Titre de l'invention : Procédé de production de cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique

Objet de l’invention

La présente invention concerne un procédé de production de cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique.

Arrière-plan technique

Certaines technologies de substitution à des produits d’origine animale ou humaine, telles que la viande de culture, les cellules éryfhroïdes ou les globules rouges de culture, nécessitent la production de grandes quantités de cellules animales ou humaines.

Toutefois, la production en quantités industrielles de cellules animales ou humaines se trouve confrontée à de nombreux obstacles, don† en particulier des coûts trop élevés ou des rendements trop faibles.

Les coûts proviennent en grande partie des protéines, hormones e† facteurs de croissance, notamment recombinantes, ajoutées au milieu de culture en remplacement ou en complément du sérum.

A titre d’exemple, il a été calculé que pour une culture en batch (par lot) de cellules destinées à la production de viande de culture, le coû† des quatre facteurs de croissance nécessaires, à savoir l’insuline, la transferrine, le FGF-2 e† le TGF-b représentai† 99% du coû† du milieu de culture, don† 96% pour les seuls FGF-2 e† le TGF- b (Spech† (2020) « An analysis of culture medium costs and production volumes for cultivated méat », The Good Food lns†i†u†e). Cependant, les coûts liés à la transferrine son† plus importants pour des cultures intensives en fer ferrique, telles que les cultures de globules rouges.

Ainsi, Giarratana et al. (201 1 ) “Proof of principle for transfusion of in vitro- generated red blood cells”, Blood 118:5071-5079 décrivent la production ex vivo de globules rouges de culture à partir de cellules souches hématopoïétiques isolées du sang périphérique. Toutefois, le procédé utilisé es† trop onéreux pour avoir une application industrielle ou médicale, notamment car il nécessite de renouveler intégralement plusieurs fois par semaine le milieu de culture, riche en facteurs de croissance e† en transferrine (330 g/mL), soi† environ 30 fois plus de transferrine en concentration que ce qui serait nécessaire pour la production de cellules destinées à la préparation de viande de culture dans l’exemple ci-dessus.

Des substituts non-protéique à la transferrine ont été proposés, tels que le citrate ferrique (Eto ét al. (1991 ) Agric. Biol. Chem. 55:863-865).

Toutefois, la faisabilité industrielle de ce type de substitution n’a pas encore été établie, notamment pour les cultures intensives en fer ferrique.

Il existe donc un besoin pour un procédé indusfrialisable de production de cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique.

Résumé de l’invention

La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, qu’il était possible de maximiser la production de cellules dans un bioréacfeur à perfusion fou† en minimisant la quantité de protéines, en particulier de transferrine, nécessaire.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de production de cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un bioréacteur à perfusion contenant un milieu de culture comprenant de la transferrine, dans laquelle le bioréacteur es† alimenté par une source de fer ferrique e† dans laquelle le milieu de culture es† filtré en sortie de bioréacteur par un filtre ayant un seuil de coupure inférieur à 76 kDa.

Avantageusement, le procédé défini ci-dessus permet d’augmenter le rapport quantité de cellules produites/ quantité de transferrine utilisée par rapport aux procédés de l’état de la technique.

A titre préliminaire, on rappellera que le terme « comprenant » signifie « incluant », « contenant » ou « englobant », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un élément ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet. A contrario, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un élément ou plusieurs éléments, l’objet ne peu† pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés. Cellules

Les cellules selon l’invention sont de tout type nécessitant un apport de fer ferrique.

De préférence, il s’agit de cellules eucaryotes, plus préférablement de cellules animales, notamment d’oiseau, de mammifère ou humaines.

Il peu† s’agir de s’agir de cellules à cultiver pour elles-mêmes, comme des cellules NK, des lymphocytes, notamment des lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique (CAR T cells), des cellules érythroïdes, notamment des érythroblastes, des globules rouges de culture ou des cellules de viande de culture, ou bien de cellules à cultiver en vue de produire des molécules d’intérêt, en particulier des protéines, plus particulièrement des anticorps ou des dérivés d’anticorps, notamment des anticorps monoclonaux.

De préférence, les cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique son† des cellules qui contiennent de l’hémoglobine et/ou de la myoglobine.

De préférence, les cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique son† des cellules érythroïdes, notamment des érythroblastes, des globules rouges de culture ou des cellules de viande de culture.

Comme on l’entend ici, « viande de culture » es† synonymes de « viande de synthèse » ou encore de « clean mea† ».

Les cellules selon l’invention peuvent être des cellules souches, des progéniteurs, ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.

Les cellules souches peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes induites (ÎPSC), ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP). De préférence le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches hématopoïétiques (HSC).

Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde peuvent être immortalisées au stade d’un progéniteur érythroïde ou d’un précurseur érythroïde. Par ailleurs, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) peuvent également être immortalisées.

L’immortalisation es† préférentiellement réalisée de façon conditionnelle. Ces cellules immortalisées peuvent alors être passées indéfiniment in vitro, cryoconservées e† récupérées, et, de manière conditionnelle, produire des globules rouges totalement différenciés à partir d'une source définie e† bien caractérisée. L'immortalisation de manière conditionnelle peut être obtenue par n'importe quel procédé bien connu de la personne du métier.

Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des cellules souches pluripotentes. Ces cellules sont à la fois capables de différenciation en de nombreux types de cellules et capables d'auforéplicafion. Elles peuvent maintenir ceffe pluripofence de différenciation fou† en se multipliant par division. Les cellules souches embryonnaires ton† référence aux cellules souches pluripotentes dérivées d'embryons au stade blastocyste, qui es† le stade précoce du développement animal. Les cellules souches pluripotentes induites (ÎPSC) son† produites en introduisant plusieurs types de gènes de facteurs de transcription dans des cellules somatiques telles que les fibroblastes.

Les cellules souches embryonnaires (ESC) selon l’invention son† obtenues par tou† moyen ne nécessitant pas la destruction d’embryons humains. Par exemple en utilisant la technologie décrite par Chung étal. ( Chung étal, Human Embryonic Stem Cell Unes generated withouf embryo destruction, Cell Stem Cell (2008)). Par ailleurs, le procédé selon l’invention n’utilise en aucun cas des embryons humains e† ne vise en aucun cas à induire le processus de développement d’un être humain.

Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules souches utilisées dans le procédé selon l’invention ne son† pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et/ou des iPSC.

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) utilisées dans le procédé selon l’invention son† des cellules mul†ipo†en†es. Elles son† capables de se différencier pour donner tous les lignages de différenciation des cellules sanguines e† capables de s'auto-répliquer tou† en maintenant leur multipotence.

Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde son† des cellules déjà engagées dans le lignage érythroïde mais capables de s’auto-répliquer e† sous contrôle externe de se différencier en cellules du lignage érythroïde.

Les cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP) utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent provenir de n’importe quelle source, y compris, être dérivées de la moelle osseuse, du sang du cordon ombilical/placentaire ou du sang périphérique avec ou sans mobilisation préalable.

L'origine des cellules souches e† cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde n'es† pas particulièrement limitée tan† qu'elle es† dérivée d'un mammifère. Les exemples préférés comprennent les humains, les chiens, les chats, les souris, les rats, les lapins, les porcs, les vaches, les chevaux, les moutons, les chèvres et similaires, les humains étant plus préférés.

Les cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent produire, sans limitation, des globules rouges de donneurs universels, des globules rouges d'un groupe sanguin rare, des globules rouges pour une médecine personnalisée (par exemple, une transfusion autologue, éventuellement avec génie génétique) et des globules rouges conçus pour inclure une ou plusieurs protéines d'inférêf.

Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, lesdifes cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent être isolées à partir d'un patient ayant un groupe sanguin rare comprenant, sans limitation, Oh, CDE / CDE, CdE / CdE, CwD- / CwD- , - D - / - D-, Rhnull, Rh: -51 , LW (a-b +), LW (ab-), SsU-, SsU (+), pp, Pk, Lu (a + b-), Lu (ab-), Kp (a + b-), Kp (ab-), Js (a + b-), Ko, K: -1 1 , Fy (ab-), Jk (ab-), Di (b- ), I-, Y† (a-), Sc: -1 , Co (a-), Co (ab-), Do (a-), Vel-, Ge-, Lan-, Lan (+), Gy ( a-), Hy-, A† (a-), Jr (a-), In (b-), Te (a-), Cr (a-), Er (a-), Ok (a-), JMH - e† En (a-).

Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdifes cellules peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), de préférence humaines (hESC) et de préférence sélectionnées dans le groupe constitué des lignées H l , H9, HUES-1 , HUES- 2, HUES-3, HUES-7, CLOl et des cellules souches pluripotentes (ÎPSC), de préférence humaine (hiPSC)

De préférence, lesdifes cellules son† des cellules souches hématopoïétiques (HSC), plus préférablement humaines.

Dans le cas de cellules dérivées du sang du cordon ombilical/ placentaire ou du sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse, une étape de sélection spécifique des cellules CD34+ peu† être effectuée avant l’étape a) du procédé selon l’invention.

L'aphérèse es† une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extracorporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever son† séparés par centrifugation e† extraits, tandis que les composants non prélevés son† réinjectés au donneur (de sang) ou au patient (aphérèse thérapeutique).

Le qualificatif CD34+ (positif) signifie que l'antigène CD (cluster de différenciation) 34 es† exprimé à la surface des cellules. Ce† antigène es† un marqueur des cellules souches hématopoïétiques e† des cellules progénitrices hématopoïétiques, et disparaît à mesure qu'elles se différencient. Des populations cellulaires similaires comprennent également des cellules positives au CD 133.

Dans le cas où les cellules d’origine son† des ESC, des ÎPSC ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, des étapes de pré-culture peuvent être ajoutées en amon† de l’étape de culture dans le bioréacteur pour multiplier les cellules e† éventuellement les engager dans une voie de différenciation, notamment de la lignée érythroïde.

De préférence, les cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique son† des globules rouges de culture e† les cellules à cultiver son† des cellules souches ou des progéniteurs érythroïdes ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.

Quelle que soi† la source cellulaire, une étape préalable de congélation des cellules à cultiver es† souvent requise pour des raisons de transport e† de conservation. Les méthodes de congélation de cellules son† bien connues de l’état de l’art e† ton† notamment appel à une descente en température programmée ainsi qu’à l’utilisation de cryoprotectan† comme le lactose ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Lorsqu'il es† ajouté au milieu, le DMSO empêche la formation de cristaux intracellulaires e† extracellulaires dans les cellules pendant le processus de congélation.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de décongélation des cellules, préalable à l’étape de culture dans un bioréacteur à perfusion, dans le cas où les cellules à cultiver son† congelées. Les méthodes de décongélation de cellules son† bien connues de la personne du métier.

La décongélation es† une étape du procédé à ne pas négliger notamment lorsque du DMSO a été utilisé pour la congélation. Ce composé es† en effet cryo préservant fan† que la suspension cellulaire es† conservée en azote liquide ou en vapeur d’azote. Par contre, il devient cytotoxique dès que la suspension cellulaire es† décongelée. Il convient donc d’éliminer très rapidement le DMSO par plusieurs étapes de lavage sitôt les cellules décongelées, comme cela es† bien connu de la personne du méfier.

Dans d’autres cas, les cellules de départ peuvent être fraîches, c’esf-à-dire que le temps entre le prélèvement des cellules e† la mise en culture es† suffisamment cour† pour ne pas nécessiter de congélation, de préférence ce temps es† inférieur à 48H. Ce††e situation peut exister par exemple lorsque le centre de prélèvement est localisé sur le même site ou à proximité du centre de production.

Procédé de culture

La perfusion es† une méthode de culture continue dans laquelle les cellules son† retenues dans le bioréacteur ou mises en circulation e† renvoyées dans le bioréacteur tandis que du milieu de culture usagé es† évacué, compensé par l’addition d’un liquide de perfusion permettant de renouveler le milieu de culture. Le milieu de culture usagé e† évacué ne confient donc pas de cellules. Dans le cas présent, le milieu de culture es† filtré en sortie de bioréacfeur pour donner un perméaf.

L’étape de culture dans un bioréacfeur à perfusion selon l’invention a pour bu† de multiplier les cellules cultivées e†, dans le cas de la production de globules rouges de culture, de terminer leur différenciation pour les amener jusqu’à un stade de réticulocyte énucléé.

La culture es† conduite un bioréacteur adapté à une culture en perfusion. De nombreux modèles de bioréacteurs adaptés pour la culture des cellules par perfusion son† connus de la personne du métier.

Le bioréacteur a de préférence une contenance de 0,5 à 5000 L.

De préférence, le bioréacteur comprend un moyen d’échange gazeux permettant de satisfaire les besoins en oxygène des cellules e† de maîtriser le pH en contrôlant l’apport et/ou l’évacuation du dioxyde de carbone (CO2). De préférence, le moyen d’échange gazeux es† à faible cisaillement.

De préférence, l’une au moins des conditions de culture suivantes, plus préférablement toutes, son† contrôlées ou régulées :

L’agitation ;

Le pH ;

L’oxygène dissous (DO) ;

La température ;

Le volume ou niveau du bioréacteur ;

Le débit de perfusion ;

L’apport en nutriments, notamment choisi parmi les glucides, les acides aminés, les vitamines e† le fer ;

L’apport en facteurs de croissance, en cytokines et/ou en hormones ;

L’encrassement du bioréacteur e† le colmatage des organes filtrants. De préférence, la culture es† effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 30 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, plus préférablement de 10 jours à 20 jours.

De préférence, la température de culture est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C.

De préférence, le pH de culture est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7.

De préférence, le DO de culture est compris entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%.

Avantageusement, l’étape de culture en bioréacteur à perfusion permet de concentrer les cellules de culture à des niveaux inatteignables en culture batch et fed-batch, c’est-à-dire au-delà de 30 millions de cellules/ml et jusqu’à 200 millions de cellules/ml. Avantageusement également, l’étape de culture en bioréacteur à perfusion du procédé de l’invention peut permettre d’effectuer une différenciation des cellules cultivées. Avantageusement, dans le cas de la production de globules rouges de culture, le taux de cellules énucléées en fin de culture de l’étape de culture en bioréacteur à perfusion dépasse 50%, 60%, 70% ou 80%.

Dans un mode de réalisation de l’invention l’étape de culture par perfusion selon l’invention est précédée d’au moins une étape de culture en bioréacteur de type batch (par lot) ou fed-batch (par lot alimenté).

Dans les cultures en "batch", le milieu n'est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en "fed-batch" correspond quant à elle à une culture en "batch" avec une alimentation notamment en nutriments et/ou en milieu de culture.

La ou les étapes de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch ont pour intérêt de réaliser une pré-amplification des cellules à cultiver et, dans le cas de la production de globules rouges de culture, d’engager ou de différencier les cellules de départ, ou de renforcer leur engagement ou leur différenciation, dans le lignage érythroïde.

Ainsi, dans le cas de la production de globules rouges de culture, on peut, dans un mode de réalisation de l’invention, poursuivre l’étape de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch jusqu’à ce que les cellules cultivées soient engagées dans le lignage érythroïde. Selon ce mode de réalisation de l’invention, on considère que des cellules son† suffisamment engagées dans le lignage érythroïde lorsqu’elles présentent une ou plusieurs caractéristiques spécifiques du lignage érythroïde, telles qu’un pourcentage de cellules présentant le marqueur CD235, mesurable par exemple par cytométrie en flux, supérieur à 50%, ou un pourcentage de cellules de phénotype érythroïde, mesurable par exemple par comptage cytologique après coloration au colorant May-Grünwald Giemsa, supérieur à 50%.

Une ou plusieurs cultures successives, ou itératives, en bioréacteur de type batch ou fed-ba†ch peuvent être conduites, par exemple entre 1 e† 4 fois.

Le modèle de bioréacteur de type batch ou fed-ba†ch n'es† pas particulièrement limité tan† qu'il peu† généralement cultiver des cellules animales. De préférence, le bioréacteur de l’étape a) a une contenance de 0,5 à 5000 L, plus préféra b le me n† de 0,5 à 500 L.

Dans un mode de réalisation de l’invention, le procédé de production de cellules de culture selon l’invention comprend une étape de purification des cellules de cultures obtenues après l’étape de culture en bioréacteur à perfusion.

L’étape de purification a pour objet :

- de laver les cellules pour éliminer les résidus potentiellement toxiques issus du procédé ; e†

- dans le cas de la production de globules rouges de culture, de trier les cellules pour concentrer au maximum les cellules énucléées.

L’étape de purification peu† comprendre une ou plusieurs opérations, notamment une opération de tri particulaire e† une opération de lavage. L’opération de lavage peu† être effectuée indifféremmen† avant et/ou après l’opération de tri particulaire.

Dans le cas de la production de globules rouges de culture, le tri particulaire permet d’augmenter le taux de cellules énucléées, en éliminant notamment les érythroblastes e† les éventuelles cellules myéloïdes résiduelles. Les érythroblastes son† des cellules cultivées qui ne se son† pas arrivées au stade de différenciation cellules énucléées, c’est-à-dire en réticulocytes ou globules rouges. Le tri particulaire permet également d’éliminer des déchets cellulaires, tels que des débris cellulaires, de l’ADN e† des pyrénocytes.

Le tri particulaire selon l’invention peu† comprendre au moins une opération sélectionnée dans le groupe constitué d’une filtration tangentielle, d’une filtration frontale e† d’une élutriation. La filtration tangentielle (ou « tangential-flow filtration ») est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction leur taille. En filtration tangentielle, le flux de liquide est parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou « dead-end filtration ») dans laquelle le flux de liquide est perpendiculaire au filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide.

La filtration frontale est bien connue de la personne du métier. Son principe consiste à retenir les particules à éliminer à l'intérieur d’un réseau poreux constitutif du filtre. La filtration repose sur 4 mécanismes : (i) les forces d’adhésion particules/paroi, (ii) les forces d’adhésion entre particules, (iii) la gêne stérique et (iv) la force de traînée du fluide sur les particules. Son efficacité dépend notamment du matériau, des tailles des pores, du type d’enchevêtrement des fibres et du rapport surface de filtration sur quantité de matière à filtrer.

L'élutriation est une technique de séparation et d'analyse granulométrique de particules de tailles différentes. L’élutriation se base sur la loi de Stokes. On envoie dans une chambre un fluide contenant les cellules à une vitesse connue où les particules sont soumises à une force centrifuge maîtrisée. Ces dernières restent en suspension quand les deux forces (d’entraînement par le fluide et centrifuge) s’annulent.

De préférence, l’opération de tri particulaire selon l’invention comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation.

L’opération de lavage a notamment pour objet d’abaisser les quantités des composés toxiques potentiellement présents dans la culture de cellules de l’étape b) en-dessous de leur seuil de toxicité.

L’opération de lavage peut comprendre une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations.

La centrifugation est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de leur différence de densité et de leur traînée en les soumettant à une force centrifuge unidirectionnelle et éventuellement à un flux opposé.

De préférence, l’étape de lavage selon l’invention comprend une succession d’opérations d’élutriation. Les étapes de tri particulaire, de lavage et de formulation son† effectuées dans une période de temps inférieure à 72h, plus préféra b le me n† inférieure à 12h.

Milieu de culture

De préférence, le bioréacteur es† alimenté par un liquide de perfusion, lequel peu† comprendre un milieu de culture.

La personne du métier es† à même de sélectionner ou de préparer un milieu de culture adapté selon l’invention. A titre d’exemple de milieux de culture adaptés on peu† citer ceux décrits dans la publication internationale WO201 1/101468A1 e† dans l’article Giarratana et al. (201 1 ) “Proof of principle for transfusion of in vitro- generated red blood cells", Blood 118:5071-5079.

Le milieu de culture comprend généralement un milieu de culture basal pour cellule eucaryotes, tel qu’un milieu DMEM, IMDM, RPMI 1640, MEM ou DMEM/F12, lesquels son† bien connus de la personne du métier e† largement disponibles commercialement.

Le milieu de culture ou le liquide de perfusion peu† également comprendre du plasma, en particulier dans une quantité de 0,5% à 6% (v/v).

De préférence, le milieu de culture ou le liquide de perfusion comprend en outre des nutriments e† des facteurs de croissance, des cytokines et/ou des hormones.

Ainsi, la personne du métier es† à même d’adapter le milieu de culture e† le liquide de perfusion en ajoutant certains composants ou en modulant les quantités de certains composants, notamment du sodium, du potassium, du calcium, du magnésium, du phosphore, du chlore, divers acides aminés, divers nucléosides, diverses vitamines, divers antioxydants, des acides gras, des sucres e† analogues, du sérum bovin fœtal, du plasma humain, du sérum humain, du sérum de cheval, de l’héparine, du cholestérol, de l'éthanolamine, du sélénite de sodium, du monothioglycérol, du mercaptoéthanol, de l'albumine sérique bovine, de l'albumine sérique humaine, du pyruvate de sodium, du polyéthylène glycol, des poloxamères, des tensioactifs, des gouttelettes lipidiques, des antibiotiques de la gélose, du collagène, de la méthylcellulose, diverses cytokines, diverses hormones, divers facteurs de croissance, diverses petites molécules, diverses matrices extracellulaires e† diverses molécules d'adhésion cellulaire.

Des exemples de cytokines comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion comprennent l'interleukine- 1 (IL-1 ), l'interleukine-2 (IL-2), l'interleukine-3 (IL-3), l'interleukine-4 (IL-4), l'in†erleukine-5 (IL- 5), in†erleukine-6 (IL-6), in†erleukine-7 (IL-7), in†erleukine-8 (IL-8), in†erleukine-9 (IL-9), in†erleukine-10 (IL-10), interleukine- 1 1 (IL-1 1 ), interleukine- 12 (IL-12), in†erleukine-13 (IL-13), in†erleukine-14 (IL-14), in†erleukine-15 (IL- 15), in†erleukine-18 (IL-18) ), ln†erleukine-21 (IL-21 ), Interféron -A (IFN-a), inferféron-b (IFN-b), inferféron-g (IFN-g), facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G- CSF), facteur de stimulation des colonies de monocytes (M-CSF), facteur de stimulation des colonies de cellules granulo-macrophagiques (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF), ligand flk2 / fl†3 (FL), facteur inhibiteur des cellules leucémiques (LIF), oncosfafine M (OM), érythropoïétine (EPO), fhrombopoïéfine (TPO) Cependant, elle n'es† pas limitée à ces derniers.

Les diverses petites molécules comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre des antagonistes du récepteur d’aryl hydrocarbone comme la StemRegeninl (SRI ), des agonistes de l’auto- renouvellemen† des cellules souches hématopoïétiques comme UM171 , e† similaires, mais sans s’y limiter.

Les facteurs de croissance compris dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre le facteur de croissance transforma n†-a (TGF-a), le facteur de croissance transforma nt-b (TGF-b), la protéine inflammatoire macrophage- la (MIP-l a), le facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance des fibroblastes- 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 (FGF- 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF), facteur de croissance vasculo-endothélial (VEGF), facteur de croissance hépatocytaire (FHGF), facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), protéase nexine I, protéase nexine II, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de différenciation cholinergique (CDF), diverses chimiokines, ligands Notch (tels que Delta 1 ), Protéines Wn†, protéines de type angiopoïétine 2, 3, 5 ou 7 (Angp† 2, 3, 5, 7), facteurs de croissance de type insuline (GF), protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP), la pléiotrophine, e† similaires, mais sans s'y limiter.

Les hormones comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre des hormones, notamment de la famille des glucocorticoïdes comme la dexaméthasone ou l’ hydrocortisone, de la famille des hormones thyroïdiennes, comme la T3 e† la T4, de G ACTH, de l’alpha-MSFI ou de l’insuline.

Filtre Le filtre selon l’invention permet d’éliminer le milieu de culture usagé sous forme de perméaf, fou† en conservant les cellules cultivées dans le bioréacfeur.

Le seuil de coupure ou « cut-off », ou encore faille des pores du filtre, es† défini comme la masse molaire du plus petit composé du milieu filtré don† la rétention observée par le filtre es† de 90 %. Généralement, le seuil de coupure es† indiqué pour les filtres du commerce.

De préférence, le seuil de coupure selon l’invention es† inférieur à 50 kDa, préférentiellement inférieur à 15 kDa. De préférence, le seuil de coupure selon l’invention es† supérieur à 1 kDa. De préférence, le seuil de coupure selon l’invention es† de 1 kDa ef à 50 kDa, plus préférablement de 1 kDa à 15 kDa.

De préférence, le filtre es† un système de filtration fangenfielle.

La filtration fangenfielle (ou « fangenfial-flow filtration ») es† bien connue de la personne du méfier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction de leur faille. En filtration fangenfielle, le flux de liquide es† parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou « dead-end filtration ») dans laquelle le flux de liquide es† perpendiculaire au filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide.

De préférence, le filtre est constitué de fibres creuses ou d’une cassette de filtration.

Source de fer ferrique

La source de fer ferrique peu† alimenter le bioréacfeur directement, par une ligne d’alimentation propre, ou par le liquide de perfusion. Dans ce dernier cas la source de fer ferrique est comprise dans le liquide de perfusion.

De préférence, la source de fer ferrique n’esf pas de nature protéique, autrement dit elle es† aproféique. Plus préférablement, la source de fer ferrique n’esf pas de la fransferrine.

De préférence, la source de fer ferrique es† un sel de fer ferrique ou un complexe de fer ferrique.

A fifre d’exemple de sel ferrique on peu† citer le chlorure de Fe, le nitrate de fer, le sulfate de fer, ou le disphosphafe de fer. Plus préférablement, la source de fer ferrique es† un complexe de fer ferrique ef d’un agent chélafanf.

De préférence, l’agent chélafanf es† sélectionné dans le groupe constitué de l’acide citrique, de l’acide méfhylglycinediacéfique (MGDA, par ex. Trilon® M), de la 2,4-penfanedione (ACAC), de l’acide N-(2-aminoéfhyl)iminodiacéfique (AEIDA), du 1 ,2-dihydroxybenzène (CAT), de l’acide 1 ,2-diaminocyclohexanetétraacétique (CDTA), de l’acide acéfhydroxamique, de l’acide acétique, de la desferriferrioxamine-B (DFB), de l’acide 1 ,8-dihydroxynaphfhalène-4-sulfonique (DHNS), de l’acide dipicolinique (DI PIC), de l’acide 1-2- diméfhyléfhylènediamineféfraacéfique (DMEDTA), de l’acide 1 ,4,7,10- féfraazacyclododécane-N,N’,N",N’"-féfraacéfique (DOTA), de l’acide diéfhylènefriaminepenfaacéfique (DTPA), de l’acide éfhylènediamineféfraacéfique (EDTA), de l’acide oxybis(éfhylènenifrilo)féfraacéfique (EEDTA), de l’acide éfhylènebis(oxyéfhylènenifrilo)féfraacéfique (EGTA), de réthylène-N,N'-bis(2- hydroxyphénylglycine (EHPG), de la glycine (Gly), de l’acide N,N'-Bis(2- hydroxybenzyl)éfhylènediamine-N,N’-diacéfique (HBED), de l’acide N- (2- hydroxybenzyl)éfhylènediamine-N,N’,N-fri-acéfique (HBET), de l’acide N- (2- hydroxyéfhyl)éfhylènediamine-N,N',N'-friacéfique (HEDTA), de l’acide N- (2- hydroxyéfhyl)iminodiacéfique (HIDA), de l’acide iminodiacéfique, de l’acide kojique, de l’acide nifrilofriacéfique (NTA), de l’acide oxalique, de l’acide propylènediamineféfraacéfique (PDTA), de l’acide picolinique (PIC), de l’acide N,N'- bis(2-méfhyl-3-hydroxy-5-hydroxyméfhyl-4-pyridylméfhyl)é fhylènediamine-N,N’- diacéfique (PLED), l’acide 1 ,4,8,1 l-féfraazacycloféfradécane-N,N’,N",N’"- féfraacéfique (TETA), le 3,5-disulfocaféchol (Tiron), l’acide friméfhylènediamineféfraacéfique (TMDTA), l’acide 1 ,4,7,10-tétraazacyclotridécane- N,N’,N",N’"-féfraacéfique (TRITA), de l’acide friéfhylèneféframinehexaacéfique (TTHA), de la déferoxamine, de la défériprone, de la fropolone ef de l’hinokitiol

Plus préférablement, la source de fer ferrique es† un complexe de fer ferrique ef de citrate.

De préférence, la source de fer ferrique es† amenée dans le bioréacfeur ou le liquide de perfusion en quantité suffisante pour maintenir le coefficient de saturation de la fransferrine contenue dans le milieu de culture à une valeur supérieure à 10%, de préférence supérieure à 50%. Transferrine

La transferrine selon l’invention peu† être de tou† type susceptible d’apporter du fer ferrique aux cellules en culture.

De préférence, la transferrine es† une transferrine d’oiseau, d’animal, notamment de mammifère, par exemple de bovin, de porcin ou d’humain. De préférence, la transferrine appartient à la même espèce que celle des cellules en culture. La transferrine peu† être extraite de plasma. De préférence, la transferrine es† recombinante. De préférence, la transferrine es† une transferrine humaine produite par voie recombinante dans du riz. De préférence, la concentration en transferrine dans le bioréacteur es† de 10 à

3000 Mg/ml, plus préférablement de 10 à 500 g/ml.

De préférence, la transferrine es† chargée en fer ferrique avant d’être ajoutée au bioréacteur ou au milieu de culture.

De préférence, le coefficient de saturation de la transferrine es† maintenu à une valeur supérieure à 10%, de préférence supérieure à 50%.

Le coefficient de saturation de la transferrine peu† être mesuré par spectrophotométrie., notamment comme cela es† décrit par Bâtes & Schlabach (1973) J. Biol. Chem. 248:3228-3232 ou parSteere étal. (2012) J. Inorg. Biochem. 116:37- 44. Le coefficient de saturation de la transferrine peu† être contrôlé en modulant les apports de la source de fer ferrique dans le bioréacteur ou dans le liquide de perfusion.

De préférence, le procédé selon l’invention consomme moins de 10 ^-10 g, plus préféra b le me n† moins de 10 ^-11 g, encore plus préférablement moins de 5.10 ^-12 g de transferrine par cellule de culture, notamment par globule rouge de culture, produit.

L’invention sera davantage explicitée à l’aide de l’Exemple non limitatif qui suit. Exemple

Le procédé de production de cellules selon l’invention es† comparé à une culture par lots (« batchs ») successifs (exemple comparatif) basée sur l’article de Giarratana et al. (201 1 ) “Proof of principle for transfusion of in vitro-generated red blood cells”, Blood 118:5071-5079, les deux étant dimensionnés pour produire l’équivalent d’une poche de sang, soi† 2.10 ¹² globules rouges.

Dans le cas de la culture en lots (« batchs ») successifs, le milieu de culture doit être intégralement renouvelé deux fois par semaine et le volume augmenté.

Les principales grandeurs son† détaillées dans le tableau ci-dessous :

[Tableau 1]

Culture par lots (« batchs ») successifs (exemple comparatif)

Le volume total de milieu nécessaire es† de 2210,5 L. La transferrine es† contenue dans le milieu à 300 g/mL. La quantité totale de transferrine requise es† de 663,15 g.

En comparaison, dans le cas d’une culture en perfusion selon l’invention (bioréacteur de 25 L avec un filtre à fibres creuses de seuil de coupure 10 kDa en sortie) dans laquelle la transferrine es† rechargée en continu par une source de fer ferrique (citrate de fer), la transferrine n’es† amenée que dans le milieu de culture servant à remplir le réacteur au début du procédé don† la composition es† similaire à celle du milieu de culture par lots (« batchs ») successifs.

Les principales grandeurs son† détaillées dans le tableau ci-dessous : [Tableau 2]

Culture en perfusion selon l'invention La transferrine es† contenue dans le milieu de culture occupant le bioréacteur à la concentration de 300 m/mL. La quantité totale de transferrine requise es† de 7,5g.

On constate que le procédé selon l’invention permet de diminuer la quantité de transferrine nécessaire d’un facteur 88,4, pour une même quantité de cellules produites e† un même facteur d’expansion. Par ailleurs, la quantité de transferrine rapportée à la quantité de globules rouges produits es† de 3,75.10 ^_12 g/globule rouge.