Procédé de production de neurones à partir de cellules d'une lignée cellulaire La présente invention concerne. un procédé de production de neurones à partir de cellules d'une lignée cellulaire humaine apte à se différencier pour produire notamment des neurones, dans lequel : - on cultive lesdites cellules en sphères, en les exposant à des facteurs de croissance, tels que, par exemple, EGF (epidermal growth factor) et/ou bFGF (basic fibroblast growth factor) ou LIF (Leukemia Inhibitory Factor), dans un milieu de croissance défini, - on induit la différenciation desdites sphères en les faisant adhérer sur un substrat, après élimination des facteurs de croissance EGF et/ou bFGF ou LIF, et en les cultivant dans le milieu de croissance pendant un laps de temps approprié.

L'invention concerne également l'utilisation, pour différentes applications, des neurones issus de la mise en oeuvre de ce procédé.

De nombreux laboratoires de recherche travaillent à l'heure actuelle à la mise au point de techniques visant à permettre à la fois la compréhension et la maîtrise des fonctions du système nerveux central et périphérique, surtout à des fins thérapeutiques, mais aussi plus simplement dans le but d'obtenir des modèles utiles pour l'évolution de la recherche.

Ainsi, le développement des procédés de production de neurones s'inscrit notamment dans les projets de mise au point de thérapies cellulaires qui, avec la greffe de cellules souches pluripotentes et/ou progénitrices, représentent une alternative prometteuse permettant d'envisager le remplacement d'éventuelles cellules détruites de la moelle épinière et du cerveau et recréer un environnement propice à la régénération nerveuse.

Maîtriser la production de neurones représente par conséquent un espoir de guérison pour de nombreux malades souffrant de lésions de la moelle épinière, ou de maladies neurodégénératives, dont les conséquences les plus manifestes se caractérisent par des dysfonctionnements de la transmission des signaux nerveux envoyés par le cerveau aux structures

périphériques, pouvant aboutir, dans les cas extrmes, à des paralysies accompagnées de déficits sensoriels.

Par ailleurs, le fait de pouvoir disposer de neurones humains produits en laboratoire en grande quantité peut également favoriser notablement la conduite d'études menées in vitro sur des molécules d'intért thérapeutique, et permet d'envisager un modèle avantageux dans le cadre de la recherche des gènes importants pour le développement du système nerveux central et périphérique.

Une des techniques employées actuellement pour produire des neurones repose sur la propriété de pluripotence des cellules souches neurales, lesquelles, tel que décrit par Gage et al.

(Current Opinion in Neurobiology 1998,. 8 : 671-676), sont amenées après une phase de culture en présence de facteurs de croissance conduisant à des agrégats sphériques, à se différencier en neurones et glie après adhésion sur un support et élimination des facteurs de croissance.

Bien que les cellules souches neurales soient considérées comme avantageuses du fait de leur absence de risques cancérigènes, et qu'elles font aujourd'hui l'objet de nombreux travaux de recherche, cette technique n'offre cependant encore que des perspectives restreintes, car la différenciation de ces cellules après transplantation ne conduit presque exclusivement qu'à la production de cellules gliales, c'est à dire d'astrocytes et d'oligodendrocytes, au détriment de la production de neurones qui ne représentent que 1 à 5% de l'ensemble des cellules obtenues.

Un rendement aussi faible ne permet évidemment pas d'envisager une réimplantation de neurones dans une éventuelle lésion.

En outre, l'on sait que les astrocytes sont susceptibles, après une greffe, de limiter la croissance des neurones et de sécréter des molécules modifiant de façon péjorative l'environnement des cellules greffées.

D'autres procédés connus consistent encore à obtenir des neurones après différenciation des cellules de la lignée de

tératocarcinome embryonnaire humain (NT2) en les traitant à l'acide rétinoïque.

. L'une d'entre elles, décrite notamment par Andrews et al.

(Developmental Biology 1984, 103 : 285-293), consistant à cultiver la lignée cellulaire NT2 en monocouche, conduit ainsi à la production de 5% de neurones matures post-mitotiques, dont une succession de réensemencements dans des conditions spécifiques permet au final la purification à 99% de neurones NT2-N.

Cette technique de production de neurones est cependant longue, fastidieuse et présente l'inconvénient d'une perte importante de matériel au cours des différents réensemencements.

En outre, le traitement à l'acide rétinoïque suppose l'utilisation de sérum bovin, comportant pour certaines applications un risque potentiel d'encéphalite spongiforme bovine, ou d'hépatite.

Une autre méthode connue, décrite par Cheung et Al (BioTechniques 1999,26 : 946-954), basée sur la formation préalable d'agrégats cellulaires à partir des cellules NT2, bien que présentant l'avantage de réduire le temps requis par la technique de culture en monocouches pour induire la différenciation neuronale, suppose également l'emploi de sérum bovin, et par conséquent, l'éventualité des risques précédemment décrits.

C'est en recherchant des solutions aptes à pallier ces divers inconvénients que les inventeurs du présent procédé ont constaté que les cellules de la lignée de tératocarcinome embryonnaire humain, traitées sur la base de la méthode utilisée pour la différenciation des cellules souches neurales, mais dans des conditions très spécifiques et scrupuleusement mises au point, étaient aptes, de manière tout à fait inattendue et étonnante, à produire un pourcentage particulièrement important de neurones, sans perte de matériel, et en toute sécurité, car la solution envisagée ne suppose plus l'emploi de sérum bovin.

En conséquence, la présente invention constitue maintenant une solution concrète pour les différentes applications exposées

précédemment, et permet donc d'envisager sérieusement leur développement.

En fait, l'invention vise en général un procédé de production de neurones à partir de cellules d'une lignée cellulaire apte à se différencier pour produire notamment des neurones, dans lequel : - on cultive lesdites cellules en sphères, de préférence en les exposant à des facteurs de croissance, tels que, par exemple, EGF (epidermal growth factor) et/ou bFGF (basic fibroblast growth factor) ou LIF (Leukemia Inhibitory Factor), dans un milieu de croissance défini, - on induit la différenciation desdites sphères en les faisant adhérer sur un substrat, après élimination des facteurs de croissance EGF et/ou bFGF ou LIFs, et en les cultivant dans le milieu de croissance pendant un laps de temps approprié, caractérisé en ce que l'on utilise les cellules de la lignée de tératocarcinome embryonnaire humain NT2.

Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel, le présent procédé comprend essentiellement trois phases : une première étape d'induction, une étape d'expansion, à la fois en volume et en nombre, des sphères issues de l'induction, et enfin une étape de différenciation en neurones.

Pour l'étape d'induction des cellules de la lignée de tératocarcinome embryonnaire humain (NT2) en sphères : - on dissocie des cellules de la lignée de tératocarcinome embryonnaire humain (NT2) cultivées en monocouches avec une solution de trypsine/EDTA, on ensemence les cellules NT2, une fois dissociées, de préférence à 100 000 cellules/ml dans des flacons, par exemple de type FALCON (marque déposée) de 75 ml à bouchon filtrant contenant le milieu de croissance auquel est rajouté extemporanément le facteur de croissance EGF et/ou le facteur de croissance bFGF,

- on les laisse proliférer pendant une période d'au moins sept jours.

Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé considéré, on utilise un milieu de croissance défini dépourvu de sérum bovin.

Pour réaliser l'étape d'expansion, on renouvelle régulièrement une fraction du milieu de croissance au cours de la période de culture des cellules NT2 en sphères.

Ceci est de préférence réalisé par le fait que l'on renouvelle tous les trois à quatre jours 70% du milieu de croissance.

Une autre caractéristique dudit procédé est par ailleurs définie par le fait qu'au cours de la période de culture des cellules NT2 en sphères, l'on soumet régulièrement les neurosphères en suspension dans le milieu de croissance à une centrifugation, et on les repique par dissociation mécanique, effectuée, par exemple, à l'aide d'une pipette Pasteur effilée.

Il a pu tre constaté que de manière tout à fait avantageuse, les présentes conditions permettaient d'ensemencer les sphères NT2 plus de 6 fois sur une période de 60 jours, sans perte de matériel.

Pour induire la différenciation des sphères NT2, le présent procédé prévoit d'utiliser de la poly-D-lysine (PDL), de préférence de faible poids moléculaire (par exemple 30kDa à 70 kDa) en tant que substrat apte à faire adhérer et différencier les sphères de cellules NT2.

D'autre part, selon un mode de mise en oeuvre envisageable pour entreprendre la différenciation des sphères de cellules NT2, l'on ensemence ces dernières sur le substrat adhésif sans les dissocier au préalable.

Dans ce cas de figure, le procédé prévoit d'ensemencer les sphères de cellules NT2 non dissociées à 50 000-100 000 cellules/cm2 en estimant leur nombre par comptage d'une aliquote.

Selon un autre mode de mise en oeuvre, pour entreprendre la différenciation des sphères de cellules NT2, l'on dissocie au

préalable les sphères de cellules NT2 à l'état de cellules uniques avant de les ensemencer sur le substrat adhésif.

De préférence, le procédé prévoit alors d'opérer la dissociation des sphères de cellules NT2 en les incubant pendant quelques minutes dans une solution de trypsine/EDTA puis en les exposant à une solution contenant 2mM de CaCl2, 0, 01% de DNase 1 et 0, 5% d'inhibiteur de trypsine.

Une caractéristique supplémentaire consiste encore à ensemencer les sphères de cellules NT2 une fois dissociées à 250 000 cellules/cm2 sur le substrat adhésif, en estimant leur nombre par comptage d'une aliquote.

Par ailleurs, le présent procédé se caractérise également en ce que lors de la phase de différenciation des sphères NT2, l'on cultive ces dernières pendant au moins dix jours.

Selon une autre caractéristique avantageuse, le présent procédé prévoit également, préalablement à la phase de différenciation, de congeler les sphères de cellules NT2 entières (sans aucune dissociation préalable) dans un milieu de congélation, défini par le milieu de croissance NS dans lequel elles ont poussé (milieu conditionné) enrichi par la présence de 10% de Dimethyl Sulfoxyde (DMSO), puis de les décongeler dans un milieu de décongélation défini par un mélange comprenant de préférence 50% en volume du milieu conditionné et 50% en volume du milieu de croissance NS neuf, en présence des facteurs de croissance bFGF et/ou EGF ou LIF.

D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre se rapportant à un exemple de réalisation donné à titre d'exemple indicatif et non limitatif.

La compréhension de cette description sera facilitée au vu des dessins joints en annexe dans lesquels : - les figures 1 et 2 correspondent à des photographies en contraste de phase illustrant l'évolution des cellules NT2 au fil du déroulement du présent procédé,

- la figure 3 représente des résultats d'études relatives à la réponse des cellules NT2 aux facteurs de croissance FGF bFGF, et LIF, - la figure 4 représente une photographie en contraste de phase de sphères NT2 différenciées, - les figures 5 et 6 représentent des résultats d'analyses dtimmunofluorescence effectuées sur les sphères NT2 différenciées, - la figure 7 représente un western-blot montrant, sur les sphères NT2 différenciées, l'expression d'un marqueur spécifique des neurones, la p3 tubuline.

L'invention concerne le domaine de la neurologie et propose un nouveau procédé d'obtention de neurones, dans lequel des cellules de la lignée de tératocarcinome embryonnaire humain NT2 sont cultivées en agrégats sphériques puis amenées à se différencier en neurones après adhésion sur un substrat.

Dans une étape préliminaire du présent procédé, les cellules de la lignée cellulaire NT2 sont d'abord cultivées de manière classique, en monocouches, dans des flacons à bouchons filtrants contenant un milieu de croissance Opti-MEM (marque déposée par la société Life Technologies) complété par 5% de sérum de veau foetal, et 5pg/ml de Gentamicine (marque déposée par la société Gibco BRL) à 37°C.

Afin d'entretenir la lignée, les cellules cultivées en monocouches sont dissociées deux fois par semaine à l'état de cellules uniques avec une solution de trypsine/EDTA à 0, 25% et repiquées au tiers.

Pour la mise en oeuvre du présent procédé, les cellules NT2 cultivées en monocouches sont récupérées et dissociées avec la solution de trypsine/EDTA à 0, 25%.

Cette étape permet d'obtenir le premier passage en sphères des cellules NT2 qui sont ensuite ensemencées, de préférence à 100 000 cellules/ml dans des flacons de type FALCON (marque déposée par la société Falcon) de 75 ml à bouchons filtrants contenant 15 ml de milieu de croissance (NS) dépourvu de sérum bovin, défini par la composition suivante : DMEM/F12 (50%/50%),

2mM de glutamine, du complément N2,0, 6% de glucose, 20pg/ml d'insuline, et auquel sont rajoutés extemporanément les facteurs de croissance EGF à 20ng/ml, bFGF à lOng/ml, 2pg/ml d'héparine ou le facteur de croissance LIF à 10 ng/ml ou 20 ng/ml.

Dans ces cultures, visibles sur la figure 1, les cellules dissociées en cellules uniques adhérent faiblement au support plastique des flacons de culture.

Au bout de 2 jours, les cellules forment de petits agrégats sphériques qui se détachent du plastique et flottent en suspension dans le milieu de croissance NS, tels que visibles sur la figure 2.

Ces sphères continuent à augmenter en taille et en nombre pendant 7 à 10 jours, et, pour l'entretien de la lignée, celles d'entre elles présentes en suspension dans le milieu de croissance NS sont centrifugées une fois par semaine et repiquées par dissociation mécanique effectuée au moyen d'une pipette pasteur effilée, à raison de 10 à 12 aller-retours.

Dans ces conditions, les cellules ont été ré-ensemencées plus de 6 fois sur une période de 60 jours, en rajoutant des facteurs de croissance, ou en renouvelant le milieu de croissance NS, préférentiellement à hauteur de 70%, tous les trois à quatre jours.

La manière dont les cellules NT2 répondent aux facteurs de croissance EGF et bFGF a été étudiée en comptant les cellules sphériques viables obtenues après trois jours de culture en présence soit de l'un ou l'autre, soit de l'un et l'autre d'entre eux, puis dissociées.

Les résultats représentés sur la figure 3, montrent le nombre de cellules viables après trois jours, tandis que la ligne horizontale indique la densité d'ensemencement.

Bien qu'il ait pu tre observé, de manière inattendue, que les cellules NT2 étaient capables de former des sphères en l'absence de facteurs de croissance, elles prolifèrent néanmoins de façon différente sous l'effet de ces derniers, et en fonction du type de facteurs de croissance ajouté au milieu de croissance NS.

Ainsi, l'on constate qu'en présence uniquement du facteur de croissance EGF, le taux de prolifération des cellules NT2 est multiplié par 1,5 par rapport aux contrôles correspondant à des cultures sans facteur de croissance.

Ce taux est multiplié par 2,2 en présence du facteur de croissance bFGF seul, tandis que la présence conjointe des deux facteurs ne montre pas d'effet additionnel.

Selon le présent procédé, pour réaliser la différenciation des sphères NT2, les milieux des flacons de culture contenant les sphères NT2 sont centrifugés après 7 à 10 jours de prolifération, puis les culots sont lavés deux fois par du Tampon phosphate (phosphate-buffered saline, PBS) afin d'éliminer toute trace de facteurs de croissance EGF et bFGF ou LIF.

Les cellules non dissociées sont ensuite réparties à 50 000 - 100 000 cellules/cm2 soit sur des plaques de 24 puits contenant des lamelles en verre recouvertes avec de la poly-D- lysine (PDL) à 40pg/ml, soit sur des boîtes de culture de 15mm de diamètre recouvertes de PDL à 40pg/ml.

Elle sont cultivées dans ces conditions pendant 10 jours sans changement de milieu.

Selon une autre alternative destinée à permettre une évaluation précise du pourcentage de cellules différenciées, les sphères NT2 sont soumises à une dissociation à l'état de cellules uniques, par une solution de trypsine/EDTA (0, 25%) en présence de 2mM de CaClz, 0, 01% de DNase 1 et 0, 5% d'inhibiteur de trypsine, avant d'tre ensemencées sur des plaques de 24 puits contenant des lamelles en verre recouvertes par de la PDL.

En traitant les sphères NT2 de cette manière, l'on observe qu'elles se différencient spontanément après le retrait des facteurs de croissance, et adhésion sur la PDL.

Cette dernière s'effectue en moins de 24 heures et s'accompagne de l'apparition de deux types cellulaires qui quittent les sphères.

Au bout de 10 jours de différenciation, les différentes morphologies visibles sur la figure 4 apparaissent, d'une part

des cellules plates et très étendues, et d'autre part des cellules neuronales plus petites, bipolaires et plus ramassées.

Des études ont également été menées pour vérifier les caractéristiques de pluripotence des sphères NT2, et la présence de cellules neuronales après différenciation.

Ainsi, l'expression des marqueurs spécifiques des neurones (83 tubuline, Map2ab), des oligodendrocytes (04) et des astrocytes (GFAP) a été étudiée par immunofluorescence, effectuée sur les sphères NT2 différenciées.

Les résultats obtenus suite à cette analyse menée de manière classique, montrent qu'à 10 jours de différenciation, 30 à 50% des cellules sont B3 tubuline (figure 5), ou Map2ab positives (figure 6), et qu'à ce stade, aucune cellule n'exprime 04 et GFAP.

L'expression de certains neurotransmetteurs a également été étudiée par immunofluorescence, et a montré que le GABA est le neurotransmetteur majoritaire, suivi de la dopamine et de la sérotonine.

Tous ces résultats montrent par conséquent que le procédé selon l'invention conduit à la production exclusive de neurones, contrairement à la technique basée sur l'utilisation de cellules souches neurales, et qu'en plus cette production donne lieu à une grande quantité de neurones, contrairement à la méthode qui consiste à traiter les cellules NT2 à l'acide rétinoique.

Par ailleurs, les sphères NT2 présentant l'avantage de pouvoir tre dissociées pendant plus de deux mois, il a également été vérifié qu'au cours des passages successifs, elles conservaient la mme capacité à se différencier en neurones.

Pour cela, les protéines totales des sphères NT2 différenciées ont été extraites à chaque passage, et l'expression de la ß3 tubuline a été étudiée à ces stades par western-blot.

Les résultats, visibles sur la figure 7, montrent que l'expression de ce marqueur neuronal est toujours très forte, du premier au cinquième passage, ce qui correspond à une période qui s'étend sur plus de deux mois, et par conséquent que les

sphères NT2 ne présentent aucune perte de leur potentialité de différenciation neuronale au fil des dissociations.

De surcroît, les sphères de cellules NT2 peuvent tre congelées entières (sans aucune dissociation préalable) dans le milieu de croissance NS dans lequel elles ont poussé (milieu de congélation conditionné) en présence de 10% de Dimethyl Sulfoxyde (DMSO).

Ceci permet avantageusement de réaliser un stock de sphères NT2 de faible passage.

Enfin, les sphères de cellules NT2 congelées entières sont décongelées dans du milieu conditionné et du milieu de croissance NS neuf (50%/50%) en présence des facteurs de croissance bFGF et/ou EGF ou LIF.

Dans ce cas, les sphères se désagrègent un peu pendant 3 à 4 jours puis se mettent à proliférer normalement, et peuvent à nouveau tre dissociées à l'état de cellules uniques entre 7 et 10 jours après le jour de la décongélation.

Ainsi qu'il ressort clairement de ce qui précède, le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes utilisées classiquement pour produire des neurones.

Les cellules NT2 cultivées en sphères permettent de produire un taux important de neurones, et constituent un modèle particulièrement avantageux pour étudier le développement précoce du système nerveux central humain et la neurogenèse, directement à partir de tissu humain, contrairement aux pratiques habituelles fondées principalement sur l'utilisation de neurones de rat ou de souris, du fait notamment du manque de disponibilité de neurones primaires humains.

Ainsi, les neurones obtenus peuvent tre avantageusement utilisés pour sélectionner de nouveaux agents, notamment des molécules et/ou des facteurs protéiques supposés intervenir dans la différenciation des cellules souches neurales, et agissant de sorte à privilégier la prolifération des neurones, au détriment des autres types de cellules neuronales. Le fait de disposer de

tels agents est essentiel, notamment dans une optique de transplantation.

Ces mmes neurones peuvent également tre utilisés pour sélectionner des agents, agissant au niveau de la croissance des neurites, et qui pourraient présenter un intért dans le cadre de stratégies réparatrices, pour favoriser la repousse de neurones lésés.

Une autre application intéressante des neurones obtenus par le biais du présent procédé, concerne leur utilisation pour cribler des agents susceptibles de présenter des propriétés neuroprotectrices, c'est à dire aptes à protéger les neurones d'agressions d'origines diverses, telles que, par exemple, celles issues de certains radicaux libres, ou celles faisant suite à un phénomène d'excitotoxicité, de type glutamatergique ou autre. Par ailleurs les neurones obtenus peuvent tre utilisés pour évaluer la neurotoxicité intrinsèque de molécules à visée thérapeutique susceptibles d'tre en contact avec le système nerveux central. Ils permettent par conséquent la sélection d'agents potentiellement thérapeutiques ne présentant pas de toxicité intrinsèque pour les neurones du système nerveux central.

D'autre part, du fait de l'absence de sérum bovin au cours du procédé, les cellules NT2 constituent également une solution extrmement prometteuse pour produire des neurones pouvant tre utilisés pour 1'obtention de greffons permettant d'envisager en toute sécurité une transplantation dans de nombreuses pathologies, notamment les maladies neurodégénératives, les accidents vasculaires cérébraux, les traumatismes de la moelle épinière et du cerveau, les pathologies de la rétine ou de l'oreille interne.

Enfin, un autre avantage important est défini par le fait que les cellules NT2 cultivées de la sorte ne donnent pas naissance aux astrocytes, ce qui élimine les éventuels problèmes évoqués de limitation de la croissance des neurones et de sécrétion de molécules modifiant de façon péjorative l'environnement des cellules greffées.

Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut y apporter diverses modifications de formes, de matériaux et de combinaisons de ces divers éléments sans pour cela s'éloigner du cadre et de l'esprit de l'invention.