- mente des verlängerten Oligonukleotids durch Verdau mit einer oder mehrerer Exo-oder Endonukleasen erzeugt.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Markierungen der Nukleotide ablösbare Massenmar- kierungen, die in einem Massenspektrometer nachweisbar sind.

Ablösbare Massenmarkierungen, die verlängerten Oligo- nukleotide insgesamt oder Fragmente hiervon werden in ei- ner besonders bevorzugten Variante des Verfahrens mittels

Matrix-assistierter Laser-Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-MS) oder mittels Elektronen- spray-Massenspektrometrie (ESI) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen und visualisiert.

Vorzugsweise weisen die im Massenspektrometer detektier- ten Fragmente eine einzelne positive oder negative Netto- ladung auf.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und Cyto- sin-Methylierungen in einem Experiment analysiert.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden der untere und der obere Strang der DNA-Probe nach der chemischen Vorbehandlung in einem Experiment analy- siert, um eine interne experimentelle Kontrolle sicherzu- stellen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, das Chemi- kalien und Hilfsmittel zur Durchführung der Bisulfit- Reaktion und/oder der Amplifikation, der Hybridisierung, der Verlängerungsreaktion und/oder Polymerasen und/oder die Dokumentation zur Durchführung des Verfahrens ent- hält.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung : Beispiel 1 : Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von Exon 23 des Faktor VIII-Gens, in dem eine bestimmte CG- Position auf Methylierung zu untersuchen ist.

Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs A amplifiziert und zwar durch

ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No. : 1) und ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No. : 2). Die amplifizierte DNA wird an ein Oligonukleotid des Typs B (beispielsweise GTTGGATGTTGTTGAGAAACG (SEQ-ID No. : 3)) hybridisiert und in einer Polymerasereaktion mit einem markierten 2', 3'-Didesoxythymidintriphosphat (Typ C2) verlängert. Nur wenn ein CG, das heißt in der ursprüngli- chen genomischen DNA-Probe ein methyliertes Cytosin vor- gelegen hat, kann diese Verlängerung erfolgen, da sonst eine Fehlpaarung am 3'-Ende des Primers die Polymerase- reaktion verhindert. Somit entscheidet der Methylie- rungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins ü- ber die Verlängerung des Primers.

Zur Kontrolle kann die Reaktion mit dem Primer GTTGGATGTTGTTGAGAAATG (SEQ-ID No. : 4) durchgeführt wer- den. In diesem Fall findet die Verlängerung nur dann statt, wenn in der zu untersuchenden DNA-Probe an besag- ter Position ein unmethyliertes Cytosin vorgelegen hat.

Die Label können beispielsweise absorbierende Farbstoffe wie Megaprime für ddTTP oder Rediprime ICI sein.

Beispiel 2 : Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von Exon 23 des Faktor VIII-Gens, in dem eine bestimmte CG- Position auf Methylierung zu untersuchen ist.

Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs A amplifiziert und zwar durch ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No. : 1) und ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No. : 2). Die amplifizierte DNA wird an ein Oligonukleotid des Typs B (beispielsweise GTTGGATGTTGTTGAGAAACG (SEQ-ID No. : 3))

hybridisiert, das mit seinem 5'-Ende an eine Festphasen- oberfläche immobilisiert ist, und in einer Polymerase- reaktion mit einem markierten 2', 3'- Didesoxythymidintriphosphat (Typ C2) verlängert. Nur wenn ein CG, das heißt in der ursprünglichen genomischen DNA- Probe ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kann diese Verlängerung erfolgen, da sonst eine Fehlpaarung am 3- Ende des Primers die Polymerasereaktion verhindert. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu un- tersuchenden Cytosins über die Verlängerung des Primers.

Zur Kontrolle kann die Reaktion mit dem Primer GTTGGATGTTGTTGAGAAATG (SEQ-ID No. : 4) durchgeführt wer- den. In diesem Fall findet die Verlängerung nur dann statt, wenn in der zu untersuchenden DNA-Probe an besag- ter Position ein unmethyliertes Cytosin vorgelegen hat.

Die Label können beispielsweise absorbierende Farbstoffe wie Megaprime für ddTTP oder Rediprime IITM sein.

Beispiel 3 : Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von Exon 23 des Faktor VIII-Gens, in dem eine bestimmte CG- Position auf Methylierung zu untersuchen ist.

Im ersten Schritt wird das Fragment durch Primer des Typs A amplifiziert und zwar durch ATTATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No. : 1) und ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No. : 2). Für diese Amplifikation wurde mit Bisulphit behandelte DNA für 5 min bei 96 °C inkubiert und dann in 40 Zyclen je- weils 55 sec bei 96 °C denaturiert, 75 sec bei 61.7 °C inkubiert (Annealing) und 100 sec bei 72 °C inkubiert (E- longation). In einer anschließenden Reaktion (final Ex-

tension) wird der Reaktionsansatz 15 min bei 72 °C inku- biert. Die amplifizierte DNA wird an die Oligonukleotide AAAAACTACAAAAACTCT (SEQ-ID No. : 5) (Spot 1 in Fig. 1) und AAAAACTACGAAAACTCT (SEQ-ID No. : 6) (Spot 2 in Fig. 1) hybridisiert, die an einer festen Phase immobilisiert sind. Für die Verlängerungsreaktion wird 2'- Desoxythymidintriphosphat (dTTP, als Typ C1), 2'- Desoxyguanosintriphosphat (dGTP, als Typ C1), 2'- Desoxyadenosintriphosphat (dATP, als Typ C1) und 2- Desoxycytidintriphosphat (dCTP, als Typ Cl) benötigt, wo- bei zusätzlich fluoreszenzmarkiertes 2'- Desoxycytidintriphosphat im Verhältnis von 3 : 1 (bezogen auf nicht markiertes 2'-Desoxycytidintriphosphat) zugege- ben wird. Der Reaktionsansatz, bestehend aus dem Amplifi- kat, dem Desoxynukleotidgemisch und lOxPuffer, wird für 15 min bei 96 °C inkubiert. Für die anschließende Primer- Extension-Reaktion wird eine DNA-Polymerase, hier Klenow Fragment, zugesetzt und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 37 °C auf der festen Phase inkubiert. Wie in der folgenden Abbildung zu erkennen, läßt die durchgeführte Primer Extension auf den Methylierungsstatus der DNA schließen. Ein Vergleich von Spot 1 und Spot 2, wie in Fig. 1 dargestellt, erlaubt eine Aussage über den Methy- lierungsstatus : im vorliegenden Fall wird durch die Stär- ke des Signals von Spot 1 ein nicht methyliertes CpG nachgewiesen.