Verfahren für differenzspektroskopische Messungen Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur differenzspektroskopischen und-fluorimetri- schen Bestimmung der Wechselwirkung von Stoffen mittels einer Mikrotiterplatte sowie die Verwendung einer Mikrotiterplatte zur differenzspektoskopi- schen und-fluorimetrischen Bestimmung der Wechsel- wirkung von Stoffen.

Die spektrophotometrische Bestimmung von Substanzen in homogenen Lösungen spielt in einer Vielzahl von Bereichen eine Rolle, beispielsweise in der Um- weltanalytik, der Grundlagenforschung, der medizi- nischen Diagnostik, der Forensik etc.. Im Rahmen dieser Bestimmungen werden Substanzen wie Nuklein- säuren, Proteine, Enzyme, deren Substrate etc. be- stimmt, das heißt nachgewiesen und/oder quantifi- ziert. Häufig ist es dabei von Interesse, die Wech- selwirkung verschiedener Stoffe miteinander zu be- stimmen. Mittels der Differenzspektrophotometrie beziehungsweise-fluorimetrie können die Interak- tionen von Stoffen miteinander aufgrund der geän- derten spektralen beziehungsweise fluorimetrischen Eigenschaften erfaßt werden. Die spektralen bezie- hungsweise fluorimetrischen Anderungen werden ent- weder durch direkte Wechselwirkung der Stoffe un- tereinander oder durch bindungsinduzierte Konforma- tionsänderungen verursacht. Ebenso können lösungs- mittelabhängige Konformationsänderungen erfaßt wer- den oder auch Aggregationsgleichgewichte in Abhän- gigkeit des Mediums und der Stoffkonzentration ver- folgt werden.

Differenzspektrophotometrische beziehungsweise -fluorimetrische Messungen werden im allgemeinen mit Hilfe zweier Tandemküvetten, nämlich einer Pro- ben-und einer Referenzküvette, durchgeführt. Eine Tandemküvette enthält zwei durch ein vertikal ange- ordnetes Septum getrennte Kammern. Für differenz- spektrophotometrische beziehungsweise-fluorimetri- sche Messungen wird die Lösung eines ersten Stoffes in gleicher Konzentration in je eine Kammer der Proben-und Referenzküvette gegeben. Die beiden an- deren Kammern werden mit Pufferlösung gefüllt. Bei der anschließenden, mit einem horizontal ausgerich- teten beide Kammern durchdringenden Lichtstrahl durchgeführten Messung müssen sich gleiche spektro- photometrische und fluorimetrische Eigenschaften bei beiden Tandemküvetten ergeben. Anschließend wird eine definierte Menge eines zweiten Stoffes in die Probenküvette zur Lösung des ersten Stoffes und die gleiche Menge in die mit Puffer gefüllte Kammer der Referenzküvette gegeben, damit die Ligandenab- sorption beziehungsweise Ligandenfluoreszenz kom- pensiert wird. Um Konzentrationsdifferenzen zu ver- meiden, muß die gleiche Menge an Pufferlösung zur Lösung des ersten Stoffes in der Referenzküvette gegeben werden. Anschließend wird wie vorstehend beschrieben ein zweites Mal gemessen und die Werte verglichen. Aufgrund der zumeist geringen spektra- len und fluorimetrischen Veränderungen ist diese Methode sehr empfindlich gegenüber Konzentrations- differenzen, weshalb die jeweiligen Zugaben des zweiten Stoffes bezüglich des Volumens gering zu wählen sind. Die Bestimmungsgrenze wird durch die Löslichkeit des Stoffes im Puffer vorgegeben. Schließlich muß beim Durchmischen der Stoffe darauf geachtet werden, daß keine Lösungen aus den Kammern entfernt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das techni- sche Problem zugrunde, ein Verfahren bereitzustel- len, das die vorgenannten Nachteile überwindet, insbesondere Konzentrationseffekte minimiert, um die Bestimmungsempfindlichkeit zu erhöhen, in der Lage ist, Stoffe mit geringer Löslichkeit zu unter- suchen und Mischungsfehler zu verringern sowie ein schnelles, universell einsetzbares, parallelisier- tes und damit kostengünstiges Bestimmen von Wech- selwirkungen von Stoffen ermöglicht.

Die vorliegende Erfindung löst das technische Pro- blem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der differenzspektroskopischen und flu- orimetrischen Wechselwirkung von mindestens zwei unterschiedlichen Stoffen mittels einer eine Viel- zahl von Näpfchen aufweisenden Mikrotiterplatte, wobei der Mikrotiterplatte ein Deckel mit minde- stens einer einem Näpfchen zugeordneten Vertiefung zugeordnet ist, und wobei eine erste Lösung eines ersten Stoffes in ein Näpfchen, eine zweite Lösung eines zweiten Stoffes in die dem Näpfchen zugeord- nete Vertiefung und eine dritte Lösung enthaltend ein Gemisch des ersten und zweiten Stoffes in eine weitere Vertiefung und/oder ein weiteres Näpfchen gegeben wird, so daß anschließend mittels vertika- ler Einstrahlung elektromagnetischer Wellen durch die befüllten Vertiefungen und Näpfchen die diffe- renzspektroskopische und/oder-fluorimetrische Be- stimmung durchgeführt werden kann. Für diese Be- stimmungen können herkömmliche Photometer und Flu- orimeter, das heißt ELISA beziehungsweise MTP- Reader, verwendet werden. Die Erfindung sieht also vor, daß in einem als Referenzbereich bezeichneten Bereich einer Mikrotiterplatte zwei unterschiedli- che Stoffe getrennt voneinander vertikal übereinan- der angeordnet sind, während in einem Probenbereich der Mikrotiterplatte die Mischung der Stoffe loka- lisiert ist und gleichzeitig gemessen werden kann.

Findet eine Wechselwirkung des ersten Stoffes mit dem zweiten Stoff statt, wobei es zur Änderung der spektralen und/oder fluorimetrischen Eigenschaften kommt, ändern sich die Extinktionskoeffizienten be- ziehungsweise das Fluoszenzverhalten zumindest ei- nes Stoffes in der dritten Lösung, das heißt dem Gemisch der beiden Lösungen im Vergleich zur Mes- sung der beiden getrennt vorliegenden Lösungen.

Diese Änderungen des Extinktionskoeffizienten er- lauben Rückschlüsse auf Stoff-Wechselwirkungen so- wie Stoffeigenschaften und-strukturen. Ohne Wech- selwirkungen beziehungsweise beim Nullabgleich sind die Extinktionskoeffizienten beziehungsweise das Fluoreszenzverhalten konstant.

Bei erfindungsgemäß bevorzugten gleichen geometri- schen Gegebenheiten der Näpfchen der Mikrotiter- platte und der Vertiefungen des Deckels sind, so- fern keine Lösungen eingefüllt sind, die Absorptio- nen im Probenbereich, das heißt in dem Bereich der Mikrotiterplatte, in dem die das Gemisch der ersten und zweiten Lösung aufnehmende Vertiefung gelegen ist, und dem Referenzbereich, das heißt in dem Be- reich der Mikrotiterplatte, in dem die erste und die zweite Lösung getrennt voneinander und überein- ander in Vertiefung und Näpfchen angeordnet werden, gleich. Sollte die Geometrie der jeweiligen Näpf- chen und/oder Vertiefungen unterschiedlich sein, muß also ein Geometriefaktor in die Bestimmung der Absorptionen mit einbezogen werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform be- trifft die Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei die dritte Lösung hergestellt wird, indem ei- ne Lösung des ersten Stoffes mit einer Lösung des zweiten Stoffes gemischt wird und dabei die Volumi- na und/oder Stoffkonzentrationen der für die Her- stellung der dritten Lösung verwendeten beiden Lö- sungen jeweils gleich denen der ersten und zweiten Lösung sind.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzug- ten Ausführungsform ein vorgenanntes Verfahren, wo- bei die Schichthöhe der dritten Lösung in dem Näpf- chen oder der Vertiefung, in der sie sich befindet, gleich der Summe der Schichthöhen der ersten und zweiten Lösung in dem Näpfchen und der Vertiefung sind, in denen sie sich befinden.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, daß die Schichthöhen der ein- gefüllten ersten, zweiten und/oder dritten Lösung standardisiert sind, das heißt daß die Bildung von Menisken oder Meßfehler aufgrund unterschiedlicher Einfüllhöhen der Lösungen vermieden werden, durch die erfindungsgemäß vorgesehene Verwendung eines Deckels mit mindestens einer Vertiefung, wobei das Bodenteil dieser Vertiefung eine definierte Distanz des Lichtweges in dem Näpfchen von Bodenteil des Näpfchens zum Bodenteil der darüber angeordneten Vertiefung bereitstellt.

Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung ei- ner Mikrotiterplatte vor, die eine Vielzahl von Näpfchen aufweist, wobei die Mikrotiterplatte zu- mindest teilweise von einem Deckel abgedeckt ist, der mindestens eine einem Näpfchen zugeordnete Ver- tiefung aufweist. Derartige Probenträgersysteme werden in ihren wesentlichen Merkmalen beispiels- weise in der DE 44 05 375 A1 beschrieben, die hin- sichtlich der Herstellung und des Aufbaus solcher Probenträgersysteme in den vorliegenden Offenba- rungsgehalt mit einbezogen wird.

Die Erfindung verwendet also ein Probenträgersy- stem, das zwei Elemente, nämlich eine Mikrotiter- platte und einen dieser Mikrotiterplatte zugeordne- ten Deckel umfaßt.

Der Deckel umfaßt mindestens eine eine oder mehrere Seitenwände und ein Bodenteil aufweisende Vertie- fung, vorzugsweise eine Vielzahl von Vertiefungen, die jeweils aus Seitenwänden und einem Bodenteil aufgebaut sind und über eine Grundplatte und/oder ein Rahmenteil miteinander verbunden sind. Der Dek- kel kann die Mikrotiterplatte teilweise oder voll- ständig abdecken, wobei vorgesehen sein kann, daß nur Bereiche des Deckels Vertiefungen enthalten, denen Näpfchen zugeordnet sind, wobei andere Berei- che des Deckels eben sind. Der Deckel ist der Mi- krotiterplatte derart zugeordnet, daß er beispiels- weise auf diese gesteckt oder gelegt werden kann, wobei die Vertiefungen des Deckels von oben in die Öffnungen der Näpfchen der Mikrotiterplatte hinein- ragen oder in diese eingreifen, also diesen zuge- ordnet sind. Der Deckel kann aber auch auf-und zu- klappbar, beispielsweise mittels Scharnieren, an der Mikrotiterplatte angebracht sein, mit dieser einstückig ausgebildet oder ihr sonstwie fest zuge- ordnet sein, wobei in letzteren beiden Ausführungs- formen jeweils eine Einfüllöffnung zum Beschicken der Näpfchen vorzusehen ist.

In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß der Deckel nur eine einzige Vertiefung aus Boden- teil, Seitenwänden und gegebenenfalls umlaufendem umgebogenem Rand oder Kragen aufweist, wobei die Grundplatte des Deckels planar vollständig oder teilweise die restliche Mikrotiterplatte überdeckt.

Dieser Deckel mit nur einer einzelnen Vertiefung kann in Kombination mit verschiedenen Mikrotiter- platten zum Einsatz kommen. Bei Verwendung von Mi- krotiterplatten mit herkömmlicher Näpfchenform oder entsprechend geformter Näpfchen neuartiger Mikroti- terplatten dient der obere Rand beziehungsweise Kragen des Deckels als Auflagefläche auf der Mikro- titerplatte. Auch der Boden des Deckels der vorlie- genden Erfindung kann, bei angepaßter Näpfchenform der Mikrotiterplatte, als Auflagefläche auf der Mi- krotiterplatte ausgenutzt werden. Die Grundplatte des Deckels kann als Steg ausge- führt sein und/oder vorteilhafterweise ein die Mi- krotiterplatte ganz oder teilweise umfassendes Rah- menteil umfassen, das dem Aufstecken des Deckels auf eine Mikrotiterplatte dient und den Deckel ortsfest auf der Mikrotiterplatte hält. Der Deckel kann die Vertiefungen in Form einer Reihe enthal- ten, das heißt aus hintereinander angeordneten Ver- tiefungen aufgebaut sein. Es kann aber auch vorge- sehen sein, daß der Deckel Vertiefungen in Form ei- ner Matrix enthält. Die Erfindung sieht selbstver- ständlich auch vor, daß ein derartiger Deckel nur Bereiche, beispielsweise eine Reihe einer Mikroti- terplatte bedeckt, das heißt dieser zugeordnet ist. Demgemäß kann einer Näpfchen-Reihe einer Mikroti- terplatte ein Deckel, der in Reihenform ausgeführt ist, zugeordnet sein. Es kann aber auch vorgesehen sein, einer beispielsweise als Matrix ausgeführten Mikrotiterplatte einen als Matrix ausgeführten Dek- kel zuzuordnen, der sämtliche Näpfchen der Mikroti- terplatte bedeckt. Die konkrete Ausbildung des Dek- kels richtet sich nach der Gestaltung der einge- setzten, herkömmlichen oder neu konstruierten, Mi- krotiterplatte.

Insbesondere ist es bevorzugt, das Verfahren mit einem Deckel für die Mikrotiterplatte auszuführen, der einen Teil der Näpfchen der Mikrotiterplatte planar, das heißt ohne Vertiefungen überdeckt, und so einen Probenbereich der darunter liegenden Mi- krotiterplatte bildet, wobei ein anderer Teil des Deckels einzelnen Näpfchen zugeordnete Vertiefungen umfaßt und den Referenzbereich der Mikrotiterplatte abdeckt. In den Probenbereich der Mikrotiterplatte, der also keine übereinander angeordnete Lokalisati- on von Proben zuläßt, wird die dritte Lösung, also das Gemisch des ersten und zweiten Stoffes einge- füllt, während in die Näpfchen des Referenzbe- reichs, in die jeweils die Vertiefungen hineinra- gen, übereinander angeordnet die erste und die zweite Lösung getrennt voneinander eingefüllt wer- den können.

Selbstverständlich ist es jedoch auch möglich, ei- nen Deckel vorzusehen, der im Probenbereich einer Mikrotiterplatte Vertiefungen aufweist. Dabei kann es erfindungsgemäß auch vorgesehen sein, die dritte Lösung ausschließlich in die Vertiefung des Deckels und nicht in das Näpfchen selbst oder aber in bei- de, das heißt das Napfchen und die ihm zugeordnete Vertiefung einzufüllen.

Ein Merkmal der erfindungsgemäß eingesetzten Deckel ist es, daß diese jeweils eine Vertiefung für je- weils ein dieser Vertiefung zugeordnetes Näpfchen dergestalt bereitgestellt, daß das Bodenteil der Vertiefung in oder auf der Öffnung des Näpfchens angeordnet ist und eine definierte lichte Weite be- ziehungsweise Distanz zwischen Bodenteil des Näpf- chens und Bodenteil der Vertiefung bereitstellt, die teilweise oder vollständig durch Probenflüssig- keit aufgefüllt wird. Demgemäß wird in vorteilhaf- ter Weise eine definierte Schichtdicke beziehungs- weise Schichthöhe der zu untersuchenden Probe be- reitgestellt, da der Lichtstrahl unabhängig von Einfüllhöhe und Meniskenbildung einen definierten Weg vertikal innerhalb der Probe zurücklegt. Daher muß die Vertiefung so ausgebildet sein, daß keiner- lei Probenflüssigkeit aus dem Näpfchen in diese ge- langen kann, das heißt die Vertiefung muß nach un- ten und zur Seite hin flüssigkeitsdicht und demge- mäß von, beispielsweise einstückig miteinander aus- gebildeten, Seitenwänden und einem Bodenteil um- schlossen sein, wobei vorteilhafterweise nach oben eine Öffnung bleibt. Die Abmessung und Geometrie der Vertiefungen sind beliebig und hängen besonders von der Abmessung und Geometrie der Näpfchen ab. Es kann erfindungsgemäß auch vorgesehen sein, die Ver- tiefung des Deckels beispielsweise als eine Be- schickungsöffnung aufweisenden allseits umschlosse- nen Hohlkörper auszuführen.

Die lichte Höhe der Näpfchen der Mikrotiterplatte, das heißt die Distanz vom Boden des Näpfchens bis zu dessen oberer Kante, wird durch das in die Näpf- chen eingreifende Bodenteil der Vertiefung redu- ziert. Da in vorteilhafter Weise vorgesehen sein kann, daß sämtliche oder viele Vertiefungen des Deckels ebenso wie die Näpfchen die gleichen Abmes- sungen und Geometrien aufweisen, werden sämtliche durch die Bodenteile der Vertiefungen teilweise ab- gedeckten Näpfchen im Hinblick auf die Weglänge des die Näpfchen vertikal durchdringenden Lichtstrahls standardisiert, das heißt die Schichtdicke bezie- hungsweise Schichthöhe, also die vom vertikal durchdringenden Lichtstrahl durchmessene Distanz in dem vollständig gefüllten Napfchen beziehungsweise der Vertiefung in allen abgedeckten Näpfchen wird auf eine identische Größe gebracht, wodurch eventu- ell vorhandene Unterschiede in der Einfüllhöhe oder der Meniskenbildung nivelliert werden. Dabei kann in besonders vorteilhafter Weise vorgesehen sein, daß die Querschnittsfläche des Näpfchens, das heißt die Fläche quer zur Einfüllhöhe, auf der Höhe des Näpfchens, auf der das Bodenteil der Vertiefung an- geordnet ist, größer als die Fläche des Bodenteils der Vertiefung ist. Die Folge davon ist, daß das Bodenteil nicht die gesamte lichte Weite des Näpf- chens in seiner Öffnung abdeckt, sondern nur einen Teil davon, so daß in dem Näpfchen vorhandene Pro- benflüssigkeit nach oben verdrängt werden kann, wo- bei trotzdem ein bezüglich seiner Lange standardi- sierter Strahlenweg gewährleistet ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Mikrotiterplatte eine eine Vielzahl von Näpfchen aufweisende Platte verstanden, wobei die Näpfchen zur Aufnahme von Proben dienen, die einer spektrophotometrischen oder fluorimetrischen Be- stimmung unterzogen werden sollen. Die Platte und die Näpfchen können einstückig miteinander ausge- bildet sein, es kann aber auch vorgesehen sein, die Näpfchen als separate Einheiten oder als zusammen- gefaßte Einheiten in einer Platte und/oder einem Rahmenteil herausnehmbar oder nicht herausnehmbar anzuordnen. Demgemäß wären Platten und/oder Rahmen als Halterung für Küvetten beziehungsweise Näpfchen oder Küvetteneinheiten beziehungsweise-verbünde ausgeführt. Die Näpfchen können in Form von einfa- chen Vertiefungen, wells, Mulden, Küvetten, Röhrchen oder ähnlichem ausgeführt sein, wobei de- ren Querschnitt ebenfalls beliebig ist und demgemäß beispielsweise kreisförmig, polygonal, quadratisch, rechteckig oder oval ausgeführt ist. Die Anzahl der Näpfchen pro Mikrotiterplatte kann beliebig sein, wobei üblicherweise die Näpfchen in Form einer Ma- trix, beispielsweise mit 96,384 oder 1536 Näpf- chen, ausgebildet sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Mikrotiter- platte aber auch die Anordnung von Näpfchen in Rei- he, das heißt nicht in Form einer Matrix, verstan- den, wobei demgemaß beispielsweise 8 Näpfchen auf- weisende Platten oder 8 Näpfchen aufweisende je- weils über Stege miteinander verbundene Platten ebenfalls als Mikrotiterplatten bezeichnet werden. Die Näpfchen der Mikrotiterplatte weisen im allge- meinen nach oben hin eine Öffnung auf, so daß die Proben eingefüllt werden können. Die Näpfchen wer- den zur Seite hin durch Seitenwände und nach unten hin durch ein Bodenteil gebildet, wobei diese Ele- mente einstückig miteinander ausgeführt sein kön- nen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Stoff ein Analyt verstanden, der mit- tels spektrophotometrischer oder fluorimetrischer Verfahren bestimmbar, also nachweisbar und/oder quantifizierbar, ist, das heißt als Chromophor wirkt. Ein derartiger Analyt kann beispielsweise ein Protein, ein Peptid, ein Protein-oder Peptin- derivat, ein Metallkomplex, ein Ligand, ein Farb- stoff, eine Nukleinsäure oder eine sonstige nieder- oder makromolekulare Verbindung sein. Die erfin- dungsgemäß einzusetzenden Mikrotiterplatten können aus beliebigem Material sein, beispielsweise aus Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polypropylen, Quarz- glas oder ähnlichem. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, Mikrotiterplatten mit beschichte- ten Näpfchen einzusetzen. Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren zur Verfügung, das eine universell einsetzbare, schnelle, parallele und damit kostengünstige Unter- suchung von Wechselwirkungen unterschiedlicher Stoffe ermöglicht. Es wird damit vorteilhaft mög- lich, Eigenschaften von Stoffen mit geringen Halb- wertzeiten zu erfassen. Ein weiterer Vorteil be- steht darin, daß Konzentrationseffekte, die die Empfindlichkeit herabsetzen, minimiert werden und zudem Stoffe mit geringer Löslichkeit besser unter- sucht werden können. Schließlich werden Mischungs- fehler, die bei der herkömmlichen Verfahrensweise auftreten, verringert.

Die Erfindung betrifft auch eine der vorstehend be- schriebenen Mikrotiterplatten, also eine Mikroti- terplatte mit einer Vielzahl von Näpfchen, wobei der Mikrotiterplatte ein Deckel mit mindestens ei- ner einem Näpfchen zugeordneten Vertiefung zugeord- net ist und wobei der Deckel eine die mindestens eine Vertiefung aufweisenden Deckelgrundplatte und eine, vorzugsweise im wesentlichen ebene, Dek- keloberplatte umfaßt und wobei die Deckeloberplatte vertikal zu der Deckelgrundplatte bewegbar ist und der Abdeckung der Vertiefung in der Deckelgrund- platte dient. Eine derartige Vorrichtung ist vor- teilhaft insofern, als daß definierte Schichthöhen sowohl in den Näpfchen der Mikrotiterplatte als auch in der Vertiefung des Deckels ermöglicht wer- den kann.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer eine Vielzahl von Näpfchen aufweisenden Mikrotiter- platte mit einem Deckel, wobei der Deckel minde- stens eine einem Näpfchen zugeordnete Vertiefung aufweist, zur Durchführung eines Verfahrens zur differenzspektroskopischen oder-fluorimetrischen Bestimmung der Wechselwirkung von Stoffen, wobei in bevorzugter Weise der Deckel aus zwei vertikal zu- einander beweglichen Platten besteht, wovon die un- tere Platte die Vertiefungen ausbildet.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausfüh- rungsbeispiele und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.

Die Figuren zeigen : Figur 1 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer erfindungsgemäß verwendeten Mikro- titerplatte mit Deckel, Figur 2 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer anderen Ausführungsform einer er- findungsgemäß verwendeten Mikrotiterplat- te mit Deckel, Figur 3 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer weiteren Ausführungsform einer er- findungsgemäß verwendeten Mikrotiterplat- te mit Deckel, Figur 4 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer weiteren Ausführungsform der erfin- dungsgemäß verwendeten Mikrotiterplatte mit Deckel in geöffnetem und geschlosse- nem Zustand.

Im folgenden werden bau-oder funktionsgleiche Tei- le mit denselben Bezugszeichen versehen.

Die Figur 1 zeigt eine Mikrotiterplatte 2 mit einem Deckel l. Die Mikrotiterplatte 2 weist zylindrische nach oben offene Näpfchen 11 auf, die aus jeweils einem Bodenteil 13 und Seitenwänden 15 aufgebaut sind. Der Deckel 1 weist zumindest eine einem Näpf- chen 11 zugeordnete zylindrische, nach oben offene Vertiefung 17 auf, wobei die Vertiefung 17 ein Bo- denteil 21 und Seitenwände 19 aufweist. Dargestellt ist auch die Grundplatte 23 des Deckels 1 der wei- tere nicht dargestellte Vertiefungen 17 miteinander verbindet und eine exakte Positionierung bezie- hungsweise Zuordnung der Vertiefungen 17 in den Näpfchen 11 gewährleistet. Der Deckel 1 ist so aus- gebildet, daß zumindest ein Näpfchen 11 von einer ebenen, keine Vertiefung aufweisenden Fläche 25 überdeckt ist, während ein weiteres Näpfchen 11 die Vertiefung 17 des Deckels aufnimmt. Bei auf die Mi- krotiterplatte 2 aufgesetztem Deckel 1 bilden sich in dem in der Figur 1 linken Näpfchen 4 also zwei vertikal übereinander angeordnete Kammern, nämlich das untere Lumen des Näpfchens 11 sowie das Lumen der Vertiefung 17. Diese Anordnung der Vertiefung 17 im Lumen des Näpfchens 11 kann der getrennten Aufnahme der Lösungen dienen und wird als Referenz- bereich 6 bezeichnet. In den Bereichen der Mikroti- terplatte 2, in denen der Deckel 1 eben ausgeführt ist und keine Vertiefung in das Lumen eines darun- ter befindlichen Näpfchens 11 hineinragt, bildet sich im Lumen des Näpfchens 11 keine getrennte Kom- partimentierung aus. Dieser Bereich wird als Pro- benbereich 7 bezeichnet.

Das Lumen des Näpfchens 11 im Probenbereich 7 ist aber seine gesamte Höhe und Innenumfang mit einer Seitenwandverdickung 28 versehen. Diese Wandverdik- kung reduziert die Querschnittsfläche des Lumens auf die im unteren Bereich des Lumens im Näpfchen 11 des Referenzbereichs 6.

Dargestellt ist auch eine um den gesamten Näpfchen- innenumfang verlaufende Seitenwandverdickung 27 im unteren Bereich des Lumens des Näpfchens 11 im Re- ferenzbereich 6. Diese Verdickung dient dazu, die Querschnittsfläche im unteren Bereich des Lumens des Näpfchens 11 genauso groß auszuführen wie die Querschnittsfläche der darüber angeordneten Vertie- fung 17.

Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Be- stimmung der Wechselwirkung zweier Stoffe A und B eine Lösung 3 von Stoff A in die Vertiefung 17 des Deckels 1 gegeben und eine Lösung 4 des Stoffes B in das Lumen des Näpfchen 11 unterhalb der Vertie- fung 17, wobei das Volumen der Lösung 4 so gewählt ist, daß die Flüssigkeitsoberkante unterhalb des Bodenteils 21 der Vertiefung 17 liegt. In den Pro- benbereich 7, das heißt in das Näpfchen 11, dem keine Vertiefung 17 zugeordnet ist, wird eine drit- te Lösung 5 enthaltend ein Gemisch von Lösungen der Stoffe A und B eingefüllt, wobei jeweils gleiche Volumina, Konzentrationen und sonstige Parameter gewählt werden, wie sie bereits für die Lösungen im Referenzbereich 6 verwendet wurden. Es ergibt sich aufgrund gleicher Vertiefungs-und Näpfchengeome- trie im Probenbereich eine Schichthöhe, die den ad- dierten Schichthöhen der Lösungen 3 und 4 im Refe- renzbereich 6 gleicht. Die Anzahl und Dicke der vom Lichtstrahl zu durchdringenden Glas-oder Kunst- stoffböden sowie der außerhalb der Lösungen durch- messene Lichtweg ist im Proben-und Referenzbereich identisch. Nach gegebenenfalls notwendiger Durch- mischung der Lösung im Probenbereich 7 können nun mittels eines Spektrophotometers, zum Beispiel ei- nes MTP-Readers, oder eines Fluoreszenzmeßgerätes die Wechselwirkung der Stoffe A und B analysiert werden, indem eine vertikale von unten nach oben oder von oben nach unten erfolgende Analyse der spektralen oder fluorimetrischen Eigenschaften ver- gleichend den Referenzbereich 6 mit dem Probenbe- reich 7 durchgeführt wird (siehe Doppelpfeile).

Sind die fluorimetrischen oder spektrophotometri- schen Eigenschaften der vertikal im Referenzbereich 6 bestimmten getrennten ersten und zweiten Lösungen 3 und 4 gleich denen der im Probenbereich 7 befind- lichen dritten Lösung 5, liegt keine Wechselwirkung vor, andernfalls wirken die Substanzen A und B mit- einander wechsel.

Die in Figur 2 für das erfindungsgemäße Verfahren dargestellte Mikrotiterplatte 2 mit dazugehörigem Deckel 1 entspricht im wesentlichen der Vorrichtung nach Figur 1. Anders als in Figur 1 unterscheidet sich hier jedoch der Probenbereich nicht von dem Referenzbereich 6, das heißt, der Deckel 1 ist in seinem gesamten Bereich gleich aufgebaut, so daß jedem Näpfchen 11 eine Vertiefung 17 so zugeordnet ist, daß diese in das Lumen des Näpfchens 11 hin- einragt. Referenzbereich 6 und Probenbereich 7 wer- den lediglich durch die Art der Befüllung der Näpf- chen 11 und Vertiefungen 17 definiert. Der Refe- renzbereich 6 der Mikrotiterplatte 2 liegt dort vor, wo die Lösungen 3,4 der Proben A und B ge- trennt und übereinander vertikal bestimmt werden, nämlich im unteren Bereich des Lumens eines Näpf- chen 11 und im darüberliegenden Lumen der Vertie- fung 17. Der Probenbereich 7 der Mikrotiterplatte 2 befindet sich dort, wo die dritte Lösung 5 als Ge- misch der Lösungen 3 und 4 eingefüllt wird. Dies kann der untere Bereich des Lumens 11 ebenso wie die Vertiefung 17 sein, die diesem Näpfchen 11 zu- geordnet ist. Möglich ist es auch, die dritte Lö- sung 5 auf Vertiefung 17 und Näpfchen 11 zu vertei- len. Auch hier ist die vertikal zur Mikrotiterplat- tengrundfläche erfolgende Einstrahlung des Lichtes durch einen Doppelpfeil angedeutet.

In der Figur 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäß zu verwendende Mikrotiter- platte 2 und deren Deckel 1 angegeben, wobei im Un- terschied zu der Vorrichtung der Figuren 1 und 2 Näpfchen 11 und Vertiefungen 17 verwendet werden, die sich von oben nach unten verjüngen, das heißt, daß ihre jeweiligen Bodenteile 21 und 13 eine ge- ringere Querschnittsfläche als im oberen Bereich ihrer Lumen aufweisen.

Die Figur 4 stellt ebenfalls eine Mikrotiterplatte 2 mit einem Deckel 1 dar, wobei die linke Abbildung der Figur 4 diese Vorrichtung in einem Zustand zeigt, in dem der Deckel 1 noch nicht auf die Mi- krotiterplatte 2 gesetzt wurde, während die rechte Abbildung den auf die Mikrotiterplatte 2 aufgesetz- ten Deckel 1 zeigt. Diese Mikrotiterplatte weist einen zweigeteilten Deckel 1 auf.

Das zylindrische Näpfchen 11 im Referenzbereich 6 der Mikrotiterplatte 2 weist in seinem unteren Be- reich um seinen Umfang in das Lumen nach innen rei- chend eine Seitenwandverdickung 29 auf, die sich nach oben bis in etwa die Hälfte der Höhe des Näpf- chens 11 erstreckt. Im Probenbereich 7 der Mikroti- terplatte 2 ist ebenfalls eine derartige Seiten- wandverdickung 31 eines zylindrischen Näpfchens 11 vorgesehen, die sich allerdings nach oben bis knapp über den oberen Rand 55 der Mikrotiterplatte 2 fortsetzt. In beiden Fällen dient die Wandverdik- kung 29 beziehungsweise 31 der Lumenverkleinerung.

In ihren oberen Begrenzungsbereichen weisen beide Wandverdickungen 29 und 31 ringförmige Pufferkanäle oder-betten 39 und 41 auf.

Der Deckel 1 ist zweiteilig aus einer Deckelgrund- platte lb und einer darüber angeordneten, zumindest in vertikaler Richtung bewegbaren ebenen Dek- keloberplatte la ausgeführt. Die Platten la und lb können über Schraub-oder Klemmverbindungen, Schar- niere oder ähnliches miteinander verbunden sein.

Die Platte la kann auch nur auf die Deckelgrund- platte lb aufgelegt sein. Die Deckelgrundplatte lb formt die zylindrische Vertiefung 17, also deren Seitenwände 19 und den Bodenteil 21, aus. Die Ver- tefung 17 ist ringförmig von einem durch eine ring- förmige Wand 42 von der Vertiefung getrenntes Puf- ferbett 35 umgeben. Die Querschnittsfläche des Bo- denteils 21 entspricht der Querschnittsfläche des lichten Lumens des Bodenteils 13 der Näpfchen 11.

In einem anderen Bereich der Deckelgrundplatte lb ist keine Vertiefung 17, sondern statt dessen eine ebene Fläche 37 vorgesehen.

Der Deckel 1 wird so auf die Mikrotiterplatte 2 ge- setzt, daß die Vertiefung 17 in das Lumen eines im Referenzbereich 6 befindlichen Näpfchens 11 ragt, also in ein Näpfchen 11, dessen Wandverdickung 29 nur bis etwa zur Hälfte seiner Höhe reicht. Der ebene Bereich 17 der Deckelgrundplatte lb schließt im geschlossenen beziehungsweise aufgelegten Zu- stand im Probenbereich 7 das Lumen des Näpfchens 11 nach oben ab, dessen Wandverdickung 31 bis knapp über den oberen Rand 55 der Grundplatte 23 der Mi- krotiterplatte 2 reicht.

Wird nun eine Lösung 3 in die Vertiefung 17 im Re- ferenzbereich 6, eine Lösung 4 in den unteren Be- reich des Lumens von Näpfchen 11 im Referenzbereich 6 und die dritte Lösung 5 in den Probenbereich 7 eines anderen Näpfchens 11 gefüllt und der Deckel aufgesetzt, setzt das Bodenteil 21 der Vertiefung 17 direkt auf der Oberkante 57 der Wandverdickung 29 im unteren Bereich des Näpfchens 11 auf oder schließt mit diesem ab und verhindert, sofern genü- gend Probenflüssigkeit 4 eingefüllt ist, eine stö- rende Meniskenbildung und unterschiedliche Füllhö- hen. So wird eine definierte Schichthöhe bereitge- stellt. Eine baugleiche Anordnung in weiteren, nicht dargestellten Näpfchen 11 ermöglicht eine Standardisierung der Schichthöhen und so eine Ver- ringerung von Meßfehlern. Möglicherweise beim Pro- beneinfüllen oder Deckelaufsetzen herausgedrückte Probenflüssigkeit 4 wird in das ringförmig in den oberen Bereich der Wandverdickung 29 eingeformte Pufferbett 39 abgeleitet. Ebenso liegt im geschlos- senen Zustand die ebene Fläche 37 der Deckelgrund- platte 1b auf der Oberkante 59 der Wandverdickung 31 des Näpfchens 11 im Probenbereich 7, um so bei geeigneter Füllhöhe eine Meniskenbildung und unter- schiedliche Füllhöhen zu verhindern und eine defi- nierte Schichthöhe zu gewährleisten. Gegebenenfalls herausgedrückte dritte Lösung 5 wird in. das ring- förmig ausgeführte Pufferbett 41 im oberen Bereich der Verdickung 31 abgeleitet. In geschlossenem Zu- stand ist das Deckeloberteil la auf die Deckel- grundplatte 1b gelegt und gegebenenfalls fixiert, wobei das Deckeloberteil la mit der Oberkante 43 der Wand 42 abschließt und bei voller Befüllung störende Meniskenbildung und unterschiedliche Füll- höhen verhindert. Eventuell herausgedrückte Proben- flüssigkeit 3 wird in das in der Deckelgrundplatte 1b ringförmig um die Vertiefung 17 ausgeführte Puf- ferbett 35 abgeleitet. Auf diese Weise wird er- reicht, daß das Licht ohne Fehlerquellen wie unter- schiedliche Füllhöhen oder Meniskenbildung sowohl die getrennten Lösungen 3 und 4 als auch die dritte Lösung 5 durchdringen kann.

Die Vorrichtung nach Figur 4 ermöglicht also das Durchführen erfindungsgemäßer Verfahren mit stan- dardisierten Schichthöhen sowohl im Referenz-als auch im Probenbereich 6,7 und eignet sich daher besonders für eine parallelisierte effiziente und genaue differenzspektroskopische oder-fluorime- trische Messung. Als besonders vorteilhaft erweist sich die durch den zweigeteilten Deckel 1 ermög- lichte Standardisierung der Schichthöhen auch in der Vertiefungen 17 des Deckels 1. Erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung dieser Vorrichtung, also einer Vorrichtung mit einer Einrichtung, zum Bei- spiel einer ebenen Platte la, zur Standardisierung der Schichthöhe in einer Vertiefung 17 des Deckels 1, sind also vorteilhaft und für automatisierte Be- stimmungen besonders geeignet.