Polyacrylamidgelelektrophoresen stellen die gebräuchlichste Methode der Proteinauftrennung dar. In der 2-dimensionalen Proteinauftrennung können dabei bis zu 10,000 Proteine als Punkte (Spots) dargestellt werden. Die Identifikation dieser Proteinpunkte ist dabeio der zentrale Schritt in der Untersuchung von Unterschieden in er Proteinzusammensetzung (z. B. zwischen krankem und gesundem Gewebe). Zur Identifikation eines Proteins wird der interessante Punkt, der mit einem Farbstoff sichtbar gemacht wurde, ausgestanzt und einer enzymatischen Spaltung (meistens durch Zugabe von Trypsin) unterworfen. Die Spaltpeptide werden dabei aus dem Gel ausgeschwemmt. Diese Mischung muss anschließend entsalzen werden, da das Salz bei der weiteren Analyse, z. B. einer massenspektroskopischen Auswertung, stört. Vor allem für die Untersuchung im Electrosprayionisations (ESI) Massenspektrometer ist man auf die Salzfreiheit der Probe angewiesen.

Bisher wurden die Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen zum großen Teil manuell durchgeführt. Dabei bestehen die folgenden Schwierigkeiten :

Das Gelfragment kann leicht von der Pipette angesaugt werden, die zum Abnehmen einer Waschlösungen verwendet wird. Dabei kann die Pipette verstopfen bzw. das Protein mit dem Gelfragment verloren gehen.

Die Peptidlösung ist salzhaltig und muss über eine extrem kleine Säule mit hydrophobem Material entsalzt werden um das (Elutions-) Volumen nicht zu groß werden zu lassen und damit die Peptide in der verdünnten Lösung zu verlieren.

Die Peptidlösung ist zu stark verdünnt, so dass die Peptide in einem anschließenden Massenspektrum nicht identifiziert werden können, da, es eine limitierte Auftragsmenge gibt.

Die Peptide werden an den Gefäßwänden absorbiert und sind einer Analyse nicht mehr zugänglich.

Die Peptide sind verunreinigt und ergeben keine interpretierbaren MS Spektren Bekanntermaßen liegen die Proteine in den Gelen in ausgesprochen kleinen Ausgangsmengen vor, wobei zum gegenwärtigen Zeitpunkt auch eine erfolgreiche Isolierung kleinster Proteinmengen (<10 fmol) aus Gelen schwierig ist.

Beim manuellen Arbeiten werden zwar Ausgangsmengen von 10-100 fmol isoliert, aber bei geringem Durchsatz und hohem Arbeitsaufwand. Für die automatische Bearbeitung sind lediglich Vorrichtungen vorhanden, mit denen Protein- Ausgangsmengen erfasst werden können, die >l pmol sind (z. B.

ABIMED DigestPro der ABIMED Analysen-Technik GmbH, DE., 5-50 pmol).

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein voll automatisierbares Verfahren und eine Vorrichtung zum Aufarbeiten von Proteinen in Gelen zu entwickeln, womit auch kleinste Proteinmengen (vorzugsweise <10 fmol) gewonnen werden können.

Diese Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung werden zahlreiche Proteine gleichzeitig, effizient und als hochkonzentrierte, salzfreie Peptidmischungen bereitgestellt, die dann einer weiteren Analyse unterworfen werden können, z. B. einer massenspektrometrischen Untersuchung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen ist dadurch gekennzeichnet, dass die Protein- Gelfragmente aus Gelen, z. B. aus Acrylamidgelen, isoliert werden. Diese Gelfragmente mit den Proteinspots werden in die entsprechende Anzahl Reaktionsgefäße einer ersten Mikrotiterplatte, die als Filterplatte bezeichnet werden kann, überführt. Die Böden der Reaktionsgefäße dieser Mikrotiterplatte sind als hydrophobe Filtermembran ausgestaltet. Die in den Wells der Filterplatte befindlichen Protein-Gelfragmente werden mit an sich bekannten Lösungen und Puffern gewaschen, wobei nach jedem Schritt die jeweilige Lösung durch die hydrophobe Filtermembran abgesaugt wird.

Anschließend werden sie einem Protease-Verdau unterzogen, indem eine Proteaselösung zu den. Protein-Gelfragmenten zugegeben wird. Die Proteine werden dadurch in kleine Peptide gespalten, welche an das hydrophobe Filtermaterial binden.

Nach einer Inkubationszeit wird die Verdaulösung in den Abfallbehälter (Waste) abgesaugt, wobei die Peptide zum Großteil an die Membran binden. Anschließend können Verunreinigungen, wie Salze, durch Hindurchsaugen von Waschlösungen in den Abfallbehälter entfernt werden.

Danach wird die erste Mikrotiterplatte (Filterplatte) über einer zweiten Mikrotiterplatte (Auffangplatte) postiert. Die Reaktionsgefäße dieser Auffangplatte weisen konische Böden auf und bestehen aus einem Material, das keine Peptide adsorbiert. Dabei handelt es sich um ein Material aus einem hochhalogenierten Kunststoff, wie z. B. aus Polytetrafluorethylen (Teflon). Erfindungsgemäß bestehen die

Reaktionsgefäße der zweiten Mikrotiterplatte bevorzugt aus Teflon.

Mittels hydrophober Elutionslösungen und unter Anlegen von Unterdruck in die Reaktionsgefäße der Auffangplatte werden im weiteren Aufarbeitungsverfahren die an den Filtermembranen der ersten Mikrotiterplatte gebundenen Peptide eluiert und in einem anschließenden Schritt aufkonzentriert. Diese Peptideluate können entweder direkt einer weiteren Analyse, vorzugsweise massenspektroskopischen Untersuchungen zugeführt werden oder sie werden zwischengelagert.

Die hydrophoben Filtermembranen für die Reaktionsgefäße der ersten Mikrotiterplatte bestehen vorzugsweise aus modifizierten Siliziummaterialien. Besonders bevorzugt werden mit langkettigen (C8-C18) oder aromatischen Kohlenwasserstoffketten modifizierte Siliziummembranen verwendet.

Als Proteaselösung zum enzymatischen Verdau wird bevorzugt eine Trypsinlösung eingesetzt, wobei die Inkubation der Protein-Gelfragmente mit der Proteaselösung vorzugsweise für 4-6 Stunden, ggf. unter Erwärmung auf ca. 37 °C, durchgeführt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung erfolgt das Verfahren vollautomatisch, wobei die Isolierung der Protein-Gelfragmente aus dem Gel sowie die Bereitstellung, Überführung und Auswechslung der beiden Mikrotiterplatten unter Einsatz eines Roboters und die Zugabe von Wasch-und Inkubationslösungen mittels Pipettierroboter bzw. einer Vielfachpipettiereinheit stattfindet.

Im Detail läuft das Verfahren wie folgt ab : Die Proteinpunkte werden manuell oder mittels eines käuflichen Roboters ausgestochen und in die erste Mikrotiterplatte (Filterplatte) überführt. Diese

Mikrotiterplatte hat als Boden eine Fritte, die aus mit bevorzugt C18 Alkyl-Ketten modifiziertem Silizium besteht.

Das Gelfragment mit dem Protein wird in verschiedenen Waschschritten behandelt, um eine günstige Inkubationslösung für den Proteaseverdau zu erreichen. Die Zugabe der Waschlösungen erfolgt dabei mit Hilfe einer Vielfachpipettiereinheit oder eines Pipettierroboters. Im letzten Schritt wird die Proteaselösung zugegeben. Alle Waschlösungen werden nach der Zugabe und Inkubation einfach per Unterdruck durch die Fritte in einen daran befindlichen Abfallbehälter abgesaugt. Das Protein verbleibt noch im Gelfragment. Durch die Inkubation in der Proteaselösung wird das Protein in kleine Peptide gespalten, die sich aus dem Gelfragment lösen und beim Absaugen der Inkubationslösung durch die hydrophobe Fritte an das hydrophobe Filter-Material binden. Vorteilhafterweise wird das Salz mit Wasser weggewaschen. Die erste Mikrotiterplatte wird im Anschluss statt über einen Abfallbehälter über der zweiten Mikrotiterplatte (Auffangplatte) mit konischen Gefäßen platziert. Die Peptide werden mittels hydrophober Waschlösung in einem relativ großen Volumen eluiert, wodurch eine vollständige Ausbeute der gebundenen Peptide erreicht wird.

Die Elutionslösung liegt dann in den konischen und nicht Peptid adsorbierenden Gefäßen der zweiten Mikrotiterplatte vor.

! Die lösungsmittelhaltige Elutionslösung wird im Anschluss schnell abgetrocknet, bevorzugt in einer Vakuumzentrifuge, und das Peptidgemisch wird in wenigen Mikrolitern (0,5-2 Al) aufgenommen und gelagert bzw. sofort einer weiteren Analyse, zum Beispiel einer massenspektroskopischen Analyse, zugeführt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen.

Diese besteht aus einem temperierbaren Reinluftraum mit einer Umluft-Temperiereinheit und umfasst eine erste Mikrotiterplatte (l), die mit einer Absaugvorrichtung (2) mit Abfallbehälter verbunden ist, wobei die Böden der Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte (1) hydrophobe Filtermembranen darstellen. Außerdem umfasst die Vorrichtung eine zweite Mikrotiterplatte (3), die sich in einer Absaugvorrichtung (4) befindet, wobei deren Reaktionsgefäße konische Böden aufweisen und aus einem Material bestehen, das keine Peptide adsorbiert. Vorzugsweise sind sie aus einem hochhalogenierten Kunststoff, besonders bevorzugt aus Polytetrafluorethylen (Teflon). Form und Material der Mikrotiterplatten sind entscheidend.

Desweiteren umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung einen Pipettierroboter bzw. eine Vielfachpipettiereinheit (5) für die Bestückung der Mikrotiterplatte (1) (Filterplatte) mit Wasch-und Pufferlösungen.

Zum bevorzugten vollautomatischen Betrieb ist die Vorrichtung außerdem noch mit einem Roboter mit Verbindungsarm (6) gekoppelt. Dieser Roboterarm dient zur Entnahme der Mikrotiterplatte (l) (Filterplatte) vom Vorrat, zum Plattentransport von einer Station zur nächsten, sowie zur Entsorgung. Mit einem anderen Roboterarm wird die zweite Mikrotiterplatte (3) eingelegt und nach der Elution weggenommen und gestapelt.

Der wesentliche Vorteil der Erfindung liegt insbesondere in der Möglichkeit der totalen Automatisierbarkeit des Verfahrens. Als einziger manueller Schritt erfolgt ggf. die Abtrocknung der eluierten Peptidmischung in der Auffangplatte (3) mittels einer Vakuumzentrifuge. Auch dieser Schritt ist jedoch mit einem etwas komplexeren Roboter ausführbar, so dass das Verfahren vollautomatisch durchführbar ist. Die fertig abgetrockneten Peptidmischungen in der Auffangplatte (3) können wiederum von einem Roboter in wenigen Mikrolitern

Puffer gelöst und z. B. auf das, Target'eines Massenspektromet'ers aufgetüpfelt werden. Alternativ kann man die Proben in den Probengeber eines ESI Massenspektrometers geben. Natürlich sind auch andere Analysenmethoden zur Identifizierung der gewonnenen Spaltpeptide einsetzbar.

Die genannten Nachteile des Standes der Technik werden mit dem vorliegenden Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sämtlich vermieden.

Anders als bei den herkömmlichen Methoden, kann über den Verbleib des Protein-Spots jederzeit eine eindeutige Aussage getroffen werden.

"Die Trennung von Gelspots und Peptidlösungen kann erstmalig einfach und vollständig erfolgen.

Das Entsalzen und Waschen der Petpide ist universell und einfach durchführbar.

Die Elution der Peptide kann in recht großen Volumina und damit annähernd vollständig erfolgen. Die Aufkonzentration wird durch eine herkömmliche Vakuumzentrifugation erreicht. Dies ist nur aufgrund des innovativen. Materials der Mikrotiterplatte (3) (Auffangplatte) möglich.

Es werden sowohl Salze als auch hydrophile Komponenten (z. B. Acrylamid-Derivate) aus den Peptidlösungen entfernt.

Ein weiterer großer Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung ist die Zeitersparnis (, hands-on-time) für das Laborpersonal durch die vollständige Automatisierung.

Desweiteren ermöglichen Verfahren und Vorrichtung auch wesentlich geringer konzentrierte Proteinpunkte als bisher zu identifizieren, denn die Proteine sind auch aus Ausgangsmengen <10 fmol analysierbar.

Die Erfindung wird anschließend an Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Fig. 1 a) Darstellung der Vorrichtung während des Waschvorgangs b) Darstellung der Vorrichtung während Protease-Verdau und Elution Legende zur Fig. 1 1 Mikrotiterplatte (Filterplatte) 2 Absaugvorrichtung mit Abfallbehälter 3 Mikrotiterplatte (Auffangplatte) 4 Absaugvorrichtung 5 Pipettierroboter 6 Roboterarm Beispiel 2 Durchführung eines automatischen Protease-Verdaus 1. Materialien a) Gilson Pipettier-Roboter"Liquid Handler 215"unter einem Reinluftraum (Haube) b) 2 M3 Empore Vaccuum Manifold Assembly (Absaugvorrichtung für M3-Filterplatten c) 3M Empore C18-SD High Performance Extraction Disk Plate (Filterplatte = 96er Mikrotiterplatte (1)) d) Whatman Multichem 96er Mikrotiterplatte (3), V-Boden, 250 yl, 7701-6250 (Teflon) e) Vakuumzentrifuge Univapo mit Rotor für Mikrotiterplatten, kühlbar f) Umlufttemperiereinheit g) Aluminium-Siegelfolie für Mikrotiterplatten 2. Chemikalien a) Wasser, Millipore b) Acetonitril (AcN), Spektranal

c) Dithiothreitol (DTT) d) Trypsin, modifiziert, Seq. grade, Protana e) Rekonstitutionspuffer von Protana (50 mM Essigsäure) f) Trifluoressigsäure (TFA) Lösung 1 : 50% AcN in Methanol Lösung 2 : 0,2% TFA in Wasser Lösung 3 : 85% AcN, 0,1% TFA in Wasser Puffer 1 : 200 mM Ammoniumbicarbonat, ca. pH 8 (1,58 g Ammoniumbicarbonat in 100 ml Wasser lösen) Puffer 2 : 20 gg Trypsin in 50 gl Rekonstitutionspuffer (0,4jHg/l) Puffer A : 100 mM Ammoniumbicarbonat, 14 mM DTT in 50% AcN Puffer B : 100 mM Ammoniumbicarbonat in Wasser Puffer C : 12,5 mM Ammoniumbicarbonat in 50% AcN Puffer D : 25 mM Ammoniumbicarbonat in 50% AcN Puffer T : 0,01 g Trypsin/1 (25 mM Ammoniumbicarbonat in 5% AcN) 3. Vorbereitung Die C18-SD High Performance Extraction Filterplatte (1), die in die Absaugvorrichtung (2) mit Abfallbehälter integriert ist, wird 3x mit 2 ml Lösung 1 gewaschen, die nach unten abgesaugt wird. Der Reinluftraum wird mittels Umluft- Temperiereinheit auf 37°C temperiert.

Die'-ausgestanzten Protein-Gelfragmente werden nun in die Reaktionsgefäße der Filterplatte (1) gegeben.

4. Durchführung des Verfahrens Bei allen Pipettierschritten ist darauf zu achten, dass die Absaugvorrichtung zuvor vollständig belüftet wird.

1) Waschen der. Protein-Gelfragmente und Umpuffern : a) Schrumpfen : In jedes Well der Filterplatte (1) werden 2 ml Puffer A pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 bar 30 sec abgesaugt. b) Quellen : In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 gl Puffer B pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird. c) Schrumpfen : In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 Al Puffer C pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 bar 30 sec abgesaugt. d) Quellen : In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 gl Puffer D pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 bar 30 sec abgesaugt. e) Schrumpfen : In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400ml Puffer C pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird mit ca. 0, 6 abgesaugt, nach 30 sec wird (ohne das Absaugen zu unterbrechen) die Filterplatte (1) mit einer Gummimatte lufticht verschlossen und. weitere 15 min bei ca. 0,1 bar gesaugt.

2) Verdau : Die Gummimatte wird entfernt, in jedes Well der Filterplatte (1) werden 25 lil Puffer T pipettiert, die Platte wird mit einer Aluminium-Siegelfolie luftdicht verschlossen und 5h inkubiert (mit Vibration).

3) Reinigung : a) Bindung : In jedes Well der Filterplatte (1) werdem 25 gl Lösung 2 direkt durch die Aluminum-

Siegelfolie pipettiert. Danach wird bei ca.

0,6 bar abgesaugt. b) Waschen : In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 gl Lösung 2 pipettiert und sofort mit ca. 0,6 bar abgesaugt. c) Elution : Die Filterplatte (1) wird nun in die Absaugvorrichtung (4) überführt, in der sich die Teflonplatte (3) zum Auffangen der Eluate befindet. In jedes Well der Filterplatte (1) werden 3x 50 gl Lösung 3 pipettiert, wobei nach jeder Zugabe mit ca. 0,6 bar in die Teflonplatte (3) abgesaugt wird.

4) Aufkonzentration : Die Teflonplatte (3) mit den darin befindlichen Peptidlösungen (hier 150 yl) wird unter Vakuum zentrifugiert, bis ein Unterdruck von ca. 0,1 bar erreicht wird.

Anschließend werden in jedes Well der Teflonplatte (3) bis ca. 5 Ul Lösung 3 zugegeben. Die Teflonplatte (3) wird mit einer Alminiüm-Siegelfolie verschlossen und bei Raumtemperatur ca. 15 min intensiv geschüttelt.

5) Lagerung bzw. Analyse Die so behandelten Peptideluate werden entweder direkt einer weiteren Analytik zugeführt oder bei-20°C gelagert.