以下、本発明の実施例について述べるが� ��本発明はこれらのみに限定されるものでは� ��い。

(実施例1)
 (1)配列番号2(図2上段)、配列番号3(図2下段)� �塩基配列でそれぞれ示されるDNAからなるプ� �イマーを用い、各試料から抽出したゲノムDN Aを鋳型として、PCRを行った。PCR反応は、常� �によって行い、例えば既述した条件で行う� �とができる。

 PCR反応終了後、アガロースゲル電気泳動に� ��ってPCR増幅産物を分離し、分離後のゲルを� ��チジウムブロマイドで染色後、UV照射下に� �いて増幅産物を視覚化することによって、� �幅産物の有無を確認した。分子量マーカー� �して100bp DNA Lader(New England BioLabs Inc., USA)� ��使用した。これらのPCRの結果を図3に記載し た。その結果、ピーカンナッツ(レーン7)及び クルミ(レーン8)のいずれも同一パターンを示 し、単なる電気泳動では両者は分別できない ことが確認された。
 (2)そこで、PCR産物の配列を確認することと� ��た。配列確認方法は、次のとおりである。� ��ーカンナッツ(Carya illinoensis)のmatK遺伝子配� ��は未知であるので、スタンダードPCRクロー� ��ング技術によってその配列を同定した。

 ピーカンナッツ(Carya illinoensis)のmatK遺伝� ��配列は未知であるため、PCR産物の塩基配列� ��確認することとした。塩基配列の確認方法� ��常法のTAクローニング技術(Marchuk,D,Drumm,M,Saul ino,A., and Collins,F,S,Nuclwic Acids Res,19 1154,1991) によってその塩基配列を決定した。

 具体的には、公知であるクルミmatK塩基配 列(Genbank accession #AF118027)に照らして、クル� �プライマーの外側の領域でプライマーセッ� �(センスプライマー:クルミAF118027の378から402� ��目、すなわち、GGATTTCTAACCATCTTGTTATCCT、アンチ センスプライマー:クルミAF118027の1295から1319� ��目、すなわち、TCCAGAAGATGTTAATCGTAAATGA)を設計� �た。そのプライマーセットを用いてピーカ� �ナッツDNAを鋳型にPCR反応を行った。得られ� �PCR産物のクローニングはTAクローニング用キ ットTOPO TA Cloning (Invitrogen社登録商標)を用� �て行った。キットに添付されているクロー� �ング用ベクターpCRII-TOPO vector(登録商標)にPCR 産物を組み込み、当該クローニング用ベクタ ーで宿主大腸菌(JM109)を常法に従い形質転換� �行った。

 当該ベクターにはアンピシリン耐性遺伝� ��が組込まれているため、アンピシリンを含� ��LBプレートで培養することで当該ベクター� �導入された宿主のみを選択できる。得られ� �コロニーから任意に10個を選択し、ベクター にPCR産物遺伝子が組込まれているか否かをプ ライマーセットを用いたコロニーPCR法で確認 した。選択した全てのコロニーでPCR産物遺伝 子が組込まれていたことが確認できた。

 さらに、それら10個のコロニーから任意� �3個を選択し、塩基配列を確認するためPCR産� ��の組込まれたベクタープラスミドを精製し� ��当該クローニングベクターの塩基配列確認� ��に既に設計されているプライマー(M13 Foward( -20)PrimerおよびM13 Reverse Primer)を用い常法に� �い塩基配列の決定を行った。確認した3クロ� ��ン全てが同一の塩基配列であった。

 決定したピーカンナッツmatK遺伝子のクル ミプライマーで増幅される領域の塩基配列を 図1に示す。また、食用を目的として市販さ� �ているピーカンナッツ2品目、アメリカアリ� ��ナ州産ピーカンナッツ(プロフーズ社)およ� �アメリカ/オーストラリア産ウェスタンシュ� ��種(キッチンガーデン お菓子の材料ネット� ��ト アパテリス)からDNAを抽出し、同様の方� ��にて塩基配列を確認したところ、2品目とも 図1に示したピーカンナッツの塩基配列と一� �していた。図中、Walnutはクルミ、Pecan nutは� ��ーカンナッツ、Hickoryはヒッコリーを示す。 ピーカンナッツの配列は、従来未知の新規配 列であって、その塩基配列を配列番号1に示� �た。

 これらの配列比較から、クルミとピーカ� ��ナッツでは15番目の塩基が1つだけ相違して� ��るのはわかるが、わずか1塩基の違いで両者 を分別検出できるとは予測できなかった。し かし、後記するように制限酵素処理によって 1塩基の違いで両者が分別検出可能であるこ� �が確認された。わずか1塩基の違いで両者の� ��別が可能となることはまさに画期的なこと� ��あって極めて特徴的であり、高い特許性を� ��するものである。

 したがって、両者を分別するためには、m atK遺伝子の配列を比較して、15番目の塩基がA かCかによって両者を分別することができる� �、また、SMAP法(理研)等によることもできる� �しかしながら、本発明者らは更に簡便な方� �を開発した。

 (3)PCR断片の制限酵素処理によるクルミとピ� ��カンナッツの分別を行った。
 すなわち、試料として1、3、5、7はクルミPCR 断片(50ng/ml)、2、4、6、8はピーカンナッツPCR� �片(50ng/ml)を用いた。反応組成は、DNA量 2μL� �酵素量 1μL(AclI:3000U/ml、BfaI: 5000U/ml)、全量� �20μLとし、37℃で3.5時間インキュベートした� ��制限酵素処理物は、2.5%アガロースゲルで電 気泳動した(3μL)。

 電気泳動図を図4に示す。図面の結果から 明らかなように、ピーカンナッツ(レーン6)と クルミ(レーン5、7)とは一見しても明らかな� �うにパターンが相違しており、レーン5、7に おいてはBfaIによって切断された2つのクルミ� ��異断片のパターンが示された。

 この結果は、予想される断片長、すなわ� ��、切断なしの場合は、両者とも120bp、AclIで� ��断した場合は、両者とも59bp、61bp、BfaIの場� ��は、クルミが40bp、80bpであるのに対してピ� �カンナッツが120bp、AclI+BfaIの場合は、クルミ が19bp、40bp、61bpであるのに対してピーカンナ ッツが59bp、61bpであるので、予想される断片� ��とよく一致するものである。

 したがって、PCR産物のBfaI処理物の電気泳 動処理によって、ピーカンナッツとクルミと を簡便、迅速、且つ正確に分別、検出するこ とができるのである。