способ определениякачестваклеточнойку льтуры

область применения изобретение относится к области клеточных технологий, а именно к анализу культивируемых iп vitrо клеток и может быть использовано в биотехнологии, косметологии, медицине (клеточной трансплантологии), для получения охарактеризованного клеточного материала, обладающего лечебными или косметологическими свойствами. предшествующий уровень техники

проблема анализа клеточного материала, а именно контроля изменчивости является актуальной задачей во всех областях, где применяются культивируемые клетки. так эксперименты на клеточных культурах являются неотъемлемой частью исследований в биологии и медицине. на клеточных моделях исследуют такие биологические процессы как апоптоз, дифференцировка, онкологическая трансформация клеток, изучают многие аспекты метаболизма, выявляют механизмы действия лекарств и т.д. последние достижения клеточных технологий позволяют использовать культивируемые клетки в качестве лекарственных препаратов, перспективных, по мнению многих ученых, в лечении многих ранее неизлечимых болезней (теrskikh а.V. еt аl., "маmmаliап stеm сеlls", реdiаtr. Rеs., 2006, v.59, 13-20).

однако, фенотип культивируемых клеток изменчив. перенос клеток из физиологичных условий iп vivо в культуральные флаконы приводит к стрессу клеток и существенной перестройке их метаболизма. причина тому - невозможность воссоздания "в пробирке" естественной для клеток среды обитания (Wright W.E., Shау J. W., "нistоriсаl сlаims апd сurrепt iпtеrрrеtаtiопs оf rерliсаtivе аgiпg", Nаt. вiоtесhпоl., 2002, v.20, 682-688; Gershon H., Gershon D., "сritiсаl аssеssmепt оf раrаdigms iп аgiпg rеsеаrсh", ехр. Gеrопtоl., 2001, у.36, 1035-1047), что ведет к: изменению в экспрессии генов (саmрisi J., "Rерliсаtivе sепеsсепсе апd immоrtаlizаtiоп", iп: Stеiп G.S., ваsеrgа а., Giоrdапо а., Dепhаrdt D.т. (еds.). "тhе моlесulаr ваsis оf CeIl сусlе апd Grоwth сопtrоl", Wilеу-Liss, Nеw Yоrk, 1999, рр.

348-373; сristоfаlо VJ. еt аl., "аgе-dерепdепt mоdifiсаtiопs оf gепе ехрrеssiоп iп humап fibrоblаsts", сrit. Rеv. еukаrуоtiс Gепе ехрrеssiоп, 1998, v.8, 43- 80);

активации лизосомальных гидролаз (вауrеuthеr к. еt аl., "нumап skiп fibrоblаsts iп vitrо diffеrепtiаtе аlопg а tеrmiпаl сеll нпеаgе", рrос. Nаtl. асаd. Sсi. USA, 1988, v.85, 5112-5116); деградации гормон-зависимого метаболизма, сдвигам в изоферментном составе (сrаbb D.W., Rоерkе J., "Lоss оf grоwth hоrmопе-dерепdепt сhаrасtеristiсs оf rаt hераtосуtеs iп сulturе", In Vitrо сеll Dеv. вiоl., 1987, v.23, 303-307;

Rоерkе J.E., сrаbb D. W., "Lоss оf sехuаl diffеrепtiаtiоп оf rаt hераtосуtеs iп shоrt-tеrm сulturе", аlсоhоl аlсоhоl Suррl., 1987, v.l, 263-264); изменениям в синтезе rлутатиона (Rеiпеrs JJJr. еt аl., "Dерlеtiоп оf сеllulаr glutаthiопе bу сопditiопs usеd fоr thе раssаgiпg оf аdhеrепt сulturеd сеlls", тохiсоl. Lеtt., 2000, v.115, 153-163); потере в процессе культивирования экстрацеллюлярных белков и деградации рецепторного аппарата (нuggiпs J.W. еt аl., "моlесulаr сhапgеs iп сеll surfасе mеmbrапеs rеsultiпg frоm trурsiпizаtiоп оf sаrсоmа 180 tumоr сеlls", вiосhim. вiорhуs. асtа, 1976, v.426, 630-637); повышению в клетках с каждым пассированием активности теломеразы и укорочению теломеров (воdпаr A. G. еt аl., "ехtепsiоп оf lifе-sрап bу iпtrоduсtiоп оf tеlоmеrаsе iпtо поrmаl humап сеlls", Sсiепсе, 1998, v.279, 349-352), что, в конечном счете, приводит к неспособности клеток пролиферировать (науfliсk L., мооrhеаd P. S., "Thе sеriаl сultivаtiоп оf humап diрlоid сеll strаiпs", ехр. сеll Rеs., 1961, v.25, 585-621).

- потере комплекса гистосовместимости (соlliпs T. еt аl., "Lоss оf HLA iп сulturе", рrос. Nаtl. асаd. Sсi. USA, 1986, v.83, 446-450; апgus R., еt аl., "ехрrеssiоп оf mаjоr histосоmраtibilitу соmрlех (MHC) апtigепs апd thеir lоss оп сulturе iп rепаl саrсiпоmа", еur. J. сапсеr, 1993, v.29, 2158-2160).

таким образом, iп vitrо клетки подвержены морфофункциональной дегенерации, ведущей к их гибели. более того, действующие iп vitrо дестабилизирующие условия и естественный отбор клеточного материала приводит к возникновению спектра отличающихся друг от друга популяций клеток. в медицинских клеточных технологиях вопрос изменчивости клеточных культур стоит наиболее остро. возьмем, к примеру, создание противоопухолевых вакцин на основе культивируемых опухолевых клеток пациента. при культивировании существенно искажается антигенный фенотип клеток (апgus R., еt

аl., "ехрrеssiоп оf mаjоr histосоmраtibilitу соmрlех (MHC) апtigепs апd thеir lоss on сulturе iп rепаl саrсiпоmа", еur. J. сапсеr, 1993, v.29, 2158-2160; Nanchahal J. еt аl., "сulturеd соmроsitе sкiп grаfts: biоlоgiсаl sкiп еquivаlепts реrmittiпg mаssivе ехрапsiоп", Lапсеt, 1989, v.22, 191-193), что ведет к несовпадению антигенов вакцины и опухоли. вероятно, именно с этим связан тот факт, что в большинстве проведенных в последнее десятилетие рандомизированных исследований таких вакцин не было получено очевидной противоопухолевой активности (Fishеr R.I. еt аl., "аdjuvапt immшюthеrару оr сhеmоthеrару fоr mаligпапt mеlапоmа", рrеlimiпаrу rероrt оf thе Nаtiопаl сапсеr Iпstitutе rапdоmizеd сliпiсаl triаl. Surg. сliп. Nоrth Am., 1981, v.61, 1267- 1277; мitсhеll M.S., "реrsресtivе оп аllоgепеiс mеlапоmа lуsаtеs iп асtivе sресifiс immuпоthеrару", Sеmiп. опсоl., 1998, v.25, 623-635).

не менее актуален вопрос изменчивости клеток при использовании клеточных трансплантатов, полученных путем размножения клеток самого пациента. в частности, известны способы лечения аутологичными фибробластами (см, например, "биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата", заявка: 2005127087/15, опубл. 20.08.2006, мпк A61K35/36; A61K35/36, а так же WO9840027 опубл. 17.09.1998, мпк A61F2/10; A61L27/24; A61L27/38; C12N5/00; US5660850, опубл. 26.08.1997, мпк C12N5/06; A61F2/00). изменение в процессе культивирования антигенов (соlliпs T. еt аl., "Lоss оf HLA iп сulturе", рrос. Nаtl. асаd. Sсi. USA, 1986, v.83, 446-450) или, например, утрата возможности пролиферировать (науfliсk L., мооrhеаd P. S., "Thе sеriаl сultivаtiоп оf humап diрlоid сеll strаiпs", ехр. CeIl Rеs., 1961, v.25, 585-621) делает подобные биотрансплантанты бессмысленными, а возможно и вредными.

таким образом, культивированные клетки, используемые в медицинских и косметологических препаратах, должны в обязательном порядке подвергаться качественному анализу.

сегодня к оценке качества культивируемых клеток относят способы, направленные на выявление контаминации, определение количества живых клеток, их тканевой принадлежности, выявление кросс-контаминаций (загрязнение клетками другого вида), а также абсолютная их идентификация.

существуют различные методы обнаружения контаминации клеточных препаратов микоплазмой, грибами и вирусами. данные способы позволяют

характеризовать качество клеточного препарата, но не характеризуют качество самих клеток препарата.

существуют различные методы оценки качества культуры, основанные на исключении красителя живыми клетками, эффективности клонирования и пролиферации в массовой культуре (хэй P. "сохранение и оценка качества клеток", в кн.: "культура животных клеток", под ред. 3. фрешни, M.: мир, 1989, с. 108-164). данные методы позволяют только определять процент живых клеток в клеточном препарате и их жизнеспособность, но не дают представления о качественных (специальных) характеристиках самих клеток.

известны различные способы определения тканевой принадлежности клеточных линий, а именно основанные на: тонком структурном анализе клеток с помощью электронного микроскопа; иммунологическом тесте белков цитоскелета (Rаmаеkеrs F.с.S. еt аl., CoId Sрriпg наrbоr Sуmр. Quапt. вiоl., 1982, v.46, 331); выявлении тканеспецифических антигенов (Nij wеidе PJ. and Mulder R. J.P.,

"Idепtifiсаtiоп оf оstеосуtеs iп оstеоblаst-likе сеll сulturеs usiпg а mопосlопаl апtibоdу sресifiсаllу dirесtеd аgаiпst оstеосуtеs", 1986, v.84, 342-347); биохимическом тестирования специфических функций клеток (применим для клеток со специфическими функциями, см., например, нау RJ. еt аl., "аmеriсап туре сulturе Collection Catalogue 11", 4 ^th еdп., 1983, Rосkvillе, MD, р.12), количественной оценке иммунологических продуктов (применим для идентификации гибридом).

недостатком тестов на тканеспецифичность при оценке клеточных препаратов является невозможность определить источник клеток. в частности фибробласты, применяемые в клеточных препаратах, могут быть как фетального (эмбрионального) происхождения, так и выделенными из тканей взрослого человека, например из кожи или жировой клетчатки (адипогенные фибробласты). таким образом, фибробласты, полученные из различных источников, хоть и относятся к одному типу ткани, обладают различными полезными качествами.

в настоящее время известно несколько способов выявления кросс- контаминаций и идентификации клеточных культур.

известен метод непрямой окраски клеток флуоресцентно-мечеными антителами. данный способ позволяет верифицировать культуру клеток, определить

кросс-контаминацию, установить изменчивость по определенным антигенам (Stulbеrg

CS. iп: "сопtаmiпаtiоп iп тissurе сulturе", Fоgh J. (еd.), асаdеmiс рrеss, 1973, Lопdоп апd Nеw Yоrk, р.l). недостатком данного способа является необходимость предварительного получения видоспецифических антител для конкретной культуры, которые получают путем иммунизации животного тестируемыми клетками. метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.

известен метод, основанный на анализе изоферментного состава. показано, что определение изоформ семи ферментов с помощью электрофореза достоверно позволяет определить принадлежность клеток человеку (о'вriеп SJ. еt аl., "епzуmе роlуmоrрhisms аs gепеtiс sigпаturеs iп hшпап сеll сulturеs", Sсiепсе, 1977, v.195, 1345- 1348). недостатком данного метода является длительность его исполнения (электрофорез идет 16-18 часов) и применимость только для выявления межвидовых кросс-контаминаций. метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.

известен цитогенетический (кариологический) способ оценки наличия примесей других типов клеток в культуре. метод основан на том, что хромосомные наборы могут значительно отличаться у клеток разных видов, что можно обнаружить с помощью микроскопа. однако при наличии загрязнения клетками близкородственного вида анализ резко усложняется (применяется G-сегментирование, см., например, Sеаbright M., "а rарid bапdiпg tесhпiquе fоr hшпап сhrоmоsопiеs", Lапсеt, 1971, v.2, 971-972). метод позволяет выявлять только межвидовую кросс- контаминацию и не может установить утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования. известен иммунологический тест на антигены группы крови (нау RJ. In:

"маrkеrs оf Colonic CeIl Diffеrепtiаtiоп", Wolman S. R., Mastromarino AJ. (еds.), 1984, Rаvеп рrеss, Nеw Yоrk, р.з) и антигены гистосовместимости (роllасk м.S. еt аl., "HLA- A, в, с апd DR аllоапtigеп ехрrеssiоп оп fоrtу-siх сulturеd hшпап tumоr сеll liпеs", J. Nаtl. сапсеr Iпst, 1981, v.66, 1003-1012). недостатком данного метода является частичное или полное отсутствие экспрессии этих антигенов у некоторых клеточных культур.

известно использование полимеразной цепной реакции и днк секвенирования (Liu м.Y. еt аl., "Idепtifiсаtiоп апd аuthепtiсаtiоп оf апimаl сеll сulturе bу роlуmеrаsе сhаiп rеасtiоп аmрlifϊсаtiоп апd DNA sеquепсiпg", In Vitго сеllulаr & Dеvеlорmепtаl

Biology - апimаl, 2003, v.39, 424-427; раrоdi в. еt аl., "Sресiеs idепtifiсаtiоп апd сопfirmаtiоп оf humап апd апimаl сеll liпеs: а рсR-bаsеd mеthоd", вiоtесhпiquеs, 2002, v.32, 432-434, 436, 438-440). недостатком метода является применимость к клеточным линиям неблизкородственных видов, а также длительность исполнения, т.к. он требует проведение электрофореза. метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.

известен днк фингерпринтинг (см, например, US2005123947, опубл. 09.06.2005; WO2005116257, опубл. 08.12.2005; US2006035261, опубл. 16.02.2006). днк фрагментируется рестриктазой и полученные фрагменты днк отличаются по размеру и в совокупности формируют уникальный профиль, позволяющий идентифицировать источник происхождения днк. подобный подход широко используется для идентификации клеточного материала. для днк фингерпринтинга наиболее широко используют полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP) (см., например, Kanter E. еt аl., "апаlуsis оf restriction frаgmепt lепgth роlуmоrрhisms iп dеохугibопuсlеiс асid (DNA) rесоvеrеd frоm driеd blооdstаiпs", J. Forensic ScL, 1986, v.зl, 403-408), вариабельные нуклеотидные тандемные повторы (VNTRS) (вudоwlе в. еt аl., "апаlуsis оf thе VNTR lосus D1S80 bу thе PCR fоllоwеd bу high-rеsоlutiоп PAGE", Am. J. нum. Gепеt, 1991, v.48, 137-144) или микросателлиты (Jеffrеуs AJ. еt аl., "нуреrvаriаblе 'miпisаtеllitе' rеgiопs iп humап DNA", Nаturе, 1985, v.314, 67-73). за исключением монозиготных близнецов подобный метод позволяет точно идентифицировать принадлежность клеточного материала индивидууму. однако метод никак не характеризует изменение качества клеточной культуры в процессе культивирования.

известен двумерный белковый электрофорез, позволяющий выявить до 2 тысяч белков (апdеrsоп N.G., апdеrsоп N.L., "тwепtу уеаrs оf twо-dimепsiопаl еlесtrорhоrеsis: раst, рrеsепt апd futurе", еlесtrорhоrеsis, 1996, v.17, 443-453). недостатком данного способа является сложность исполнения. способ требует последовательное проведение двух электрофоретических разделений белков, в связи с чем не применяется в качестве рутинного метода для оценки качества культур клеток. более того, двумерный белковый электрофорез не характеризует наиболее актуальную для клеточной терапии фракцию поверхностных антигенов клеток, ввиду того, что данным способом не анализируют мембранные белки.

известно применение масс-спектрометрии для идентификации клеточных культур (Zhапg X. еt аl, "Idепtifiсаtiоп оf маmmаliап CeIl Lines Using MALDI-TOF апd Lс-еSI-мS/мS маss Sресtrоmеtrу", J. Am. Sос. маss Sресtrоm., 2006, v.17, 490-499). быстрый и относительно простой метод профилирования белков клеток описан для клеток млекопитающих при непосредственном анализе времяпролетной (MALDI TOF) и другими видами масс-спектрометрии. используя MALDI масс-спектры как уникальный фингерпринт можно дифференцировать клеточные линии млекопитающих.

недостатком данного подхода является низкая специфичность, обуславливаемая присутствием в анализируемой пробе множества цитозольных (внутриклеточных) белков, чьи фрагменты, как правило, в массе своей не специфичны для типов клеток, засоряют масс-спектры и не позволяют провести чувствительный анализ и охарактеризовать клетки по наиболее актуальным для клеточной трансплантологии мембранным белкам. из патента WO2006115426 ("способ регулирования биохимических процессов и устройство для его осуществления", опубл. 02.11.2006, мпк G01R23/16; C12Mз/00; с 12Nl /00) известен способ оценки качества культивирования клеточных культур на основе регистрации временных интервалов состояний клеток "рост-размножение" и "накопление-мутация", в котором границы интервалов определяются радиосигналами в среднечастотном и низкочастотном диапазонах. недостатком данного способа является необходимость применения специального оборудования, а так же возможность определения параметров только в результате постоянного мониторирования роста клеток, что не применимо к оценке качества готовых клеточных препаратов. известен способ оценки свойств культуры клеток нейронов (см. патент

US2004106101, опубл. 03.06.2004, мпк G01Nзз/487; G06Q10/00; G01Nзз/487) на основе измерения электрической активности клеток путем выращивания их на микроэлектродном чипе. данный способ относиться только к культуре нейронных клеток и не распространяется на другие клеточные культуры. так же известен способ сертификации культуры клеток хондроцитов (см. патент WO02095399, опубл. 28.11.2002, мпк C12Q1/42; G01Nзз/50; G01Nзз/68). недостатком данного способа является применимость его только в регенеративной терапии хрящевых тканей.

известен способ определения качества клеточной культуры, включающий масс- спектрометрический анализ органических молекул клеток. известный способ предусматривает применение масс-спектрометров, измеряющих массы молекул с высокой точностью за счет применения ионно-циклотронного резонанса, что позволяет увеличивать количество информации получаемой с проб клеток (US6974702, опубл. 02.06.2005, MTTK G01N27/62; G01Nзз/15; G01Nзз/483).

недостатком данного метода является, с одной стороны загрязненность получаемых спектров неинформативными цитозольными белками и другими биополимерами, т. к. для анализа используют целые клетки, и, во вторых, использование определенного и дорогостоящего масс-спектрометра, позволяющего с высокой точностью определять массы молекул. в связи с этим данный подход не получил распространение в качестве рутинного метода анализа качества культур.

наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ, основанный на масс-спектрометрическом анализе именно поверхностных белков клеток, раскрытый в патенте "рrераrаtiоп оf highlу-рurifiеd рlаsmа mеmbrапеs" (WO03025565, опубл. 27.03.2003, MпK-7 G01N27/62; C07K1/22; C07K16/28), в котором описан способ определения качества клеточной культуры, включающий масс- спектрометрический анализ предварительного выделенных мембранных белков.

недостатком данного способа является необходимость использования специфичных для мембранных белков антител или их антигенсвязывающих фрагментов для формирования комплексов с белками мембраны для последующего их выделения и очистки. подобная многостадийность не позволяет применять данный подход в качестве рутинного метода анализа качества культивируемых клеток.

в настоящем изобретении была поставлена задача разработки нового способа определения качества клеточной культуры, ориентированного на анализ клеточных препаратов, отличительными чертами которого являются:

- быстрота исполнения (не более 2-х часов), что позволит использовать его для оценки качества готовых клеточных препаратов перед их применением, учитывая малый срок их годности с момента изготовления (несколько часов);

- чувствительность, позволяющая определять потерю качества клетками в процессе культивирования;

- чувствительность, позволяющая дифференцировать морфофункционально идентичные клетки от одного донора, но обладающие при применении различными полезными свойствами;

- ориентация на анализ поверхностных белков клеток, определение сохранности которых в процессе культивирования наиболее актуально;

- интегрируемость в культивирование клеток, что подразумевает отсутствие специального оборудования и сложных манипуляций для подготовки проб для анализа;

- относительная дешевизна, чтобы цена анализа была несопоставимо меньше стоимости клеточного препарата;

- минимальное или отсутствие потребления клеток, что позволит многократно проводить анализ культивируемых клеток без их расхода;

- возможность численного выражения результатов анализа, что необходимо для реализации стандарта GMP, исключающего человеческий фактор при проведении оценки качества культуры клеток.

раскрытие изобретения

технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в повышении объективности (точности) идентификации культивируемых iп vitrо клеток для отбора качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток при снижении временных и материальных затрат.

указанный технический результат обеспечивается при реализации способа определения качества клеточной культуры, включающего масс-спектрометрический анализ поверхностных клеточных белков. согласно настоящему изобретению предварительно промытые живые клетки исследуемой клеточной культуры подвергают витальному воздействию протеазы, отбирают отщепленные фрагменты поверхностных белков и масс-спектрометрически определяют их массы, контролируют наличие качественных характеристик у исследуемой культуры клеток путем сравнения совокупности полученных масс с совокупностью масс-

спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками.

в предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин. для идентификации отношения клеточной культуры к определенной группе клеточных препаратов с полезными свойствами контролируют наличие качественных характеристик, определяющих источник клеток.

в предпочтительном варианте реализации изобретения контролируют наличие качественных характеристик, определяющих пригодность для проведения противоопухолевой иммунотерапии.

для установления сохранности полезных свойств клетками контролируют наличие качественных характеристик, свидетельствующих об отсутствии изменений фенотипа клеток исследуемой клеточной культуры в процессе культивирования.

в качестве живых клеток с известными качественными характеристиками может быть использована первичная культура клеток.

в качестве живых клеток с известными качественными характеристиками могут быть использованы клетки, не претерпевшие изменений в фенотипе в процессе хранения и культивирования.

отщепленные фрагменты поверхностных белков перед масс- спектрометрическим анализом могут быть дегликозилированы.

обработка первичной культуры клеток витальным воздействием трипсина приводит к отщеплению с поверхности клеток фрагментов белков, состав которых специфичен для конкретных культур клеток. таким образом, согласно данному изобретению, действие трипсина, как и других протеаз, приводит к высвобождению в раствор специфичных для культивируемых клеток фрагментов поверхностных белков, совокупность измеренных масс которых являются характеристической для культуры клеток. для подобных характеризующих культивируемые клетки совокупностей масс был введен термин протеомный футпринт (белковый отпечаток). клетки при обработке витальным воздействием протеазы не погибают, что дает возможность избежать загрязнения анализируемых проб мажорными белками цитоплазмы клетки и избежать расхода клеточного материала при анализе.

и краткое описание чертежей

далее изобретение поясняется конкретными примерами реализации изобретения и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее:

на фиг. 1 - схема получения согласно данному изобретению протеомного футпринта культивируемых клеток.

на фиг. 2 - протеомные футпринты фибробластов из различных тканей человека, классифицированные иерархическим кластерным анализом.

на фиг. 3 — масс-спектр фрагментов поверхностных белков и соответствующий ему футпринт, полученный согласно второму примеру реализации изобретения со свежеинициированной первичной культуры опухолевых клеток человека (за); масс- спектр фрагментов поверхностных белков и соответствующий ему футпринт, полученный с той же культуры клеток после непродолжительного их культивирования (зб); масс-спектр и соответствующий ему футпринт полученный с той же культуры клеток после более длительного культивирования клеток (3B).

лучшие варианты осуществления изобретения

пример 1. на фиброб ластах человека

морфологически все типы фибробластов практически идентичны (имеют веретенообразную форму). однако фибробласты, полученные из различных источников, существенно отличаются по своим свойствам, и соответственно, имеют различные показания к применению в клеточной терапии. в частности, фибробласты, полученные из жировой ткани человека, отличаются плюрипатентностью подобно стволовым клеткам (см., например, Zuk р.а. еt аl, "нumап аdiроsе tissuе is а sоurсе оf multiроtепt stеm сеlls", MoI. вiоl. CeIl., 2002, v.13, 4279-4295). фибробласты кожи человека обладают слабым потенциалом к размножению, но пригодны для мезотерапии большими дозами размноженных клеток самого пациента. эмбриональные фибробласты кожи человека обладают хорошим потенциалом к размножению и пригодны для аллогенной клеточной трансплантации (сухих г.T., "трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее", бюлл. эксп. биол. мед., 1998, 126, прил.l, 3-13). фибробласты дермального сосочка

волосяного фолликула обладают трихогенными свойствами и могут использоваться в клеточной терапии алопеции (см., например, патент "биотрансплантант, способ его получения (варианты) и способ лечения алопеции", заявка: 2004125092/15, опубл. 18.08.2004).

ниже приведен пример определения согласно данному изобретению качественных характеристик тестируемой культуры фибробластов, путем установления идентичности ее протеомного футпринта полученным аналогичным образом футпринтам культур фибробластов известного происхождения и с установленными полезными свойствами.

сорок две первичные культуры кожных, адипогенных, фетальных фибробластов и фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула получали из соответствующих источников согласно описанным ранее методикам. первичные культуры кожных фибробластов получали согласно методике Rittiе и Fishеr ("Isоlаtiоп апd сulturе оf skiп fibrоblаsts", меthоds MoI. меd., 2005, v.117, 83-98). первичные культуры адипогенных фибробластов получали согласно методике Zuk и соавт. ("мultiliпеаgе сеlls frоm lшmап аdiроsе tissuе: imрliсаtiопs fоr сеll-bаsеd thеrарiеs", тissuе епg., 2001, v.7, 211-288). первичные культуры фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула получали согласно методике Zhопg-fа и соавт. ("вiоlоgiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf сulturеd dеrmаl рарillа сеlls апd hаir fоlliсlе rеgепеrаtiоп iп vitrо апd iп vivо", сhiпеsе меdiсаl Jоurпаl, 2006, v.119, 275-281). первичные культуры фетальных фибробластов человека получали из абортивного материала согласно методике Sаlvаtоri и соавт. ("Rеtrоvirаl vесtоr-mеdiаtеd gепе trапsfеr iпtо humап рrimаrу mуоgепiс сеlls lеаds tо ехрrеssiоп iп musсlе flbеrs iп vivо", нum. Gепе тhеr., 1993, v.4, 713-723). культивирование первичных культур проводили в идентичных условиях (ростовая среда дмем, 5% CO ₂ , 37 ⁰ C, 10% фетальной бычьей сыворотки). на 20-25 день после инициации культур делали стерильный клеточный препарат (1 млн фибробластов в 1 мл физиологического раствора), который анализировали по следующему протоколу:

1. клеточный препарат, содержащий тестируемые фибробласты, в стерильных условиях выливают в культуральный флакон. во флакон доливают ростовой

среды (дмем с 10% фетальной бычьей сыворотки) и инкубируют при 37 ⁰ C в

CO ₂ -инкyбaтope в течение 30-45 мин.

2. удаляют ростовую среду из флакона и трижды промывают прикрепившиеся ко дну флакона клетки стерильным физиологическим раствором, используя объем равный половине ростовой среды.

3. добавляют к клеткам 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл р-ра на 25 см ² поверхности культурального флакона.

4. инкубируют флакон при 37 ⁰ C. между пятой и седьмой минутами инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток фрагменты белков.

5. раствор трипсина, отобранный от клеток, используют для масс- спектрометрического определения совокупности масс фрагментов поверхностных белков, соответствующей анализируемым клеткам.

6. измеренную совокупность масс фрагментов поверхностных белков анализируемых клеток сравнивают с полученной аналогичным способом совокупностью масс фрагментов поверхностных белков клеточных культур с известными качественными характеристиками.

масс-спектрометрический анализ проводят следующим образом. пробы, полученные в процессе инкубации клеток с трипсином (см. пункт N°4 протокола) обессоливают, применяя наконечники для автоматических пипеток с обращенной фазой ZipTipc ₁₈ (мilliроrе соrр., сша), в соответствии с протоколом производителя. массы пептидных фрагментов, содержащиеся в пробе, измеряют методом времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. 2 мкл обессоленного раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором α-циaнo-4-гидpoкcиcинaминoвoй кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 600 до 4000 да. полученные масс-спектры, соответствующие разным клеточным линиям, предварительно обрабатывают для последующей классификации иерархическим кластерным анализом. список масс пептидов переводят в бинарный код ("1"- есть

определенная масса пептида в спектре и, соответственно, "о"- отсутствие массы пептида), генерируя таким образом протеомный футпринт клеточной культуры. классификацию (разбиение на группы) футпринтов проводят кластеризацией по методу варда, с использованием квадратов евклидовых расстояний для расчета матрицы дистанций.

из фиг. 2 видно, что футпринты 42-х препаратов фибробластов из различных источников, таких как дермального сосочка волосяного фолликула, жировой клетчатки, кожи предплечья взрослого человека и фетальной кожи четко классифицируются по четырем группам соответственно происхождению фибробластов (1, 2, 3 и 4 группы на фиг. 2, соответственно). таким образом, имея тестируемый клеточный препарат фибробластов, можно точно установить его происхождение по принадлежности его футпринта к тому или иному кластеру. к примеру, если тестируемому клеточному препарату соответствует отмеченный звездочкой (*) на фиг. 2 футпринт, то достоверно можно утверждать, что фибробласты тестируемого препарата были выделены из дермального сосочка волосяного фолликула, размножены соответствующим образом и в процессе культивирования не были утрачены качественные характекристики, позволяющие отнести данные фибробласты к фибробластам с трихогенными свойствами. в случае, если тестируемая культура клеток не будет принадлежать ни одному из кластеров (см, например, футпринт адипогенных фибробластов в кластере 2' на фиг. 2), можно утверждать, что клетки не принадлежат ни одному из определяемых источников, либо в процессе культивирования их фенотип изменился и ассоциировать их с качественными клеточными препаратами установленного происхождения и с известными свойствами уже нельзя.

из приведенного примера видно, что совокупность (набор) молекулярных масс фрагментов поверхностных белков, т.н. протеомный футпринт, является своеобразным "штрих-кодом" характеризующим клетки на предмет отношения к фибробластам с определенными, представляющими интерес для клеточной терапии, свойствами.

следует отметить, что забор раствора трипсина, содержащего отщепленные от клеток фрагменты поверхностных белков, желательно осуществлять до момента открепления клеток от дна культурального флакона под воздействием трипсина, что

позволит предотвратить попадание клеток в пробу и избежать дополнительной стадии очистки пробы.

условия обработки протеазой клеток определяют экспериментально для каждого типа клеток и активности используемой протеазы, и могут существенно варьировать от 0,00001% до 0,05%, для концентрации протеазы, и от 30 секунд до 10 минут для времени обработки клеток. в случае использования трипсина с другой активностью, концентрация его меняется прямо пропорционально увеличению или уменьшению активности.

в других вариантах реализации изобретения используют любой другой вариант масс-спектрометрии.

раствор трипсина можно готовить как на стерильном физиологическом растворе, так и на любом подходящем для этого солевом или буферном растворе.

вместо трипсина могут быть использованы другие протеазы, например, химотрипсин, протеиназа к и т.д. отщепленные фрагменты поверхностных белков могут перед масс- спектрометрическим анализом быть дегликозилированы, например проназой.

вместо трипсина может быть использована комбинация протеаз.

в случае использования суспензионной культуры клеток необходимо перед забором пробы клетки осадить на дно, например центрифугированием или использовать любой другой подходящий способ для удаления клеток из тестируемой пробы.

обессоливание и концентрирование пептидов пробы для масс- спектрометрического анализа можно осуществлять любым подходящим для этого способом. в других вариантах реализации изобретения, если применяемый протокол масс-спектрометрического анализа не требует обессоливания и/или концентрирования анализируемой пробы, содержащей фрагменты поверхностных белков, обессоливание и/или концентрирование не проводиться.

в случае использования трипсина для снятия клеток прикрепленной культуры с подложки при получении клеточного препарата, необходимо перед анализом провести дополнительное инкубирование клеток в соответствующих условиях 18-20 часов для репарации клетками поверхностных белков.

в других вариантах реализации изобретения используют для формирования характеристической совокупности масс не появление той или иной массы фрагмента поверхностного белка, а изменение его интенсивности в масс-спектре, что соответствует изменению его концентрации в анализируемой пробе. в других вариантах реализации изобретения используется любая подходящая математическая обработка измеренных масс белковых фрагментов, позволяющая корректно классифицировать клеточный материал по интересующим свойствам, к примеру, применив регрессионный анализ, к-mеапs кластеризацию, нейросети, PCA, SVM, SOM, и т.д., а также их комбинации. патентуемый способ может применяться к любым типам клеточных препаратов, в частности к суспензии клеток, смешанным культурам, органотипным культурам и клеточным агрегатам (гранулы, сфероиды), а также к свежевыделенным клеткам и тканевым фрагментам.

пример 2. на опухолевых клетках человека

далее изобретение поясняется вторым примером оценки качества культуры опухолевых клеток рака толстого кишечника человека на предмет пригодности использования их для противоопухолевой вакцинации. выделенные из опухоли больного, культивируемые и впоследствии используемые для противоопухолевой вакцинации клетки, должны быть идентичны опухолевым клеткам больного. однако культивирование клеток существенно искажает фенотип первичной культуры по причине невозможности искусственного воссоздания iп vitrо условий, при которых опухолевые клетки росли в организме больного. таким образом, качество используемых для вакцинации культивированных опухолевых клеток подлежит обязательному контролю и выражается в степени их соответствия клеткам опухоли больного. протокол установления подобного соответствия представлен ниже.

1. из флакона с культивируемыми опухолевыми клетками удаляют ростовую среду и трижды промывают клетки 0,9%-ым раствором хлорида натрия или фосфатным буфером силана, используя каждый раз объем равный не менее половины объема заливаемой в культуральный флакон ростовой среды. в результате промывки клеток должны быть удалены следы сыворотки, содержащейся в ростовой среде.

2. к клеткам добавляют 0,0001% раствор трипсина (активность -3000 ед/мг), используя 1 мл р-ра на один 25 см ² поверхности культурального флакона.

3. инкубируют флакон при 37 ⁰ C. между 5-ой и 7-ой минутами инкубации отбирают из флакона раствор, содержащий отщепленные от клеток фрагменты поверхностных белков. опухолевые клетки в момент отбора раствора должны быть прикреплены к дну культурального флакона. если под воздействием трипсина часть клеток открепилась и стала свободно плавать, то ростовую среду надо отцентрифугировать при 400 g в течение 5 мин и использовать супернатант свободный от примеси клеток. 4. для инактивации остатков трипсина в культуральном флаконе добавляют свежеприготовленную культуральную среду, содержащую фетальную бычью сыворотку и продолжают культивирование клеток при 37 ⁰ C и 5% CO ₂ .

5. раствор, полученный в пункте Nаз анализируют масс-спектрометрически и сравнивают со спектром полученным аналогичным образом (пп. 1-4), но ранее для свежевыделенных опухолевых клеток.

масс-спектрометрический анализ проводят по протоколу масс-спектрометрии гликозилированных пептидов (таjiri M. еt аl., "Diffеrепtiаl апаlуsis оf sitе-sресifiс glусапs on рlаsmа апd сеllulаr fibrопесtiпs: аррliсаtiоп оf а hуdrорhiliс аffiпitу mеthоd fоr glусорерtidе епriсhmепt", Glусоbiоlоgу, 2005, v.15, 1332-1340). это объясняется с одной стороны тем, что внеклеточные фрагменты белков, как правило, гликозилированы, с другой стороны, именно гликозилированные фрагменты поверхностных белков опухолевых клеток наиболее иммуногены и являются вероятными антигенами вакцины (см., например, Franco A., "стL-ваsеd сапсеr рrеvепtivе/тhеrареutiс Vассiпеs fоr саrсiпоmаs: RoIe оf тumоur-аssосiаtеd саrbоhуdrаtе апtigепs", Sсапd. J. Immuпоl., 2005, v.61, 391-397).

140 мкл анализируемого раствора фрагментов поверхностных белков смешивают со 140 мкл этанола, 720 мкл бутанола и добавляют 15 мкл сефарозы CL4B. инкубируют при медленном перемешивании 45 мин. после инкубации сефарозу дважды промывают раствором с тем же содержанием спирта и бутанола и инкубируют 30 мин в 50%-oм растворе этанола. раствор этанола отбирают от сефарозы и высушивают на роторном испарителе. полученный осадок растворяют в 10 мкл воды и анализируют времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрией. 2 мкл

анализируемого раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором 2,5-диrидpoкcибeнзoйнoй кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 1000 до 4000 да.

согласно полученным данным, при повторном (контрольном) масс- спектрометрическом анализе культуры клеток воспроизводится не менее 95% масс фрагментов белков, что можно считать критерием идентичности двух сравниваемых клеточных препаратов. предлагается оценивать пригодность клеточного препарата для вакцинации больного на основе идентичности не менее 90% общих масс фрагментов белков у анализируемых клеток и свежевыделенных опухолевых клеток донора.

на фиг. за показан времяпролетный спектр белковых фрагментов и соответствующий футпринт, полученные согласно второму варианту реализации изобретения со свежевыделенных опухолевых клеток рака толстого кишечника человека. на фиг. зб показан масс-спектр и соответствующий футпринт тех же самых клеток, размноженных культивированием (1-ый пассаж) и пригодных для противоопухолевой вакцинации. снятый с них спектр идентичен исходному спектру, полученному со свежевыделенных опухолевых клеток. на фиг. зв представлен масс- спектр тех же самых клеток, размноженных культивированием (2-ой пассаж), но уже не пригодных для противоопухолевой вакцинации. в процессе культивирования произошли существенные изменения в поверхностных белках клеток (см., например, область 1800-2000 да футпринта на фиг. зв), что позволило считать их неидентичными клеткам исходной опухоли донора.

в случае использования протеазы для диссоциации ткани опухоли, с целью высвобождения опухолевых клеток, необходимо проводить масс-спектрометрический анализ для получения образца футпринта исходной (неизмененной) культуры клеток не раньше чем через сутки после инициации опухолевой культуры, чтобы клетки успели восстановить поврежденные при выделении поверхностные белки.

совокупность масс фрагментов поверхностных белков является своеобразным

"штрих-кодом", т.е. показателем, наиболее объективно характеризующим клетки.

поэтому контроль наличия качественных характеристик у исследуемой клеточной культуры путем сравнения совокупности полученных масс фрагментов поверхностных белков ее клеток с совокупностью масс-спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками дает возможность наиболее точно произвести отбор качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток.

применение при реализации способа масс-спектрометрического анализа позволяет определять качество клеточной культуры достаточно быстро - в течение не более 2-х часов. это позволит использовать его для оценки качества готовых клеточных препаратов перед их применением, учитывая малый срок их годности с момента изготовления (несколько часов).

кроме этого полученные масс-спектры могут быть преобразованы с возможностью численного выражения результатов анализа, что необходимо для реализации стандарта GMP ₅ исключающего человеческий фактор при проведении оценки качества культуры клеток, и позволит обеспечить необходимую объективность результатов.

точность определения наличия качественных характеристик у исследуемой культуры клеток при реализации патентуемого способа обеспечивается также за счет использования живых клеток исследуемой клеточной культуры, которые подвергают витальному воздействию протеазы. клетки при обработке витальным воздействием протеазы не погибают, что дает возможность избежать загрязнения анализируемых проб мажорными белками цитоплазмы клетки и значительно уменьшить расход клеточного материала при анализе культуры клеток.

загрязнения анализируемых проб позволяет избежать также предварительная промывка клеток, которая необходима для удаления следов сыворотки, содержащейся в ростовой среде.

промышленная применимость

таким образом, патентуемый способ позволяет охарактеризовать клетки по наиболее актуальным, в том числе и для клеточной трансплантологии, поверхностным белкам.