Campo de la invención La presente invención describe métodos de selección de cepas (+) y (-) Blakeslea trispora superproductoras de P- caroteno y un nuevo procedimiento de fermentación de dichas cepas que permite obtener preparaciones estabilizadas de ß- caroteno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.

Estado de la técnica Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide sintetizados por ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Pueden clasificarse en dos tipos : (i) hidrocarburos puros denominados carotenos, entre los que se encuentran compuestos como P-caroteno, a- caroteno, y-caroteno o licopeno y (ii) moléculas denominadas xantofilas, las cuales contienen oxígeno en diferentes formas (grupos hidroxi, epoxi, etc. ), entre las que se encuentran astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina, luteína, etc. Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana como antioxidantes (prevención del cáncer y otras enfermedades) y como precursores de la vitamina A. Debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios [Ninet L. y Renaut J.

(1979) En : Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial

Technology, 2nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529- 544].

El (3-caroteno es un carotenoide, cuya síntesis química se conoce desde el año 1956, que posee un peso molecular de 536,9 y una molécula (C4oHs6) con once dobles enlaces conjugados. Posee color rojo-violeta en estado cristalino, amarillo-naranja en solución oleosa y naranja en dispersión acuosa. El P-caroteno sintético posee la configuración isomérica todo-trans, mientras que el (3-caroteno procedente de diversas fuentes naturales posee diferentes formas : todo-trans, mono-cis, di-cis y poli-cis.

La producción de carotenoides por biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Los procesos biotecnológicos muestran, entre otras, la ventaja de permitir obtener de forma simple los carotenoides de estructura más compleja, así como los isómeros conformacionales que sólo existen de forma natural. Los procesos biotecnológicos industriales para la producción de P-caroteno, competitivos con la síntesis química, están basados en la utilización del alga Dunaliella salina y del hongo B. trispora. El proceso de producción con B. trispora implica la realización de una fermentación mixta de las cepas (+) y (-) para conseguir una máxima producción de ß- caroteno. El incremento de producción de carotenoides en cultivos mixtos está correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos denominados factor (3 o ácidos trispóricos [WO 00/77234, Caglioti L. et al. (1966) Tetrahedron Supplement 7 : 175-187]. El ß-caroteno es producido tanto por la cepa (+) como por la (-), siendo metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a 4-

dihidrotrisporol. La cepa (+) utiliza 4-dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido dihidrotrispórico y su éster metílico (metil-4-dihidrotrisporato). Por su parte, la cepa (-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a trisporol.

Finalmente, el metil-4-dihidrotrisporato es convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es convertido en ácido trispórico por la cepa (+). Esta descripción de la biosíntesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya que durante el proceso se generan muchos co-metabolitos, algunos de los cuales son comunes a ambas cepas (+) y (-), pero otros son específicos de una de ellas. Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos son variables en función de las cepas.

La ruta biosintética de P-y-caroteno (Esquema 1) ha sido descrita en hongos filogenéticamente relacionados con B. trispora como Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloides [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98 : 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267 : 5509- 5519]. Para dicha biosíntesis son necesarias al menos tres actividades enzimáticas : (i) fitoeno sintasa, la cual une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato generando fitoeno, (ii) fitoeno deshidrogenasa, la cual introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii) licopeno ciclasa, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la molécula de ß- caroteno. El análisis de mutantes de B. trispora ha permitido concluir que la ruta biosintética de ß-caroteno en este hongo es similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B. J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42 : 836-838]. En el caso de

P. blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno. Mevalonato 4lsopentenil-PP pPP vOPP 0=OPP Geranilgeranil-PP Fitoeno sintasa (carRP) Fitoeno Fitoeno deshidrogenasa (carB) Fitoflueno Fitoeno deshidrogenasa (car8) 4-caroteno ~ _ 1 1 Fitoeno deshidrogenasa (carB) ZY Neurosporeno Fitoeno deshidrogenasa (carB) Licopeno Licopeno ciclasa (carRP) y w w w w w w Y-Caroteno Licopeno ciclasa (carRP) I ß-Caroteno t Xg Esquema 1 Uno de los sistemas de selección de cepas utilizados en microbiología industrial se basa en la citometría de flujo.

Esta técnica permite seleccionar subpoblaciones de mutantes a partir de una población heterogénea. Para ello, utiliza métodos no destructivos como la medición de la fluores- cencia y de la dispersión de la luz. El aislamiento de los mutantes se consigue mediante un accesorio acoplado al citómetro ("Sort") que permite la clasificación y

separación de células. La selección de subpoblaciones se basa en la medición de parámetros determinados que se relacionan directa o indirectamente con el nivel de producción. La citometría de flujo es especialmente útil en muestras biológicas cuyo producto de interés es autofluorescente. A pesar de que el-caroteno no es propiamente una molécula fluorescente, cuando se excita con un láser de argón a una longitud de onda de 488 nm, al regresar del estado excitado a su estado basal, la pérdida de energía origina un proceso de transferencia de radiación que se detecta a una longitud de onda superior a 600 nm.

Esta propiedad permite la selección directa de los mutantes de interés.

La obtención de P-caroteno mediante la fermentación de B. trispora está recogida en las patentes US 3522146, SU 1592327, RU 2053301 y US 5422247. La patente US 5422247 reivindica la producción de 3,5 a 7 g/1 de P-y-caroteno utilizando cepas seleccionadas de B. trispora en condiciones específicas de fermentación. La presente patente describe nuevos métodos de selección de cepas y condiciones mejoradas de fermentación que permiten producir 9 g/1 de P-caroteno.

Descripción detallada de la invención La presente invención describe una serie de procedimientos para la obtención de elevadas producciones de P-caroteno con el hongo B. trispora. La invención consiste en (i) el diseño de métodos para la obtención y selección de mutantes de B. trispora superproductores de P- caroteno y (ii) el desarrollo de condiciones mejoradas de fermentación. B. trispora es un hongo que posee una gran

importancia industrial para la producción biotecnológica de a-caroteno. De hecho, dicho proceso resulta competitivo con el procedimiento sintético utilizado., industrialmente en la actualidad.

Con la finalidad de obtener cepas superproductoras de P-caroteno, en primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B. trispora con los agentes mutagénicos etil metano sulfonato (EMS) y N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 ml de una solución de Triton X-100 al 0, 1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a través de un filtro de nylon de 20 pm de poro. La concentración de esporas en la suspensión fue alrededor de 106 esporas/ml.

El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 106 esporas/ml en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0, 1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos. El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 106 esporas/ ml en una solución que contenía 250 pg/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0, 1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos. Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Triton X-100 al 0, 1% y se incubaron a 25°C durante 4 días para obtener colonias aisladas.

Las estrategias utilizadas para la selección de cepas de B. trispora (-) superproductoras de a-caroteno fueron las siguientes : (i) la utilización de la técnica de selección de células basada en fluorescencia (FACS, fluorescent activated cell sorting), (ii) la menor produc- ción de y-caroteno y otros carotenoides y (iii) la intensidad de color de la colonia. Para la selección de mutantes productores de P-caroteno mediante FACS se crecieron las esporas mutadas en medio PDA, se lavaron con Triton X-100 0, 1% y se analizaron en un citómetro de flujo asociado a un clasificador y separador de células ("FACSort", Fluorescent Activated Cell Sorting). La utilización de esta técnica permite seleccionar la subpoblación de mutantes que presenta los niveles más altos de autofluorescencia. A pesar de que el-caroteno no es propiamente una molécula fluorescente, cuando se excita con un láser de argón a 488 nm, emite una radiación fluores- cente que se detecta a una longitud de onda superior a 600 nm. De esta forma, la autofluorescencia detectada es proporcional al contenido de ß-caroteno presente en la espora.

Las esporas seleccionadas se sembraron en medio PDA (Difco) y se incubaron a 25°C, observándose que los mutantes superproductores de ß-caroteno adquirían color naranja intenso. La selección de mutantes productores de P- caroteno en función de su menor producción de y-caroteno y otros carotenoides se realizó de la siguiente forma : la subpoblación de mutantes con mayor nivel de autofluo- rescencia aislados mediante FACSort se fermentó en medio líquido con el fin de determinar los niveles de producción de-caroteno en cultivo mixto. Una vez finalizada la fermentación se procedió a la cuantificación de-caroteno

y otros carotenoides mediante HPLC. De este modo se seleccionaron aquellos mutantes que presentaban (i) una producción elevada de »-caroteno y (ii) una menor producción de y-caroteno y otros carotenoides. Aplicando ambos métodos con la cepa VKPM F-744 (-) se seleccionaron las cepas CMA1 (-), CMA2 (-), CMA3 (-) y CMA4 (-) (Esquema 2).

VKPM F-208 (-) uv SN v M6 (-) NTG SN r VKPM F-551 (-) Ácido nitroso SN ir VKPM F-727 (-) NTG SN VKPM F-736 (-) NTG SN Y r VKPM F-744 (-) ; L25 (-) FACS EMS SN zu CMA1 (-) CMA2 (-) CMA3 (-) CMA4 (-) Color NTG SN ir CMB1 (-) CMB2 (-) ESQUEMA 2 Esquema 2. Filogenia de las cepas de B. trispora (-) obtenidas a partir de B. trispora VKPM F-208 (-) utilizando procedimientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,

EMS etilmetanosulfonato, FACS fluorescent activated cell sorting.

El sistema de siglas empleado para la denominación de las cepas seleccionadas es el siguiente : CM = caroteno minus (-), CP = caroteno plus (+). La relación entre generaciones parentales sigue el orden del alfabeto : A es parental de B, B es parental de C, etc. El número situado tras las letras se corresponde con el número del mutante.

Así por ejemplo, la denominación CMA1 (-) significa que se trata de una cepa productora de caroteno (C), menos (M), parental de CMB y mutante número 1. Del mismo modo, CMA1 (-), CMA2 (-), CMA3 (-) y CMA4 (-) se corresponden con los mutantes 1,2, 3 y 4 de una misma generación.

La selección de mutantes productores de ß-caroteno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma : las esporas mutadas de la cepa CMA1 (-) se sembraron en placas de medio sólido YEPDA y, una vez crecidas, se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso que la cepa parental CMA1 (-). De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso denominadas CMB1 (-) y CMB2 (-).

La selección de mutantes superproductores de (3- caroteno de B. trispora (+) se realizó creciendo esporas mutadas en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-). El nivel de producción de P-caroteno en medio sólido se estimó en función de la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-). De esta forma se seleccionó la cepa B. trispora CPA1 (+) (Esquema 3), la cual daba lugar a una mayor producción de (3-caroteno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-). El nivel de producción de la cepa B. trispora CPA1 (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio líquido.

ESQUEMA 3 Esquema 3. Filogenia de las cepas de B. trispora (+) obtenidas a partir de B. trispora VKPM F-117 (+) utilizando procedimientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato.

Las cepas (+) y (-) de B. trispora seleccionadas en medio sólido se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de ß-caroteno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello, se crecieron matraces de inóculo independientes de las cepas (+) y (-) y posteriormente se realizó una fermentación mixta de ambas cepas en matraz. Una vez concluida la fermentación (alrededor de 6 días), el micelio de B. trispora se lisó mediante agitación en vortex, se extrajo el P-caroteno con solventes orgánicos (por ejemplo acetona) y se determinó su concentración y pureza mediante HPLC. Los niveles de producción obtenidos oscilaron entre 6,0 y 7,0 g/l.

Las cepas seleccionadas se cultivaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de ß-caroteno. Para ello, se crecieron separa- damente en matraces, se transfirieron separadamente a tanques intermedios de crecimiento y por último se fermen- taron conjuntamente. La fermentación se incubó durante 100- 140 horas. Los valores medios de producción de a-caroteno obtenidos en una serie de fermentaciones diferentes fueron de 7,2 g/1 para las cepas CPA1 (+)/CMA3 (-) y de 6,8 g/1 <BR> <BR> para las cepas CPA1 (+) /CMB2 (-). Cuando en la fermen-<BR> tación de las cepas CPA1 (+) /CMA3 (-) se redujo la edad de los inóculos de 48 a 46 horas, se comprobó que su nivel de producción se incrementaba a 7,7 g/l. Del mismo modo, <BR> <BR> cuando en la fermentación de las cepas CPA1 (+) /CMB2 (-) se redujo la edad de los inóculos de 48 a 46 horas, se comprobó que su nivel de producción se incrementaba a 7,1 g/1. Posteriormente se consiguió incrementar el nivel de producción de ß-caroteno de las cepas CPA1 (+) /CMA3 (-) estableciendo un programa óptimo de adición de P-ionona. De esta forma se alcanzaron producciones en el rango de 8,7

g/l. Por último, se desarrolló un sistema de fermentación con inyección de oxígeno que permitió (i) incrementar al menos hasta 9 g/1 la producción de P-y-caroteno en fermentaciones de las cepas CPA1 (+) /CMA3 (-) y (ii) reducir la acumulación de y-caroteno y otros carotenoides.

Depósito de microorganismos de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Las cepas de Blakeslea trispora han sido depositadas, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscú 113545, (Rusia), con los siguientes números y fechas : VKPM F-117 el 21-12- 1979, VKPM F-208 el 20-12-1979, VKPM F-551 el 19-11-1992, VKPM F-674 el 19-11-1992, VKPM F-726 el 21-01-1997, VKPM F- 727 el 2101-1997, VKPM F-736 el 07-10-1997, VKPM F-741 el 28-01-1998, VKPM F-744 el 28-01-1998 y VKPM F-816 el 13-12- 2000.

Los siguientes ejemplos describen en detalle y sin limitación la presente invención.

EJEMPLO 1 Estrategias de mutación de las cepas (+) y (-) de B. trispora En primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B. trispora, para lo cual se analizaron : (i) diferentes tipos de agentes mutagénicos, (ii) concentración del mutágeno, (iii) concen- tración de esporas, (iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se seleccionaron como agentes

mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG).

Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs, cuya composición es la siguiente : extracto de levadura 4 g/l, almidón soluble 15 g/l, K2HP04 1 g/l, MgS04-7H20 0,5 g/1 y agar 15 g/l, a un pH final de 5, 8. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 ml de una solución de Triton X-100 al 0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a través de filtro de nylon de 20 pm de poro. La concen- tración de esporas en la suspensión fue alrededor de 106 esporas/ml.

El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 106 esporas/ml en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de morta- lidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0, 1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos.

El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 106 esporas/ml en una solución que contenía 250 pg/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0, 1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos.

Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Triton X- 100 al 0, 1%. La composición por litro del medio Sutter IV es la siguiente : 40 g de glucosa, 4 g de L-asparragina, 10 g de KH2PO4, 40 ml de solución de microelementos 50x y 30 g de agar. La solución de microelementos 50x está compuesta

por : 25 g/1 de MgSO4. 7H2O, 1,82 g/1 de CaCl2. 2H2O, 0,05 g/1 de tiamina, 0,1 g/1 de ácido cítrico, 0,075 g/1 de Fe (N03) 3. 9H20, 0,05 g/1 de ZnSO4. 7H2O, 0,17 g/1 de MnSO4. H20, 0, 025g/1 de CuS04. 5H20 y 0,025 g/1 de NaMo04. 2H2O. Las placas sembradas se incubaron a 25°C durante 4 días para obtener colonias aisladas.

EJEMPLO 2 Estrategias de selección de mutantes de B. trispora (-) superproductores de ß-caroteno En este ejemplo se describen estrategias de selección de cepas de B. trispora (-) superproductoras de P-caroteno basadas en (i) la utilización de la técnica de selección de células basada en fluorescencia (FACS, fluorescent activated cell sorting), (ii) la menor producción de y- caroteno y otros carotenoides y (iii) la intensidad de color de la colonia. En el Esquema 2 se muestra la filogenia de las cepas de B. trispora (-) utilizadas en la presente invención.

La selección de mutantes productores de »-caroteno mediante FACS se realizó a partir de esporas mutadas con EMS tal y como se describe en el ejemplo 1. Las esporas mutadas se sembraron en medio sólido PDA y se incubaron a 25°C durante 7 días. Transcurrido este tiempo se recogieron las esporas por centrifugación y se lavaron dos veces con una solución de Triton X-100 al 0, 1%. Cada placa se suspendió en un volumen final de 1 ml. Las esporas mutantes de B. trispora se analizaron mediante citometría de flujo en un equipo FACSort (Becton Dickinson). La excitación se realizó con un láser de argón a 488 nm, evaluándose los siguientes parámetros : dispersión frontal de luz (FSC), dispersión lateral de luz (SSC) y emisión de fluorescencia

a partir de 600 nm (mediante la utilización del detector FL3). La selección de mutantes superproductores de- caroteno se realizó mediante la purificación de la subpoblación de esporas que poseía los niveles de autofluorescencia más elevados en el detector FL3. Las esporas aisladas de este modo se sembraron en medio PDA con el fin de obtener colonias aisladas. La producción de cada una de las colonias se analizó mediante fermentación en matraz en cultivo mixto con la cepa B. trispora CPA1 (+) tal y como se indica en el ejemplo 4. Los resultados obtenidos con 10 colonias mutantes fueron los siguientes : 5 colonias (50%) presentaron un incremento de producción de P-caroteno significativo respecto a la cepa parental B. trispora VKPM F-744 (-), el 30% de las colonias presentaron valores de producción similares a la cepa parental y el 20% restante produjo cantidades inferiores a la cepa parental (Figura 1). De los 5 mutantes que poseían una producción de -caroteno incrementada (CMA1 (-), CMA2 (-), CMA3 (-), CMA4 (-) y F9 (-) ), sólo uno de ellos (F9 (-) ) poseía niveles superiores de y-caroteno y otros carotenoides, por lo que se descartó. La cepa que presentó mayor pureza y producción de -caroteno fue CMA1 (-), por lo que se seleccionó como cepa parental del siguiente ciclo de mutación (Esquema 2).

La selección de mutantes superproductores de caroteno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma : La cepa CMA1 (-) se sometió a mutagénesis tal y como se indica en el ejemplo 1.

Las esporas mutadas se sembraron en placas de medio sólido YEPDA (bacto-peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l, glucosa 20 g/1 y agar 20 g/1, a un pH final de 6,0), se incubaron a 25°C durante 24 horas y seguidamente a 20°C durante 48-72 horas. Por último, se seleccionaron aquellas

colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso que la cepa parental CMA1 (-). De esta forma se aislaron 2 colonias con color naranja intenso denominadas CMB1 (-) y CMB2 (-) las cuales podrían ser superproductoras de P- caroteno. El nivel de producción de las cepas B. trispora CMA1 (-), CMA2 (-), CMA3 (-), CMA4 (-), CMB1 (-) y CMB2 (-) se analizó posteriormente en cultivo mixto con la cepa CPA1 (+) en medio líquido tal y como se describe en los ejemplos 4,5, 6 y 7. En el Esquema 2 se muestra la filogenia de las cepas de B. trispora (-) utilizadas en la presente invención.

EJEMPLO 3 Estrategias de selección de mutantes de B. trispora (+) superproductores de ß-caroteno La selección de mutantes superproductores de ß- caroteno de B. trispora (+) se realizó a partir de esporas mutadas tal y como se indica en el ejemplo 1. Dichas esporas se sembraron en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV y se incubaron a 25°C durante 7 días para obtener colonias aisladas. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa con medio PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-). La distancia entre los puntos de siembra de las cepas (+) y (-) debe ser de aproximadamente 2 cm. El nivel de producción de (3-caroteno en medio sólido se estima por la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-). De esta forma se seleccionó la cepa B. trispora CPA1 (+), la cual daba lugar a una mayor producción de (3-caroteno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-). E1 nivel de producción de la cepa B. trispora CPA1 (+) se analizó

posteriormente en cultivo mixto en medio líquido tal y como se describe en los ejemplos 4,5, 6 y 7. En el Esquema 3 se muestra la filogenia de las cepas de B. tríspora utilizadas en la presente invención.

EJEMPLO 4 Procedimiento de producción de (3-caroteno mediante cultivo mixto en matraz de las cepas (+) y (-) de B. tríspora Las cepas (+) y (-) de B. trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1,2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de (3-caroteno en medio líquido y cultivo mixto.

Para ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición por litro : 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2PO4 y 0,002 g de clorhidrato de tiamina. El pH se ajustó a 6,3. La cepa (+) se sembró en matraces de 500 ml con 67 ml de medio a razón de 103 esporas por ml. La cepa (-) se sembró en matraces de 500 ml con 100 ml de medio a razón de 104 esporas por ml. Ambos tipos de inóculos se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44 horas.

El medio de fermentación posee la siguiente compo- sición por litro : 44 g de harina de soja, 19 g de harina de maíz, 10 g de harina de naranja, 0,5 g de KH2PO4, 0,28 g de isoniacida, 0,002 g de clorhidrato de tiamina, 10 g de lecitina y 100 g de aceite vegetal. El pH se ajustó a 6,3.

El medio se repartió en matraces Erlenmeyer de 250 ml a razón de 20 ml por matraz. Los matraces con el medio de fermentación se inocularon con un 10% de una mezcla de las cepas (+) y (-) en proporción 1/10. Los matraces se incubaron a 25°C y 250 rpm y a las 48 horas se adicionó 3- ionona a razón de 1 ml por litro de medio de cultivo. Una vez concluida la fermentación (6 días), se preparó una

mezcla de caldo de fermentación y cloruro de metileno/ metanol (1/1). La mezcla con el solvente ocasionó la lisis del micelio de B. trispora con la consiguiente liberación del P-y-caroteno intracelular. El ß-caroteno se extrajo en la fase orgánica y posteriormente se diluyó en acetona. La concentración y pureza del P-caroteno se determinó mediante el uso de cromatografía líquida HPLC en fase reversa.

Los niveles de producción obtenidos en fermentaciones mixtas de las cepas CPA1 (+) con las cepas CMA1 (-), CMA2 (-), CMA3 (-), CMA4 (-), CMB1 (-) y CMB2 (-) oscilaron entre 6,0 y 7,0 g/l. (Figura 1).

EJEMPLO 5 Procedimiento de producción de P-caroteno mediante cultivo mixto en fermentador de las cepas (+) y (-) de B. trispora Las cepas de B. trispora CMA1 (-), CMA2 (-), CMA3 (-), CMB1 (-) y CMB2 (-), seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2,3 y 4, se cultivaron en fermentadores pre-industriales junto con la cepa CPA1 (+) con la finalidad de determinar el nivel de producción de P-caro- teno. Para ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición por litro : 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2PO4, 0,002 g de clorhidrato de tiamina. El pH se ajustó a 6,3. Las cepas (+) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 ml con 500 ml de medio y se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44-48 horas.

Cada una de las cepas se transfirió al 0, 1% a un tanque de crecimiento vegetativo con un medio de cultivo cuya composición por litro es : 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2PO4 ; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. La

cepa (+) se incubó a 25-27°C con una aireación de 0,66 v/v/m (volumen/volumen/minuto) y la cepa (-) a 27-29°C con una aireación de 1,5 v/v/m. Estas diferencias en las condiciones de incubación dan lugar a un crecimiento diferente de ambas cepas, de modo que en el momento de la mezcla en el fermentador el estado fisiológico sea el adecuado para conseguir una producción máxima.

Tras incubar durante 46 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una proporción 1/10 y, con un 10% de la mezcla, se sembró el medio de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente : 50 g de harina de soja, 25 g harina de maíz, 15 g de harina de naranja, 0,5 g de KH2PO4, 0,28 g de isoniacida, 0,002 g de clorhidrato de tiamina, 10 g de lecitina de soja, 80 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, con pH inicial ajustado a 5,9. La fermentación se incubó durante 120-140 horas a una temperatura de 25- 28°C con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. El control de pH se realizó con amoniaco ó ácido fosfórico. Entre las 40 y 50 horas de fermentación se adicionaron 10 gramos de una solución de ß- ionona al 10% en aceite vegetal por cada litro de caldo de fermentación. Asimismo, entre las 70-80 horas de fermentación se adicionaron 10 gramos de una solución de etoxiquina al 10% en aceite vegetal por cada litro de caldo de fermentación.

La valoración de la concentración y pureza del caroteno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2. El valor medio de producción de (3- caroteno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y CMA3 (-) fue de 7,2 g/1 en el fermentador que procedía de inóculos incubados durante 48

horas y 7,7 g/1 cuando los inóculos se habían incubado durante 46 horas. La producción de las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) fue de 6,8 g/1 en el fermentador que procedía de inóculos incubados durante 48 horas y 7,1 g/1 cuando los inóculos se habían incubado durante 46 horas. Esto significa que una disminución de 2 horas en el tiempo de incubación del inóculo incrementa la producción de ß-caro- teno alrededor del 5-7%. Este ejemplo demuestra con claridad la influencia que ejercen sobre la producción de P-caroteno (i) el tiempo de incubación y (ii) las condi- ciones de crecimiento establecidas para cada una de las dos cepas.

EJEMPLO 6 Procedimiento de producción de (3-caroteno mediante cultivo mixto en fermentador de las cepas CPA1 (+) y CMA3 (-) de B. trispora utilizando un programa específico de adición de ionona Las cepas CPA1 (+) y CMA3 (-), seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2,3 y 4, se cultivaron en fermentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de (3-caroteno. Las condiciones de fermentación (inóculos, tanques de crecimiento vegetativo y fermentador) son las descritas en el ejemplo 5, pero modificando el programa de adición de ß-ionona.

El programa de adición de (3-ionona establecido en el ejemplo 5 consistía en aportar entre las 40-50 horas de fermentación 10 gramos de una solución de (3-ionona al 10% en aceite vegetal por cada litro de caldo de fermentación.

En este caso se analizaron una nueva serie de programas de adición, obteniendo los mejores resultados con el siguiente : 10 gramos de una solución de p-ionona al 10% en

aceite vegetal por cada litro de caldo de fermentación entre las 40-50 horas de fermentación, otros 10 gramos por cada litro entre las 60-70 horas de fermentación y otros 5 gramos por cada litro entre las 100-105 horas de fermentación.

La valoración de la concentración y pureza del (3- caroteno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de P-caroteno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y CMA3 (-) fue de 7,2 g/1 utilizando el programa de adición de (3-ionona descrito en el ejemplo 5 y de 8,7 g/1 con el programa mejorado descrito en el presente ejemplo. Estos resultados corroboran la existencia de una estrecha relación entre el programa de adición de P-ionona y el nivel de producción de P-caroteno.

EJEMPLO 7 Procedimiento de producción de P-caroteno mediante cultivo mixto en fermentador de las cepas (+) y (-) de B. trispora utilizando inyección de oxígeno Las cepas de B. trispora CPA1 (+) y VKPM F-744 (-), seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2 y 3, se cultivaron en fermentador pre-industrial con la fina- lidad de determinar el nivel de producción de (3-caroteno.

Las condiciones de fermentación (inóculos, tanques interme- dios de crecimiento y fermentador) son las descritas en el ejemplo 5, pero incrementando la cantidad de oxígeno disuelto en el caldo de fermentación mediante la inyección de oxígeno.

La fermentación estándar (sin adición extra de oxígeno) se llevó a cabo con un patrón de agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5

v/v/m. Por su parte, en la fermentación con inyección de oxígeno, se utilizaron estas mismas condiciones pero en este caso el aire de entrada al fermentador se había enriquecido en oxígeno mediante la conexión de botellas de oxígeno puro. De esta forma se consiguió incrementar el contenido de oxígeno del aire desde el 21% hasta el 24,5%.

El suplemento de oxígeno se realizó entre las 40 y las 70 horas de fermentación. El valor medio de la concentración de oxígeno disuelto en el caldo de fermentación en las condiciones de suplemento de oxígeno alcanzó valores del 49%, mientras que dicho valor fue del 34% cuando no se adicionó oxígeno.

La valoración de la concentración y pureza del caroteno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de (3-caroteno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y VKPM F-744 (-) fue de 6,7 g/1 sin adicionar oxígeno y de 7,1 g/1 cuando se inyectó oxígeno. Esto demuestra que es posible incrementar la producción de P-caroteno mediante el suministro de oxígeno extra en aquellos momentos de la fermentación en los que la concentración de oxígeno disuelto en el caldo de fermentación es mínima. Aplicando esta tecnología a las condiciones de fermentación establecidas en el ejemplo 6 para las cepas CPA1 (+) y CMA3 (-), se alcanzaron niveles de producción superiores a 9 g/1 (Figura 3).

Adicionalmente, el enriquecimiento en oxígeno del aire de entrada al fermentador dio lugar a la disminución de la producción de otros carotenoides no deseados como y-caroteno y p-zeacaroteno. La producción media de y-caroteno (en % respecto de P-caroteno) en la serie de experimentos ante- riormente descritos fue del 1, 8% sin inyección de oxígeno y

del 1, 2% cuando se inyectó oxígeno. Por su parte, los valores de ß-zeacaroteno fueron del 1, 0% sin inyección de oxígeno y solamente del 0, 5% cuando se inyectó. En función de estos resultados se deduce la existencia de una estrecha relación entre la oxigenación del cultivo y (i) el incremento de producción ß-caroteno y (ii) la disminución de los niveles de y-caroteno y ß-zeacaroteno.

Descripción detallada de las figuras Figura 1. Producción de (3-caroteno mediante fermentación mixta en matraz de la cepa B. trispora CPA1 (+) con una serie de cepas (-) de B. trispora. Ordenadas : g/1 ; Abcisas : F1, F2, etc. mutantes seleccionados con el sistema FACsort, de los cuales se eligieron CMA1, CMA2, CMA3 y CMA4 tras su fermentación en matraz (Ejemplo 2). L25 (-) se corresponde con VKPM F-744 (-).

Figura 2. Producción de (3-caroteno mediante fermentación mixta en fermentador de la cepa B. trispora CPA1 (+) con una serie de cepas (-) de B. trispora. Ordenadas : % sobre la producción de L25 (-). L25 (-) se corresponde con VKPM F-744 (-)- Figura 3. Producción de P-caroteno mediante fermentación <BR> <BR> mixta en fermentador de las cepas CPA1 (+) /L25 (-) y<BR> CPA1 (+) /CMA3 (-) sin inyección directa de oxígeno (estándar) o utilizando inyección directa de oxígeno. Ordenadas : g/l.

L25 (-) se corresponde con VKPM F-744 (-).