Verfahren zum Nachweis einer Plasmodieninfektion

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Plasmodieninfektion in einer Patientenblutprobe.

Plasmodieninfektionen, wie beispielsweise die durch die Erre- ger Plasmodium falciparum, Piasmodium vivax, Plasmodium ova- le, Plasmodium malariae sowie Plasmodium knowlesi hervorgeru- fenen Malariaerkrankungen, sind weltweit Ursache für Hunderte von Millionen Neuerkrankungen pro Jahr. Nach Zahlen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird mit jährlichen Neuerkran- kungen im Bereich von 300 bis 500 Millionen Personen gerech- net .

Im Hinblick auf die zunehmende Resistenzentwicklung gegenüber den existierenden Arzneistoffen zur Behandlung von Plasmodie- ninfektionen besteht daher ein zunehmender Bedarf an zuverlässigen, preisgünstigen und rasch durchführbaren diagnostischen Verfahren, die zudem falsch-positive und falsch-nega ^¬ tive Ergebnisse weitestgehend ausschließen können. Beispiels ^¬ weise wären in Regionen mit einer niedrigen Prävalenz von Malariainfektionen, hochsensitive diagnostische Verfahren erforderlich, um die wenigen Erkrankten auch als solche zu erkennen .

Hingegen besteht in den Weltregionen mit hoher Prävalenz / Inzidenz, die üblicherweise auch zu den ärmeren Regionen der Welt zählen, ein hoher Bedarf an Testverfahren mit einer hohen Spezifität, um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen (d.h. Gesunde auch als gesund zu erkennen) .

In der Regel besteht zudem das Problem, dass nicht nur eine extrem hohe Anzahl an Patientenproben untersucht werden muss, sondern dass dies - wie oben angesprochen - auch rasch erfolgen muss. Denn die Ergebnisse der Diagnose sollten innerhalb weniger als 2 Stunden verfügbar sein. Falls dies nicht möglich ist, muss der Patient möglicherweise auf Grundlage einer oberflächlichen, klinischen Bewertung behandelt werden. Die Folgen einer fehlerhaften oder falsch-negativen/ falschpositiven Malariadiagnose sind vielfältig: bei einer falsch positiven Diagnose kann der (sinnlose) Einsatz von Arzneimit ^¬ teln vermeidbare Nebenwirkungen mit sich bringen, ganz abgesehen von der finanziellen Belastung für das Gesundheitssys- tem, sowie der Möglichkeit einer Resistenzbildung durch die Plasmodien. In einer Studie aus dem Jahre 2006 wurde ge- schlussfolgert , dass ein diagnostischer Test mit einer Sensi- tivität und Spezifität von jeweils 95 %, der nur minimale Infrastruktur benötigt, mehr als 100.000 Todesfälle und mehr als 400 Millionen unnötige Behandlungen ersparen könnte (Ra- fael ME, Taylor T, Magill A et al . Reducing the bürden of childhood malaria in Africa: The role of improved diagnosis. Nature. 2006; 444 (suppl 1) : 39 - 48) In der Praxis ergibt sich ein Hauptproblem bei der Diagnose von Parasitenerkrankungen, beispielsweise Malaria, dadurch, dass die Labordiagnose erst dann erfolgt, wenn ein klinischer Verdacht auftritt, dass der Patient tatsächlich unter einer derartigen Infektion leidet. Dies kann insbesondere in Regio- nen mit einer niedrigen Prävalenz / Inzidenz dazu führen, dass erkrankte Personen nicht oder nicht rechtzeitig behan ^¬ delt werden. Beispielsweise wurde in einer kanadischen Studie (Kain et al, 1998, Clinics in Infectious Diseases 27, 142 - 149) berichtet, dass bei 59 % aller mit Malaria infizierten zurückkehrenden Reisenden anfänglich nicht die richtige Diagnose gestellt wurde. Im Schnitt vergingen 7,6 Tage vor Stel ^¬ lung der richtigen Diagnose und vor Therapiebeginn für Plasmodium falciparum und 5,1 Tage für Plasmodium vivax. Derartige Verzögerungen können zu bedeutenden Komplikationen und zu einer erhöhten Mortalitätsrate führen (Humare et al, 1997, Canadian Medical Association Journal 156, 1165 - 1167) . Zur Diagnose von Plasmodieninfektionen stehen mehrere Verfahren zur Verfügung: das sicherste Verfahren besteht in einer mikroskopischen Blutuntersuchung, jedoch ist dieses Verfahren personal-, zeit-, und geräteaufwändig . Mit den gängigen mik- roskopischen Verfahren kann das geschulte Fachpersonal die Art und das Stadium der Infektion zuverlässig bestimmen.

Daneben existieren die sogenannten raschen diagnostischen Tests (Rapid Diagnostic Test = RDT) . Beispielsweise werden hier monoklonale Antikörper zum Nachweis von Parasitenantige- nen verwendet. Dieser Test wird üblicherweise eingesetzt, um Plasmodium falciparum-Infektionen zu erkennen.

Ein deutlich sensitiveres Verfahren für die Malaria- Diagnostik besteht in der Polymerase-Kettenreaktion, die jedoch aufgrund des hohen Material- und Zeitaufwands für den Akutfall wenig geeignet ist.

Zur Gruppe der Rapid Diagnostic Tests (RDT) zählen mittlerwei- le auch automatisierte Verfahren, die sich aufgrund ihres ho ^¬ hen Durchsatzes für flächendeckende Nachweisverfahren hervorragend eignen. Siehe hierzu Hanscheid T, Pinto BG, Pereira I, Christino JM, Valadas E (1999) Avoiding misdiagnosis of ma- laria: a novel automated method allows specific diagnosis, even in the absence of clinical suspicion. Emerging Infecti- ous diseases [1999, 5(6) : 836-838].

Zur automatisierten Anwendung werden so genannte "automated cell counters" (Automatisierte Zellzählgeräte) mit zunehmen- dem Erfolg angewendet. Beispiele hierfür sind das Advia 2120, Sysmex XE-2100 sowie CellaVision DM96 Gerät. Diese automati ^¬ sierten Geräte stellen, abgesehen von ihrer hohen Durchsatzzahl, einige Vorteile bereit, wie beispielsweise hohe Objek ^¬ tivität (keine Variabilität abhängig vom Beobachter), Elimi- nation statistischer Variationen, die üblicherweise mit einer manuellen Zählung verbunden sind (Zählung hoher Zellzahlen), sowie die Bestimmung zahlreicher Parameter, die bei einer ma- nuellen Auszählung nicht verfügbar wären und, wie angesprochen eine effizientere und kosteneffektivere Handhabung.

Einige dieser Geräte können 120 bis 150 Patientenproben pro Stunde bearbeiten.

Die technischen Prinzipien der automatischen Einzelzellzählung beruhen entweder auf einer Impedanz- (Widerstands-) Messung oder auf einem optischen System (Streulicht- oder Absorptionsmessung) .

Beim Impedanzverfahren erfolgt die Zellzählung sowie deren Größenbestimmung auf Grundlage des Nachweises und der Messung von Veränderungen in der elektrischen Leitfähigkeit (Widerstand) , die durch ein Teilchen verursacht werden, das sich durch eine kleine Öffnung hindurchbewegt. Teilchen, wie bei ^¬ spielsweise Blutzellen, sind selbst nicht leitend, werden je ^¬ doch in einem elektrisch leitenden Verdünnungsmittel suspendiert. Wenn eine derartige Suspension von Zellen durch eine Öffnung hindurchgeleitet wird, nimmt bei Durchgang einer ein- zelnen individuellen Zelle die Impedanz (Widerstand) des e- lektrischen Weges zwischen den beiden Elektroden, die sich auf jeder Seite der Öffnung befinden, vorübergehend zu.

Beispielsweise wird in WO 2005/088301 ein Verfahren zum Nach- weis von Malaria und anderen Parasiteninfektionen mittels einer derartigen Impedanzmessung (siehe experimenteller Teil) sowie im Artikel "Development of an Automated Malaria Discri- minant Factor Using VCS Technology", Briggs C et al . Am J Clin Pathol 2006, beschrieben.

Im Gegensatz zum Impedanzverfahren umfasst das optische Verfahren das Durchleiten eines Laserlichtstrahles durch eine verdünnte Blutprobe, die in einem kontinuierlichen Strom von dem Laserstrahl erfasst wird. Jede Zelle, die durch die Er- fassungszone der Durchflusszelle hindurchtritt streut das fo- kussierte Licht. Das gestreute Licht wird dann durch einen Fotodetektor nachgewiesen und in einen elektrischen Impuls umgewandelt. Die hier erzeugte Anzahl von Impulsen ist direkt zur Zellanzahl proportional, die durch die Erfassungszone in einer speziellen Zeitspanne hindurchtritt. Bei den optischen Verfahren wird die Lichtstreuung der einzelnen Zelle, die durch die Erfassungszone hindurchtritt, in verschiedenen Winkeln gemessen. Hierdurch werden Informationen über Zellstruktur, Form und Reflexionsvermögen erfasst. Diese Eigenschaften können dazu verwendet werden, verschiede- ne Arten von Blutzellen zu differenzieren und die abgeleiteten Parameter zur Diagnose von Abweichungen der Blutzellen von der Norm zu verwenden.

Die durch beide Messverfahren erzielten Werte werden mittels der Differentialdiagnostik zu einem aussagekräftigen Diagnoseresultat verknüpft.

Die Sensitivität und Spezifität von diagnostischen Verfahren spielt im Rahmen der Differentialdiagnostik eine tragende Rolle, dementsprechend wird fortwährend an einer Verbesserung dieser Eigenschaften gearbeitet.

Beispielsweise werden in WO 2005/088301 die Messwerte bezüg ^¬ lich des Zellvolumens von Lymphozyten und Monozyten erfasst und als Parameter für eine Malariaerkrankung herangezogen.

Genauer gesagt wird hier die Standardabweichung des Volumens der Monozyten- und Lymphozytenpopulationen bewertet, d.h. deren Heterogenität . Es hat sich jedoch herausgestellt, dass dieser Parameter für die Diagnose einer Parasiteninfektion nicht spezifisch genug ist, da es auch bei jeder anderen Infektionskrankheit (beispielsweise Erkältungen) zu einer Volu ^¬ menveränderung der Lymphozyten und Monozyten kommen kann. Darüber hinaus haben sich Impedanzmessungen von Blutproben als fehleranfällig erwiesen, z.B. können Messergebnisse (bei- spielsweise durch variierende Viskosität der zu testenden Suspension) verfälscht werden. In ähnlicher Weise wird in "Development of Automated Malaria Discriminant Factor Using VCS Technology" (s.o.) beschrieben, dass die Standardabweichung des Volumens von Lymphozyten und Monozyten signifikant vom Normwert abweicht, wenn eine Mala- riainfektion vorliegt.

Eine beispielhafte Darstellung verschiedener Sensitivitäten und Spezifitäten unter Verwendung automatisierter Bluttestgeräte findet sich in Tabelle 3, wonach die Sensitivität teilweise nur 48,6 bzw. 52 % beträgt. Damit gelingt es mit den gängigen Testmethoden nicht im ausreichendem Maße, Verfahren mit hoher Sensitivität und Spezifität bereitzustellen, d.h. Verfahren zum Nachweis einer Plasmodieninfektion, die einen erkrankten Patienten auch als solchen erkennen, sowie andererseits einen gesunden Patienten als gesund erkennen können .

Nach neueren Untersuchungen ist die Aussagekraft der bestehenden automatisierten Testsysteme (und damit auch der ange- gebenen Sensitivitäten /Spezifitäten) zudem fraglich und lässt Spielraum für Verbesserungen zu. Siehe hierzu das kürzlich veröffentlichte Paper "Automated haematology analysis to diagnose malaria", Malaria Journal 2010, 9:346. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis einer Plasmodieninfektion in einer Blutprobe bereit zu stellen, das Testergebnisse mit hoher Sensitivität und Spezifität ergibt. Es ist eine weitere Auf ^¬ gabe der Erfindung, ein Nachweisverfahren für Malariainfekti- onen bereit zu stellen, das durch den Einsatz mehrerer unabhängiger Parameter eine hohe Spezifität und Sensitivität für Malaria unabhängig von anderen Infektionen oder unterschiedlichem Gesundheitszustand der Patienten erlaubt. Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein solches Verfahren bereitzustellen, das mit Hilfe automatisierter Blutanalysegeräte durchgeführt werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den in Patentanspruch 1 angegebenen Merkmalen gelöst.

Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Nachweis einer Plas- modieninfektion in einer Patientenblutprobe, umfassend a) Durchführen einer Differentialanalyse der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der Probe und Bestimmen der Verteilung des Zellvolumens und der Zelldichte; b) Bestimmen der Thrombozytenanzahl in der Probe; c) Bestimmen der Verteilung der Zelldichte der Thrombozyten in der Probe; d) Gewinnen von Probenparametern aus den in a) bis c)

durchgeführten Bestimmungen; und e) Bewerten der Parameter gegenüber einem vorherbestimmten Kriterium, wobei bei Erfüllung des Kriteriums eine Plas- modieninfektion vorliegt.

Bei der erfindungsgemäß untersuchten Patientenblutprobe han ^¬ delt es sich in der Regel um eine humane Blutprobe. Es ist jedoch auch möglich, Blutproben von Säugetieren zu untersuchen .

Der Begriff "Differentialanalyse" wie hierin verwendet bedeu ^¬ tet die Erfassung mehrerer messbarer Einzelwerte der Bestandteile der Patientenblutprobe, die letztendlich für die durch ^¬ zuführende Diagnose kombiniert ausgewertet werden.

In Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird hierzu zunächst eine Differentialanalyse der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der Probe bezüglich der Bestimmung der Verteilung des Zellvolumens und der Zelldichte durchgeführt. Dies schließt jedoch nicht aus, dass weitere Leukozytenarten, beispielsweise eosinophile oder basophile Granulozyten ebenfalls in die Untersuchung mit eingeschlossen werden .

Eine Abweichung der Verteilung des Zellvolumens sowie der Zelldichte von der Norm weisen in der Regel auf einen pathologischen Zustand hin. Im vorliegenden Fall weisen gegenüber den üblicherweise gemessenen Normalwerten niedrigere Werte auf eine Plasmodieninfektion hin. Die mit der Plasmodienin- fektion einhergehende Verringerung des Zellvolumens sowie der Zelldichte ist mit den im Zuge der Infektion auftretenden Verteidigungsmechanismen der Leukozyten zu erklären. Beispielsweise wandern neutrophile Granulozyten aus dem Blutge ^¬ fäß in das Gewebe ein, sezernieren dort proteolytische Enzyme um interzelluläre Verbindungen zu lösen und phagozytieren dort Bakterien. Hierdurch kommt es zu einer Veränderung des Zellvolumens und der Zelldichte.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass die Sen- sitivität und Spezifität des Nachweisverfahrens für eine Plasmodieninfektion deutlich erhöht werden kann, wenn neben den oben beschriebenen Bestimmungen (d.h. sequentiell oder gleichzeitig) sowohl die Thrombozytenanzahl in der Patientenblutprobe als auch die Verteilung der Zelldichte der Thrombo ^¬ zyten in der Probe bestimmt wird. Auch hier ist ein von der Norm nach unten abweichender Wert prädiktiv für das Vorliegen einer Plasmodieninfektion . Dies führt erfindungsgemäß zu einer gegenüber bestehenden Verfahren deutlich erhöhten Sen- sitivität und Spezifität des Nachweisverfahrens.

Aus den in den Schritten a) bis c) erzielten Messergebnissen werden Probenparameter gewonnen und gegenüber einem vorherbestimmten Kriterium bewertet, wobei bei Erfüllung des Kriteriums eine Plasmodieninfektion vorliegt.

Bei Parametern handelt es ich um abgeleitete Größen, bei ^¬ spielsweise steht der Begriff Zellvolumenparameter für einen mit der Zellvolumenverteilung in Beziehung stehenden Parameter wie beispielsweise das durchschnittliche Zellvolumen oder die Standardabweichung der Zellvolumenverteilung einer gegebenen Zellsubpopulation.

Der Begriff "vorherbestimmtes Kriterium" wie hierin verwendet betrifft ein Kriterium, das auf Grundlage einer oder mehrerer Probenparameter etabliert wurde, im Falle der vorliegenden Erfindung insbesondere aufgrund von Zellvolumenparametern, Zellzahlparametern und Zelldichteparametern. Das Kriterium wird auf Grundlage eines Vergleichs von infizierten Blutpro ^¬ ben mit entsprechenden Werten von normalen Blutproben bestimmt, beispielsweise wurden für die experimentellen Untersuchungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen ein Vergleich von 204 P. falciparum infizierten Blutproben mit entsprechenden Werten von 3240 normalen Blutproben durchgeführt .

Durch Kombination und Bewertung von Probenparametern polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten (Zellvolumen und Zelldichte) und, zusätzlich, unter Heranziehung der Thrombo- zytenanzahl sowie der Verteilung der Zelldichte der Thrombozyten in der Probe, konnten erfindungsgemäß unerwartet hohe Werte für die Sensitivität und Spezifität des Nachweisverfah ^¬ rens erzielt werden. Wie in den Beispielen dargelegt wird, gelang es hierbei, Spezifitätswerte von 99 % und Sensitivi- tätswerte von 98 % erreichen. Dies bedeutet, dass bei flä ^¬ chendeckenden, automatisierten Blutuntersuchungen die Anzahl der falsch-positiven bzw. falsch-negativen Diagnoseergebnisse in einem bisher nicht bekannten Maße reduziert werden konnte und beinahe vernachlässigt werden kann. Dies bedeutet einen großen Fortschritt in Hinblick auf eine gesicherte Plasmodie- ninfektionsdiagnose, insbesondere Malaria-Diagnose und wird in Ländern, die von einer hohen Prävalenz / Inzidenz von Malariainfektionen betroffen sind zu einer deutlichen Verbesserung des Gesamtgesundheitszustandes über rechtzeitige und sinnvolle medizinische Maßnahmen führen. In einer Aus führungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Parameterbestimmung durch Streulichtmessung. Bei der Streulichtmessung handelt es sich, wie oben ausgeführt ("optisches Verfahren") im Gegensatz zur Impedanzmessung um ein Verfahren, bei dem Laserlicht verwendet wird, wobei die Blutproben (Zelle für Zelle) durch das Laserlicht geführt werden und die Ablenkung der Laserstrahlen durch eine geeignete Vorrichtung erfasst werden kann. Das unter Verwendung des Laserstrahls durchgeführte Verfahren ist in der beilie ^¬ genden Figur 1 erläutert. Hierbei werden die von einer individuellen Zelle gestreuten Lichtstrahlen in verschiedenen Winkelbereichen erfasst (niedriger Winkel / low angle und großer Winkel / high angle), die jeweils Hinweise auf Volumen (kleiner Winkel) sowie Dichte (großer Winkel) zulassen. Erfindungsgemäß wird als "kleiner Winkel" ein Winkel von ca. 2° bis 3° bezeichnet, als ein "großer Winkel" ein Winkel von ca. 5° bis 15° Abweichung von der Laserlichtachse. Es hat sich herausgestellt, dass die Streulichtmessung der Impedanzmes- sung im Hinblick auf die geringere Störanfälligkeit der Mess ^¬ ergebnisse überlegen ist.

In einer Aus führungs form handelt es sich bei der Plasmodien- Infektion um eine Infektion mit P. ovale (Malaria tertiana), P. vivax (Malaria tertiana), P. malariae (Malaria quartana) oder P. falciparum (Malaria tropica) . Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann für diese Plasmodieninfektionen gleichermaßen verwendet werden. In einer Aus führungs form werden zusätzlich zu den oben genannten Verfahrensschritten zusätzlich eine Sphärisierung und Differentialanalyse der Retikulozyten und Erythrozyten in der Patientenblutprobe durch Streulichtmessung durchgeführt. Auch hier handelt es sich um eine Differentialanalyse, wobei die letztendlich zu bewertenden Parameter das Zellvolumen, die

Zelldichte sowie den Hämoglobingehalt der Zellen und den Re- tikulozytenanteil betreffen. Bei Retikulozyten handelt es sich um junge rote Blutkörperchen, die im Gegensatz zu den Erythrozyten selbst noch RNA enthalten und dadurch differenziert werden können. Die Sphärisierung der Erythrozyten oder Retikulozyten ist notwendig, um die Blutzellen unabhängig von ihrer ursprünglichen Form in eine bei der Streulichtmessung auswertbare Form zu überführen. Zu diesem Zweck wird die Blutprobe mit einem Reagens versetzt, das zu einer Sphärisierung der Retikulozy- ten und Erythrozyten führt. Beispielhafte Reagenzien sind in US 5,045,472, US 5,284,771, US 5,633,167 sowie US 6,114,173 offenbart. Beispielsweise offenbart US 5,045,472 ein Reagenz ^¬ gemisch umfassend eine isotonische wässrige Lösung, ein Sphä- risierungsmittel (beispielsweise ein Detergens wie Alkalime- tallsalze eines Alkylsulfats ) sowie ein Protein, das reversi ^¬ bel das Spärisierungsmittel bindet.

Durch Einbeziehung der Retikulozyten und Erythrozyten in das erfindungsgemäße Nachweisverfahren können Spezifität und Sen- sitivität weiter erhöht werden. Das Verhältnis von Retikulo ^¬ zyten zu Erythrozyten ist ein wichtiger Hinweis auf das Vorliegen einer Plasmodieninfektion im Blut. Je höher das Verhältnis der Retrikulozyten, d.h. junger, unreifer Erythrozyten im Verhältnis zu reifen Erythrozyten ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens einer Plasmodieninfek ^¬ tion .

In einer weiteren Aus führungs form wird nach einer Peroxidase- Einfärbung aller Leukozyten in der Blutprobe eine Differenti- alanalyse durch Streulichtmessung und Absorption durchgeführt .

Die Peroxidase-Einfärbung erfolgt üblicherweise durch zellu ^¬ läre Peroxidase-Aktivität nach Umsetzung mit 4-Chlor-l- Naphtol. 4-Chlor-l-Naphtol dient hier als Substrat, das es

Wasserstoffperoxyd ermöglicht, ein dunkles Präzipitat an en ^¬ dogenen Orten der Peroxidase-Aktivität in den Granula der Leukozyten zu bilden. Bei einer Streulichtmessung werden dann die Zellen mit einer geringen oder moderaten Peroxidase- Aktivität weniger Licht absorbieren, während Zellen mit einer hohen Peroxidase-Aktivität mehr Licht absorbieren werden.

In einer weiteren Aus führungs form werden zusätzlich nach einer Peroxidase-Einfärbung, wie vorher geschildert, die Volumenverteilung der neutrophilen Granulozyten gemessen. Auch hier gilt, dass, je größer die Volumenverteilung der neutro- philen Granulozyten ist, desto größer die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Plasmodieninfektion in der Patientenblutprobe ist.

In einer weiteren Aus führungs form wird zusätzlich als Parame- ter die Standardabweichung der Volumenverteilung aller Leukozyten nach Peroxidase-Einfärbung verwendet. Je größer die Standardabweichung der Volumenverteilung aller Leukozyten ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens einer Plasmodieninfektion .

Bei einer Aus führungs form wird die Bestimmung in a) , d.h. die Durchführung einer Differentialanalyse der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der Probe nach Lysieren wenigstens der eosinophilen und neutrophilen, nicht jedoch der ba- sophilen Leukozyten (BASO Lysereagenz ) , durch ein geeignetes Lysereagenz durchgeführt. Auch hier ist das Vorliegen einer breiten Volumen- bzw. Dichteverteilung ein Indiz für das Vorliegen einer Plasmodieninfektion . Als Lysereagenz haben sich hier Gemische auf Basis von Phthalsäure und Detergenzien als vorteilhaft herausgestellt, beispielsweise kann ein derarti ^¬ ges Reagenz Salzsäure, Phthalsäure, ein Tensid sowie wahlwei ^¬ se ein Konservierungsmittel enthalten. Das Verhältnis von Phthalsäure und Salzsäure ist hierbei ungefähr 2,5:1 (basie ^¬ rend auf ihrer Konzentration in mmol/1. Durch dieses Reagenz werden die roten Blutkörperchen, die Thrombozyten, sowie alle Leukozyten (außer den basophilen Granulozyten) lysiert . Auch durch dieses zusätzliche Verfahren kann der Plasmodien- spezifische Vorhersagewert erhöht werden.

In einer weiteren Aus führungs form wird nach einer spezifi- sehen Lyse aller Zellen außer der basophilen Leukozyten der unspezifische Anteil aus dem Streulichtdiagramm (Klein- und Großwinkelstreuung) bestimmt wird. Je höher dieser Anteil ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Plas- modieninfektion vorliegt.

Die im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren durchgeführten Bestimmungen a) , b) und c) sind, wie oben ausgeführt, prädiktiv für das Vorliegen einer Plasmodieninfektion . Der Begriff "niedrige" Werte im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeu- tet einen niedrigeren Wert der im Einzelfall durchgeführten Bestimmung im Vergleich zu den bei normalen Patientenproben (d.h. nicht infizierten Patientenproben) erzielten Standardwerte . Im Gegensatz hierzu bedeutet die zusätzliche Heranziehung der Parameter, die durch Peroxidase-Einfärbung sowie Bestimmung der Volumenverteilung der neutrophilen Granulozyten sowie der Standardabweichung der Volumenverteilung aller Leukozyten erzielt wird, sowie die Bestimmung des unspezifischen Anteils aus dem Streulichtdiagramm nach spezifischer Lyse aller Zellen, dass, je höher die Werte sind, desto höher die Wahr ^¬ scheinlichkeit für das Vorliegen einer Plasmodieninfektion ist . Des Weiteren werden Aus führungs formen des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren de ^¬ tailliert beschreiben. Es zeigen:

Figur 1 eine schematische Darstellung einer durchfluss- zytometischen Vorrichtung 1 zur Durchführung des erfindungs- gemäßen Verfahrens.

Figur 2 eine schematische Darstellung des Groß-Winkel- Streulichts anhand einer roten Blutzelle 11, das mit der Gra- nularität und Dichte der Zelle korreliert und in einem typi- sehen Bereich von 5° bis 15° gemessen wird. Dies entspricht der Bestimmung der Zelldichte.

Figur 3 die Bestimmung des Zellvolumens (bzw. der Zellgröße) der Zelle 11 im Klein-Winkel-Streulichtbereich (2° bis 3°) .

Figur 4 Streulichtdiagramme, durchgeführt mit dem Gerät ADVIA 2120i, das die beispielhafte Verschiebung des Volumens 16 und der Dichte 17 für Thrombozyten und polymorphkernige Leukozyten (PMNx) bei Malaria-infizierten Blutproben zeigt.

Figur 5 die Ergebnisse einer Analyse nach Peroxidase- Einfärbung mit dem Gerät ADVIA 2120i, das beispielhaft die Volumen- und Dichteverteilung (PEROX Y 26 bzw. PEROX X 27) zwischen einer Malaria-infizierten Probe 24 und einer norma- len Probe 25 darstellt. "PEROX Y" 26 bezeichnet die Breite der Peroxidase-negativen Populationen entlang der Y-Achse. Diese erscheint bei einer Malariaprobe länger im Vergleich zu einer normalen Probe. Die Ergebnisse für die Malariaprobe 24 wirken diffuser als die normale Probe 25, was auf die größere Volumenverteilung 26 und Dichteverteilung 27 zurückzuführen ist .

Im Folgenden wird beispielhaft die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, sowie zwei Algorithmen, die auf Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens die Bewer ^¬ tung der ermittelten Parameter und eine Vorhersage einer Plasmodieninfektion mit hoher Spezifität und Sensitivität er- möglichen. Die Messungen wurden mit dem ADVIA 2120i-System der SIEMENS AG durchgeführt.

Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

Gemäß einer ersten erfindungsgemäßen Auswertung ergab sich folgender Algorithmus 1 für ein Nachweisverfahren für eine Malariainfektion mit hoher Spezifität:

PLT x MPC / 100 < 47 und

PMNx + 0,1635 x(PLT x MPC / 100) < 33 Anhand dieses Algorithmus zeigt sich deutlich (siehe unten), dass das zueinander ins Verhältnis setzen der Ergebnisse ei ^¬ ner Differentialanalyse der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten bezüglich der Verteilung der Zelldichte (PMNx) mit der Thrombozytenanzahl und der Verteilung der Zelldichte der Thrombozyten in der Probe gegebenenfalls unter Hinzuzie- hung weiterer Unteralgorithmen (lb und lc) zu einer sehr hohen Spezifität führt.

Unter Hinzuziehung der weiteren Unteralgorithmen

PLT mode - 30 x %Baso Noise < 27 sowie

Perox Y Sigma + 12/70 x %Abnorm > 12 ergab sich eine Testspezifität für Malaria von 99 % sowie ei- ne Sensitivität von 76,5 %.

Algorithmus 1 kann insofern in vorteilhafter in Ländern mit einer hohen Prävalenz von Malaria verwendet werden. Für Länder mit einer niedrigen Malariaprävalenz würde sich der folgende Algorithmus 2 anbieten:

2a. PMN peak + 14 / 140 x(PLT x MPC) /100 < 34

2b. Baso Noise >0, 074

2c. PLT Mode + 25 x %Baso Noise < 45

2d. Perox Y Sigma > 6, 6

Die beobachtete Spezifität betrug 90,2 %, die Sensitivität 98,9 %. Mit anderen Worten kann durch den Algorithmus 2 eine extrem hohe Sensitivität erreicht werden.

Damit können durch den Algorithmus 1 in einer großen Probenpopulation beinahe alle Malaria positiven Proben erkannt werden, wohingegen sich Algorithmus 2 insbesondere für Scree- ning-Untersuchungen eignet. Auch eine Kombination beider Algorithmen kann zusätzliche Vorteile mit sich bringen. Bezugs zeichenliste

1 Vorrichtung zur Durchfluss

2 Laser

3 Sensormodul

4 Optische Linsen

5 halbduchlässiger Spiegel

6 Blende

7 Spiegel

8 Sensor

9 Sensor

10 Sensor

11 Zelle

12 Baso Volumen

13 Baso Konfiguration

14 Großwinkel PLT Scatter

15 Kleinwinkel PLT Scatter

16 Thrombozyten Volumen

17 Thrombozyten Komponenten

18 Unspezifischer Anteil aus <

19 Lymphozyten

20 Große ungefärbte Zellen

21 Monozyten

22 Neutrophile Leukozyten

23 Eosinophile Leukozyten

24 Malariaprobe

25 Normale Probe

26 Peroxy-Sigma

27 Absorption