Campo técnico

La presente invención se relaciona en el campo técnico de la nanoencapsulación de compuestos activos, particularmente se refiere a un método para la obtención de nanoestructuras, específicamente nanoemulsiones y nanocápsulas de carotenoides tales como curcumina y astaxantina. La presente invención también se refiere a las nanoemulsiones y nanocápsulas de curcumina y astaxantina, para su utilización en la industria alimenticia, farmacéutica, cosmetológica u otros.

Antecedentes de la invención

Los carotenoides son pigmentos orgánicos que se encuentran en abundancia en la naturaleza, donde se han reportado más de 600 de estos compuestos. Los carotenoides se utilizan ampliamente en la industria como colorantes, pero últimamente se descubrió el potencial terapéutico de alguno de estos como, por ejemplo, la curcumina y la astaxantina.

Estructuralmente, la mayoría de los carotenoides son tetraterpernoides (C40), lo que corresponde a 8 unidades de isoprenoides, unidos de tal forma, que las moléculas son lineales y simétricas con dos anillos terminales. Debido a su estructura, los carotenoides son moléculas hidrófobas, lipofílicas, insolubles en agua y solubles en disolventes como la acetona, el alcohol y el cloroformo. A su vez, son moléculas que se caracterizan por ser fotosensibles e inestables frente a cambios de pH y oxígeno (Natália Mezzomo and Sandra R. S. Ferreira, "Carotenoids Functionality, Sources, and Processing by Supercritical Technology: A Review," Journal of Chemistry, vol. 2016, 16 page, 2016).

Debido a las características fisicoquímicas de estas moléculas, ha sido un interés constante la búsqueda de su encapsulación mediante emulsiones, partículas con polímeros cargados y mezcla de ambos métodos, para aumentar su solubilidad en agua. Por ejemplo, la solicitud de patente WO 2009/093812 A2, propone un método de co-polimerización de monómeros para formar un polímero, donde estos tienen un grupo hidrofóbico, para encapsular a los carotenoides en general, dentro de los cuales, se menciona astaxantina. En esta patente no se menciona el efecto fotoprotector de este polímero a cambios ambientales, ya sea fotolisis o cambios de pH. A su vez, la solicitud de patente WO 2009/016091 A1 , elabora un método de encapsular saborizantes y colorantes liposolubles dentro de los cuales se encuentran los carotenoides, elaborando cápsulas de nanoemulsiones cubiertas con polímero. Para este proceso utilizan como emulsificante un éster de sacarosa y altas temperaturas, por lo cual requiere de mucha energía para generarlas. En ninguna de las solicitudes mencionadas anteriormente aseguran la protección de los carotenoides u otras moléculas liposolubles frente a cambios en el medio ambiente (ejemplo luz, oxidación, etc.) y tampoco evalúan la eficiencia de la carga de estas moléculas en sus productos.

En el caso de la curcumina y astaxantina, dado que son moléculas de alto interés comercial debido a su potencial terapéutico (como antioxidante, antiinflamatorio, antibacteriano y anticancerígeno, entre otros), se genera un mayor interés. El principal problema de estas dos moléculas es que son muy malas candidatas para su vehiculización tradicional y administración en medios que contengan agua, por ejemplo, la curcumina tiene una baja solubilidad en medios acuosos y es altamente inestable (rápida hidrólisis, producto de cambios en el pH y la oxigenación). Entonces, se hace necesario generar nanoestructuras que aumenten su solubilidad en agua y las protejan de estos cambios en el ambiente.

La curcumina y astaxantina son moléculas, pertenecientes a la familia de los carotenoides, que tienen un gran potencial terapéutico (antioxidante, antiinflamatoria, antibacteriana y anticancerígena, entre otras). No obstante esto, debido a las características físico-químicas de estas moléculas, entre las que destacan, muy baja hidrosolubilidad y muy alta inestabilidad medioambiental (luz, oxígeno y pH neutro, entre otras condiciones), su potencial terapéutico se ve altamente limitado. En el caso de postular un producto que contemple la administración de estas moléculas por vía oral y en un medio acuoso (bebidas, tónicos, jugos, yogurt, sopas, entre otras) las limitantes de solubilidad, fotólisis y oxidación se hacen críticas. En este mismo sentido, existen antecedentes técnicos sobre intentos de generar nanocápsulas para estas moléculas mediante mezclas con polímeros catiónicos o nanoemulsiones desarrolladas con compuestos lipidíeos. Por ejemplo, con respecto a la curcumina, mediante ultrasonicación generaron nanoemulsiones con MCT-60 utilizando Tween-80 y un concentrado de proteínas de suero WPC-70 (Sari, T. P., Mann, B., Kumar, R., Singh, R. R. B., Sharma, R., Bhardwaj, M., & Athira, S. (2015). Preparation and characterization of nanoemulsion encapsulating curcumin. Food Hydrocolloids, 43, 540-546). Dichas nanoemulsiones tienen un potencial z de máximo -6mV, es decir, forman una solución inestable. Además, no evaluaron el efecto protector de la nanoemulsion sobre la curcumina respecto a la luz y la oxidación. Sumado a ello, usando una metodología similar en un trabajo previo (Abbas, Shabbar & Eric, Karangwa & Bashari, Mohanad & Hayat, Khizar & Hong, Xiao & Sharif, Hafiz & Zhang, Xiaoming. (2014). Fabrication of polymeric nanocapsules from curcumin-loaded nanoemulsion templates by self-assembly. Ultrasonics Sonochemistry. 23), se generó este mismo tipo emulsiones cubiertas con almidón modificado con Octenil succínico anhídrido (OSA) y luego se usó como polímero catiónico de cubierta, quitosano. En este trabajo no se evaluó ni la eficiencia del proceso ni si estas nanocápsulas protegen a la curcumina de la luz y la oxidación.

Por otra parte, se generaron emulsiones de curcumina en aceite de maíz producidas mediante homogeneización de alta presión y alta temperatura por 10 minutos a 100°C, para su posterior uso en hidrogeles de alginato o carragenina. (Zhang, Z., Zhang, R., Zou, L, Chen, L, Ahmed, Y., Al Bishri, W. & McCIements, D. J. (2016). Encapsulation of curcumin in polysaccharide-based hydrogel beads: Impact of bead type on lipid digestión and curcumin bioaccessibility. Food Hydrocolloids, 58, 160-170.). Por tanto, este método requiere mucha energía y resulta altamente costoso para su producción a gran escala.

La patente US 9,504,754 B2, y el posterior artículo de los mismos inventores (Kumar, S., Kesharwani, S. S., Mathur, H., Tyagi, M., Bhat, G. J., & Tummala, H. (2016). Molecular complexation of curcumin with pH sensitive cationic copolymer enhances the aqueous solubility, stability and bioavailability of curcumin. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 82, 86-96.), muestran un ejemplo donde se produjo un complejo curcumina-polímero catiónico (Eudragit ^® E PO) en una proporción de 1 :2. Esto generó partículas con una eficiencia de carga de curcumina con respecto a este polímero, del 55,6%. Según este antecedente, esta fue la mayor eficiencia que lograron conseguir, lo que corresponde una pérdida de curcumina del 44,4% con respecto a la inicial, lo que supone un método muy poco eficiente y con una alta pérdida de compuesto activo. Además, en este trabajo no evalúan si estas partículas generan fotoprotección de la curcumina explicitando que, por lo mismo, todos los ensayos de este trabajo se realizaron en oscuridad.

Con respecto a la astaxantina, se generaron nanoemulsiones de esta molécula con un surfactante no iónico y oleína de palma como aceite, mediante el método de homogenización de alta presión HPH (Affandi, M. . M., Julianto, T., & Majeed, A. (201 1 ). Development and stability evaluation of astaxanthin nanoemulsion. Asían J Pharm Clin Res, 4(1 ), 142-148). Al no conocer el efecto protector de la emulsión, todos los procedimientos fueron realizados en oscuridad.

Por otra parte, se generaron nanocápsulas de astaxantina utilizando lecitina y quitosano por agregación y sonicación (Liu, N., Zhang, X., & Zhou, D. (2013). Preparation and properties research of astaxanthin ¡oaded nanocapsules. Journai of Agricultura! Science and Technology (Beijing), 15(8), 35- 39). La eficiencia de encapsulación de la astaxantina fue de! 51 ,02%, con una capacidad de carga de sólo un 10,34%, lo cual muestra que esta metodología no es óptima.

En consecuencia, no existe un método apropiado para la nanoencapsulación de carotenoides que sea eficiente en la carga efectiva del ingrediente activo, que utilice baja energía y costos asociados, y que sean óptimas en medios acuosos sin pérdida de material. A su vez, no existe un método que, teniendo una alta eficiencia de carga, sea capaz de proteger a estas moléculas de los cambios ambientales, ya sea por efecto de la luz, oxidación, cambios en el pH, etc. Por lo tanto, se hace necesario generar un método eficaz para generar nanoestructuras, donde haya la menor pérdida de principio activo, que permita que éste se solubilice a una concentración apropiada en un medio acuoso y que proteja a las moléculas contenidas en las nanoestructuras de los cambios ambientales, con el fin de generar un producto estable en el tiempo y con amplias oportunidades dentro de la industria.

Sumario de la Invención

La presente invención proporciona un método altamente eficiente para obtener nanoestructuras con carotenoides en cuanto a la carga de estas moléculas en las nanoestructuras que se obtienen, el cual a su vez provee de una apropiada protección a las mismas contra factores ambientales tales como la luz y la oxidación.

Para ello, el método para obtener nanoestructuras con carotenoides de la presente invención incluye las etapas de mezclar un compuesto carotenoide con un surfactante aniónico, con un solvente orgánico miscible en agua, y con un aceite líquido, en proporciones particulares en masa de 1 :5-70:10-1000:30-250, respectivamente. Se le agrega agua a la mezcla anterior en una proporción de entre 1 :1-100, respectivamente y se elimina el solvente orgánico, obteniéndose así una nanoemulsión.

El método de la invención incluye opcionalmente agregar a la mezcla del compuesto carotenoide con un surfactante aniónico, el solvente orgánico miscible en agua, y el aceite líquido, un segundo solvente orgánico miscible en agua en una proporción en masa 1 :10-20.

El método de la invención incluye además agregar un polímero catiónico al agua del paso correspondiente para formar una solución polimérica catiónica y a continuación se procede eliminar los solventes, o se agrega una solución polimérica catiónica a la nanoemulsión obtenida para obtener de esta manera una nanoemulsión recubierta como una nanocápsula catiónica. Dicha solución polimérica catiónica se encuentra a una concentración entre 0,01-2% p/v en la mezcla final.

De manera opcional el método de la invención permite obtener nanocápsulas aniónicas mezclando las nanocápsulas catiónicas con una solución polimérica aniónica en una concentración entre 0,01 -2% p/v en la mezcla final.

En una modalidad preferida las nanoestructuras con carotenoides contienen curcumina o astaxantina. Si lo que se desea es obtener una estructura con curcumina, el método incluye los pasos de:

a) mezclar curcumina con un extracto aniónico de lecitina, con etanol, y con un aceite líquido, en una proporción en masa de 1 :8,6:1 14:34, respectivamente;

b) agregar a la mezcla anterior acetona en una proporción 1 :14; c) agregar a la mezcla anterior agua en una proporción de 1 :36; y d) eliminar el etanol y la acetona para obtener una nanoemulsión.

En la modalidad preferida en que se desee obtener una nanocápsula catiónica con curcumina se agrega un polímero catiónico al agua del paso correspondiente para formar una solución polimérica catiónica, y a continuación se procede con el paso eliminación de los solventes, o alternativamente se agrega una solución polimérica catiónica a la nanoemulsión obtenida. En una modalidad preferida el polímero catiónico es un polimetacrilato catiónico y se encuentra a una concentración entre 0,01 y 1 % p/v y en otra modalidad preferida el polímero catiónico es quitosano y se encuentra a una concentración entre 0,01 y 1 % p/v.

El método de la invención permite también nanocápsulas aniónicas a partir de las nanocápsulas catiónicas con curcumina recubierta con polimetacrilato catiónico para lo cual estas se mezclan con una solución de carragenina iota en una concentración de 0,0765% p/v en una proporción 1 :1 .

En otra modalidad preferida de la invención el método permite obtener nanoestructuras de astaxantina, en la cual el método incluye los pasos de:

a) mezclar astaxantina con un extracto aniónico de lecitina, con etanol, y con un aceite líquido, en una proporción 1 :50:667:200, respectivamente;

b) agregar a la mezcla anterior acetona en una proporción 1 :14; c) agregar agua a la mezcla del paso b) en una proporción de 1 :36; y d) eliminar el etanol y la acetona para obtener una nanoemulsión.

Si se desea obtener una nanocápsula catiónica con astaxantina, el método incluye agregar quitosano al agua del paso correspondiente para formar una solución polimérica catiónica al 0,05% p/v y a continuación se procede con la eliminación de los solventes, o alternativamente se mezcla una solución de quitosano al 0,2% p/v con la nanoemulsion obtenida. De manera similar se puede obtener una nanocápsula aniónica con astaxantina recubriendo la nanocápsula catiónica con una solución de carragenina iota en una concentración de 0,153% p/v en una proporción 1 :1

La invención también se refiere a las nanoestructuras con carotenoides que se obtienen por el método inventivo propuesto. Si se trata de una nanoemulsion, dicha nanoestructura comprende carotenoides entre 0,0001 % p/v y 0,5% p/v; un surfactante aniónico entre 0,03% p/v y 3% p/v; y un aceite entre 0,1 % p/v y 15% p/v. Si es una nanocápsula catiónica, comprende carotenoides entre 0,0001 % p/v y 0,5% p/v; surfactante aniónico entre 0,03% p/v y 3% p/v; aceite entre 0,1 % p/v y 15% p/v; y polímero catiónico entre 0,04% p/v y 20% p/v. Si es una nanocápsula aniónica, comprende carotenoides entre 0,0001 % p/v y 0,5% p/v; surfactante aniónico entre 0,03% p/v y 3% p/v; aceite entre 0, 1 % p/v y 15% p/v; polímero catiónico entre 0,04% p/v y 20% p/v; y polímero aniónico 0,00765% p/v y 0,38% p/v.

En una modalidad preferida de la invención, la nanoestructura con carotenoides es una nanoemulsion con curcumina que comprende curcumina entre 0,06% y 0,07% p/v, 0,6% p/v de extracto aniónico de lecitina y 2,36% p/v de aceite. En otra modalidad de la invención la nanoestructura es una nanocápsula catiónica con curcumina que comprende curcumina entre 0,06% p/v a 0,07% p/v, 0,6% p/v de extracto aniónico de lecitina, 2,36% p/v de aceite, y 4% p/v de polimetacrilato catiónico. En otra modalidad preferida de la invención la nanoestructura es una nanocápsula aniónica con curcumina que comprende curcumina entre 0,06% y 0,07% p/v, 0,6% p/v de extracto aniónico de lecitina, 2,36% p/v de aceite, 0,024% p/v de polimetacrilato catiónico y 0,03825% p/v de carragenina iota.

Alternativamente, la nanoestructura en forma de nanocápsula catiónica con curcumina comprende curcumina entre 0,06% p/v y 0,07% p/v, 0,6% p/v de extracto aniónico de lecitina, 2,36% p/v de aceite y 0,2% p/v de quitosano. En otra modalidad preferida de la invención la nanoestructura de la invención es una nanoemulsión con astaxantina que comprende 0,006% p/v de astaxantina, 0,3% p/v de extracto aniónico de lecitina y 1 ,18% p/v de aceite. La nanoestructura de astaxantina de la invención puede estar en la forma de una nanocápsula catiónica con astaxantina que comprende 0,006% p/v de astaxantina, 0,3% p/v de extracto aniónico de lecitina, 1 ,18% p/v de aceite y 0, 1 % p/v de quitosano o en la forma de una nanocápsula aniónica que comprende 0,003% p/v de astaxantina, 0, 15% p/v de extracto aniónico de lecitina, 0,59% p/v de aceite, 0,05% p/v de quitosano y 0,0765% de carragenina iota. Breve Descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra una fotografía de 4 frascos con distintas formulaciones cargadas con curcumina: (a) nanoemulsiones, (b) nanoemulsiones recubiertas con una capa de copolímero catiónico basado en dimetilaminoetil metacrilato, butil metacrilato y metil metacrilato, (c) nanoemulsiones recubiertas con quitosano, (c) nanoemulsiones recubiertas con una capa de copolímero catiónico basado en dimetilaminoetil metacrilato, butil metacrilato y metil metacrilato, y otra cubierta adicional de carragenina iota.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la degradación de la curcumina mediada por fotolisis en una matriz oleosa y en diversas formulaciones de nanoemulsiones y nanocápsulas.

La Figura 3 es un gráfico de la degradación de curcumina mediada por fotólisis y oxidación (radical hidroxilo) en diversas formulaciones de nanoemulsiones y nanocápsulas.

La Figura 4 muestra un gráfico de la degradación de la astaxantina mediada por fotólisis en acetona (♦), en nanoemulsiones en nanocápsulas de quitosano ( 4 ), y en nanocápsulas de quitosano recubiertas con carragenina (®) cuando es sometida a un estímulo fotolítico.

La Figura 5 muestra dos gráficos relacionados con la estabilidad de las formulaciones antes y después de ser convertidas en un polvo seco y reconstituidas en agua. La Figura 6 muestra imágenes de la fotodegradación en el tiempo de astaxantina en hidrogeles esféricos.

La Figura 7 muestra imágenes de microgeles suspendidas en agua que contienen nanoemulsiones con astaxantina. (A) Imágenes obtenidas por microscopio óptico, (B) ojo desnudo, y (C) transformados en un polvo seco mediante liofilización.

Descripción detallada de la Invención

La presente invención se refiere a un método que permite producir nanoestructuras de carotenoides de forma mucho más sencilla que lo descrito en el estado de la técnica, sin requerimientos de altas cantidades de energía (pues se realiza a temperatura ambiente y sin equipos complejos de producción), y con una alta eficiencia de carga de carotenoides que permite disminuir la pérdida de insumos. A su vez, la presente invención se refiere a distintos tipos de nanoestructuras obtenidas con el método descrito, que permiten dispersar adecuadamente las moléculas de carotenoides en agua y proveer de distintos grados de protección frente a la fotolisis y a la oxidación. Es importante destacar que además se puede transformar las nanoestructuras en un polvo seco reconstituible, lo que le aporta versatilidad pues se mantienen estables por un tiempo muy prolongado y se pueden dispersar en un medio acuoso que el usuario estime conveniente (cremas cosmetológicas, fármacos, bebidas refrescantes, bebidas isotónicas, batidos, sopas, yogures, etc.) o utilizar como insumo industrial para enriquecer otras formulaciones alimentarias. Por otra parte, también se puede incluir estas nanoestructuras conteniendo carotenoides en hidrogeles de tamaño milimétrico y micrométrico. Esto puede proveer a los sistemas de mayor potencial pues permite: i) modificar el perfil de estabilidad y liberación de los carotenoides, ii) favorecer la aceptación por los consumidores debido a las características de palatabilidad, consistencia y aspecto de los hidrogeles esféricos, y iii) favorecer la aceptación por los consumidores debido a las características propias de los componentes poliméricos que forman los hidrogeles (por ejemplo, mucoadhesividad que aumenta el efecto de saciedad "disminuyendo el hambre"). Todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado que entiende cualquier persona con conocimientos en el estado de la técnica a la cual pertenece la invención. Sin embargo, para una mejor comprensión de la presente invención y sus alcances, a continuación, se detallarán ciertos términos técnicos utilizados en la descripción de la misma.

Se entenderá en el contexto de la presente invención por "nanoestructuras" una formulación con un tamaño de partículas menor o igual a 500 nm, con la facultad de transportar, solubilizar y proteger del medioambiente compuestos activos hidrofóbicos. Dichas nanoestructuras comprenden nanoemulsiones y nanocápsulas.

El término "nanoemulsión" se refiere a una mezcla de dos o más compuestos lipidíeos y acuosos que normalmente son inmiscibles, que forman gotas de un tamaño menor o igual a 500 nm y que por medio de un surfactante brindan estabilidad a su superficie.

El término "nanocápsula" se refiere a una nanoemulsión recubierta con polímeros iónicos (catiónicos y/o aniónicos), los cuales pueden ser polímeros sintéticos, semi-sintéticos o naturales. Dichas nanocápsulas tienen un tamaño menor o igual a 500 nm y se designará como nanocápsula catiónica, aquella nanocápsula cuyo recubrimiento polimérico más externo tenga carga positiva y como como nanocápsula aniónica, aquella nanocápsula cuyo recubrimiento polimérico más externo tenga carga negativa.

El término "surfactante" se refiere a una molécula anfifílica que puede ser natural o sintética, que permite conseguir o mantener una emulsión. Dicha molécula puede ser iónica (aniónica, catiónica o anfótera) o no-iónica.

El término "solvente orgánico" se refiere a la solución orgánica volátil que contienen carbono y se convierten fácilmente en vapores o gases. Son utilizadas para disolver materias primas, usándose como parte del proceso en la formación de una emulsión.

El término aceite se refiere a una sustancia grasa de origen mineral, vegetal o animal, líquida, insoluble en agua, combustible y generalmente menos densa que el agua, que está constituida por ésteres de ácidos grasos o por hidrocarburos derivados del petróleo-

El término polimetacrilato se refiere a un copolímero catiónico basado en dimetillaminoetil metacrilato, butil metacrilato, y metil metacrilato.

Un primer objeto de la presente invención se refiere a un método para la producción de estructuras con carotenoides que comprende mezclar un compuesto carotenoide con un surfactante aniónico, con un solvente orgánico miscible en agua, y con un aceite líquido en una proporción particular, para luego verter dicha mezcla en una solución acuosa y agitar, y eliminar el solvente orgánico para así obtener una nanoemulsión de carotenoides.

En el presente método, pueden utilizarse carotenoides producidos de forma natural o sintética. Por ejemplo, la nanoemulsión puede contener cualquiera o una mezcla de los más de 700 carotenoides conocidos, tales como β-caroteno, luteína, licopeno, zeaxantina, astaxantina, capsantina, β-criptoxantina, curcumina o sus derivados (tales como demetoxicurcumina, bisdemetoxicurcimina, tetrahidroxicurcumina, Bis-O-demetilcurcumina (BDMC)), aloxantina, cantaxantina, fucozantina, p-Apo-2'-carotenal, entre otros. Preferiblemente, el método de la presente invención utiliza las moléculas de astaxantina y curcumina.

En el primer paso del método que aquí se describe, comprende mezclar el carotenoide con un surfactante aniónico con un solvente orgánico miscible en agua, y con un aceite líquido en una proporción en masa de 1 :5-70:10-1000:30- 250, respectivamente. El orden en el cual se mezclan los componentes es irrelevante para el resultado que se desea obtener.

Preferentemente, el surfactante aniónico utilizado es un extracto aniónico de lecitina, pero puede utilizarse cualquier surfactante aniónico aceptado para su uso farmacéutico, cosmetológico o alimenticio, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, entre otros, sin limitarse a los ejemplos aquí mencionados. A su vez, el solvente orgánico miscible en agua es preferentemente etanol, pero puede utilizarse cualquier solvente orgánico aceptado para su uso farmacéutico, cosmetológico o alimenticio, tanto de origen natural como sintético, por ejemplo, acetona, sin limitarse a estos solventes mencionados. Por otra parte, se puede utilizar cualquier tipo de aceites líquidos como por ejemplo los que se obtienen de fuentes naturales como el aceite de coco o el aceite de palma, pero puede utilizarse cualquier aceite líquido aceptado para su uso farmacéutico, cosmetológico o alimenticio. Por ejemplo, es posible utilizar aceites disponibles comercialmente, sin limitarse a ellos, tales como M-5, Miglyol ^® 808, Miglyol ^® 810, Miglyol ^® 812, Miglyol ^® 818, Miglyol ^® 829, Miglyol ^® 8108, Miglyol ^® 840, Miglyol ^® 8810, Miglyol ^® 285 y Dynacet ^® 285 entre otros, cuya alta polaridad propicia mayor solvencia con sustancias activas.

A la mezcla anteriormente descrita, se agrega agua en una proporción 1 :1 -

100, respectivamente. El agua es preferentemente ultrapura mediante sistemas de purificación Milli ^® Q. Finalmente, se elimina el solvente orgánico para así obtener una nanoemulsión. La eliminación del solvente orgánico se puede realizar a través de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica para su remoción. Así, en una modalidad preferida de la invención, los solventes orgánicos se eliminan por evaporación mediante un rotavapor.

Cabe destacar que el presente método se realiza a temperatura ambiente durante todo el procedimiento, por lo que no requiere ninguna fuente de energía externa para elevar o disminuir la temperatura. A su vez, no requiere de ningún control de pH del medio para obtener las nanoestructuras deseadas.

Opcionalmente, se puede agregar un segundo solvente orgánico miscible en agua antes de agregar agua a la mezcla. Dicho segundo solvente orgánico es preferentemente distinto al primer solvente orgánico, pero puede utilizarse el mismo sin restricción. En una modalidad preferida, dicho segundo solvente es acetona y se agrega a la mezcla en una proporción en masa 1 :10-20, pero puede utilizarse cualquier solvente orgánico aceptado para su uso farmacéutico, cosmetológico o alimenticio. Esta mezcla recién formada se vierte sobre un rango de 1 :1 -100 de agua, la cual preferentemente es agua ultrapura (agua destilada purificada mediante sistemas Milli-Q ^® ) y se somete a agitación para formar una suspensión de aspecto lechoso. Dicha agitación se puede realizar manualmente, o de forma magnética, o mediante cualquier técnica de agitación conocida en el estado de la técnica. Finalmente, se eliminan todos los solventes orgánicos mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica, preferentemente mediante rotavapor, para formar la nanoemulsión.

Opcionalmente, se pueden obtener nanoemulsiones recubiertas con una o más capas de polímeros iónicos. En una modalidad preferida de la invención, el método para obtener nanoemulsiones recubiertas como una nanocápsula catiónica con carotenoides, comprende agregar un polímero catiónico al agua del paso anterior para formar una solución polimérica catiónica y a continuación se procede con el paso para eliminar el(los) solvente(s) orgánico(s). Por otra parte, también se pueden obtener nanoemulsiones recubiertas como una nanocápsula catiónica con carotenoides si se agrega la solución polimérica catiónica posterior a la etapa de eliminación de el(los) solvente(s) orgánico(s). Se puede utilizar cualquiera de estas dos alternativas para generar las nanocápsulas catiónicas con carotenoides.

Preferentemente, la solución polimérica catiónica está a una concentración entre 0,01 -2% p/v en la mezcla final. Dicha solución polimérica contiene un polímero catiónico que puede ser natural, sintético o semi-sintético como, por ejemplo, derivados catiónicos de celulosa, almidones catiónicos, co-polímeros de sales de acrilamida, polímeros de vinilpirrolidona/vinilimidazola, productos de condensación de poliglicoles y aminas, cualquiera de los polímeros llamados policuaternio, polietilenamina, polímeros de silicona catiónica, co-polímeros de dimetilamino hidroxipropil dietilenetriamina, derivados catiónicos de quitina tales como quitosan y sus derivados, derivados de goma guar catiónica como guarhidroxipropiltrimonio, proteínas catiónicas seleccionadas de gelatina, goma arábica, poliamidas, policianoacrilatos, poliláctidos, poliglicólidos, polianilina, polipirrol, polivinilpirrolidona, polímeros de amino siliconas, co-polímeros de metil metacrilato, dimetilamino metacrilato, poliacrilatos catiónicos y polimetacrilatos, entre otros, o cualquier mezcla de ellos. En una modalidad preferida de la invención, se utiliza una solución polimérica que se selecciona del que consiste de quitosano, polímeros o co-polímeros catiónicos basados en dimetilaminoetil metacrilato, butil metacrilato y metil metacrilato (cuyo nombre comercial es Eudragit ^® E PO). La solución polimérica comprende el polímero catiónico en una solución acuosa de agua ultrapura y ácido acético glacial. Opcionalmente, el método de la presente invención comprende agregar un segundo recubrimiento, pero esta vez con una solución polimérica aniónica que se une por cargas al primer recubrimiento polimérico catiónico, y se agita, formándose así las nanoestructuras aniónicas.

Preferentemente, la solución polimérica aniónica está a una concentración entre 0,01 -2% p/v en la mezcla final. Dicha solución polimérica contiene un polímero aniónico que puede ser natural, sintético o semi-sintético como, por ejemplo, carragenina o sus derivados, carboximetil celulosa, ácido algínico, acetato-ftalato de celulosa, co-polímeros aniónicos de ácido metacrílico, acetato- succinato de celulosa, polivinil acetato ftalato, ftalato de hidroxipropilmetil celulosa, entre otros. Preferentemente, el polímero utilizado se selecciona del grupo que consiste de cualquiera de las variantes de carragenina, tales como carragenina iota, carragenina kappa, carragenina lambda, etc. La solución polimérica comprende el polímero aniónico en una solución acuosa de agua ultrapura.

En otra modalidad preferida del método de la presente invención, se especifican las concentraciones y proporciones requeridas entre los componentes previamente mencionados para obtener particularmente nanoestructuras de curcumina. Para ello, se mezcla la curcumina con un extracto aniónico de lecitina, con etanol, y con un aceite líquido, en una proporción en masa de 1 :8,6:1 14:34, respectivamente; luego se agrega a la mezcla anterior acetona en una proporción 1 :14; luego se agrega a la mezcla anterior agua en una proporción de 1 :36; y finalmente se elimina el etanol y la acetona para obtener una nanoemulsion con curcumina. Los parámetros y formas de mezcla son iguales al procedimiento para la obtención de nanoemulsiones de carotenoides.

Opcionalmente, se puede obtener una nanocápsula catiónica con curcumina, para la cual se agrega un polímero catiónico al agua del paso anterior para formar una solución polimérica catiónica, y a continuación se procede con el paso de eliminación de el(los) solvente(s) orgánico(s), o se agrega una solución polimérica catiónica a la nanoemulsion obtenida después de eliminar el(los) solvente(s) orgánico(s). Preferentemente, el polímero catiónico es un polimetacrilato catiónico y se encuentra a una concentración entre 0,01 y 1 % p/v. Alternativamente, el polímero catiónico es quitosano y se encuentra a una concentración entre 0,01 y 1 % p/v. Adicionalmente, la nanocápsula catiónica con curcumina se puede mezclar con una solución de carragenina en una concentración de 0,0765% p/v en una proporción 1 :1 para formar una nanocápsula aniónica.

En otra modalidad preferida del método de la presente invención, se especifican las concentraciones y proporciones requendas entre los componentes previamente mencionados para obtener particularmente nanoemulsiones de astaxantina. Para ello, se mezcla la astaxantina con un extracto aniónico de lecitina, con etanol, y con un aceite líquido, en una proporción en masa de 1 :50:667:200, respectivamente; luego se agrega a la mezcla anterior acetona en una proporción 1 :14; luego se agrega a la mezcla anterior agua en una proporción de 1 :36; y finalmente se elimina el etanol y la acetona para obtener una nanoemulsión con astaxantina. Los parámetros y formas de mezcla son iguales al procedimiento para la obtención de nanoemulsiones de carotenoides.

Opcionalmente, se puede obtener una nanocápsula catiónica con astaxantina, para la cual se agrega quitosano al agua del paso anterior para formar una solución polimérica catiónica al 0,05% p/v y a continuación se procede con el paso de eliminación de el(los) solvente(s) orgánico(s), o se agrega una mezcla de una solución de quitosano al 0,2% p/v a la nanoemulsión obtenida después de eliminar el(los) solvente(s) orgánico(s). Adicionalmente, la nanocápsula catiónica con astaxantina se puede mezclar con una solución de carragenina en una concentración de 0, 153% p/v en una proporción 1 :1 para formar una nanocápsula aniónica.

Un segundo objeto de la presente invención es una nanoestructura con carotenoides que comprende una nanoemulsión o una nanocápsula con carotenoides. En el caso de la nanoemulsión, ésta comprende carotenoides entre 0,0001 % p/v a 0,5% p/v, un surfactante aniónico entre 0,03% p/v a 3% p/v, y un aceite entre 0, 1 % p/v a 15% p/v. En el caso de las nanocápsulas catiónicas, éstas comprenden carotenoides entre 0,0001 % p/v y 0,5% p/v; surfactante aniónico entre 0,03% p/v y 3% p/v; aceite entre 0,1 % p/v y15% p/v; y polímero catiónico entre 0,04% p/v y 20% p/v. En el caso de las nanocápsulas aniónicas, éstas comprenden carotenoides entre 0,0001 % p/v y 0,5% p/v; surfactante aniónico entre 0,03% p/v y 3% p/v; aceite entre 0,1 % p/v y 15% p/v; polímero catiónico entre 0,04% p/v y 20% p/v; y polímero aniónico 0,00765% p/v y 0,38% p/v.

Preferentemente, los carotenoides presentes en las nanoestructuras se seleccionan del curcumina y astaxantina. Dichas nanoestructuras pueden ser nanoemulsiones, nanocápsulas catiónicas o nanocápsulas aniónicas cargadas con curcumina o astaxantina.

En una modalidad preferida de la presente invención, la nanoemulsión con curcumina comprende curcumina entre 0,06% y 0,07% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,6% p/v y aceite entre 2,36% p/v. En otra modalidad preferida de la invención, la nanocápsula catiónica con curcumina que comprende curcumina entre 0,06% p/v a 0,07% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,6% p/v, aceite 2,36% p/v, y un polimetacrilato catiónico 4% p/v; o comprende curcumina entre 0,06% p/v y 0,07% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,6% p/v, aceite 2,36% p/v y quitosano al 0,2% p/v. A su vez, la nanocápsula aniónica con curcumina comprende curcumina entre 0,06% y 0,07% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,6% p/v, aceite 2,36% p/v, polimetacrilato catiónico 0,024% p/v, y carragenina 0,03825% p/v.

En otra modalidad preferida de la presente invención, la nanoemulsión con astaxantina comprende astaxantina 0,006% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,3% p/v y aceite 1 ,18% p/v; la nanocápsula catiónica con astaxantina comprende astaxantina 0,006% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,3% p/v, aceite 1 ,18% p/v y quitosano 0,1 % p/v; y la nanocápsula aniónica comprende astaxantina 0,003% p/v, extracto aniónico de lecitina 0,15% p/v, aceite 0,59% p/v, quitosano 0,05% p/v y carragenina al 0,0765%.

Una vez formuladas las nanoemulsiones y nanocápsulas, éstas se pueden almacenar en forma de polvo seco, mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica tales como secado por atomización o liofilización, y luego reconstituirse en agua sin perder ninguna de las características beneficiosas ya mencionadas de estas nanoformulaciones. Todos los materiales, métodos y ejemplos aquí utilizados son sólo ilustrativos y no deben considerarse en modo alguno para limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN La curcumina se compró a Sigma-Aldrich™. Los polímeros utilizados para la fabricación de los nanocápsulas fueron Eudragit ^® E PO (Evonik Industries™), quitosano (Sigma-Aldrich™) y carragenina iota (Gelymar™). La matriz oleosa fue el aceite Miglyol ^® 812 (Sasol™) y el tensoactivo Epikuron ^® 145V (Cargill™). El peróxido de hidrógeno 30 volúmenes se adquirió de Merck. Los solventes acetona y etanol fueron de grado HPLC. El agua bidestilada se purificó mediante un sistema Milli-Q ^® .

Ejemplo 1. Formulación de nanoestructuras de curcumina y astaxantina

Nanoemulsiones que contienen curcumina

Las nanoemulsiones se prepararon de la siguiente forma: se pesaron cerca de 3,5 mg de curcumina en un tubo de ensayo junto con 30 mg de Epikuron ^® 145 V, luego se agregaron 500 L de etanol y se agitaron en un vortex hasta disolución. A continuación, se agregó 125 μί de Miglyol ^® 812, se agitó y se le agregó, desde otro tubo de ensayo, 9,5 mL de acetona. La mezcla se vertió rápidamente sobre 20 mL de agua Milli-Q ^® y se sometió a agitación magnética por 5 minutos formándose una suspensión lechosa que comprendía las nanoemulsiones. Finalmente se evaporó el solvente hasta un volumen final de 5 mL.

Nanocápsulas catiónicas de Eudragit ^® E PO que contienen curcumina

Las nanocápsulas catiónicas de Eudragit ^® E PO se prepararon de la siguiente manera: se siguió el mismo procedimiento utilizado para las nanoemulsiones del Ejemplo 1 , pero esta vez, luego de agregarle los 9,5 mL de acetona, se vertió la mezcla sobre 20 mL de una solución de Eudragit ^® E PO al 1 %. Esta solución se preparó con 1 gr de Eudragit ^® E PO disuelto en un volumen final de 100 mL con agua Milli-Q ^® , agregando previamente 1 mL de ácido acético glacial. La mezcla se agitó durante 5 minutos para obtener las nanocápsulas y luego se evaporó el solvente hasta un volumen final de 5 mL.

Nanocápsulas catiónicas de quitosano que contienen curcumina

Las nanocápsulas catiónicas de quitosano se prepararon de la siguiente manera: se siguió el mismo procedimiento utilizado para las nanoemulsiones que contienen curcumina, pero esta vez, luego de agregarle los 9,5 mL de acetona, se vertió la mezcla sobre 20 mL de una solución de quitosano al 0,05%. Esta solución se preparó con 10 mg de quitosano disuelto en un volumen final de 20 mL en agua Milli-Q ^® , previa adición de 200 μί de ácido acético glacial. La mezcla se agitó durante 5 minutos para obtener las nanocápsulas y luego se evaporó el solvente llegando a un volumen final de 5 mL.

Nanocápsulas catiónicas recubiertas con el polímero aniónico carraqenina que contienen curcumina

Se desarrolló un protocolo de fabricación de nanocápsulas aniónicas mediante el recubrimiento de las nanocápsulas catiónicas de Eudragit ^® E PO utilizando un polímero de carga negativa como la carragenina iota. Para ello, se siguió el mismo procedimiento utilizado para las nanoemulsiones que contienen curcumina, pero esta vez, luego de agregarle los 9,5 mL de acetona, se vertió la mezcla sobre 20 mL de una solución de Eudragit ^® E PO al 0,01 %. Esta solución se preparó con 0,002 gr de Eudragit ^® E PO disuelto en un volumen final de 20 mL con agua Milli-Q ^® , agregando previamente 0,04 mL de ácido acético glacial. La mezcla se agitó durante 5 minutos para obtener las nanocápsulas y luego se evaporó el solvente hasta un volumen final de 5 mL. Luego, se mezcló 2,5 mL de estas nanocápsulas cubiertas con Eudragit ^® E PO con 2,5 mL de solución de carragenina al 0,0765% p/v y se agitó por 10 min hasta obtener las nanocápsulas aniónicas.

Nanoemulsiones que contienen astaxantina

Las nanoemulsiones se prepararon de la siguiente forma: se pesaron cerca de 0,597 mg de astaxantina en un tubo de ensayo junto con 30 mg de Epikuron ^® 145 V, luego se agregaron 500 μί de etanol y se agitaron en un vortex hasta disolución. A continuación, se agregó 125 μί de Miglyol ^® 812, se agitó y se le agregó, desde otro tubo de ensayo, 10 mL de acetona. La mezcla se vertió rápidamente sobre 20 mL de agua Milli-Q ^® y se sometió a agitación magnética por 5 minutos formándose una suspensión lechosa que comprendía las nanoemulsiones. Finalmente se evaporó el solvente hasta un volumen final de 10 mL.

Nanocápsulas catiónicas de quitosano que contienen astaxantina

Las nanocápsulas catiónicas de quitosano se prepararon de la siguiente manera: se siguió el mismo procedimiento utilizado para las nanoemulsiones que contienen astaxantina, pero esta vez, luego de agregarle los 10 mL de acetona, se vertió la mezcla sobre 20 mL de una solución de quitosano al 0,05%. Esta solución se preparó con 10 mg de quitosano disuelto en un volumen final de 20 mL de agua Milli-Q ^® , previa adición de 2 mL de ácido acético glacial al 0,1 % v/v. La mezcla se agitó durante 5 minutos para obtener las nanocápsulas y luego se evaporó el solvente llegando a un volumen final de 5 mL.

Nanocápsulas catiónicas recubiertas con el polímero aniónico carraqenina que contienen astaxantina

Se desarrolló un protocolo de fabricación de nanocápsulas aniónicas mediante el recubrimiento de las nanocápsulas catiónicas de quitosano utilizando un polímero de carga negativa como la carragenina iota. Para ello, se siguió el mismo procedimiento utilizado para las nanoemulsiones que contienen astaxantina, pero esta vez, luego de agregarle los 10 mL de acetona, se vertió la mezcla sobre 20 mL de una solución de quitosano al 0,05%. Esta solución se preparó con 10 mg de quitosano disuelto en un volumen final de 20 mL con agua Milli-Q ^® , agregando previamente 2 mL de ácido acético glacial al 0, 1 % v/v. La mezcla se agitó durante 5 minutos para obtener las nanocápsulas y luego se evaporó el solvente hasta un volumen final de 10 mL. Luego, se mezcló 4 mL de estas nanocápsulas cubiertas con quitosano con 4 mL de solución de carragenina al 0, 153% p/v y se agitó por 10 min hasta obtener las nanocápsulas aniónicas.

Ejemplo 2. Caracterización de las formulaciones desarrolladas

Las concentraciones finales de los componentes en las formulaciones previamente descritas fueron: Nanoemulsiones que contienen curcumina

- Curcumina 0,06-0,07% p/v

- Miglyol ^® 812 2,36% p/v

- Epikuron ^® 145 V 0,6% p/v Nanocápsulas catiónicas de Eudraqit ^® E PO que contienen curcumina

- Curcumina 0,06-0,07% p/v

- Miglyol ^® 812 2,36% p/v

- Epikuron ^® 145 V 0,6% p/v

- Eudragit ^® E PO 4% p/v Nanocápsulas catiónicas de quitosano que contienen curcumina

- Curcumina 0,06-0,07% p/v

- Miglyol ^® 812 2,36% p/v

- Epikuron ^® 145 V 0,6% p/v

- Quitosano 0,2% p/v

Nanocápsulas catiónicas recubiertas con el polímero aniónico carraqenina que contienen curcumina

- Curcumina 0,06-0,07% p/v

- Miglyol ^® 812 2,36% p/v

- Epikuron ^® 145 V 0,6% p/v - Eudragit ^® E PO 0,02% p/v

- Carragenina 0,03825% p/v

Nanoemulsiones que contienen astaxantina

- Astaxantina 0,00597% p/v

- Miglyol ^® 812 1 , 18% p/v - Epikuron ^® 145 V 0,3% p/v Nanocápsulas catiónicas de quitosano que contienen astaxantina

- Astaxantina 0,00597% p/v

- Miglyol ^® 812 1 , 18% p/v

- Epikuron ^® 145 V 0,3% p/v - Quitosano 0, 1 % p/v

Nanocápsulas catiónicas recubiertas con el polímero aniónico carraqenina que contienen astaxantina

- Astaxantina 0,002985% p/v

- Miglyol ^® 812 0,59% p/v - Epikuron ^® 145 V 0, 15% p/v

- Quitosano 0,05% p/v

- Carragenina 0,0765% p/v

Todas las formulaciones desarrolladas se caracterizaron en términos de tamaño, índice de polidispersión (PDI) y potencial zeta utilizando el equipo Zetasizer Nano ZS. Tamaño de la nanoemulsión obtenida: 150-250 nm. Tamaño de las nanocápsulas obtenidas: 150-500 nm.

La eficiencia de encapsulación de curcumina en las nanoformulaciones (referida al porcentaje de curcumina que está en el nanosistemas comparado con el que está en la fase acuosa externa) y el rendimiento del proceso (referida a la cantidad total de curcumina que está en la formulación (en los nanosistemas y en la fase acuosa externa) y comparada con la cantidad añadida inicialmente), se evaluó utilizando los métodos convencionales descritos en la literatura. En la Tabla 1 se observa que el rendimiento del proceso de carga de curcumina en las formulaciones es mayor al 90% en la mayoría de los casos, indicando que existe una muy poca pérdida de materia prima utilizando el método propuesto en la presente invención. Estos mismos datos se observaron para las formulaciones que contenían astaxantina. Tabla 1. Eficiencia de carga de curcumina en las nanoemulsiones y diferentes nanocápsulas.

Ejemplo 3. Comparación de la estabilidad de la curcumina, sometida a estímulos degradativos como fotolisis y oxidación

Efecto de la fotolisis en distintas formulaciones con curcumina

Se disolvieron entre 3,2 y 3,5 mg de curcumina en 5 mL de Miglyol ^® 812, o se estudió una cantidad similar de curcumina que estaba contenida en 5 mL de las nanoformulaciones (nanoemulsiones, nanocápsulas de Eudragit ^® E PO, nanocápsulas de quitosano y nanocápsulas de Eudragit ^® E PO recubiertas con el polímero aniónico carragenina iota); luego se tomaron 1 ,5 mL de esta suspensión y se sometieron a fotolisis. Para ello se expuso este volumen (contenido en una cubeta de cuarzo) a una lámpara de mercurio que emitía un haz de luz a 254 nm y a 10 cm de distancia. La cubeta fue colocada en un dispositivo de termorregulación que permite el paso del haz de luz, a través de un área determinada, y con una temperatura fija de 30 grados Celcius. Efecto de la fotolisis y oxidación (radical hidroxilo) en distintas formulaciones con curcumina

Se encapsularon entre 3,2 y 3,5 mg de curcumina en 5 ml_ de las distintas nanoformulaciones (nanoemulsiones, nanocápsulas de Eudragit ^® E PO, nanocápsulas de quitosano y nanocápsulas de Eudragit ^® E PO recubiertas con el polímero aniónico carragenina iota). Luego se tomaron 1 ,5 ml_ de estas suspensiones, se mezclaron con 263 μΙ_ de H2O2 (30% v/v), y se sometieron a fotolisis a la vez que se promovía la generación del radical «OH (lámpara de mercurio de 254 nm, a 10 cm de distancia) que es el que genera la oxidación. La cubeta fue colocada en un dispositivo de termorregulación que permite el paso del haz de luz, a través de un área determinada, y con una temperatura fija de 30 grados Celcius.

Como se puede apreciar en la Figura 1 se muestran (a) nanoemulsiones, (b) nanocápsulas de Eudragit ^® E PO, (c) nanocápsulas de quitosano y (d) nanocápsulas de Eudragit ^® E PO/carragenina, la estrategia de nanoencapsulacion en diversos sistemas de núcleo oleoso permite dispersar adecuadamente la curcumina en agua.

La Figura 2 muestra un gráfico de la degradación de la curcumina mediada por fotolisis en Miglyol ^® y en diversas nanoformulaciones (nanoemulsiones, nanocápsulas de Eudragit ^® E PO, nanocápsulas de quitosano y nanocápsulas de Eudragit ^® E PO/carragenina) cuando es sometida a un estímulo fotolítico (lámpara a 254 nm, 10 cm de distancia y 30 grados Celcius). El eje "y" representa la razón de cambio absoluta en la absorbancia y expresada en términos de Ln para ajustar a una cinética de degradación de primer orden (n=3 + D.E). En esta Figura 2 se puede apreciar que las nanocápsulas proveen a la curcumina de un mayor grado de protección frente a la fotolisis (relacionado con una menor pendiente de degradación) y comparado con el aceite Miglyol ^® (que es el componente oleoso que permite disolver a la molécula en el interior de las nanoemulsiones). En la Tabla 2, se puede apreciar, cuantitativamente, que el orden decreciente de protección de todas las formulaciones hacia la curcumina es nanocápsulas de Eudragit E PO > nanocápsulas de Eudragit E PO/carragenina > nanocápsulas de quitosano > nanoemulsión > matriz oleosa (Miglyol ^® ).

Tabla 2. Pendiente de degradación de las distintas formulaciones conteniendo curcumina y expuestas a fotolisis (lámpara a 254 nm, 10 cm de distancia y 30 grados Celcius).

La Figura 3 muestra un gráfico de la degradación de la curcumina mediada por fotolisis y oxidación (radical ·ΟΗ) en diversas nanoformulaciones (nanoemulsiones, nanocápsulas de Eudragit ^® E PO, nanocápsulas de quitosano y nanocápsulas de Eudragit ^® E PO/carragenina) cuando es sometida a un estímulo lumínico (lámpara de 254 nm, 10 cm de distancia y 30 grados Celcius ). El eje "y" representa la razón de cambio absoluta en la absorbancia y expresada en términos de Ln para ajustar a una cinética de degradación de primer orden (n=3 + D.E). Como se puede apreciar en la Figura 3, las nanoformulaciones proveen de distinto grado de protección (relacionado con una menor pendiente de degradación) frente a la fotolisis y a la oxidación (mediada por el radical ·ΟΗ). En la Tabla 3, se puede apreciar, cuantitativamente, que el orden de protección decreciente de todas las formulaciones hacia la curcumina es nanocápsulas de Eudragit ^® E PO > nanocápsulas de Eudragit ^® E PO/Carragenina > nanocápsulas de quitosano > nanoemulsión. Es importante destacar que, en este caso, no se pudo evaluar el efecto de protección brindada por el aceite Miglyol pues el H2O2 (que es el que genera el radical oxidante ·ΟΗ) no es miscible en el este aceite.

Tabla 3. Pendiente de degradación de las distintas formulaciones conteniendo curcumina y expuestas a fotolisis y oxidación (radical ·ΟΗ) (lámpara de 254 nm, 10 cm de distancia y 30 grados Celcius).

Efecto de la fotolisis en distintas formulaciones con astaxantina

La Figura 4 muestra un gráfico de la degradación de la astaxantina mediada por fotolisis en acetona (♦), en nanoemulsiones (§0, en nanocápsulas de quitosano ( 4 ), y en nanocápsulas de quitosano recubiertas con carragenina («) cuando es sometida a un estímulo fotolítico (lámpara de 254 nm, 10 cm de distancia). El eje "y" representa la razón de cambio absoluta en la absorbancia y expresada en términos de Ln para ajustar a una cinética de degradación de primer orden (n=3 ± D.E). En la Figura 4, se puede apreciar un experimento de fotolisis para el carotenoide astaxantina disuelto en el solvente acetona y en nanoemulsiones y nanocápsulas similares a las anteriores. Los resultados indican, al igual que en los experimentos anteriores, que es posible controlar la estabilidad del carotenoide mediante su inclusión en diversos nanoformulaciones. Ejemplo 4. Transformación de las nanoformulaciones a un polvo seco mediante liofilización

Distintas concentraciones de las nanoemulsiones (0.5 y 1 % p/v) cargadas con curcumina y la presencia del crioprotector trealosa (5 y 10% p/v) fueron las variables a considerar para transformar la nanoformulaciones a un polvo seco y estudiar su reconstitución en agua. El espectro UV-Vis de la curcumina desde las formulaciones recién hechas y aquellas liofilizadas y reconstituidas en agua se evaluaron en cubetas de cuarzo a una longitud de onda de entre 350 y 550 nm. Para el análisis, distintas alícuotas (200 y 400 μΙ_) de las nanoemulsiones reconstituidas en agua se mezclaron con acetona (volumen final, 5 ml_) y se agitaron vigorosamente en un vortex. Luego las formulaciones se centrifugaron por 30 min a 12000 G y el sobrenadante se analizó en el espectrofotómetro.

La Figura 5 muestra la estabilidad de las formulaciones antes y después de ser convertidas a un polvo seco y reconstituidas en agua (se analizó el efecto en distintas concentraciones de nanoemulsiones y el efecto del agente crioprotector trealosa evaluado en distintas concentraciones). Tamaño y potencial zeta (izquierda) y espectro de la curcumina antes y después de ser liofilizada y reconstituida en agua (derecha). Como se puede apreciar en la Figura 5, la nanoemulsión que contiene curcumina mantiene sus características fisicoquímicas (tamaño, potencial zeta y espectro UV-Vis) luego de que la suspensión dispersa en agua sea sometida a un proceso de secado por liofilización y posterior reconstitución en agua.

Ejemplo 5. Inclusión de nanoformulaciones en hidrogeles

Como se podrá apreciar en las siguientes figuras, se demostró que las nanoformulaciones aquí descritas se pueden incluir estratégicamente en hidrogeles esféricos de tamaño milimétrico (Figura 6) y micrométrico (Figura 7). La Figura 6 muestra la fotodegradación de astaxantina en hidrogeles esféricos de 2 - 3 milímetros de diámetro. La Figura 7 muestra imágenes de microgeles de alginato de calcio conteniendo nanoemulsiones con astaxantina y suspendidas en agua. Se pueden apreciar imágenes obtenidas por (A) microscopía óptica, (B) a ojo desnudo y (C) transformados en un polvo seco mediante liofilización. Es importante destacar que los hidrogeles que contienen quitosano proveen de mayor fotoprotección. Además, se puede apreciar en la imagen 7C que es posible transformar estos hidrogeles en un polvo seco.

Los resultados experimentales presentados en el Ejemplo 3 denotan el potencial de la invención propuesta y describen en detalle la tecnología utilizada para proteger y administrar carotenoides por vía oral. Si bien, estas pruebas son de laboratorio (in vitro) la tecnología utilizada es simple y escalable, y considerando que los sistemas se dispersan adecuadamente en agua, y que se pueden transformar en un polvo seco, estas nanoestructuras ofrecen un gran potencial para desarrollar alimentos líquidos o insumos sólidos para enriquecer alimentos y así administrar carotenoides que se mantengan estables en la formulación y que se dispersen adecuadamente en medio acuoso.