Область техники

Изобретения относятся к антисептическим средствам и способу их получения и могут быть использованы в качестве дезинфекционного средства широкого спектра действия в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и т.д.

Согласно современным представлениям основной причиной порчи практически всех материалов (древесина, металл, кожа, краски, штукатурка, пищевых продуктов и т.п.), большей части болезней человека, животных и растений являются микробы - бактерии, грибы, вирусы и простейшие. Актуальность борьбы с ними постоянно возрастает во всех отраслях промышленности, в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве. Наибольшее значение в профилактике распространения микробных поражений во всех отраслях играют антисептики. Число общедоступных антисептиков для промышленности, медицины, ветеринарии и сельского хозяйства является явно недостаточным. Большая часть существующих препаратов имеет ряд выраженных недостатков, и, прежде всего, токсичность, неприятный запах, малую эффективность. Повсеместно наблюдается формирование и распространение микробов, устойчивых к существующим антисептикам (Fidel P.L. Jr, Vazquez J.A., Sobel J.D. Candida glabrata: review of epidemiology, pathogenesis and clinical disease with comparison to C. albicans 1999, 1 :80-96. White T. Antifungal drug resistance in Candida albicans, ASM News 8:427-433). В промышленности многие антисептики представляют собой побочные продукты нефтехимической переработки и, как следствие, токсичны, имеют выраженный запах или содержат повышенное количество металлов, например, меди, что также является серьезным недостатком.

В настоящее время существует потребность в новых антисептиках, особенно ввиду постоянного изменения видового состава патогенной микрофлоры и появления форм, резистентных к препарату. Как правило, поиски направлены на получение препаратов с заданными физико-химическими (растворимость, гидролитическая устойчивость и др.) и биологическими свойствами (широта действия, специфичность применительно к тем или иным микроорганизмам, активность к резистентным штаммам и др.). Предшествующий уровень техники

Известен способ получения биоцидного гуанидина путем поликонденсации смеси гексаметилендиамина, додекаметилендиамина и гуанидингидрохлорида. После окончания процесса поликонденсации к раствору полученного сополимера добавляют гидразингидрат в тройном избытке и нагревают (обратным холодильником до прекращения выделения аммиака).

Раствор высушивают в вакууме, смешивают с 1 молем изоникотиновой кислоты и греют на масляной бане при 150°С до прекращения выделения влаги, RU 2176523 С1.

Полученный продукт представляет собой гидрофобный полигуанидин, его водный раствор является биоцидным средством, предназначенным для использования в качестве дезинфицирующего вещества при туберкулезе.

Обработка гидразином полученного полигуанидина не позволяет ввести гидразиновый фрагмент в полимерную цепочку, поскольку при этом либо не происходит разрыв этой цепочки (при непродолжительном нагревании), либо происходит полное разрушение полимерной цепочки (при продолжительном и/или более интенсивном нагревании). В любом случае сохранить цепочку с введением в нее гидразинового фрагмента при реализации способа по RU 2176523 С1 невозможно. Полученный по данному способу биоцидный полигуанидин имеет низкую биологическую активность и узкий спектр действия.

Известен способ получения биоцидного полигуанидина, включающий поликонденсацию а, ω-диамина с солью гуанидина; при этом используют гидрофобный а, ω-диамин в смеси с гексаметилендиамином или в смеси с 4,9-диоксадодекадимином H ₂ N-(CH ₂ ) ₃ -0-(CH ₂ ) ₄ -0-(CH ₂ ) ₃ -NH ₂ при следующих соотношениях, мас.%:

гидрофобный а, со-диамин 16 - 60

гексаметилендиамин или

4,9-диоксадодекандиамин 84 - 40,

причем в качестве гидрофобного а, ω-диамина используют 1,10-декаметилендиамин H ₂ N-(CH ₂ )io-NH ₂ или 1,12- додекаметилендиамин (H ₂ N-(CH ₂ )i ₂ -NH ₂ или N,N-6HC-(3- аминопропил)додециламин

H ₂ N- (CH ₂ ) ₃ -N- (CH ₂ ) ₃ -NH ₂

В результате реализации способа получают биоцидный олигуанидин со следующей формулой:

HC1 - NR,R ₂

где п=30-50;

R, и R ₂ = Н, СН ₃ , С ₂ Н ₅ , С ₄ Н ₉ , С ₈ Н ₁₇ , СН ₂ С ₆ Н ₅ , RU 2324478 С2. Данный способ (RU 2324478 С2), принятый в качестве прототипа настоящего изобретения, не обеспечивает достаточной степени полимеризации исходных компонентов (п = 30-50) и не позволяет получить биоцидное средство с высокой биологической активностью.

Биоцидные полигуанидины указанного выше типа («метацид» и его аналоги) применяются более 50 лет, в результате чего возникло большое количество разнообразных резистентных штаммов патогенных микроорганизмов.

Раскрытие изобретений

Задачей настоящих изобретений является · получение биоцидного полигуанидина с высокой антимикробной активностью широкого спектра действия.

Согласно изобретению в части способа в способе получения биоцидного полигуанидина, включающем поликонденсацию гексаметилендиамина с солью гуанидина, в процессе поликонденсации дополнительно используют гидразингидрат при следующем соотношении компонентов, масс.%:

гексаметилендиамин 20-55

соль гуанидина 25-65

гидразингидрат остальное.

Согласно изобретению в части вещества заявлен биоцидный полигуанидин, полученный способом по п.1, с формулой: или

где n - количество звеньев А в единичном фрагменте

полимерной цепочки, п = 1 - 3;

m - количество звеньев В в единичном фрагменте полимерной цепочки, m = 2 - 10;

z - количество единичных фрагментов в полимерной цепочке, 2 = 4 - 20;

Acid - кислота.

Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленных изобретений критерию "новизна" (N).

Заявителем не обнаружены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии заявленных отличительных признаков на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данных технических решений критерию «изобретательский уровень» (IS). Краткое описание чертежей

В дальнейшем изобретения поясняются подробным описанием примеров их осуществления без ссылок на чертежи.

Лучший вариант осуществления изобр

Получение биоцидного полигуанидина заявленным способом поясняется примерами.

Пример 1. В колбу вместимостью 1 л, снабженную газоотводной трубкой и термометром, загружали 95,5 г гуанидина гидрохлорида (48,7 масс.%), 95,5 г гексаметилендиамина (48,7 масс.%) и 5 г гидразингидрата (2,6 масс.%). Содержимое колбы перемешивали и помещали в воздушный термостат, а газоотводную трубку подсоединяли к приемнику для улавливания аммиака; нагревали реакционную смесь до 200 °С с постепенной отгонкой воды и аммиака и выдерживали 2 ч при этой температуре до прекращения выделения аммиака. После этого горячую сиропообразную массу выливали на металлический противень, охлаждали и получили 179 г продукта в виде твердого, практически, бесцветного прозрачного стекловидного вещества с формулой:

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Общее количество звеньев А и В в среднестатистической полимерной цепочке (n + m)z = 100.

Пример 2. Способ осуществляли так же, как в примере 1 , при этом использовали, масс.%:

Гуанидина гидрохлорида 65

Гексаметилендиамина 20

Гидразингидрата 15

Получено вещество с формулой:

Общее количество звеньев А и В в среднестатистической полимерной цепочке (n + m)z = 60.

Пример 3. Способ осуществляли так же, как в примере 1 , при этом использовали, масс.%:

Гуанидина гидрохлорида 40

Гексаметилендиамина 55

Гидразингидрата 5,5

Получено вещество с формулой:

Общее количество звеньев А и В в среднестатистической полимерной цепочке (n + m)z = 48.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Пример 4. Способ осуществляли так же, как в примере 1 , при этом использовали, масс.%:

Гуанидина сульфата 50

Гексаметилендиамина 45

Гидразингидрата 5

полимерной цепочке (n + m)z = 100.

Пример 5. Способ осуществляли так же, как в примере 1 , при этом использовали, масс.%:

Гуанидина карбоната 50

Гексаметилендиамина 45

Гидразингидрата 5

Получено вещество с формулой:

Общее количество звеньев А и В в среднестатистической полимерной цепочке (n + m)z = 80.

Пример 6. Способ осуществляли так же, как в примере 1 , при этом использовали, масс.%:

Гуанидина ацетата 50

Гексаметилендиамина 37,5

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Гидразингидрата 12,5

полимерной цепочке (n + m)z = 100.

Пример 7. Способ осуществляли так же, как в примере 1 , при этом использовали, масс.%:

Гуанидина бензоата 64,3

Гексаметилендиамина 33,9

Гидразингидрата 1 ,8

полимерной цепочке (n + m)z = 99.

Элементный состав веществ по примерам 1 -7, полученных , согласно заявленному способу, приведен в таблице 1.

Антимикробная активность заявляемого вещества по примерам 1 -7 в сравнении с прототипом подтверждается следующими примерами.

Пример 8.

Определение противогрибковой активности заявляемого вещества по отношению к спорам грибов.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В экспериментах использованы различные грибы вегетативные формы и споры, вызывающие заболевания людей и животных, а также порчу сельскохозяйственных продуктов продуктов и различных промышленных материалов - древесины, кожи и др.

Биоцидные свойста испытаны на спорах культур грибов, предусмотренных ГОСТ 9.050-75. Оптическая плотность посевной суспензии спор Е=0,310. Суспензия содержала в равных пропорциях споры следующих микромицетов:

Aspergillis niger

Aspergillis terreus

Alternaria alternata

Fusarium moniliforme

Penicillium brevicompactum

Penicillium chrysogenum

Penicillium ochro-chloron

Penicillium martensii

Trichoderma viride

Определение антисептических свойств заявляемых веществ проводили через 7 суток выращивания микромицетов методом бумажных дисков и методом лунок (таблица 2).

Зона ингибирования составила от 16 до 38 мм. Вещество по примерам 3, 4 проявляет биоцидные свойства уже в концентрации 0,1%.

Пример 9.

Оценка эффективности воздействия вещества на дрожжи и дрожжеподобные грибы. Активность против дрожжей и дрожжеподобных грибов определяли методом серийных разведений.

Испытуемые вещества растворяли в воде и титровали в среде N- 1, RPMI, Сабуро так, что заявленное вещество содержалось в отдельных пробирках со средой в различных концентрациях.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о весьма высокой активности заявляемого вещества по отношению к дрожжам и одноклеточным грибам рода Candida в сравнении с прототипом.

Пример 10.

Определение эффективности вещества в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (аэробных и анаэробных).

В экспериментах использованы стандартные коллекционные штаммы и бактерии, выделенные от больных. Оценку проводили методом серийных разведений с использованием питательных сред пригодных для культивирования соответствующих видов микроорганизмов.

Соединения растворяли в стерильной воде и титровали в концентрациях от 500 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°С

(таблица 4) .

Таким образом, заявляемое вещество обладает выраженной антибактериальной активностью.

Пример 10.

Определение действия заявляемого вещества на микобактерии туберкулеза Для определения активности был использован стандартный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv, чувствительный ко всем антимикробным препаратам. Оценку антимикобактериального действия проводили методом серийных разведений.

Вещества растворяли в стерильной воде и титровали так, чтобы препарат содержался в отдельных пробирках со средой в концентрациях от 200 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°С (таблица 5).

Таким образом, заявляемые соединения по активности против возбудителя туберкулеза значительно превосходят прототип.

Пример 1 1.

Определение антипротозойного действия вещества по отношению к трихомонадам (Trichomonas vaginalis).

В экспериментах использованы штаммы, выделенные от больных. Оценку проводили методом серийных разведений с использованием питательных сред пригодных для культивирования соответствующих видов микроорганизмов.

Вещества растворяли в стерильной воде, и титровали в концентрациях от 500 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°С (таблица 6).

Результаты свидетельствуют о достаточно высокой активности заявляемого вещества против простейших на примере трихомонад. Пример 12.

Определение действия заявляемого вещества на вирус простого герпеса.

Антивирусная активность изучалась по отношению к вирусу простого герпеса I типа (ВГТГ-1/Ленинград/248/88) по общепринятому методу [Gentry G.A., Lawrency N., Lushbaugh N. Isolation and differentiation of Herpes simplex virus and Trichomonas vaginalis in cell culture, J. of Clinical Microbiology 1985, Vol. 22, No. 2, P. 199-204]. Вирусы выращивали на перевиваемой культуре клеток Vero, полученной из банка клеточных культур Института цитологии РАН. Результаты оценивали по наличию цитопатогенного действия вируса на клетки через 36 часов культивирования при 37°С в С0 ₂ -инкубаторе. Для оценки цитопатического действия вируса подсчитывали число неизмененных клеток. Результаты приведены в таблице 7.

Полученные результаты указывают, что заявленное вещество обладает высокой активностью против вируса герпеса.

Пример 13.

Использование заявляемого вещества для борьбы со смешанной микробной инфекцией.

У лабораторных животных (морские свинки) выбривали часть волосяного покрова, наносили поверхностные царапины и втирали микробную смесь, состоящую из грибов рода Candida, стафилококка, кишечной палочки и энтерококка. Через 24 часа у всех животных возникал местный воспалительный процесс. Для лечения использовали мазь, приготовленную из вещества по примеру 3 или вещества-прототипа, приготовленного в виде мази на ланолине. Вещества были добавлены в количестве 100 мкг/мл. В контрольной группе наносили чистый ланолин. Каждая группа включала 5 животных. Критерием эффективности был срок полного заживления и восстановления кожного покрова. У животных в группах, леченных веществом по примеру 3, выздоровление наступило через 5 дней. В группах, получавших препарат-прототип в течение 6 дней, все животные были больны. Выздоровление этой группы наступило через 13 дней, а в контрольной группе с ланолином - через 15 дней.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что заявленное вещество может быть эффективно использовано местно для борьбы со смешанными инфекциями, вызванными грамположительными и грамотрицательными бактериями и грибами.

Пример 14.

Использование заявленного вещества для придания антимикробных свойств краскам.

В работе использована белая водоиммульсионная краска завода «Кронос», в которую было добавлено заявленное вещество по примеру 5 в конечной концентрации 1,0%. В чашках Петри на питательную среду засевали тест-микробы (Е. coli АТСС 25922, S.aureus VT209, Candida АТСС 885-653, Aspergillus niger VT-7765) и после 15 минутного подсушивания поверх них накладывали бумажные диски диаметром 5 мм, пропитанные краской с заявленным веществом. После инкубации в течение 20-24 часов при 35-37°С определяли наличие и величину зоны угнетения роста микробов вокруг дисков. Во всех экспериментах было зарегистрировано выраженное угнетение роста тест штаммов использованных бактерий.

Таким образом, полученные данные свидетельствует, что заявленное вещество, введенное в водоэмульсионную краску сохраняло антимикробные свойства и проявляло их по отношению к различным неродственным бактериям и грибам.

Пример 15.

Использование заявляемого вещества для обработки корневых каналов зубов.

Исследование выполнено на экстерпированных зубах. Зубы предварительно обрабатывали, удаляли посторонние вещества и очищали корневой канал. В обработанные таким образом зубы в канал вводили 0,05% вводный раствор вещества по примеру 7 или вещества-прототипа, после чего вход в канал закрывали временной пломбой, не пропускающей жидкость. Зуб помещали на 24 часа в стерильной пустой чашке Петри в термостат и инкубировали при температуре 37°С 20— 24 часа. Во время этой инкубации могла происходить диффузия веществ в канальцы дентина. Известно, что именно канальцы дентина могут быть местом, где сохраняются вредные и опасные микробы после обработки корневых каналов, при этом общая протяженность таких канальцев в однокорневом зубе составляет около 5 километров. После инкубации зубы помещали в полужидкий агар, содержащий тест-микробы (E.coli или S. aureus) в количестве 1,0-5,0 х 105 мл.

Чашки инкубировали еще 20-24 часа при 37°С. Результат учитывали по наличию и величине зоны угнетения роста, возникающей по периметру зуба. Наличие зоны угнетения роста свидетельствовало о проникновении препарата в дентин, его способности выходить по периметру зуба (в организме человека в ткани вокруг зуба) и сохранять антимикробные свойства.

Препарат во всех использованных концентрациях, начиная с 0,05, вызывал антимикробный эффект в поставленных экспериментах

Пример 16.

Придание антимикробных свойств шовному материалу и эндопротезам.

В чашку Петри 0 90 мм с тонкой (3 мм) подложкой из 1 ,5%

МПА помещали образцы нитей длиной около 1 см по 2 кусочка на пробу, по 4 кусочка на чашку. Пробы заливали 6 мл 0,7% МПА, содержащего 0,6 мл тест-культуры в концентрации 5x 105 микроорганизмов в 1мл. Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 ч (бактерии), 30 °С 24 ч (грибы).

Чашки с 1 ,5% МПА засевали газоном взвесью микроорганизмов в физиологическом растворе в концентрации 5x 105, разведенной в 10 раз для бактерий/ 5 ЕД, разведенной в 10 раз для грибов. Чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 минут, далее на них раскладывали диски из фильтровальной бумаги 0 6мм, смоченные исследуемыми растворами в количестве 2 диска на пробу, 4 диска на чашку. Пробы снова подсушивали в перевернутом виде в течение 10-15 мин и инкубировали в термостате при 37 "С в течение 24 ч (бактерии), при 30°С - 24 ч (грибы). Результаты оценивали по наличию или отсутствию зон задержки роста вокруг тестируемых объектов (таблица 8); использованы шовные нити и сетки (эндопротезы).

Полученные результаты свидетельствуют, что заявленное вещество (по примеру 2), нанесенное на шовный материал, смывается с него и сохраняет антимикробную активность с широким спектром действия и угнетает рост грамположительной и грамотрицательной бактериальной флоры, а также одно- и многоклеточных грибов, представляющих опасность для человека.

Промышленная применимость

Для реализации изобретений используются известные материалы и оборудование, что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие изобретений критерию «промышленная применимость» (IA).

Элементный состав веществ по примерам 1 - 7

Таблица 1

При- мер х Acid n m z Данные элементного анализа, %

С Н N C1(S)

1 НС1 1 9 10 46,91 9,06 24,25 19,78

2 НС1 3 2 12 45,05 9,12 26,27 19,56

3 HC1 2 10 4 46,60 9,20 23,97 20,23

4 H ₂ SO ₄ 1 9 10 43,60 9,02 22, 1 1 8,44

5 нет 1 9 8 58,0 10,67 30,45 -

6 СНзСООН 2 3 20 45,87 8,69 21,94 -

7 C ₆ H ₅ COOH 1 10 9 63,26 8,71 15,91 -

Результаты определения антисептических свойств

заявляемых веществ

Таблица 2

Споры грибов Минимальная подавляющая (биоцидная) (смесь) концентация (МПК) вещества в водном растворе, мкг/мл.

1 2 3 4 5 6 7 Про- то- тип

A. niger

A. terreus

A.alternata

F.moniliforme 1,0 1,5 0,5 0,5 1,0 1,5 2,0 3,5

P. brevicompactum

P. chrysogenum

P. ochrochloron

P. martensii

Эффективность воздействия вещества на дрожжи и дрожжеподобные грибы

Таблица 3

Гриб Штамм Минимальная подавляющая концентрация

(МПК) (мкг/мл)

(примеры 1 - 7 и прототип)

1 2 3 4 5 6 7 Про- то- тип

Saccharo- VT-2 0,5 0,7 0,4 0,5 0,5 0,7 0,8 12000 myces

cervisiae

Candida 21 0,8 0,7 0,5 0,5 0,7 0,8 0,9 10000 albicans

Candida 372 0,9 0,7 0,3 0,3 0,6 0,9 1,0 12000 albicans

Candida 80 1,0 0,8 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 12000 albicans

Candida 382 0,8 0,8 0,7 0,8 1,0 1,1 1,2 14000 glabrata

Candida 1 11 0,7 0,8 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 12000 glabrata

Candida 160 0,8 0,9 0,6 0,7 0,8 0,8 1,0 12000 glabrata

Candida 21 ' 0,9 1,0 0,7 0,8 1,0 1,1 1,2 12000 krusei Эффективность вещества в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (аэробных и анаэробных)

Таблица 4

Микроорганизм МПК (мкг/мл)

1 2 3 4 5 6 7 Про- то- тип

Escherichia 0,7 0,9 0,5 0,5 1,0 1,5 2,0 2,0 coli АТСС922

Salmonella 1,5 2,0 1,0 1,1 2,0 3,0 4,0 10,1 typhimur.

VT-191

Enterococcus 1,5 2,0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 4,0 fecalis

Pseudomonas 0,1 0,2 0,1 од 0,1 0,1 0,2 од aeruginosa

ATCC27853

Klebsiella 0,7 1,0 0,5 1,0 1,5 1,5 2,0 2,0 pneumoniae

Bacillus cereus 2,5 3,0 2,0 2,0 2,5 2,5 3,0 12

Staphylococcus 2,5 3,0 2,0 2,5 2,5 3,0 3,0 5,0 aureus VT-209

Fusobacterium 0,3 0,4 0,2 0,3 0,5 0,6 0,7 0,4 nucleatum

Porfhiromonas 0,8 1,0 0,5 0,6 1,0 1,5 2,5 6,0 gingivalis

Prevotella 0,8 1,0 0,4 0,7 1,0 1Д 1,4 1,5 melaninogenica Действие заявляемого вещества на микобактерии туберкулеза

Таблица 5

Антипротозойное действие вещества по отношению к

трихомонадам (Trichomonas vaginalis)

Таблица 6

Действие заявляемого вещества на вирус простого герпеса

Таблица 7

Вирус МПК (мкг/мл)

1 2 3 4 5 6 7 Про- тотип

ВПГ- 80,0 100,0 50,0 70,0 100,0 140,0 150,0 1000

1/Ленинград/248/88 Антимикробные свойства шовного материала и эндопротезов

Таблица 8 jYo Тестируемый объект / Антимикробная активность

(мм от края нити)

Е. coli St. Candida Aspergillus АТСС aureus АТСС niger / Тест-культуры 25922 209 885-653

1 Капроновая нить

обработанная водным 4 6 5 6 раствором заявленного

вещества (1,0мг/ 1,0мл)

2 Лавсановая нить,

обработанная водным 5 4 4 5 раствором заявленного

вещества (1,0мг/ 1,0мл)

3 Сетка

полипропиленовая 5 4

5 6

заявленного вещества

(1,0мг/ 1,0мл)

4 Сетка из ПВДФ

волокна заявленного 6 5 5 3 вещества (1,0мг/ 1,0мл)

5 Лавсановая сетка

заявленного вещества 8 7 8 6

(1,0мг/ 1,0мл)