Gibberellinsäure, gibberellic acid (GA), gehört zur Gruppe der Phytohormone, die wie die tierischen Hormone dadurch gekennzeichnet sind, dass sie organischer Natur sind, in geringen Mengen gebildet werden und ihr Bildungs-und Wirkungsort innerhalb eines Organismus verschieden sind. Im Gegensatz zu tierischen Hormonen besitzen die Phytohormone aber eine geringe Organ-und Wirkungsspezifität. Ihre Wirkung entfalten die Phytohormone auf verschiedene Stoffwechselprozesse in der Pflanze, wie etwa Wachstum oder Blüteninduktion.

Neben den Gibberellinen sind vier weitere Hauptgruppen von Pflanzenhormonen bekannt : Auxine, Cytokinine, Abscisine und Ethylen. Dabei wirken die Auxine und Cytokinine hauptsächlich positiv auf physiologische Prozesse, während die Abscisine und Ethylen eine eher negative Wirkung auf Stoffwechselprozesse der Pflanze entfalten. Die Hormone verschiedener Gruppen wirken aber nicht separat, sondern beeinflussen auch die Aktivität der anderen Hormongruppen, so dass die physiologische Reaktion letztlich vom Mengenverhältnis der positiv und negativ wirkenden Hormone abhängig ist.

Die Gibberellinsäure 3 (GA3) wurde in den 20er Jahren des 20. Jahrhunderts aus dem Pilzpathogen Gibberellafujikori isoliert, das Reis befällt und ein starkes

Streckungswachstum auslöst, was zur Folge hat, dass die Reiskörner kleiner und der Ertrag geringer werden. Später wurde herausgefunden, dass die wirksamen Stoffe nicht nur in diesem Pilz, sondern auch endogen in Pflanzen vorkommen, wo sie verschiedene Funktionen erfüllen. Seither wurden mindestens 125 Mitglieder der Gibberellin-Familie identifiziert, von denen etwa 30% biologisch aktiv sind. Alle höheren Pflanzen enthalten mindestens ein, üblicherweise aber mehrere Gibberelline.

Die höchsten Gibberellinkonzentrationen können in jungen und unreifen Geweben, die sich rasch entwickeln, detektiert werden.

Allen Mitgliedern der Gibberellin-Familie gemeinsam ist ein Gibbanskelett, das ein Diterpen aus vier Ringen ist und aus vier Isopreneinheiten über eine Reihe von Zyklisierungs-und Oxidationsreaktionen gebildet wird. Ein Schlüsselenzym für die Synthese der Gibberelline ist die GA20-Oxidase, deren Expression durch GA Feedback-reguliert wird. Der Abbau der Gibberelline dagegen wird durch eine 2ß- Hydroxylierung eingeleitet, die von der GA2-Oxidase katalysiert wird. Die Expression sowohl der Schlüsselenzyme der GA-Synthese als auch der des GA- Abbaus wurde in der Vergangenheit moduliert, um GA-abhängige Prozesse in transgenen Pflanzen zu beeinflussen (Coles et al. (1999) Plant J. 17 : 547-556 ; Eriksson et al. (2000) Nature Biotechnology 18 (7) : 784-788 ; Sakamoto et al. (2001) Plant Physiol. 125 : 1508-1516 ; Schomburg et al. (2003) Plant Cell 15 : 151-163).

Die Hauptwirkung der Gibberelline ist die Förderung des Streckungswachstums durch Stimulation der Zellteilung und der Zellstreckung. Dies wird besonders deutlich, wenn Zwergmutanten, z. B. von Bohne oder Mais, in denen die Biosynthese der Gibberelline genetisch blockiert ist, mit exogenen Gibberellinen behandelt werden, wodurch normales Streckungswachstum ausgelöst werden kann. Bei der Regulation des Streckungswachstums wirken die Gibberelline synergistisch mit den Auxinen, die auch in der Lage sind, die Biosynthese der Gibberelline zu fördern.

Eine weitere wichtige Funktion kommt den Gibberellinen bei der Samenkeimung, z. B. der Gerste, zu. In diesem Falle wird GA vom Skutellum des Embryos synthetisiert und freigesetzt und stimuliert die Produktion des stärkeverdauenden Enzyms a-Amylase sowie anderer hydrolytischer Enzyme durch das Aleuron. Die durch die Aktivität der Enzyme entstehenden einfachen Zucker werden durch das Skutellum absorbiert und dienen dem Embryo als Wachstumsstoffe. In diesem physiologischen System konnte erstmals gezeigt werden, dass GA in der Lage ist, die Aktivierung von Genen auszulösen, in diesem Falle der a-Amylase. Diese Stimulation der Transkription wird gehemmt durch das antagonistische Hormon Abscisinsäure, das die Dormanz induziert und dessen Wirkung durch ein Ansteigen der GA-Konzentration überwunden werden muss.

Die Parthenokarpie, die Fruchtbildung ohne Gametenkopulation, wie sie zum Beispiel bei Äpfeln, Trauben und Kürbissen auftritt, kann ebenfalls durch GA-Gabe ausgelöst werden.

Weiterhin sind Gibberelline in der Lage, die Knospenruhe zu brechen. Dies geschieht natürlicherweise durch eine kälteinduzierte, allmähliche Zunahme der Gibberellinkonzentration während der Knospenruhe, so dass nach Überschreiten eines bestimmten Schwellenwerts die hemmende Wirkung der Abscisinsäure überwunden wird.

Alle diese oben beschriebenen Funktionen werden dadurch erfüllt, dass GA extrazellulär an ihren Rezeptor bindet und einen intrazellulären Signalweg initiiert, der letztlich zur Veränderung der Genexpression führt. Komponenten dieses Signalwegs wurden durch Mutanten identifiziert, die ein verändertes Wachstum zeigen. Mutanten, die durch Zwergwachstum gekennzeichnet sind, weisen auf

Komponenten hin, die die GA-Wirkung positiv beeinflussen, während Mutanten mit verstärktem Wachstum wahrscheinlich negative Regulatoren der GA-Antwort betreffen (Olszewski et al. (2002) The Plant Cell, Supplement, S61-S80).

Auf diese Weise konnten unter anderem das Protein DWARF1, bei dem es sich um die a-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins handelt und das somit wichtig für die Signaltransduktion ausgehend vom Rezeptor ist, und der Transkriptionsfaktor GAMYB als positive Regulatoren des GA-Weges identifiziert werden. GAMYB ist ein GA-induzierter Myb-Transkriptionsfaktor, der an das GA-"response element" (GARE) im Promotor z. B. der a-Amylase bindet und deren Expression stimuliert.

Die Expression von GAMYB selbst wird auch durch GA stimuliert.

Als negative Regulatoren des GA-Weges während der gesamten Pflanzenentwicklung wurden die RGA/GAI-Proteine identifiziert. Die Mitglieder dieser Familie wirken als transkriptionelle Regulatoren und werden durch einen aktiven GA-Signalweg inaktiviert, indem sie destabilisiert werden. Ebenfalls als negative Regulatoren bzw. Repressoren des GA-Wegs wirken der Transkriptionsfaktor HRT und die mutmaßliche O-GlnAc-Proteintransferase SPY.

Die oben beschriebenen Wirkungen der Gibberelline auf beispielsweise das Streckungswachstum und die Samenkeimung werden in verschiedenen wirtschaftlichen Anwendungen ausgenutzt. So werden z. B. Trauben mit GA behandelt, um die Traubengröße und den Abstand der einzelnen Beeren innerhalb eines Fruchtstandes zu erhöhen. Durch letzteres wird die Gefahr des Pilzbefalles oder anderer Krankheiten minimiert. Ebenfalls zu erhöhtem Wachstum und damit erhöhtem Ertrag führt die GA-Behandlung bei Sellerie und Zuckerrohr. Bei zweijährig blühenden Nutzpflanzen, die natürlicherweise eine Kältebehandlung benötigen, wie etwa Rote Beete oder Kohl, bewirkt die Applikation von GA eine

Blütenbildung jedes Jahr. In Brauereien wird GA verwendet, um den Stärkeabbau im Mälzereiverfahren dadurch zu steigern, dass die GA-induzierte a-Amylase verstärkt exprimiert wird.

Andererseits besteht bei verschiedenen Pflanzen auch wirtschaftliches Interesse, die Gibberellinwirkung zu hemmen. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn das Streckungswachstum auf Kosten des Ertrages geht, wie etwa bei Weizen oder Reis.

So trugen Mutanten des GA-Weges in den siebziger Jahren zur grünen Revolution" beim Anbau von Weizen bei, da diese Mutanten kürzer sind und dafür mehr Ausbeute liefern, da sie wenig Energie in das Streckungswachstum, aber viel in die reproduktiven Teile investieren. Zusätzlich sind diese Pflanzen resistenter gegenüber Schäden, die von Wind und/oder Regen hervorgerufen werden, da sie standfester sind. Ebenfalls genutzt wird die GA-Hemmung bei der Zucht von Zierpflanzen wie bspw. Chrysanthemen oder Weihnachtssternen, die nach der Behandlung mit Hemm- stoffen der GA-Synthese kürzer und stämmiger bleiben. Weitere wirtschaftliche Anwendungen der GA-Hemmung im Zusammenhang mit dem Pflanzenwachstum bestehen bei der Behandlung von Bäumen in bewohnten Gebieten, wo reduziertes Wachstum erwünscht ist, und bei der Behandlung von Golfrasen.

Des Weiteren kann in manchen Nutzpflanzen, wie etwa Mango, durch verringerte GA-Signale die Blüten-und damit auch die Fruchtbildung gesteigert werden.

Ebenfalls möglich ist es, durch die GA-Hemmung die vorzeitige Keimung verschiedener Nutzpflanzen wie Kartoffel oder Getreide zu verhindern. So führt das "preharvest sprouting", das Auskeimen auf der Ähre nach Regen kurz vor oder während der Ernte, zu Qualitätseinbußen beim Weizen und daraus hergestellten Produkten durch einen verfrühten Stärkeabbau.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für die Hemmung der GA-Antworten ist die Beeinflussung des Lignin/Zellulose-Verhältnisses in Nutzhölzern. Durch Hemmung des GA-Weges kann die Lignifizierung vermindert und der Gehalt an Zellulose gesteigert werden, was insbesondere für die Papierindustrie von Bedeutung ist.

Bisher wurde diese wirtschaftlich bedeutsame Hemmung des GA-Signalwegs hauptsächlich durch die Verwendung von chemischen Hemmstoffen der GA- Synthese, wie etwa Paclobutrazol (Produktname z. B. Profile 2SC oder Bonzi) oder Ancymidol, erreicht. Jedoch besitzen diese chemischen Stoffe die gleichen Nachteile wie andere Pestizide, etwa den möglichen Übergang ins Grundwasser. Darüber hinaus müssen diese chemischen Inhibitoren mehrmals appliziert werden, was ihre Verwendung teuer und aufwendig macht.

Im Rahmen der"grünen Revolution"wurden, wie oben beschrieben, Weizenstämme gezüchtet, die gegenüber der GA-Verabreichung unempfindlich waren. Der Nachteil der Verwendung dieser Mutanten besteht darin, dass die Mutagenisierung ungerichtet erfolgt und dass die Züchtung einen hohen Zeitaufwand erfordert. Auch müssten diese Mutanten für alle Arten von Nutzpflanzen einzeln in einem aufwendigen Verfahren hergestellt werden.

Bei detaillierter Analyse der mutanten Weizenstämme stellte sich heraus, dass in diesen Pflanzen die GAI-Gene, die für einen negativen transkriptionellen Regulator GA-abhängiger Prozesse kodieren, mutiert sind.

Die Tatsache, dass die GAI-Gene den GA-Weg negativ beeinflussen, hat man auch in transgenen Reispflanzen untersucht (Fu et al. (2001), The Plant Cell 13 : 1791- 1802). Diese Pflanzen zeigen unter anderem Zwergwachstum und eine Blockierung der GA-Induktion der a-Amylase im Aleuron.

Die oben aufgeführten Beispiele zeigen, dass ein hoher wirtschaftlicher Bedarf an Pflanzen mit veränderten GA-Antworten besteht, die verschiedene veränderte physiologische Prozesse aufweisen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren zur Hemmung GA- abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen bereitzustellen.

Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gehemmten GA-Antworten zur Verfügung zu stellen. Da die Pflanzen endogen den Repressor exprimieren, wird die teure und aufwendige Verwendung von chemischen GA-Inhibitoren überflüssig.

Diese und andere Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.

Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Modulation GA-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen durch die transgene Expression bestimmter Transkriptionsregulatoren, die in der Fachwelt auch als ET-Faktoren bezeichnet werden und die negative Regulatoren GA-abhängiger Prozesse sind. Gene für derartige Repressoren wurden aus Vicia faba, Brassica napus und Arabidopsis thaliana isoliert. Die erfindungsgemäßen Regulatoren sind durch eine oder mehrere hochkonservierte C-terminale Proteindomänen mit einem typischen Cystein-Muster der Struktur : C-XI-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-C-XIo-Xl 2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR charakterisiert, die durch einen Linker voneinander getrennt sind (vgl. Abb. 1). Jede dieser Proteindomänen bindet ein Zink-Ion, was die ET-Proteine in die

verwandtschaftliche Nähe der Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren rückt. Jedoch besitzen die klassischen Zinkfingerproteine das gemeinsame Sequenzmotiv X3-C-X2-4-C-Xi2-H-X3-4-H-X4, das von dem der ET-Proteine abweicht. Beiden Familien gemeinsam ist aber die Fähigkeit, über die durch das Zink-Ion gefalteten Proteindomänen an die DNA zu binden und die Transkription gewebespezifisch, zeitlich und quantitativ zu regulieren.

Es wurde gefunden, dass durch die Expression von Genen, die für derartige Transkriptionsregulatoren kodieren, unter Kontrolle geeigneter Promotoren in transgenen Pflanzen GA-abhängige Prozesse negativ beeinflusst werden können.

Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung GA-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X2o um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird.

Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei X13 um P, bei X14 um V und/oder bei Xl7 um R.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G ; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V ; bei X3 um I oder K ; bei X4 um L ; bei X5 um D, P, H, C oder Y ; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N ; bei X7 um M oder G ; bei Xs um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S ; bei Xg um I, R, P oder V ; bei Xl0 um S, R, N oder E ; bei Xll um K,

R oder S, bevorzugt um K ; bei X12 um M, K, T, R oder S ; bei X13 um P ; bei Xi4 um V ; bei Xls um G, S, P oder K ; bei X16 um K, G oder R, bevorzugt um G ; bei Xl7 um R ; bei Xis um V oder K, bevorzugt um K ; bei Xl9 um N, E oder Q, bevorzugt um E ; und/oder bei X2o um E oder D, bevorzugt um E.

Im besonderen werden die Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch das Bereitstellen eines Verfahrens zur Hemmung GA-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen gelöst, wobei eine DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus : i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1,3 oder 5 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2,4 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird.

Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei X13 um P, bei X14 um V und/oder bei Xl7 um R.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G ; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V ; bei X3 um I oder K ; bei X4 um L ; beiXsumD, P, H, C oder Y ; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N ; bei X7 um M oder G ; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S ; bei Xg um I, R, P oder V ; bei X10 um S, R, N oder E ; bei Xl um K, R oder S, bevorzugt um K ; bei X12 um M, K, T, R oder S ; bei X13 um P ; bei X14 um V ; bei X15 um G, S, P oder K ; bei X16 um K, G oder R, bevorzugt um G ; bei Xl7 um R ; bei Xl8 um V oder K, bevorzugt um K ; bei Xi9 um N, E oder Q, bevorzugt um E ; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die DNA-Sequenz aus Brassica napus.

Gegenstand der Erfindung sind auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus : i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren,

enthalten sowie rekombinante ET-Proteine, die von diesen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Hemmung der Expression der ET- Proteine, was zu einer Steigerung der Gibberellinsäure-abhängigen Prozesse führt.

Geeignete Verfahren zur Hemmung der Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und schließen ein RNA-Interferenz-, Antisense-und Co- Suppressionsverfahren. Ebenfalls möglich ist es, ausschließlich die Cystein-Domäne der ET-Proteine mit der Aminosäuresequenz C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR wobei es sich bei Xi bis X2o um beliebige Aminosäuren handelt, transgen zu exprimieren, die durch ein"Austitrieren"von interagierenden Faktoren bzw. durch das Binden an die entsprechenden Bindungsstellen im Promotor als dominant- negativer Regulator wirkt.

Der Begriff"Gibberellinsäure-abhängiger Prozess"im Sinne der Erfindung bezeichnet einen physiologischen oder molekularen bzw. biochemischen Vorgang innerhalb der Pflanze bzw. Pflanzenzelle, der durch Gibberellinsäure reguliert wird.

Beispiele für solche Prozesse wurden einleitend erwähnt und sind darüber hinaus der Literatur zu entnehmen. Solche Prozesse schließen auch die durch GA vermittelte Aktivierung auf Transkriptionsebene ein.

Die Begriffe"Hemmung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse"und"gehemmte Gibberellinsäure-abhängige Prozesse", wie sie hier verwendet werden, bedeuten, dass endogene physiologische Vorgänge, die in Wildtyppflanzen durch Gibberellinsäure reguliert werden, in der transgenen Pflanze im Vergleich zu Wildtyppflanzen um mindestens 20% oder 35%, besonders bevorzugt um mindestens

50% oder 65%, insbesondere bevorzugt um mindestens 80% oder 85% und am meisten bevorzugt um mindestens 90% oder 95% vermindert sind.

Die Begriffe"ET-Faktor","ET-Protein","ET-Regulator","negativer Regulator Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse"oder"Regulator im Sinne der Erfindung" werden im Rahmen der Erfindung verwendet für ein Protein, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X2o um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt.

Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei X13 um P, bei X14 um V und/oder bei X17 um R.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G ; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V ; bei X3 um I oder K ; bei X4 um L ; bei X5 um D, P, H, C oder Y ; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N ; bei X7 um M oder G ; bei Xg um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S ; bei Xg um I, R, P oder V ; bei Xio um S, R, N oder E ; bei Xu um K, R oder S, bevorzugt um K ; bei X12 um M, K, T, R oder S ; bei X13 um P ; bei X14 um V ; bei X15 um G, S, P oder K ; bei X16 um K, G oder R, bevorzugt um G ; bei Xl7 um R ; bei Xl$ um V oder K, bevorzugt um K ; bei Xig um N, E oder Q, bevorzugt um E ; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.

Der Begriff"Fragmente der DNA", wie er hier verwendet wird, bezeichnet Teilstücke der DNA, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt,

und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, wobei die von den DNA-Teilstücken kodierten Proteine die gleichen Wirkungen auf Gibberellinsäure-abhängige Prozesse ausüben wie die von der vollständigen DNA-Sequenz kodierten Proteine.

Der Begriff"Fragmente des Proteins", wie er hier verwendet wird, bezeichnet Teilstücke des Proteins, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, wobei die Teilstücke des Proteins die gleichen Wirkungen auf Gibberellinsäure-abhängige Prozesse ausüben wie das Protein in seiner vollen Länge.

Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei X13 um P, bei Xl4 um V und/oder bei Xl7 um R.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G ; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V ; bei X3 um 1 oder K ; bei X4 um L ; bei Xs um D, P, H, C oder Y ; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N ; bei X7 um M oder G ; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S ; bei Xg um I, R, P oder V ; bei Xl0 um S, R, N oder E ; bei Xll um K, R oder S, bevorzugt um K ; bei X12 um M, K, T, R oder S ; bei X13 um P ; bei Xi4 um V ; bei Xi5 um G, S, P oder K ; bei Xi6 um K, G oder R, bevorzugt um G ; bei Xl7 um R ; bei Xig um V oder K, bevorzugt um K ; bei X, 9 um N, E oder Q, bevorzugt um E ; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.

Der Begriff"Hybridisierung unter stringenten Bedingungen"bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung, dass die Hybridisierung in vitro unter

Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Solche stringenten Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (Sambrook und Russell (2001), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3.

Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York).

Allgemein bedeutet"spezifisch hybridisieren", dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z. B. Gesamt-) DNA oder RNA vorliegt.

Der Begriff"stringente Bedingungen"steht allgemein für Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präferenziell an ihre Zielsequenz hybridisieren wird, und zu einem deutlich geringeren Ausmaß oder gar nicht an andere Sequenzen.

Stringente Bedingungen sind z. T. Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Moleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0, 01 bis 1,0 M Natriumionen-Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 und die Temperatur mindestens 30°C für kurze Moleküle (also z. B. 10-50 Nukleotide) beträgt.

Zusätzlich können stringente Bedingungen durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden.

Typische Hybridisierungs-und Waschpuffer haben z. B. folgende Zusammensetzung :

Prähybridisierungslösung : 0, 5 % SDS 5x SSC 50 mM NaPO4, pH 6, 8 0, 1% Na-Pyrophosphat 5x Denhardt's Lösung 100 ßg/ml Lachssperm Hybridisierungslösung : Prähybridisierungslsg.

1x106 cpm/ml Sonde (5-10 min 95°C) 20x SSC : 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat ad pH 7 mit HCl 50x Denhardt's Reagenz : 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Bovine Serum Albumine ad 500 ml A. dest.

Eine typische Verfahrensweise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus : Optional : Blot 30 min in lx SSC/0,1% SDS bei 65°C waschen Prähybridisierung : mindestens 2 h bei 50-55°C Hybridisierung : über Nacht bei 55-60°C Waschen : 05 min 2x SSC/0,1% SDS Hybridisierungstemp.

30 min 2x SSC/0,1% SDS Hybridisierungstemp.

30 min lx SSC/0,1% SDS Hybridisierungstemp.

45 min 0,2x SSC/0,1% SDS 65°C 5 min 0, 1x SSC Raumtemperatur

Der Fachmann weiß, dass die genannten Lösungen und das dargestellte Protokoll je nach Anwendung modifiziert werden kann oder muss.

Der Begriff"Sequenzidentität"im Sinne der Erfindung bezeichnet eine Identität über die gesamte kodierende Sequenz zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleinsäuresequenzen von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 85%, besonders bevorzugt von mindestens 90,91, 92,93 oder 94% und am meisten bevorzugt von mindestens 95,96, 97,98 oder 99%. Insbesondere beträgt die Sequenzidentität innerhalb von 600 Basenpaaren ausgehend vom 3'-Ende einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92%, besonders bevorzugt mindestens 94%, insbesondere bevorzugt mindestens 96% und am meisten bevorzugt mindestens 98% zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Sequenzen und auf Aminosäureebene innerhalb von 200 Aminosäuren ausgehend vom C-Terminus einer der in SEQ ID No. 2,4 oder 6 angegebenen Sequenzen mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 92 oder 94%, insbesondere bevorzugt mindestens 96 oder 97% und am meisten bevorzugt mindestens 98 oder 99% zu einer der in SEQ ID No. 2,4 oder 6 angegebenen Sequenzen.

Die Sequenzidentität wird über eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen, bestimmt. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp (Feng und Doolittle (1987) J. Mol.

Evolution 25 : 351-360 ; Higgins et al. (1989) CABIOS 5 : 151-153) oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 : 443 - 453 und Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2 : 482-489) verwendet, die im GCG-Software-Paket (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) enthalten sind.

Die oben in Prozent angegebenen Sequenzidentitätswerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt : Gap Weight : 50, Length Weight : 3, Average Match : 10000 und Average Mismatch : 0,000.

Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.

Nukleinsäuresequenzen, die von den in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleinsäuresequenzen abweichen, können z. B. durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder-deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID No. 1, 3 oder 5 erzeugt werden, so dass Proteine entstehen, in die gegenüber der in SEQ ID No. 2,4 oder 6 angegebenen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder-deletionen eingebracht wurden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID No. 1, 3 oder 5 durch Standardtechniken, wie z. B. stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Amino- säuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste, also an Aminosäureresten, die die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellin-abhängiger Prozesse nicht beeinflussen, hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution"wird ein Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden.

Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure und Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin,

Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B.

Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in dem erfindungsgemäß verwendeten ET-Faktor wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungs- form die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der für den ET- Faktor kodierenden Sequenz eingebracht werden, z. B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach der Aktivität eines negativen Regulators Gibberellin-abhängiger Prozesse durchmustert werden, indem das kodierte Protein rekombinant exprimiert wird, um Mutanten zu identifizieren, die diese Aktivität beibehalten haben. Die Aktivität des Proteins kann z. B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden.

Die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellin-abhängiger Prozesse lässt sich am einfachsten dadurch bestimmen, dass die DNA, die für diesen Regulator kodiert, zusammen mit einem Reportergen, das unter der Kontrolle eines GA-abhängigen Promotors steht, in die Pflanzenzellen eingebracht wird und diese entweder mit GA behandelt werden oder unbehandelt belassen werden. Als Kontrolle werden Wildtypzellen mit dem gleichen Reportergen-Konstrukt transfiziert und mit GA stimuliert bzw. unstimuliert belassen. Wird in den Zellen, die mit der zu testenden DNA transfiziert wurden, die Expression des Reportergens durch die Zugabe von GA nicht induziert, während sie in den Wildtypzellen induziert wird, handelt es sich bei der transfizierten DNA um einen negativen Regulator Gibberellin-abhängiger Prozesse.

Geeignete Reportergene sind beispielsweise das ß-Glucuronidase- (GUS)-Gen aus E. coli, ein Fluoreszenzgen wie etwa das Green-Fluorescence-Protein (GFP) -Gen aus

Aequoria victoria, das Luziferase-Gen aus Photinuspyralis oder das ß-Galaktosida- se- (lacZ)-Gen aus E. coli. Weitere geeignete Reportergene sind dem Fachmann bekannt.

Geeignete GA-abhängige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden. Beispielsweise handelt es sich um den Promotor des Aquaporin-Gens (Kaldenhoff R. et al. (1996) Journal of Photochemistry Photobiology 36 (3) : 351-354), des cytosolischen Glutamin-Synthetase-Gens (Gomez-Maldonado et al. (2004) Planta 218 (6) : 1036-1045), des A121-Gens aus Weizen (Cejudo et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20 (5) : 849-856) und des a-Amylase- Gens aus Gerste (Gubler und Jacobsen (1992) Plant Cell 4 (11) : 1435-1441).

Die kontrollierte Expression der erfindungsgemäßen Regulatoren bzw. ET-Faktoren in transgenen Pflanzen bietet die Möglichkeit, Gibberellinsäure-abhängige Prozesse in der Pflanze zu beeinflussen, so dass die äußere Gabe von chemischen GA- Syntheseinhibitoren bzw. die langwierige Selektion von Mutanten und anschließende Züchtung auf klassischem Wege überflüssig wird.

Die veränderte Expression der ET-Faktoren in transgenen Pflanzen hat durch die Beeinflussung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse verschiedene positive Effekte.

Zum einen kann allgemein das Streckungswachstum gehemmt werden, was vor allem für eine Ertragssteigerung bei Getreidesorten wie Weizen oder Reis von Bedeutung ist, weil die transgenen Pflanzen weniger Nährstoffe in das Wachstum und dafür mehr in die Entwicklung der reproduktiven Organe investieren. Die Hemmung des Streckungswachstums ist auch nützlich bei Bäumen und Gräsern, bei denen geringeres Wachstum erwünscht ist, wie z. B. Golfrasen.

Zum anderen kann durch die vorliegende Erfindung auch die ungewollte Keimung von Samen und Knollen verhindert werden. Dies findet unter anderem Anwendung bei der Getreidezucht zur Vermeidung des"preharvest sprouting"-Syndroms, dem Austreiben auf der Ähre.

Da die Menge an aktivem Gibberellin auch das Verhältnis von Zellulose und Lignin kontrolliert, kann durch eine Hemmung der Gibberellin-Antworten auch das Verhältnis zugunsten der Zellulose verschoben werden, wodurch eine größere Menge an Rohstoffen für die Papierindustrie zur Verfügung gestellt wird.

Schließlich bietet die transgene Expression der ET-Faktoren auch die Möglichkeit, die Blüten-und damit auch die Fruchtbildung bei verschiedenen Nutzpflanzen zu beeinflussen.

Weitere nützliche Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den von GA natürlicherweise in den Pflanzen regulierten Vorgängen.

Durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Hemmung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen können Gibberellinsäure-abhängige Prozesse wie Streckungswachstum, Keimung und Fruchtbildung in den transgenen Pflanzen beeinflusst werden, wobei dies bevorzugt durch Überexpression des Gens, das für Regulatoren der ET-Familie (wie in Anspruch 1 definiert) kodiert, in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen erfolgt.

Dadurch können Pflanzen erzeugt werden, die ein geringeres Streckungswachstum als die Wildtyppflanzen zeigen und deshalb ertragreicher und resistenter gegen Wind und Regen sind. Außerdem können Pflanzen mit einem veränderten

Keimungsverhalten erzeugt werden, was ebenfalls zu einer Erhöhung des Ertrags führt. Weitere Anwendungen sind bereits weiter oben aufgeführt und ergeben sich des Weiteren aus den natürlichen Prozessen, wie sie durch GA gesteuert werden.

Grundvoraussetzung für die Erzeugung solcher Nutzpflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels biolistischer Methoden sowie weitere Möglichkeiten. Diese Transformationstechniken sind dem Fachmann bekannt oder können in Übersichtsartikeln bzw. entsprechenden Nachschlagewerken nachgelesen werden.

Neben der Verwendung der hier erstmals offenbarten bzw. in der Literatur und den Datenbanken bereits verfügbaren DNA-Sequenzen, die für Regulatoren im Sinne der Erfindung kodieren, kann der Fachmann weitere entsprechende DNA-Sequenzen aus anderen Organismen mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann beispielsweise geeignete Hybridisierungssonden von den erfindungsgemäßen ET-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, also z. B.

Kartoffel oder Getreide, aus dem ein neues ET-Gen isoliert werden soll, einsetzen.

Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs-und Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio-oder gentechnologischen Labor wohlbekannt und etabliert sind (siehe z. B. auch Sambrook und Russell (2001)

Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York). Der Fachmann kann natürlich auch anhand der erfindungsgemäßen Sequenzen geeignete Oligonukleotid-Primer zur PCR-Amplifikation von ET-Sequenzen synthetisieren und einsetzen.

Geeignete Primerpaare zur Amplifikation von ET-Genen sind beispielsweise : Primerpaar ET1 (optimale Anlagerungstemperatur : 53°C) : ETla-new 5'ATGTTCAAGAGAGACGACTACATTCG 3' ETlb 5'AAGATGTCATTCTCATCCCCTTGTGC 3' Primerpaar ET2 (optimale Anlagerungstemperatur : 58°C) : ET2a-out 5'CTATATCATCGGTTTTATCGAAATGGAATT 3' ET2b-out 5'AAGTGATGCAGAGGTTAGGTGATTCTCATT 3' Primerpaar ET3 (optimale Anlagerungstemperatur : 55°C) : ET3a 5'ATGTCGTTTGTTCTATTATCGAAGATGGC 3' Et3b 5'ACCAAATGGTCTCATCACTTTGAGTG 3' Geeignete PCR-Bedingungen zur Amplifikation von ET-Genen mit den oben aufgeführten Primerpaaren sind : 1. 96°C für 4 Minuten 2.35 Zyklen : 96°C für 30 Sekunden optimale Anlagerungstemperatur für das ausgewählte Primerpaar für 45 Sekunden . 72°C fflr 30 Sekunden 3. abschließende Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten.

Üblicherweise werden die Hybridisierungssonden bzw. Oligonukleotid-Primer so ausgewählt werden, dass sie die für das in Anspruch 1 angegebene Aminosäure- Sequenzmotiv kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen. Selbstverständlich besteht aber auch die Möglichkeit, eine der in dieser Anmeldung offenbarten DNA-Sequen- zen in ihrer Gesamtheit oder wesentliche Teile davon als Hybridisierungssonde in herkömmlichen Hybridisierungstechniken einzusetzen.

Des Weiteren ist es auch möglich, mit Hilfe von geeigneten Oligonukleotidsequen- zen und der Southwestern-Technik Proteine aus weiteren Pflanzenarten zu isolieren, indem Extrakte aus den gewünschten Pflanzen in einem Polyacrylamid-Gel ihrer Größe nach aufgetrennt und auf einen Nitrozellulose-Filter übertragen werden, wo sie mit markierten Oligonukleotidsequenzen, die eine mögliche Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor enthalten, in Kontakt gebracht werden. Die an das Oligo- nukleotid bindenden Proteine können anschließend über die Markierung des Oligo- nukleotids identifiziert werden. Zur Southwestern-Analyse geeignete Oligonukleo- tide sind dem Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung zu entnehmen.

Die auf diese Weise isolierten Proteine können wie oben beschrieben in Reportergen- Assays hinsichtlich ihrer Aktivität als negativer Regulator Gibberellin-abhängiger Prozesse getestet werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinsäuremoleküle, umfassend die folgenden Elemente in 5'-3'-Orientierung : - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen erfindungsgemäßen Transkriptionsregulator kodiert,

- ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die in der Pflanzenzelle als Transkriptions-, Terminations-und/oder Polyadenylierungssignale dienen können.

In den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die eine für einen ET-Faktor kodierende DNA-Sequenz enthalten, liegt die kodierende Nukleinsäure- sequenz wie im nativen Gen, also in 5'-3'-Orientierung, in operativer Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor vor. Auf diese Weise kann eine Überexpres- sion der kodierenden Sequenz in den transgenen Pflanzen erreicht werden.

In einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül bedeutet"operativ daran gebunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz (en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und die beiden Sequenzen derart aneinander gebunden sind, dass sie die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen.

Geeignete regulatorische Sequenzen, die die Transkription einer operativ verknüpften erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in der transformierten Pflanze bzw.

Pflanzenzelle steuern, sind dem Fachmann wohl bekannt, können mit Verfahren des Standes der Technik isoliert oder den Datenbanken und der Literatur entnommen werden.

Der Promotor kann so gewählt werden, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in spezifischen Geweben und/oder zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression) angeschaltet wird. In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors kann eine zell-bzw. gewebespezifische Expression auch dadurch erreicht werden, dass die Genexpression

in den Zellen bzw. Geweben, in denen sie nicht erwünscht ist, gehemmt wird, beispielsweise durch Ausprägung von Antikörpern, die das Genprodukt binden und somit seine Aktivität unterbinden, oder durch geeignete Inhibitoren.

Konstitutive oder gewebe-bzw. entwicklungsspezifische oder induzierbare Gene bzw. Promotoren kann der Fachmann dem Stand der Technik, insbesondere den einschlägigen wissenschaftlichen Journal und Datenbanken entnehmen. Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, rnittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z. B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA- Protein-Bindungsstudien, z. B. gewebespezifische regulatorische Nukleinsäuremoleküle identifizieren. Dabei wird z. B. in einem ersten Schritt aus einem bestimmten Gewebe, z. B. einem Speicherorgan, des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly (A) +-RNA isoliert und eine cDNA-Bank daraus angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit cDNA-Klonen, die auf poly (A) +-RNA-Molekülen aus einem Nicht-Speicherorgangewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly (A) +- RNA-Moleküle lediglich im Gewebe des Speicherorgans akkumulieren.

Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Speicherorgan-spezifische regulatorische Elemente verfügen.

Geeignete Promotoren zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren sind konstitutive Promotoren wie der CaMV35S-, der Octopinsynthase-, der Nopalinsynthase-oder der Ubiquitinpromotor.

Als induzierbare Promotoren sind zum Beispiel östrogen-induzierbare Promotoren geeignet, wie sie etwa in den pMDC-GATEWAY-Vektoren (Curtis MD und Grossniklaus U. (2003) Plant Physiology 133 : 462-469) vorhanden sind.

Zur Transgenexpression in Samen können beispielsweise die LeguminB4-und USP- Promotoren verwendet werden (Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225 : 459-467 ; Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225 : 121-128).

Wenn das Transgen spezifisch in den Knollen von Pflanzen exprimiert werden soll, bietet sich unter anderem der Promotor des Klasse 1 Patatin-Gens an (Rocha-Sosa M. et al. (1989) EMBO J 8 : 23-29).

Zu den Promotoren, die insbesondere in Früchten aktiv sind, gehören der Promotor des Polygalacturonase-Gens oder einer ACC-Oxidase und der 2A11-Promotor (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28 : 423-435 ; Atkinson et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38 : 449-460 ; van Haaren et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17 : 615-630).

Um das Verhältnis von Zellulose und Lignin zu beeinflussen, kann ein kambiumspezifischer Promotor wie etwa der CAD-Promotor verwendet werden (S.

Hawkins et al. (1997) Plant Physiol. 113 : 321-325).

Die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle können als regulatorische Elemente auch noch z. B. Enhancer-Elemente umfassen, ferner können sie Resistenzgene, Replikationssignale und weitere DNA-Bereiche enthalten, die eine Propagation der Vektoren in Bakterien wie z. B. E. coli ermöglichen. Die regulatorischen Elemente umfassen auch Sequenzen, die eine Stabilisierung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen bewirken. Insbesondere umfassen solche regulatorischen Elemente Sequenzen, die eine stabile Integration des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtsgenom der Pflanze oder eine autonome Replikation des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in den Pflanzenzellen ermöglichen. Solche regulatorischen Elemente sind dem Fachmann bekannt.

Ferner sind im rekombinanten Nukleinsäuremolekül optional Transkriptions-bzw.

Terminationssequenzen vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dienen, sowie der Addition eines PolyA-Tails an das Transkript dienen können, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig austauschbar.

Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf die Transkriptionsebene beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise zusätzlich zu den oben beschriebenen Elemente andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'- untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA- Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Research 15 : 8693-8711).

Schließlich erfolgt die Herstellung chimärer Genkonstrukte, in denen die kodierenden DNA-Sequenzen unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen stehen, die eine Expression in Pflanzenzellen gewährleisten, mittels konventioneller Klonierungsmethoden (siehe beispielsweise Sambrook und Russell (2001), vide supra).

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend : a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzengeweben aktiven Promotors ; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen ET-Regulator kodiert ; und

c) ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations-und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.

Die DNA-Sequenz, die einen ET-Regulator kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach bekannten Verfahren synthetisiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein aktives ET- Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus : i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1,3 oder 5 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2,4 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die beschriebene, für ein ET-Protein kodierende DNA-Sequenz aus Brassica napus (wie in SEQ ID No. 1 angegeben).

Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook und Russell (2001) vide supra), ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die

gentechnologische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse-und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt.

Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen ermöglicht, in denen Gibberellinsäure- abhängige Prozesse gehemmt sind. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.

Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren zur Expression der ET- Proteine können sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen aktiv sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheit halber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Diese Klonierungsvektoren enthalten ein Replikationssignal für den entsprechenden Mikroorganismus und ein Markergen zur Selektion erfolgreich transformierter Bakterienzellen. Zur Expression in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, zu diesen gehören z. B. in E. coli pLG33 8, pACYC184, die pBR-Reihe, wie z. B. pBR322, die pUC-Reihe, wie z. B. pUC18 oder pUC19, die Ml 13mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS 1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Agtl 1 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBl 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.

Bei einer weiteren Ausführungsform stellt der Expressionsvektor einen Hefeexpressionsvektor oder einen Bacillovirus-Expressionsvektor dar.

Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind z. B. beschrieben in : Cloning Vectors (Hrsg. Pouwels, P. H. et al. Elsevier, Amsterdam, New York-Oxford, 1985). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 15 und 16 von Sambrook und Russell, vide supra.

Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die ET-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3) : 239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in : Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992), Plant Mol. Biol. 20 : 1195-1197 ; und Bevan, M. W. (1984), Nucl. Acids Res. 12 : 8711- 8721 ; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in : Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15- 38.

Des Weiteren wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes ET- Protein, insbesondere ein ET-Protein mit der SEQ ID No. 2, bereitgestellt.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen bzw.

Pflanzenzellen mit gegenüber Wildtyp-Pflanzen bzw.-Pflanzenzellen gehemmten Gibberellinsäure-abhängigen Prozessen, umfassend die folgenden Schritte :

a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst : - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors ; - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein ET-Protein kodiert ; und - optional operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations-und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können ; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen ; und c) gegebenenfalls die Regeneration intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die ein ET-Protein kodieren, enthalten und in denen die Menge des negativen Regulators im Vergleich zu Wildtyppflanzen erhöht ist. Die Erfindung betrifft ebenfalls transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungs- material transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfin- dungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten. Transgene Pflanzen der vorliegenden Erfindung weisen aufgrund der Einführung einer ET-kodierenden DNA-Sequenz gegenüber Wildtyppflanzen gehemmte GA-abhängige Prozesse auf.

"Transgen"bzw. "rekombinant"im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c) a) und b) nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befindet oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurde, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette-beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors des ET-Faktors mit den entsprechenden Genen, die für den ET-Faktor kodieren-wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise eine Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in US 5,565, 350 oder WO 00/15815.

Unter einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle im Sinne der Erfindung ist wie oben ausgeführt zu verstehen, dass sich die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom der Pflanze bzw.

Pflanzenzelle befinden, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert

werden können. Transgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zwar an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor.

Für den Fachmann ist klar, dass die für die Herstellung der transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle verwendete Nukleinsäuresequenz, die für einen ET-Faktor kodiert, ggf. an die Organismus-spezifische Kodonverwendung angepasst werden muss. Die Kodonverwendung lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer bekannter Gene des gewählten Organismus bestimmen.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet.

Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethoden zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und daraus gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.

Wie bereits erwähnt, stehen für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels biolistischer Methoden sowie weitere Möglichkeiten, die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.

Je nach Einführungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird z. B. zur Transformation der Pflanzenzelle das Ti-oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti-bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden zur Transformation Agrobakterien verwendet, muss die

einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor.

Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti-oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können allerdings nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmi ds kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).

Binäre Vektoren dagegen können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid enthalten, welches eine vir-Se quenz innerhalb der T-DNA trägt, welche in die Pflanzenzelle übertragen wird. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakteriurm wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweck- mäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücl<ce, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kaltivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder

Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.

Während die Transformation dikotyle Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u. a. Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22,491-506).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104,37-48 ; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11,1553-1558 ; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24,317-325 ; Spencer et al. (1990), Theor. Appl.

Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker oder Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind,

stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. Cotransformation oder Sequenz- spezifische Rekombinasen.

Die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen umfassen differenzierte und undifferenzierte Pflanzenzellen einschließlich Protoplasten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden und die die im Folgenden beschriebenen Nuklein- säuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert haben oder diese als autonom replizierende Moleküle enthalten.

Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure, die ein ET-Protein kodiert bzw. auf Anwesenheit des Genprodukts, also des ET-Proteins, untersucht werden.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5,81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden.

Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Pathogen-Responsivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.

Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.

Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, in der Gibberellinsäure-abhängige Prozesse gehemmt werden sollen. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Ebenfalls bevorzugt sind Zierpflanzen bzw. Zellen von Zierpflanzen, bei denen ein buschiges Wachstum erwünscht ist. Besonders bevorzugt handelt es sich um dikotyle Pflanzen wie Nutzholzgewächse, Kartoffel, Mango, Chrysantheme, Weihnachtsstern bzw. monokotyle Pflanzen wie z. B. Reis, Weizen, Rasengräser. Prinzipiell ist jede Pflanze geeignet, bei der eine normale Reaktion auf GA zu unerwünschten Eigenschaften führt.

Die Erfindung betrifft ebenfalls transgenes Vermehrungsmaterial und transgene Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge usw.

Die Erfindung betrifft weiterhin Zellulose, gewonnen aus transgenen Nutzholzpflanzen mit gehemmten Gibberellinsäure-abhängigen Prozessen, deren

Zellulosegehalt gegenüber Wildtyppflanzen erhöht ist, wobei die Zellulose mittels in der Papierindustrie üblicher Methoden aus dem Nutzholz gewonnen wird.

Die spezifische Expression des ET-Proteins in den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern- Blot-Analyse zum Nachweis ET-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von ET-spezifischer RNA oder eine Southern-Blot-Analyse zum Nachweis von für ET kodierenden DNA-Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.

Beispiele 1) Isolierung von ET-Sequenzen durch Southwestern-Screening Das Southwestern-Screening (Somssich IE und Weisshaar B. (1996) Expression library screening. In : Plant Gene Isolation : Principles and Practice. Foster GD und Twell D (Hrsg. ) John Wiley & Sons Ltd. ) wurde durchgeführt mit amplifizierten SZAPII cDNA Expressionsbibliotheken (Clontech, Palo Alto, CA, USA). Im Primärscreen wurden etwa 6x105 PFU (plaque-bildende Einheiten) getestet unter Verwendung entweder einer Bibliothek aus unreifen Brassica napus- (Taipalensuu J. et al. (1997) Eur. J. Biochem. 243 : 605-611) oder Vieafaba-Samen (Wohlfarth T, 1996 : Regulation samenspezifischer Gene der Ackerbohne Vicia faba : Analyse von

cis-Elementen sowie Isolierung und Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren.

Dissertation, Martin-Luther-Universität, Halle-Wittenberg, Deutschland). Die Oligonukleotide, die als Proben verwendet wurden, wurden synthetisiert nach den Sequenzen des napA-Promotors aus B. napus (EMBL/Genbank accession number J02798), des USP- (EMBL/Genbank accession number X56240) oder des Legumin B4- (LeB4) Promotors (EMBL/Genbank accession number X03677) aus V. faba. Die Oligonukleotide wurden so konstruiert, dass sie nach dem Aneinanderheften doppelsträngige phosphorylierte Proben mit entweder 3'zurückgesetzten (recessed) Enden oder BamHI-oder EcoRI-kohäsiven (sticky) Enden ergaben, um die Oligomerisierung durch Ligation zu ermöglichen. Die konkatamerisierten Oligonukleotide (durchschnittlich 200 bp) wurden durch Nick-Translation unter Verwendung von a- [32P]-dNTPs (Amersham International, Amersham, UK) markiert. Das Southwestern-Screening wurde durchgeführt mit einem Inkubationspuffer, der aus 25 mM HEPES (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 4 mM KCI, 7 % Glycerin, 1 mM MgC12, 0,5 mM DTT and 1,0 mM ZnS04 zusammengesetzt war.

Das Sequenzieren des Inserts der ausgeschnittenen Plasmide wurde für beide Stränge mit dem Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und einem Applied Biosystem 373A DNA-Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) durchgeführt. In den einzelnen Schritten wurden molekularbiologische Standardtechniken angewandt (Ausubel et al. (1996) Current protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, NY, U. S. A ; Sambrook und Russell, 2001, vide supra).

2) Klonierung des BnET-Expressionsvektors und Regeneration transgener Pflanzen Standardtechniken für das Klonieren und Sequenzieren wurden durchgeführt nach Ausubel et al. (1996, vide supra). BnET, das aus einer Samen-spezifischen cDNA- Bibliothek von Brassica napus isoliert worden war, wurde durch PCR mit Primern, die zusätzliche NcoI-Schnittstellen enthielten, amplifiziert. Das Fragment wurde in

den pCR-Script Vektor (Stratagene) kloniert und sequenziert. Danach wurde die BnET cDNA direkt in den binären Vektor pBinAR (Höfgens R. und Willmitzer L.

(1990) Plant Science 66 : 221-230) kloniert. Die Regeneration der transgenen Pflanzen erfolgte wie beschrieben (Bäumlein, H. et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 225 : 459-467 ; Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225 : 121-128.).

3) Transiente Expression von BnET in Tabakprotoplasten Für die Protoplastenisolierung wurden Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum verwendet. Nach dem Verdau der Zellwand in einer Lösung mit 1% Zellulase R10 und 0,5% Macerozym R10 (Duchefa Biochemie, Niederlande) wurden die Protoplasten zentrifugiert und zweimal mit W5-Medium (0,9% NaCl, 1,8% CaCl2, 0,04% KCl, 0,1% Glucose, pH 5,6) gewaschen. Dann wurden sie in Mg-Mannitol (0,45 M Mannitol, 15 mM MgCl2, 0,1% MES, pH 5,6) auf eine Dichte von etwa 3x106 Zellen/ml konzentriert. Um die resultierenden Protoplasten zu transformieren, wurde eine Lösung, die Plasmid-DNA (5 llg von jedem Plasmid) und Träger-DNA (160 u. g) enthielt, zu 330 Ill Mg-Mannitol mit 1x106 Protoplasten zugegeben. Nach 10 Minuten Inkubation wurde dem Gemisch die gleiche Menge PEG-Lösung (40% PEG 6000,0, 1 M Ca (N03) 2, 0,4 M Mannitol, 0, 1% MES, pH 6,5) zugegeben. Nach 20 Minuten wurden die transformierten Protoplasten in 4 ml K3-Medium verdünnt und in kleine Petrischalen überführt. Nach einer Inkubation mit 101lM GA (Duchefa Biochemie, Niederlande) für 16 bis 18 Stunden bei 25°C in der Dunkelheit wurden die Protoplasten geerntet und die GUS-Aktivität durch einen Chemiluminiszenz- Assay mit dem GUS-Light TM Kit (Tropix, Bedford, USA) und einem Lumat LB9501 Luminometer (Berthold) bestimmt. Die Ergebnisse dieser Messung sind in Abbildung 2 dargestellt. Als Reporterkonstrukt wurde das GUS-Reportergen unter der Kontrolle des Aquaporin-Promotors (Kaldenhoff R. et al. (1996) Journal of Photochemistry Photobiology 36 (3) : 351-354) verwendet. Ein Kontrollkonstrukt,

das das GUS-Reportergen unter der Kontrolle des 35S CaMV-Promotors enthielt, wurde in diesem System effizient exprimiert und verwendet, um die verschiedenen Experimente zu standardisieren.

4) Untersuchung der Samenkeimung Die Oberfläche der Samen aus Wildtyp-und BnET-transgenen Pflanzen wurde sterilisiert und jeweils 100 Samen wurden in jeweils fünf Petrischalen überführt, die 1 x Murashige/Skoog-Medium enthielten. Nach der Stratifizierung bei 4°C für drei Tage bei gedämpftem Licht wurden die Samen bei 22°C unter Langtagbedingungen (18L/6D) gekeimt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 4 dargestellt.

Beschreibung der Abbildungen Abb. 1 : Sequenzvergleich der zinkbindenden Domänen der Regulatoren aus den Spezies Vieiafaba, Brassica napus und Arabidopsis thaliana Die Kleinbuchstaben a bis d stellen jeweils unterschiedliche Motive innerhalb eines Proteins dar. Die fett und unterstrichen markierten Aminosäuren entsprechen den im Konsensusmotiv konservierten Aminosäuren.

Abb. 2 : Reduktion der GA-Induktion des GA-responsiven Aquaporin-Promotors (NtAqP1) durch die transiente Expression von BnET in Tabakprotoplasten Die Stimulation der Protoplasten mit 10 go GA für 16 Stunden führt zu einer erhöhten Aktivität des GA-abhängigen Aquaporin-Promotors und einer erhöhten Expression des Reportergens GUS. Exprimieren die Protoplasten das ET-Protein aus Brassica napus, ist die GA-Induktion des Promotors blockiert. Ein Kontrollkonstrukt, das das GUS-Reportergen unter der Kontrolle des 35S CaMV- Promotors enthielt, wurde in diesem System effizient exprimiert und verwendet, um die verschiedenen Experimente zu standardisieren. Die einzelnen Balken repräsentieren unterschiedliche Experimente.

Abb. 3 : Ektopische Expression des BnET-Gens führt zu Zwergwachstum Auf der linken Seite sind jeweils die Wildtyp-Kontrollpflanzen von Arabidopsis thaliana (oben) bzw. Nicotiana tabacum (unten) und auf der rechten Seite unabhängige transgene Linien von Arabidopsis thaliana (oben) bzw. Nicotiana tabacum (unten) gezeigt. Die transgenen Linien enthalten jeweils ein

Nukleinsäuremolekül, das die BnET-sense-Sequenz unter der Kontrolle des 35S CaMV-Promotors exprimiert. Die Bilder der Pflanzen wurden bei Nicotiana tabacum nach 30 Tagen und bei Arabidopsis thaliana nach 20 Tagen aufgenommen.

Abb. 4 : Reduktion der Keimung durch ektopische Expression des BnET-Gens Es wurde die Keimung von Samen aus Wildtyp-Kontrollpflanzen und transgenen Tabaklinien untersucht, die das BnET-Transgen unter der Kontrolle des 35S CaMV- Promotors exprimieren. Während die Wildtyp-Samen innerhalb von 60 Stunden zu 100% auskeimen, erreichen die transgenen Samen selbst nach 350 Stunden nur eine Keimungsrate von etwa 30%.

Abb. 5 : Stammanatomie von Tabakpflanzen, die ektopisch BnET exprimieren, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen Hellfeld- (a-f) und Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen (g, h) von Schnitten durch den Stamm zwischen dem siebten und achten Nodium. Die transversen und longitudinalen halbdünnen Schnitte von fixiertem Material zeigen eine reduzierte Bildung der sekundären Zellwand in Pflanzen, die ektopisch BnET exprimieren (b, d, f) verglichen mit Wildtyp (a, c, e). Die Autofluoreszenz von lignifizierten sekundären Zellwänden von frischen Stammschnitten wurde nach Anregung mit Blaulicht nachgewiesen. Verglichen mit dem hellen Signal des Xylems im Wildtyp (g) konnte kein signifikantes Fluoreszenzsignal in den Schnitten der BnET- exprimierenden Pflanzen (h) nachgewiesen werden. Alle mikroskopischen Untersuchungen wurden mit mindestens drei verschiedenen transgenen Pflanzen mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. mX, Metaxylem ; Ph, Phloem ; pX, Protoxylem. Maßstab 1501lm.