MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere a un proceso de producción de antocianinas, especialmente para la industria alimenticia y nutraceútica, a partir de cultivos de callos de Arístotelia chilensis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la industria alimenticia, específicamente en el área de los colorantes, actualmente existe una fuerte demanda enfocada hacia los colorantes naturales, debido a que la mayoría de los colorantes artificiales poseen algún nivel de toxicidad. Es por esto, que las antocianinas, al ser un pigmento vegetal, entra como fuerte competencia en la industria de los colorantes, pudiendo así desplazar a su variante sintético.

El Maqui ( Arístotelia chilensis) además de poseer una alta concentración de antocianinas, se caracteriza por sus propiedades antiinflamatoria, anticancerígeno, antibacteriano y neuroprotectoras, entre otras, que lo hace útil como alimento funcional y requerido como materia prima en la industria nutracéutica y cosmética.

La demanda de fruto de Maqui actual ya sea para bebidas o alimentos que lo contienen, o como fuente de antocianinas para la industria que lo emplea como colorante nutraceútico natural, no está completamente abastecida. La falta de cultivos y la estacionalidad del fruto hacen un déficit en la cantidad de materia prima que hay disponible para el mercado. Además, los cultivos actualmente disponibles están sometidos a la variabilidad de la calidad del fruto, ya sea por la variación genética de los ejemplares o por las condiciones ambientales y de recolección. La colecta de fruto es manual y ocurre en zonas geográficas con características diversas, lo que dificulta tener un estándar de calidad de la materia prima. En Chile se recolectan aproximadamente 170 toneladas de maqui al año, lo cual está muy lejos de las 600-800 ton/año que se pronostican como demanda para el año 2020. i De modo de solucionar este problema técnico, los inventores han desarrollado un proceso de producción de un concentrado de antocianinas obtenidas a partir de cultivos celulares de Maqui, que permite desvincular el abastecimiento de estos compuestos de la estacionalidad del fruto y la elaboración de un producto de calidad estandarizada. El proceso de la invención para la producción de antocianinas consiste en la obtención de la biomasa de Arístotelia chilensis en cultivo de callo y su posterior elicitación de antocianinas, de este modo se obtiene un producto rico en estos compuestos, no estacional, y de calidad constante, ya que es producido en un ambiente controlado.

En el estado del arte, no hemos encontrado publicaciones que obtengan antocianinas de cultivos de callos de A. chilensis. Dentro de los documentos cercanos encontramos la publicación de Saw, N. et al ("Effect of elicitors and precursors on the synthesis of anthocyanin in grape Vitis vinifera cell cultures." Energy Res J 1.2 (2010): 189-191 ), donde se estudia la producción de antocianinas en cultivos celulares de vides. Además de la diferencia obvia del material vegetal, en el documento se analiza el efecto de etefón y otros compuestos en la producción de antocianinas en cultivos celulares de Vitis vinifera, y se ve que etefón, compuesto clave en el proceso de la invención afecta negativamente, con resultados inferiores al control, tanto la producción de biomasa, como la producción de antocianinas en ese modelo.

Entre los documentos más cercanos en patentes encontramos la solicitud de patente china CN107721545 A (UNIV FOSHAN, 2018-02-23). Esta solicitud de patente divulga un método basado en el control de las proporciones de nitrato de potasio como fuente de nitrógeno, para promover la acumulación de antocianinas en cultivos de callos. Se muestra un medio de cultivo de uso general, aunque se indica que sirve en callos de Celosía. El medio se caracteriza por el contenido de nutrientes seleccionados para promover la acumulación de antocianinas, pero la invención se diferencia de este documento en que comprende una etapa de inducción o elicitación durante el cultivo, lo que no se sugiere en el documento CN107721545 A.

Sorprendentemente, los inventores han logrado obtener un cultivo de callo de Aristotela chilensis que, a pesar de ser obtenido de cotiledones y hojas de la planta, logra expresar y producir las antocianinas propias del fruto maqui. De este modo, el cultivo de callos se presenta como una nueva alternativa para proveer un aditivo nutricional rico en antocianinas apropiado para la industria alimenticia, o cualquier otra aplicación que requiera antocianinas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Gráfico de rendimiento de biomasa (mf/mO) de callos sometidos a tratamiento de aumento de biomasa, se muestra la razón entre la biomasa final (mf) y biomasa inicial (mO).

Figura 2. Gráfico concentración antocianinas expresada en miligramos equivalente de delfinidina por gramos de peso seco (mg eq del/ gps) de callos sometidos a tratamiento de elicitación de producción de antocianinas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención apunta a un proceso de producción de antocianinas a partir de cultivos de callos de Arístotelia chilensis.

Este proceso, de producción de antocianinas, se divide en 2 etapas esenciales. La primera es la obtención de biomasa en cultivo de callos de A. chilensis, la segunda etapa consta de la elicitación de la producción de antocianinas en el cultivo, para obtener el producto deseado.

Esencialmente, el proceso de producción de antocianinas a partir de cultivos de callos de Arístotelia chilensis comprende las siguientes etapas: a) cultivar callos de Arístotela chilensis en un medio de cultivo para vegetales suplementado con azúcares, conteniendo además, entre 0, 1 a 2 mg/L de BAP (6-Bencil amino purina), entre 0,1 a 2 mg/L de NAA (ácido naftalenacético) y entre 100 a 500 mg/L ácido ascórbico; por un período de entre 5 y 50 días, con alternancia de luz y oscuridad; b) elicitar la producción de antocianinas al mantener el cultivo de la etapa a) en un medio de cultivo para vegetales, suplementado con azúcares, y entre 10 a 500 mg/L etefón; por un período de entre 5 y 30 días, con alternancia de luz y oscuridad. En la etapa a) del proceso los azúcares del medio están en una concentración total de entre 1 a 5 %p/v y se escogen entre sacarosa, glucosa y/o fructosa y el medio opcionalmente comprende entre 20 a 200 mg/L de quelato de Hierro. Y el cultivo se mantiene en un fotoperiodo de entre 12 a 20 horas luz y entre 12 a 4 horas de oscuridad al día, con una intensidad lumínica de entre 5.000 a 30.000 lux.

En la etapa b) del proceso los azúcares del medio están en una concentración total de entre 1 a 20 %p/v y se escogen entre sacarosa, glucosa y/o fructosa y el medio opcionalmente comprende entre 20 a 200 mg/L de quelato de Hierro; y entre 10 a 500 mg/L etefón; por un período de entre 5 y 30 días. Y el cultivo se mantiene en un fotoperiodo de entre 12 a 20 horas luz y entre 12 a 4 horas de oscuridad al día, con una intensidad lumínica de entre 5.000 a 20.000 lux. El quelato de hierro puede ser sulfato de hierro, mono, penta o hepta hidratado.

Donde, de manera adicional al finalizar la etapa b) se extraen las antocianinas de los callos en cultivo. O de manera alternativa al finalizar la etapa b) los callos A. chilensis se secan, por ejemplo, por liofilización y muelen hasta obtener un polvo rico en antocianinas.

En una realización preferida el polvo obtenido puede ser empleado directamente como suplemento para alimentos y bebidas, y también como como fuente de antocianinas para productos nutraceúticos

Como se indicó, la finalidad de la etapa a) del método de la invención es la obtención de biomasa en grandes cantidades, los inventores han realizado estudios a escala laboratorio, donde han logrado obtener un rendimiento de biomasa de los callos de A. chilensis de hasta 9,5 veces respecto de la biomasa inicial, en 21 días de cultivo.

La segunda etapa del proceso de la invención consta de la elicitación de la producción de antocianinas en los cultivos. En esta etapa se somete a los callos de A. chilensis en cultivo, a estrés nutricional, de forma que se active la ruta metabólica de la producción de antocianinas y así lograr el cambio de coloración de los callos de verde a morado, color característico de la presencia de antocianos en el tejido vegetal.

Después de la etapa a) de aumento de biomasa, el medio de cultivo es retirado y los callos son mantenidos en medio de cultivo para vegetales, suplementado con azúcares, y como elicitor de etefón. Las condiciones de cultivo son fotoperiodo 16 horas luz 8 horas oscuridad, agitación constante de 100 rpm. En estas condiciones se logra obtener callos completamente coloreados y con un alto contenido de antocianinas.

Opcionalmente, se pueden procesar los callos coloreados para la obtención de un extracto de antocianinas en formato polvo. Para ello, en una realización preferida los callos son sometidos a centrifugado durante 15 minutos, para eliminar el exceso de medio de cultivo. Luego son liofilizados durante 72 hrs. y posteriormente pasan a la molienda en un molinillo de cuchillos durante 10 minutos. Al final del proceso se realiza un control de calidad del producto, donde se medirá el contenido de antocianinas.

El producto de la invención tiene la ventaja que no se encuentra bajo el efecto de la estacionalidad del fruto, ya que la materia prima de la producción de antocianinas está presente en todo el año para el caso de la invención. Cabe destacar también que la variabilidad propia de los frutos, tanto por variables genéticas de las plantas o por variables climáticas ambientales, en nuestro caso no afecta a la producción de la antocianina, debido a que la producción de esta se encuentra regulada por otros factores que nos hacen ser independientes de la variabilidad genética. El proceso de la invención permite obtener una biomasa con alto contenido de antocianinas, que podría competir con la biomasa de fruta obtenida en una temporada.

A continuación, se describen algunos ejemplos, los que muestran realizaciones preferidas de la invención. Dentro de los ejemplos existen condiciones que dan resultados mejores que las otras probadas, no obstante, todas las opciones se consideran parte de la invención. Estos ejemplos deben considerarse como ilustrativos y no limitativos del alcance del proceso de la invención.

EJEMPLOS

El proceso de obtención de antocianinas se divide en el aumento de la biomasa de callos a través de la adición de nutrientes y hormonas, seguido de la elicitación de la producción de antocianinas con ayuda de elicitores.

Ejemplo 1 : Aumento de la biomasa de callos. Para el aumento de la biomasa se proveen callos de A. chilensis obtenidos por métodos tradicionales de callogénesis. Estos callos fueron cultivados en 4 diferentes tratamientos o medios los cuales están especificados a en la Tabla 1.

Las condiciones de cultivo fueron fotoperiodo 16 horas luz con intensidad lumínica de 27.000 lux y 8 horas de oscuridad, por 28 días.

En la Figura 1 se aprecia la comparación de los resultados obtenidos con cada tratamiento utilizado, en donde luego del proceso se logró obtener un rendimiento de 9,5 veces aumento de biomasa inicial con el tratamiento N°4, esto quiere decir que para 1 g de callo fresco inoculado se obtiene 9,5 g de callo fresco al final el proceso. En caso del tratamiento N°1 y N°2 la biomasa se triplicó y para el tratamiento N°3 la biomasa se quintuplicó.

Tablal . Descripción de tratamiento utilizados para el aumento de biomasa

Ejemplo 2: Elicitación de antocianinas

Posterior al proceso de aumento de biomasa celular, callos obtenidos de acuerdo con el tratamiento 4 descrito en el ejemplo 1 , fueron transferidos a tratamientos o medios de elicitación de la producción de antocianinas, los que se especifican en la Tabla 2.

Tabla 2. Descripción tratamientos utilizados para elicitación.

Las condiciones de cultivo fueron fotoperiodo 16 horas luz roja con intensidad lumínica de 11 .000 lux y 8 horas de oscuridad, por 14 días.

Transcurridos los 14 días los callos fueron cosechados y sometidos a un proceso de extracción y cuantificación de las antocianinas. Los callos fueron masados y parte de ellos transferidos a tubos Falcon para cuantificar y aislar las antocianinas producidas. Para esto a los tubos Falcon se les adicionó 5 mi de metanol acidificado (0,1% HCI) y se dejaron en agitación 200 rpm por 1 hora. La mezcla fue centrifugada a 10.000 g por 15 minutos, se recuperó el sobrenadante y se almacenó a 4°C.

Al pellet restante se le adicionaron 3 mi de metanol acidificado y nuevamente se dejó en agitación por una hora, se centrifugó y el sobrenadante fue juntado con el anterior. La concentración de antocianinas en los extractos fue cuantificada a través del método del pH diferencial.

Del tratamiento 1 se obtuvo un callo con zonas coloreadas rojizo, la cuantificación mostró que el callo tenía una concentración promedio de antocianinas de 2,2 mg eq del/gps.

En el caso del tratamiento 2 se obtuvo un callo coloreado rojizo y con zonas púrpura, la cuantificación mostró que el callo tenía una concentración promedio de 3,8 mg eq del/gps.

Finalmente, para el tratamiento 3 se obtuvo un callo coloreado púrpura, la cuantificación mostró que el callo tenía una concentración promedio de antocianinas de 6,4 mg eq del/gps, los resultados se grafican en la Figura 2. El resto de la biomasa obtenida fue liofilizada por 72 hrs a una temperatura de -70°C y presión de 0,0007 pascal y se obtuvo un polvo seco púrpura, rico en antocianinas.

El polvo obtenido puede ser mezclado con alimentos o bebidas aportando antocianinas como nutraceútico. O puede emplearse como fuente de antocianinas en cualquier composición que lo requiera.

Los ejemplos precedentes demuestran la efectividad del proceso de la invención. Para el experto en la técnica serán evidentes modificaciones a estas realizaciones, las que tendrían resultados similares a los descritos, quedando todas estas modificaciones comprendidas en el alcance la invención, según se indica en las reivindicaciones adjuntas.