Vorrichtung und Nanowellarrav

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Vorrichtung zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarravs sowie Nanowellarravs.

Viele (rekombinante) Proteine, wie beispielsweise pharmazeutische Wirkstoffe, werden in eukaryotischen Zellen produziert. Im Gegensatz zu prokaryotischen Expressionssystemen zeichnen sich eukaryotische Expressionssysteme, wie Hefen, Insektenzellen und

Säugerzellen, u.a. durch ihre Fähigkeit aus, posttranslationale Modifikationen vorzunehmen, die von entscheidender Bedeutung für die biologische Aktivität einer Vielzahl von Proteinen sind.

Der erste Schritt bei der Produktion (rekombinanter) Proteine im industriellen Maßstab ist die Generierung stabiler Produktionszelllinien. Gängige Produktionszellen sind Hybridomazellen (Produktion monoklonaler Antikörper) oder, zur Produktion rekombinanter Proteine, genetisch modifizierte Zellen, wie beispielsweise Ovarialzellen chinesischer Hamster (CHO) oder humane embryonale Nierenzellen (HEK-293 bzw. HEK-293T). Bei Hybridomazellen handelt es sich um Fusionen aus Plasmazellen und immortalisierten Myelomzellen, die den für die jeweilige Plasmazelle spezifischen Antikörper produzieren. Die Plasmazellen werden aus der Milz von Tieren gewonnen, die mit einem Antigen von

Interesse immunisiert wurden. Nach der Fusion von Plasmazellen und Myelomzellen erhält man eine heterogene Population von Hybridomazellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität (gegen das zur Immunisierung verwendete Antigen) bzw. anderer Spezifität produzieren. Zudem unterscheiden sich die Zellen in ihrer Produktivität.

Für die Produktion rekombinanter Proteine wird ein Transgen, welches das Protein von Interesse kodiert, in geeignete Zellen, z.B. CHO oder 293T, eingebracht (bspw. mittels Transfektion). Die Integration des Transgens erfolgt bei den konventionellen Verfahren zufällig in das Genom der Wirtszelle. Dabei beeinflusst der Integrationsort durch benachbarte endogene regulatorische Elemente (Enhancer, Silencer, Chromatinstruktur, etc.) stark die Promoteraktivität und somit die Transkriptionsrate des Transgens. Zudem ist die Kopienzahl des Transgens in einer Zelle (Zahl der Integrate nach der Transfektion beziehungsweise Gen-Amplifikation) entscheidend für dessen Expressionsstärke. Nach der Transfektion erhält man daher einen Pool von Zellen unterschiedlicher spezifischer Produktivität, d.h. Zellen, die eine individuell spezifische Produktion des gewünschten Produktes zeigen. War die Transfektion erfolglos oder erfolgte ein sogenanntes Gen-Silencing, werden keine der gewünschten Produkte hergestellt und die spezifische Produktivität ist Null.

Um bei der biotechnologischen Herstellung des (rekombinanten) Proteins die maximale Ausbeute zu erzielen, ist es essentiell, aus dem Pool von Hybridomazellen bzw. transgener Zellen diejenigen Zellen mit hoher spezifischer Produktivität als Ausgangsmaterial für die Generierung einer Zelllinie zu selektieren.

Häufig besteht die Anforderung, dass es sich bei den Produzentenzellen um einen Zellklon handeln muss, d.h. um Zellen, die durch Zellteilung aus einer einzelnen Ausgangszelle hervorgegangen und genetisch identisch sind. Der Zellklon von Interesse sollte sich dabei zudem durch eine hohe Proliferationskapazität sowie die Stabilität der (rekombinanten) Proteinexpression auszeichnen. Nach derzeitigem Stand der Wissenschaft werden zur Generierung neuer monoklonaler Zelllinien hauptsächlich die nachfolgend erläuterten drei Verfahren genutzt:

1 ) Einzelzellklonierung mittels Limiting Dilution,

2) Einzelzellklonierung in semi-solidem Medium und

3) Einzelzellklonierung basierend auf Durchflusszytometrie.

Limiting Dilution

Bei diesem Verfahren wird eine Suspension von Hybridomazellen, genetisch veränderten Zellen (gewöhnlich nach Selektion auf Antibiotikaresistenz) oder natürlicherweise ein Protein von Interesse produzierender Zellen in verschiedenen Verdünnungsstufen ausgesät. Als Ausgangspunkt der Zelllinienherstellung dient die sogenannte Grenzverdünnung, bei der statistisch eine einzelne oder keine Zelle pro Well einer 96- oder 364-Well-Platte vorliegt. Nach der Transfektion der Zellen im gängigen Labormaßstab liegen ca. 10 ⁷ Zellen zur Verteilung vor. Hieraus wird ersichtlich, welche große Anzahl an Well-Platten beschickt, kultiviert und ausgewertet werden müssen. Aus den Einzelzellen lässt man in Folge unter geeigneten Kulturbedingungen Zellklone wachsen, die anschließend hinsichtlich ihrer (spezifischen) Produktivität, Wachstumsrate und Stabilität charakterisiert werden. Die Charakterisierung kann dabei beispielsweise durch eine Analyse des Zellkulturüberstandes mittels ELISA erfolgen. Das Verfahren der Limiting-Dilution ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Außerdem ist ein hoher Materialaufwand, beispielsweise von Zellkulturplatten und anderen

Verbrauchsmaterialien, Medien, etc. erforderlich. Um für die Zelllinienentwicklung, wie gemeinhin vorgeschlagen, mindestens 1000 (genetisch modifizierte) Einzelzellen bzw. die daraus hervorgegangenen Zellklone screenen, d.h. identifizieren und analysieren, zu können, müssten bei der üblichen Aussaatdichte von 0,5 Zelle/Well in einem ersten Schritt beispielsweise mindestens 21 Platten mit 96 Wells oder sechs 384-Well-Platten befüllt werden. Oft wird auch eine Aussaatdichte von 0, 1 Zelle/Well gewählt, was die Zahl der benötigten Zellkulturplatten entsprechend steigert. Zudem erfolgt die Aussaat zumeist parallel in mehreren Verdünnungen. Alle ausgesäten Zellen werden in der Folge kultiviert und propagiert, da keine Charakterisierung und Selektion auf Einzelzellebene stattfindet. Ohne zusätzliche und nachvollziehbar dokumentierte mikroskopische Überwachung der Zellproliferation ab dem Zeitpunkt der Aussaat, müssen meist zwei Runden der Limiting Dilution durchgeführt werden, um beispielsweise die Anforderungen behördlicher

Zulassungsverfahren zu erfüllen. Dies ist nötig, da einzelne Wells nach der Aussaat der Zellsuspension mehr als eine Ausgangszelle enthalten können und dient dem Ausschluss daraus resultierender nicht-monoklonaler Zelllinien.

Einzelzellklonierung in semi-solidem Medium

Bei diesem Ansatz werden Zellen in semi-solides Medium, wie beispielsweise

Methylzellulose, eingesät. Die Zellen werden in dem viskosen Medium immobilisiert und können zu Kolonien heranwachsen, die anschließend isoliert werden können. Da eine Kolonie aus einer Einzelzelle entstanden sein oder auch auf zwei oder mehrere eng benachbarte Zellen zurückgehen kann, fehlt bei dieser Methode jedoch ein eindeutiger Nachweis der Monoklonalität. Zudem sind Visualisierungen von Einzelzellen am Tag der Aussaat schwierig, da beispielsweise nicht alle Zellen in der Fokusebene einer zur

Erfolgskontrolle der Aussaat verwendeten optischen Vorrichtung liegen.

Die spezifische Produktivität der Produzentenzellen kann jedoch einfach durch geeignete Immundiffussionstests charakterisiert werden. Diese beruhen auf der Präzipitation des Produktes, welches um den Produzentenzellklon herum in das semi-solide Medium diffundiert. Eine Charakterisierung ist beispielsweise unter Einsatz Fluorochrom-konjugierter Antikörper möglich. Die Größe eines sich um die Produzentenzelle bildenden Präzipitatrings korreliert dabei mit der Menge des sekretierten Produktes und erlaubt demnach eine

Bewertung der Produktivität eines Zellklons unter Berücksichtigung der Größe des Zellklons.

Einzelzellklonierung basierend auf Durchflusszytometrie

In diesem Verfahren zur Einzelzellklonierung werden einzelne Zellen mit Hilfe eines Sorters gezielt aus einer Zellsuspension isoliert und anschließend separat in Kavitäten (Wells) einer Zielplatte abgelegt. Dabei wird eine Einzelzelle in jedes Well beispielsweise einer 96- bzw. 384-Well-Platte eingebracht. Die Zielzellen werden anhand ihrer Fluoreszenz, die auf der Expression von Reportergenen bzw. Anfärbung von Oberflächen-Antigenen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern beruhen kann, von anderen Zellen unterschieden. In den Wells der Zielplatten wachsen die Einzelzellen anschließend zu Zellklonen heran. Einen Vorteil dieses Verfahrens stellt der hohe Durchsatz dar, der bei der Isolation von Produzentenzellen durch den Sorter erzielt werden kann. Bis zu 5 x 10 ⁷ Ausgangszellen können in 30 min sortiert werden. Zudem sind eine Fluoreszenz-basierte Auswertung der Produktivität der Zelle und die gezielte Isolation von Zellen mit gewünschten Eigenschaften möglich. Da das Verfahren allerdings nicht so schonend wie die vorher beschriebenen Alternativen ist, kann es zur Beeinträchtigung der Viabilität isolierter Zellen kommen. Zudem erfolgt die Zellsortierung nicht unter sterilen Bedingungen, sodass der Einsatz von Antibiotika unabdingbar ist, um das Kontaminationsrisiko zu verringern. Kritisch für den Erfolg des Verfahrens sind auch die vorgenommenen Einstellungen des verwendeten Sorters. Die als optimal angesehen Einstellungen (z. B. Gating, Kompensation, etc.) sind probenspezifisch und werden anhand eines Teils der vorliegenden Probe, beispielsweise der Zellsuspension, vorgenommen. Die darin befindlichen Zellen, möglicherweise auch die Zielzellen, werden verworfen, sodass sie weder für die Isolation noch für Folgeschritte zur Verfügung stehen. Aber auch nach der initialen Definition geeigneter Parameter gehen Zellen unwiederbringlich verloren. Der Verlust möglicher Zielzellen während des gesamten Sortiervorganges wird mit bis zu 50% angegeben. Eine weitere Schwierigkeit besteht darin sicherzustellen, dass wirklich Einzelzellen und keine Aggregate aus zwei oder mehreren Zellen bzw. mehrere Einzelzellen in einem Tropfen isoliert werden. Der Nachweis der erfolgreichen

Einzelzellablage kann nur durch die mikroskopische Betrachtung der Zielplatten erbracht werden. Ohne diese Kombination der Einzelzellklonierung mittels Durchflusszytometrie mit der Mikroskopie ist kein Monoklonalitätsnachweis möglich.

Allen drei Standardverfahren ist gemein, dass die Monoklonalität der jeweiligen Zelllinie nicht eindeutig nachgewiesen werden kann. Außerdem ist der Zeit und Materialaufwand bei der Herstellung monoklonaler Zelllinien hoch.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Verfahren vorzuschlagen, das für die Herstellung monoklonaler Zelllinien geeignet ist. Außerdem soll mit der Erfindung eine Vorrichtung vorgeschlagen werden, mit der das Verfahren ausführbar ist.

Die Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens durch den Gegenstand des Anspruchs 1 und hinsichtlich der Vorrichtung durch die Merkmale des Anspruchs 12 gelöst. Ein in dem

Verfahren verwendbares und mit der Vorrichtung nutzbares Nanowellarray ist Gegenstand der Anspruchs 16. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der nebengeordneten und der abhängigen Ansprüche.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Verifizierung des Erfolgs von

Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays und umfasst mehrere Schritte.

In einem Schritt erfolgt ein Beleuchten eines mit einzelnen biologischen Zellen besäten Nanowellarrays, wobei das Nanowellarray eine Anzahl von Nanowells aufweist, in denen unmittelbar nach der Aussaat, gegebenenfalls nach anschließend erfolgenden

Waschschritten, jeweils höchstens eine biologische Zelle enthalten sein soll. Das

Nanowellarray wird mit mindestens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung beleuchtet. Eine durch die Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung bewirkte

Detektionsstrahlung wird ortsaufgelöst (2D) als Bilddaten erfasst. Dabei dient eine

Beleuchtungsstrahlung der Beleuchtung des Nanowellarrays, ohne dabei die Zellen oder deren Bestandteile zu verändern. Eine Anregungsstrahlung dient dazu, anregbare Moleküle und/oder Stoffgemische zu verändern und beispielsweise zur Emission einer

Fluoreszenzstrahlung anzuregen. Eine Detektionsstrahlung kann durch reflektierte Anteile der Beleuchtungsstrahlung und/oder der Anregungsstrahlung sowie durch Strahlung gegeben sein, die aufgrund der Anregungsvorgänge emittiert wird. Es ist auch möglich, die Detektionsstrahlung durch die Probe hindurch zu erfassen (Durchlichtverfahren).

Im Sinne der Beschreibung werden Vertiefungen zur Aufnahme von Proben als Nanowells bezeichnet, wenn deren Volumen kleiner als 1 mm ³ (1 μΙ) ist. Vertiefungen zur Aufnahme von Proben, wie diese beispielsweise auf 384-Well-Mikrotiterplatten (ca. 40 μΙ Volumen pro Well) oder 1536 (ca. 10 μΙ Volumen pro Well) ausgebildet sind, werden als Wells oder Makrowells bezeichnet.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgelagert können die Schritte des Aussäens von Einzelzellen auf dem Nanowellarray sowie das Spülen des Nanowellarrays sein. Der letztere Schritt dient dazu, Zellen außerhalb der Nanowells und/oder überzählige Zellen in den Nanowells zu entfernen.

In einem Schritt werden sogenannte Produktionszellen als Einzelzellen in dem

Nanowellarray ausgesät. Bei den Produktionszellen kann es sich beispielsweise um

Hybridomazellen, durch Transfektion, Transduktion beziehungsweise Transformation genetisch veränderte Zellen oder natürlicherweise ein Protein von Interesse- exprimierende Zellen handeln. Die Zellen liegen für die Aussaat in Suspension vor oder werden, im Fall adhärenter Zellen, vor der Aussaat mechanisch, enzymatisch oder unter Zuhilfenahme entsprechender Puffer abgelöst und in Suspension gebracht. Eine Vereinzelung der Zellen kann auch mithilfe siebartiger Vorrichtungen wie Netzen aus Nylon erreicht werden. Alle zur Verfügung stehenden Zellen werden im Nanowellarray ausgesät. In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens können simultan auch Produktionszellen auf mehreren Nanowellarrays ausgesät werden. Dabei können mehrere Nanowellarrays angeordnet und besät werden und/oder die von einem der Nanowellarrays weggewaschenen Zellen werden auf einem anderen Nanowellarray ausgesät. Die Aussaat der Zellen in den Nanowellarray kann manuell oder mit einer Vorrichtung erfolgen und Kipp- bzw. Schwenkbewegungen, Zentrifugationsschritte und Waschschritte umfassen. Die weiter unten beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Aussaat von Zellen auf einem Nanowellarray ausgebildet sein und beispielsweise über eine

Pipettiereinheit verfügen und mit einem Zellsieb in Verbindung stehen.

In den jeweiligen Nanowells wird nach der Aussaat das Vorhandensein wenigstens einer Zelle erwartet, so dass jeweils auch von einem Erwartungsbereich gesprochen werden kann. Die Zwischenräume zwischen den Nanowells, die beispielsweise durch Stege zwischen den Nanowells oder durch einen Rand des Nanowellarrays gegeben sind, stellen keine

Erwartungsbereiche dar. In der Praxis ergibt sich oft eine Verteilung der Nanowells mit einer Zelle, mit mehreren Zellen und mit leeren Zellen, die mittels einer

Wahrscheinlichkeitsverteilung, beispielsweise einer Gaußfunktion, beschrieben werden kann. Die erwartete Anzahl von einer Zelle je Nanowell entspricht einer idealen Aussaat. Sind Nanowells mit mehr als einer Zelle und/oder leere Nanowells vorhanden, kann eine erwartete oder erwünschte Belegung der Nanowells mit je einer Zelle nachträglich mittels der unten ausgeführten Korrekturschritte herbeigeführt werden.

Um zu bewerten, welche der Nanowells nur eine einzige Zelle beinhaltet, wird das beladene Nanowellarray beleuchtet. Die Verteilung der Zellen wird dabei beispielsweise mittels einer Hellfeldbeleuchtung und ggf. anhand von Fluoreszenzaufnahmen erfasst und analysiert. Im Hellfeld werden die Nanowells selbst als auch Einzelzellen in den Nanowells detektiert. Die so erhaltenen Bilddaten werden hinsichtlich der Position der Nanowells als auch des

Vorhandenseins genau einer Zelle in den jeweiligen Nanowells ausgewertet. Außerdem werden die Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins von Zellen in Zwischenräumen zwischen den Nanowells ausgewertet. Sollten sich Zellen in den Zwischenräumen zwischen den Nanowells befinden, werden auch diese in dem Schritt detektiert und benachbarte Nanowells können für die Isolation ausgeschlossen werden, um der Aufnahme von mehr als einer Zelle vorzubeugen. Eine ortsaufgelöste Erfassung der Detektionsstrahlung bezieht sich auf eine mögliche

Ermittlung und Angabe von zweidimensionalen Koordinaten eines jeweiligen Ortes, von dem ausgehende Detektionsstrahlung erfasst wurde. Insbesondere ist es möglich,

zweidimensionale Koordinaten einer Detektionsstrahlung emittierenden Zelle zu erfassen und anzugeben.

Die Positionen derjenigen Nanowells, in denen nicht genau eine Zelle vorhanden ist sowie derjenigen Zwischenräume, in denen Zellen vorhanden sind, werden abgespeichert und erhalten eine Identität (nachfolgend auch kurz: ID), beispielsweise in Form einer Nummer, eines Koordinatenpaares und optional weiterer ID-Parameter wie Versuchsnummer, Bezeichnung der Zellen, Labornummer des Versuchs/ der Zelle etc.. Zusätzlich können die Positionen derjenigen Nanowells gespeichert werden, in denen genau eine Zelle und/oder keine Zelle vorhanden ist.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens werden Nanowells ohne Zellen und/oder Nanowells mit mehr als einer Zelle und/oder Nanowells, die an Zwischenräume angrenzen, in denen Zellen detektiert worden sind, identifiziert, deren ID erfasst und deren Positionen abgespeichert. Die so identifizierten Nanowells werden von nachfolgenden

Verfahrensschritten ausgeschlossen. Dadurch ist vorteilhaft erreicht, dass weder leere Nanowells noch Nanowells mit mehr als einer Zelle für nachfolgende Schritte verwendet werden. Es werden daher Zustellbewegungen von Entnahmevorrichtungen zu leeren Nanowells vermieden beziehungsweise werden keine Nanowells angefahren, die mit Sicherheit nicht die Anforderungen an eine Monoklonalität ihres Inhalts erfüllen. Mit einer solchen Ausgestaltung werden Zeit, Energie und Verbrauchsmaterial wie Pipetten gespart. In einer möglichen Weiterbildung des Verfahrens werden Nanowells, in denen nach der Aussaat mehr als eine Zelle vorhanden ist, und/oder Zellen in Zwischenräumen eine Entnahmevorrichtung, z. B. eine Pipette, zugestellt. Mittels der Entnahmevorrichtung und einer entsprechende Ansteuerung derselben werden zuvor mittels einer

Auswerteeinheit (s.u.) überschüssige Zellen, vorzugsweise einzeln, aus den betreffenden Nanowells und/oder Zwischenräumen entnommen. Mit dieser Verfahrensausgestaltung können fehlerhaft angesäte Nanowells und Zwischenräume erkannt und der jeweilige Aussaatfehler korrigiert werden. Die entnommenen Zellen können verworfen werden. Besser ist es aber, wenn die entnommenen Zellen weiterverwendet werden können. Dazu wird vorgeschlagen, dass nach der Aussaat leer gebliebene Nanowells identifiziert und deren Position ermittelt werden. In diese bis dato leeren Nanowells werden entnommene Zellen einzeln abgelegt.

Die vorgenannten Ausgestaltungen des Verfahrens werden durch entsprechende

Steuerprotokolle und Bild- und/oder Videoaufnahmen nachvollziehbar dokumentiert und so abgespeichert, dass eine nachträgliche Verifikation der ausgeführten Verfahrensschritte möglich ist und deren jeweilige Erfolge eindeutig nachvollzogen werden können.

Um die Vorteile der vorstehenden Verfahrensvarianten zu erzielen ist es vorteilhaft, wenn die abgespeicherten Positionen der Nanowells ohne Zellen und/oder Nanowells mit mehr als einer Zelle und/oder Nanowells, die an Zwischenräume angrenzen, in denen Zellen detektiert worden sind, dazu verwendet werden, um in Abhängigkeit von diesen Positionen

Steuerbefehle für nachfolgende Verfahrensschritte zu generieren oder anzupassen.

Beispielsweise werden die Steuerbefehle zur Ansteuerung der Entnahmevorrichtung entsprechend angepasst. Um bestimmte gewünschte physiologische Reaktionen der Zellen auszulösen oder zu unterstützen, wird das Nanowellarray vorteilhaft unter Kulturbedingungen gehalten, bei denen die gewünschten physiologischen Reaktionen der Zellen ermöglicht werden. Solche physiologischen Reaktionen sind beispielsweise das Überleben, das Wachstum und/oder die Proliferation der Zellen. Es können darüber hinaus oder stattdessen beispielsweise auch die Expression und Sekretion bestimmter Stoffe wie Peptide, Proteine, Hormone,

Wachstumsfaktoren und dergleichen als gewünschte physiologische Reaktionen ermöglicht und unterstützt werden.

Die Zellen liegen nach der Aussaat und nach einer eventuellen Vereinzelung jeweils allein in einem Nanowell. Die Nanowells mit den Zellen können mit einem Medium, beispielsweise einem Nährmedium, überschichtet werden, so dass eine Kommunikation der Zellen untereinander möglich ist. Eine solche Kommunikation kann vorteilhaft die Proliferationsrate erhöhen und somit die Effizienz des Verfahrens steigern. Die Schritte des Verfahrens können in einem sterilen, den Bedürfnissen der Zellen angepassten Umfeld stattfinden, indem beispielsweise gewünschte Temperaturen, definierte Gasgehalte wie ein definierter CO2- und/oder 02-Gehalt sowie eine bestimmte Luftfeuchte geregelt sind.

Soll die Isolation der Zellen anhand ihrer spezifischen Produktivität erfolgen, muss die Produktion des Proteins von Interesse visualisierbar sein und der Zielzelle zugeordnet werden können. Im Fall produktiver transgener Zellen kann die Detektion dabei u.a. auf der zusätzlichen Produktion von Reporterproteinen durch die Zielzellen beruhen. Bei dieser Methode wurde vorab zusätzlich zu der Sequenz, die das rekombinante Protein kodiert, die kodierende Sequenz eines Reporterproteins, welches später detektiert wird, in die Zelle eingebracht. Die Expression beider Gene muss korrelieren.

Alternativ wird die Präsenz des (sekretierten) Proteins direkt nachgewiesen. Dabei können Oberflächenproteine, bspw. B- und T-Zell-Rezeptoren, direkt über immunologische

Verfahren nachgewiesen werden. Im Fall sekretierter Proteine erfolgt eine Immobilisierung des sekretierten (rekombinanten) Proteins in räumlicher Nähe der Produzentenzelle (bspw. durch eine Beschichtung der Nanowellstruktur oder über Antigen-Antikörper- oder andere Protein-Protein-Interaktionen).

Es ist möglich, dass von der Zelle abgegebene Stoffe und/oder Stoffgemische in dem Well und/oder neben dem Well mittels für die nachzuweisenden Stoffe und/oder Stoffgemische spezifischen Bindungspartnern wenigstens anteilig gebunden werden. Proteine können auch einen Tag aufweisen, der gebunden werden kann. Das Protein von Interesse kann nun mittels immunologischer Verfahren nachgewiesen werden und resultiert in einem distinkten, messbaren Signal (bspw. Fluoreszenz; Lumineszenz). Eine solche Immobilisierung der abgegebenen, beispielsweise sekretierten, Stoffe bzw. Stoffgemische in räumlicher Nähe der jeweiligen Zelle ermöglicht eine Bewertung der Produktivität der betreffenden Zelle oder eines aus der Zelle vorvorgegangenen Zellklons.

Die Detektion der spezifischen Produktivität von Einzelzellen, kann auf der Detektion des (sekretierten), (rekombinanten) Proteins beruhen. Dazu geeignet sind beispielsweise über Fluorochrom-gekoppelte Antikörper wie Fluorochrom-gekoppelte Detektionsantikörper oder unmarkierter Detektionsantikörper und Fluorochrom-gekoppelte Sekundärantikörper. Des Weiteren über Enzym-gekoppelte Antikörper (Enzym-gekoppelte Detektionsantikörper oder unmarkierter Detektionsantikörper und Enzym-gekoppelte Sekundärantikörper); über die Interaktion des Proteins von Interesse mit andere Bindungspartnern (bspw. dem Antigen, für das ein sekretierter Antikörper spezifisch ist) und deren Detektion (Fluorochrom-gekoppelte Antikörper, Enzym-gekoppelte Antikörper) sowie über andere Detektionskaskaden, bspw. biotinylierter Detektionsantikörper und Enzym-gekoppeltes Avidin.

Die Signalintensität der Zelle bzw. des Zellklons oder im Nanowell (Fluoreszenz,

Chemilumineszenz, ein messbarer Farbumschlag bei enzymatischer Umsetzung

chromogener Substrate) wird durch eine Bilderfassungsvorrichtung erfasst. Die

Signalintensität lässt Rückschlüsse auf die Menge des produzierten (rekombinanten) Proteins zu und wird analysiert, um Hochproduzenten von Produzenten und NichtProduzenten zu unterscheiden. Abhängig von der gewählten Detektionsmethode können Fluoreszenzaufnahmen die

Detektion von Zielzellen, die das (rekombinante) Protein produzieren, ermöglichen. Da das Fluoreszenzsignal in diesem Fall mit der Menge des produzierten Zielproteins korreliert, kann die Vorrichtung durch eine Quantifizierung der Fluoreszenzsignalintensität

Hochproduzenten erkennen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren beziehungsweise einer seiner Ausgestaltungen kann eine Erfassung und Auswertung von Fluoreszenzsignalen und die Quantifizierung der Produktivität von Zellen oder Zellklonen bereits kurz nach der Aussaat erfolgen. Dadurch ist eine frühzeitige Auswertung der Signale der ausgesäten Zellen bzw. der sich entwickelnden Zellklone möglich. In weiteren Schritten des Verfahrens werden ausgewählte Zellen oder aus einer einzelnen Zelle hervorgegangene Zellklone aus den jeweiligen Wells automatisiert entnommen und einzeln weiter kultiviert, so dass später monoklonale Zelllinien erhalten werden.

Solche Einzelzellen oder Zellklone werden vorteilhaft anhand ihrer spezifischen Produktivität, vorzugsweise automatisiert, für den Isolationsprozess ausgewählt. Anschließend werden die ausgewählten Einzelzellen bzw. Zellklone gezielt von der Vorrichtung isoliert und in einem Zielgefäß abgelegt. Der Isolationsprozess wird dabei vorteilhaft durch die Aufnahme von Bildern vor und nach der Ernte der Zielzelle sowie eines Erntevideos dokumentiert. Bei dem Zielgefäß kann es sich bspw. um ein weiteres Nanowellarray oder eine konventionell genutzte Mikrotiterplatte bspw. 96- oder 384-Well-Platte handeln. Von Vorteil ist es, wenn das Zielgefäß vorab daraufhin untersucht wurde, ob dieses noch keine Zellen enthält und dessen Nanowells beziehungsweise Wells leer sind. Eine solche Kontrolle kann

beispielsweise unter Verwendung eines bildgebenden Verfahrens erfolgen und dokumentiert werden. Ist dies nicht der Fall, sind die Wells also nicht nachweislich leer, werden die entsprechenden Wells des Zielgefäßes als Zielwells ausgeschlossen. Um den hohen Anforderungen an den Nachweis der Monoklonalitat von Zelllinien gerecht zu werden, können die physiologischen Reaktionen dokumentiert werden, wobei Wachstumsund Proliferationsprozesse beispielsweise im Hellfeld erfasst und gemessen werden. Dabei können die Zelldichte sowie die Anzahl und Größe der Zellen bzw. Zellklone als Parameter verwendet werden. Eine Produktion von Stoffen durch die Zelle bzw. den Zellklon kann anhand markierter Antikörper, insbesondere Fluorochrom-markierter Antikörper, Enzymmarkierter Antikörper, spezifischer Interaktionen von produzierten Stoffen, Nanobodies, scFv-Antikörper (single chain variable Fragment-Antikörper), DARPin (Designed Ankyrin Repeat Proteins) und/oder Stoffwechselvorgängen der jeweiligen Zelle erfasst und ausgewertet werden.

Die Proliferation der Einzelzelle zum Zellklon wird durch die Aufnahme von Bildern in regelmäßigen Abständen (z. B. täglich) beispielsweise durch eine Bilderfassungseinheit dokumentiert. Der Zellklon wird anschließend mittels geeigneter Analysemethoden hinsichtlich seiner spezifischen Produktivität, der Stabilität der (rekombinanten)

Proteinproduktion und seiner Wachstumsrate charakterisiert.

Das Verfahren erlaubt vorteilhaft eine umfassende Dokumentation aller ausgeführten Schritte. So können in einem automatisierten Dokumentationsschritt im selben

Probenbehälter, insbesondere im selben Nanowellarray, die Bilderfassung, der Nachweis der Monoklonalität, die Detektion von Proliferation und Produktion, darauf basierend die Auswahl und Isolation von Einzelzellen oder Zellklonen aus den Nanowells des Nanowellarrays sowie der Transfer der detektierten und anhand von Proliferations- und/oder Produktionskriterien ausgewählten Zellen in ein Zielgefäß erfolgen. Ebenso kann die Zellabgabe in das Zielgefäß und die Proliferation der Einzelzelle im Zielgefäß dokumentiert werden. Die Dokumentation kann dabei mit der Bilderfassungseinheit oder mit einer zusätzlichen Dokumentationseinheit, die zur Bilderfassung und Speicherung von Bilddaten ausgebildet ist, erfolgen. Die

Einstellungen der Vorrichtung für die Detektion und Ernte werden automatisch gespeichert. Es können Bilder des Nanowellarrays vor und nach dem Picken (Isolation) und des

Zielgefäßes vor und nach der Zellablage aufgenommen werden.

Für die Detektion der spezifischen Produktivität von Einzelzellen ist im Fall sekretierter Proteine die Immobilisierung des (rekombinanten) Proteins in räumlicher Nähe bzw. an der Produzentenzelle unabdingbar. Dies kann geschehen über:

- die Wellstruktur, die ein Wegdiffundieren des (rekombinanten) Proteins aus dem Nanowell verhindert; - Überschichtung der Nanowells mit semi-solidem Medium, welches ein Wegdiffundieren des (rekombinanten) Proteins aus den Nanowells verhindert;

- Beschichtung der Nanowells mit Interaktionspartnern des (rekombinanten) Proteins;

- Antigen bzw. Antikörper;

- antikörperbindende Proteine wie Protein L, Protein A, Protein G;

- Antigen bzw. Antikörper (inklusive Einzeldomänenantikörper wie Nanobodies);

andere Interaktionspartner:

- diverse Linker zwischen sekretiertem Protein und Produzentenzelle, ggf. auch nach Modifikation der Zielzelle;

- künstliche, antigen-bindende-Proteine, wie beispielsweise DARPins, scFv-Fragmente, Monobodies, Affiline, Anticaline, Avimere, Affibodies;

- Biotinylierung der Zellen und Avidin-gekoppelte Antikörper gegen das (rekombinante) Protein;

- bispezifische Antikörper, die ein Antigen auf der Zelloberfläche und das sekretierte Protein binden;

andere Linker:

- induzierbarer Wechsel zwischen membrangebundener Form des Proteins und der sekretierten Form, wie dies beispielsweise aus den Publikationen von Yu et al. (2014;

Antibody-membrane switch (AMS) technology for facile cell line development. Protein Eng Des Sei (10):309-15) und Chuang et al. (2014; High-Throughput Sorting of the Highest Producing Cell via a Transiently Protein-Anchored System. PLoS ONE 9(7): e102569) bekannt ist.

Die Aufgabe wird ferner mit der bereits erwähnten Vorrichtung gelöst. Diese dient zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays und ist dafür vorgesehen, in einem Verfahren zur Generierung monoklonaler Zelllinien verwendet zu werden. Die Vorrichtung umfasst eine Bilderfassungseinheit, die zur Erfassung von Bilddaten eines in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays ausgebildet ist. Weiterhin sind eine Beleuchtungseinheit zur Bereitstellung wenigstens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung und Mittel zur gesteuerten Beleuchtung der Probe mit der wenigstens einen Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung Teil der Vorrichtung. Die

Bilderfassungseinheit ist derart konfiguriert, dass auf dem Nanowellarray

Erwartungsbereiche mit erwartetem Vorhandensein je einer Probe, insbesondere je einer Zelle, festgelegt oder verifiziert werden können, indem erfasste Bilddaten der betreffenden Erwartungsbereiche mittels einer Auswerteeinheit der Vorrichtung ausgewertet werden können. Dies umfasst die automatische Detektion der Nanowells als Erwartungsbereiche. Außerdem ist die Bilderfassungseinheit derart ausgebildet, dass auf dem Nanowellarray Zwischenräume festgelegt, detektiert oder verifiziert werden können, in denen keine Proben erwartet werden. Nach dem Beleuchten des Nanowellarrays kann eine ortsaufgelöste Erfassung einer durch die Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung bewirkten

Detektionsstrahlung erfolgen, wozu die Bilderfassungseinheit einen Detektor, insbesondere einen zur zweidimensional aufgelösten Detektor, beispielsweise einen Matrixdetektor, eine CCD-oder eine CMOS-Kamera aufweist.

Die Bilderfassungseinheit ist weiterhin dazu ausgebildet, erfasste Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins genau einer Zelle in den jeweiligen Nanowells und hinsichtlich des

Vorhandenseins von Zellen in Zwischenräumen zwischen den Nanowells auszuwerten und abzuspeichern. Dazu kann die Vorrichtung eine Auswerteeinheit aufweisen, die mit der Bilderfassungseinheit in einer für den Austausch von Daten geeigneten Weise verbunden ist. Zusätzlich ist es möglich, die Positionen derjenigen Nanowells, in denen nicht genau eine Zelle vorhanden ist sowie derjenigen Zwischenräume, in denen Zellen vorhanden sind, abzuspeichern.

Die Bilderfassungseinheit kann in weiteren Ausführungsbeispielen dazu ausgebildet sein, ein Nanowellarray hinsichtlich seines Typs zu identifizieren und dessen Position und räumliche Ausrichtung zu bestimmen bzw. sämtliche Nanowells unabhängig vom Array zu erfassen. Jedem Well eines Nanowellarrays kann mittels der Bilderfassungseinheit und/oder der Auswerteeinheit eine ID zugeordnet werden.

Dazu kann die Bilderfassungseinheit mit einer Datenbank verbunden sein, in der Daten üblicher Nanowellarrays verschiedener Hersteller und Typen abgelegt sind. Anhand wenigstens eines Bildes eines in dem Probenraum, beispielsweise auf einem Probentisch, angeordneten Nanowellarrays kann durch Vergleich der von dem Nanowellarray erfassten Bilddaten dessen Typ und Hersteller ermittelt werden. Zugleich kann die relative

Positionierung des betreffenden Nanowellarrays in dem Probenraum ermittelt werden. Mit dem Typ des Nanowellarrays und dessen relativer Positionierung in dem Probenraum sind auch die Positionen der Erwartungsbereiche und die Positionen und gegebenenfalls die Verläufe der Zwischenräume ermittelbar. Entsprechend der bekannten Positionen und den Daten über Nanowells ohne Zelle, mit mehr als einer Zelle und Nanowells benachbart zu Zellen, die sich in einem Zwischenraum befinden, können Steuerbefehle beispielsweise für eine Pipettiereinheit generiert werden, die entsprechend die ausgewählten Zellen in den ausgewählten Nanowells ernten. Alternativ kann durch eine mit der Bilderfassungseinheit verbundene Auswerteeinheit anhand von bildanalytischen Detektionsschritten auch die Dimensionen und Positionen sämtlicher vorhandener Nanowells unabhängig von einer Datenbank üblicher

Nanowellarrays erkannt werden. Die Auswerteeinheit liefert hierbei eine Liste sämtlicher erkannter Nanowells inkl. deren Größe, Position, Umrisse, Randbereiche etc. so dass keine vorherige Definition von Erwartungsbereichen notwendig ist. Jedes Nanowell wird hierbei eine ein-eindeutige ID zugeordnet, welche eine spätere Zuordnung und ein Wiederauffinden ermöglicht. Anhand der Position und Umrisse der detektierten Nanowells kann dann eine Zuordnung der Position der erkannten Zellen erfolgen und somit Rückschlüsse über z.B. die Anzahl der Zellen im Bereich eines Nanowells erfolgen.

Um eine Dokumentation aller Verfahrensschritte und relevanter Ereignisse während des Verfahrens zu erlauben, ist die Vorrichtung vorteilhaft zur Dokumentation des

Nanowellarrays und/oder von auswählbaren Verfahrensschritten und Verfahrensstadien ausgebildet. Dazu weist die Vorrichtung vorteilhaft beispielsweise eine Kamera, eine

Speichereinheit und optional zusätzliche Dokumentationsspeicher auf. Zusätzlich kann eine Verbindung zu einer Auswerteeinheit oder Rechnereinheit bestehen.

Die Vorrichtung kann außerdem eine Einheit aufweisen, mittels der ausgewählte Zellen von einem Erwartungsbereich, insbesondere einem Well, des Nanowellarrays in einen Bereich, beispielsweise ein Well, eines Zielgefäßes übertragbar ist. Eine solche Einheit kann als eine Pipettiereinheit ausgebildet sein.

Mittels der Vorrichtung, insbesondere mittels der Entnahmevorrichtung, kann ein zuvor bestimmter monoklonaler Zellklon separat in ein abgegrenztes Nanowell beziehungsweise Well eines Zielgefäßes abgelegt werden und dort weiter heranwachsen.

Alternativ kann mittels der Vorrichtung auch eine ausgewählte Einzelzelle separat in ein abgegrenztes Nanowell beziehungsweise Well eines Zielgefäßes abgelegt werden und dort definiert zu einem Zellklon heranwachsen. Da die Vorrichtung hierbei gesichert nur eine Zelle in ein Nanowell beziehungsweise Well abgelegt, kann es sich bei der resultierenden Zelllinie in dem Nanowell beziehungsweise Well nur um einen Zellklon handeln.

Es ist ferner möglich, dass die Vorrichtung mit weiteren Einheiten interagiert. Solche Einheit können modular der Vorrichtung zuordenbar sein und beispielsweise Module zum

Liquidhandling, Picker, Brutschrank etc. umfassen, vorzugsweise in einem

Reinraumgehäuse. Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise unter Nutzung eines Nanowellarrays durchgeführt. Ein solches Nanowellarray wird vorteilhaft auch beim Betrieb der Vorrichtung eingesetzt.

Die Nanowellarrays können im praktisch zu handhabenden Plattenformat, beispielsweise nach SBS-Standard, vorliegen.

Ein Nanowell ist in möglichen Ausführungen von Nanowellarrays nur wenig größer als die Zielzelle selbst, sodass gewährleistet wird, dass nur eine einzelne Zelle, nicht aber mehrere Zellen, in einem Nanowell Platz finden. Die mittleren Durchmesser der Zellen werden als 95%-lntervall der mittels FACS oder Mikroskopie in einer Neubauerkammer gemessenen Zelldurchmesser oder mittels Casy Cell Counter bestimmt. Für verschiedene große Zelltypen werden daher Nanowellarrays mit auf die Zellgröße abgestimmter Nanowellgroße eingesetzt.

Neben der Geometrie des Nanowellarrays werden auch Zellzahl und das

Beladungsprotokoll, beispielsweis inklusive der durchzuführenden Waschschritte etc., so abgestimmt, dass sich im Allgemeinen nur eine Zelle oder keine Zelle pro Nanowell befindet. Die Geometrie der Nanowells ist so ausgebildet, dass die Zelle auch während optional erfolgender Waschschritte in dem Nanowell festgehalten wird. Die Nanowellarrays können zudem funktionalisierte Oberflächen aufweisen. Zum Beispiel können Interaktionspartner für eine Immobilisierung sekretierter Proteine oder eine die Adhäsion verhindernde

Beschichtung bei stark adhärenten Zellen vorhanden sein. Die Nanowellarrays können beispielsweise eine polyHEMA-Beschichtung aufweisen. Durch deren Wirkung wird verhindert, dass sich Zellen an den Seitenwänden der Nanowells festsetzen und stattdessen in die Nanowells sinken und etwa in der Mitte des betreffenden Nanowells zu liegen kommen. Außerdem können die Nanowells als Rundbodenwells ausgebildet sein.

In weiteren Ausführungen können die Wells Siebe enthalten, auf denen durch Wirkung eines Unterdrucks die Zelle oder der Zellklon gehalten wird. Beim Durchfluss beispielsweise eines Mediums durch eines der Siebe entsteht ein Unterdruck, der Zellen in das betreffende Nanowell einsaugen kann.

Während auf die Größe der Produktionszellen abgestimmte Nanowells Vorteile bei der Sicherstellung nur einer Zelle je Nanowell aufweisen, müssen Nanowellarrays mit unterschiedlich großen Nanowells vorgehalten werden, wenn in einem Labor mit

unterschiedlich großen Produktionszellen gearbeitet werden soll. Die Erfindung umfasst daher auch Nanowellarrays und die Verwendung solcher Nanowellarrays, die Nanowells mit einem Durchmesser aufweisen, der die Aufnahme von mehreren Zellen erlaubt. Die Vorteile liegen darin, dass ein Wachstum der Zelle zu kleinen Klonen innerhalb des Nanowells ermöglicht ist. Außerdem muss nur ein Typ Nanowellarrays vorgehalten werden.

Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass nach einer Aussaat und den nachfolgenden Waschschritten nur jeweils eine Zelle je Nanowell vorliegt, ist in einer möglichen Ausführung eines erfindungsgemäßen Nanowellarrays auf dem Grund jedes der Nanowells eine

Ankerstruktur zur Bindung nur einer Zelle vorhanden.

Solche Nanowells können dabei beispielsweise einen Durchmesser von 50 μηη und mehr aufweisen. Die Ankerstruktur kann beispielsweise in Form einer Oberflächenstrukturierung des das Nanowell bildenden Materials und/oder eine Beschichtung mit Ankermolekülen ausgebildet sein. Ankermoleküle können beispielsweise geeignet Proteine, Lipide,

Kohlenhydrate und/oder Polymere oder deren Gemische sein.

Eine solche Ankerstruktur bewirkt eine verbesserte Bindung der Zelle an das Nanowell und verringert die Gefahr, dass die Zelle bei einem Waschschritt irrtümlicherweise entfernt wird. Zudem ist die Ankerstruktur vorteilhaft so dimensioniert, dass nur eine Zelle an diese binden, beispielsweise adhärieren kann. Weitere Zellen können trotz des Umstands, dass diese im dem Nanowell Platz finden, nicht an der Materialoberfläche des Nanowells binden und werden weggewaschen. Diese Wirkung wird durch eine Beschichtung der Innenseite des Nanowells unterstützt, die eine Adhäsion von Zellen an der inneren Wand des Nanowells verhindert.

Werden größere Nanowells verwendet, gegebenenfalls in Verbindung mit einer

Beschichtung die sicherstellt, dass Zellen sich nur im Zentrum der Nanowells ansiedeln, hat dies eine Reihe Vorteile. Hier kann wie bei bisherigen Verfahren durch statistische

Verdünnung die Zellsuspension ausgesät und bildanalytisch sichergestellt und dokumentiert, dass nur Nanowells mit nur einer Zelle für alle weiteren Untersuchungen und

Selektionsschritte beachtet werden. Hintergrund ist die ökonomisch sinnvolle Herstellung und Verwendung größerer Wells. Sind die Zellen in der Mitte des jeweiligen Wells, wird zudem die optische Erfassung und Analyse unterstützt. In weiteren möglichen Ausführungsformen des Nanowellarrays ist zusätzlich wenigstens eine Beschichtung innerhalb und/oder außerhalb der Wells vorhanden, um von der Zelle abgegebene Stoffe und/oder Stoffgemische wenigstens anteilig zu binden und/oder eine Nachweisreaktion zum Nachweis des Vorhandenseins des Stoffs beziehungsweise des Stoffgemischs und/oder der Erfassung einer Signalintensität einer Detektionsstrahlung zu initiieren.

Der Boden der Nanowells kann optisch durchsichtig (transparent) sein, um invers den Inhalt der Nanowells screenen, beispielsweise abscannen, zu können. Dabei kann die

Vereinzelung der Zellen geprüft und der Transport einzelner Zellen dokumentiert werden. Die

Nanowellarrays können beispielsweise aus Kunststoff, Glas, Keramik oder Silizium(-chips,) sein, welche durch Verfahren wie Spritzguss, Ätzen, Laser- oder

Elektronenstrahlbearbeitung in die gewünschte geometrische Form gebracht werden.

Optionale Beschichtungen erlauben die Bindung der erwarteten exprimierten Verbindungen an der Wand oder dem Boden des Nanowells und deren Detektion mittels bildgebender und bildverarbeitender Verfahren.

Auf Grund der Separierung der einzelnen Zellen durch deren Platzierung in den Nanowells wird sichergestellt, dass die Zellen im gesamten Prozess identifizierbar bleiben. In der Zellkultur ist bekannt, dass das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Zellen auch maßgeblich vom direkten Zellkontakt zu den Nachbarzellen und durch Kommunikation der Zellen über die umgebenden Medien bestimmt werden. Im Gegensatz zu bisher

eingesetzten Mikrotiterplatten kann durch die Verwendung der beschriebenen Nanowells zwar kein direkter Zellkontakt stattfinden, wohl aber eine Verbindung über ein die Nanowells überschichtendes Medium, wie diese bereits oben beschrieben wurde.

Um eine ungehinderte Kommunikation zwischen den Zellen, beispielsweise über ein überschichtetes Medium, zu ermöglichen, kann ein Nanowellarray in weiteren Ausführungen auch ohne Nanowells ausgebildet sein, wobei dieses dann lediglich die Ankerpunkte aufweist und ansonsten im Wesentlichen eine Platte ist. Die Platte kann beispielsweise der Boden einer Petrischale oder ein Objektträger sein. Die Ankerpunkte befinden sich auf wenigstens einer der Oberflächen des Nanowellarrays und sind so dimensioniert, dass nur eine Zelle je Ankerpunkte binden kann. In weiteren Ausführungen sind Nanowells vorhanden, die jedoch eine Tiefe aufweisen, die etwa gleich oder geringer als der

Durchmesser der Zelle ist. Die Vorteile des Verfahrens und der Vorrichtung sowie des Nanowellarrays sind vielgestaltig. Ein eindeutiger Nachweis der Monoklonalität wird durch eine Aussaat in Nanowellarrays erreicht, die so konzipiert sind, dass sich nur eine Zelle in einem Nanowell des Arrays befindet. Dabei können verschiedene Zelllinien in Nanowellarrays mit auf sie abgestimmter Geometrie ausgesät werden. Zusätzlich wird die erfolgte Vereinzelung mittels bildgebender Verfahren in Verbindung mit einer Bildverarbeitung überprüft. Eine Entnahme einer Zelle oder eines Zellklons aus einem Nanowell wird mittels Bildern vor und nach der Ernte und/oder einem Video vom Ernteprozess dokumentiert. Außerdem kann eine Dokumentation darüber erfolgen, dass ein Nanowell beziehungsweise Well eines Zielgefäßes leer ist, bevor eine geerntete Zelle oder ein Zellklon (im Folgenden wird der Einfachheit halber nur von einer Zelle gesprochen) in diese abgelegt wird.

Eine Identifikation von Hochproduzenten ist ohne zusätzliche genetische Modifikation der Zellen möglich. Die Identifikation kann über die Detektion von Oberflächenproteinen bzw. die Immobilisierung der sekretierten Proteine nahe der Produzentenzelle und deren Detektion, beispielsweise analog eines ELISAs in vorbereiteten und beschichteten Nanowells, erfolgen. Dies ist besonders wichtig für Biopharmazeutika in der Humantherapie und deren

Zulassungen (nationale Zulassungsbehörden, EMA, FDA, etc.). Die Zelle muss keine Reportergene exprimieren, wie dies bei durchflusszytometrischen Verfahren üblich ist, und kann somit unmodifiziert bzw. nur mit der Expressionskassette des rekombinanten Proteins modifiziert sein (transgene Produktionszellen).

Die Gesamtheit aller (genetisch modifizierten) Zellen wird auf ihre spezifische Produktivität untersucht. Die spezifische Produktivität wird quantifiziert und alle Zellen können

dahingehend miteinander verglichen werden. Darauf basierend werden aus allen Zellen geeignete Hoch- und Mittelproduzenten ausgewählt. Es besteht keine Gefahr, produktive Einzelzellen oder Zellklone zu verlieren.

Im Gegensatz dazu treten bei der Limiting Dilution Verluste von Zellen auf, da nicht alle Zellen ausgesät und analysiert werden können (Material- und Platzbedarf zu groß). Bei durchflusszytometrischen Verfahren treten Verluste von Zellen während der Definition optimaler Sortiereinstellungen und während des Sortiervorgangs auf.

Es können ferner optimale Kulturbedingungen während des Zellhandlings erreicht werden. Alle Arbeiten mit der Vorrichtung erfolgen unter sterilen Bedingungen. Kulturbedingungen (Parameter) wie Temperatur, Luftfeuchte, CO2- und 02-Gehalt können an die Bedürfnisse der Zellen angepasst werden. Es wird eine Reduktion des Materialaufwands erreicht, da jedes Nanowellarray wesentlich mehr Nanowells aufweist, als die Zahl der Wells auf konventionell genutzte 96- bzw. 384- Well-Platte beträgt. Ferner wird weniger Zellkulturmedium verbraucht (μΙ/ml statt I) und weniger Platz in Inkubatoren benötigt. Weiterhin ist eine Reduktion des Zeitaufwands erreicht, da mehrere Nanowellarrays parallel prozessiert werden können.

Eine Identifizierung von Hochproduzenten kann bereits auf der Einzelzellebene erfolgen. Dabei werden nur vielversprechende Einzelzellen weiterkultiviert. Eine Wiederholung von Prozessen, wie etwa bei Limiting Dilution, ist nicht nötig, da die Monoklonalität einwandfrei nachgewiesen werden kann.

Das Verfahren wird für Zellen angewandt, die eukaryotische Zellen sind, beispielsweise Zellen von Hefen, Insektenzellen oder Säugerzellen. Die Zellen liegen für die Aussaat als Einzelzellen in einer Suspension vor. Bei Bedarf werden die Hefezellen mittels geeigneter Methoden in Suspension gebracht. Die Zellen sind genetisch so verändert (transfiziert, transduziert, transformiert), dass sie eine Expressionskassette mit der Sequenz, die das Zielprotein kodiert (ggf. zusammen mit weiteren Sequenzen, die bspw. für Reporterproteine oder Selektionsmarker kodieren können) enthalten. Sie können auch

antikörperproduzierende Hybridomazellen sein. Möglich sind auch Zellen, die

natürlicherweise, ohne genetische Modifikation, ein Protein von Interesse produzieren. Dabei kann es sich um sekretierte Proteine, aber auch um Oberflächenproteine, wie beispielsweise B- oder T-Zell-Rezeptoren, handeln. Ferner kann das Verfahren bei der Kultivierung von Tumorzellen (z. B. zirkulierender Tumorzellen, CTCs) ausgeführt werden. Die CTC sind dabei mit einem gemeinsamen Medium überschichtet. Das Verfahren und die Vorrichtung sowie das Nanowellarray können beispielsweise auch zur Kultivierung von Stammzellen, Eigenzellen (autologe Zellen) genetisch modifizierter Zellen, Tumorzellen sowie für

Interaktionsstudien zwischen Zellen verwendet werden. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Tabelle mit einem Vergleich von Einzelzellklonierungsverfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren;

Fig. 2 eine schematische Übersicht der Arbeitsschritte bis zur monoklonalen Zelllinie am Beispiel rekombinanter Proteinproduktion bei verschiedenen Verfahren; Fig. 3 eine schematische Übersicht der Verfahrensschritte bei der Verwendung von

Nanowells mit einem Fassungsvermögen für mehrere Zellen (oben) beziehungsweise für nur eine Zelle (unten);

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Wellplatte in einem Reinraumgehäuse während eines ersten optionalen Verfahrensschritts;

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines zweiten

optionalen Verfahrensschritts;

Fig. 6 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines dritten

optionalen Verfahrensschritts; Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines vierten

optionalen Verfahrensschritts;

Fig. 8 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines fünften

optionalen Verfahrensschritts;

Fig. 9 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines sechsten optionalen Verfahrensschritts;

Fig. 10 eine schematische Darstellung eines Ausschnitts eines Nanowellarrays mit

Zellen;

Fig. 1 1 eine schematische Darstellung eines Nanowellarrays in der Draufsicht;

Fig. 12 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 13 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 14 eine schematische Darstellung eines Ausschnitts eines Ausführungsbeispiels eines Nanowellarrays mit Ankerpunkten in jedem Nanowell und Fig. 15 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels eines

Nanowellarrays mit Ankerpunkten und ohne Nanowells.

Die Abbildungen zeigen schematisch und vereinfachend Elemente der Vorrichtungen und illustrieren Verfahrensschritte. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche technische Elemente beziehungsweise gleiche Verfahrensschritte.

In der Fig. 1 werden die bereits oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik zur Generierung von Einzelzellklonen dem erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich einiger ihrer ökonomischen Parameter tabellarisch gegenübergestellt. Die Verfahrensabläufe der Verfahren sind in der Fig. 2 zusammengefasst und gegenüber gestellt.

Fig. 3 veranschaulicht noch wesentliche Verfahrensschritte und Prozesse eines Verfahrens unter Verwendung von Nanowells 17 (siehe Fig. 7 und folgende) mit einem großen

Durchmesser, der die Aufnahme mehrerer Zellen 2 erlaubt (obere Reihe) und von

Nanowells 17, deren Durchmesser nur die Aufnahme einer Zelle 2 erlaubt (untere Reihe). Die Schritte der Erfassung nach einer Aussaat fehlerhaft besetzter Nanowells 17 erfolgt nach der Identifikation von Nanowells 17 mit Einzelzellen (mit EZ bezeichnet). In der Fig. 4 ist eine in einem Reinraumgehäuse 5 befindliche Wellplatte 1 , beispielsweise eine übliche 96-Well-Platte im SBS-Format, dargestellt. In der Wellplatte 1 befinden sich biologische Zellen 2, die von einem Medium 3 überschichtet sind. Mittels einer Absaug- und/oder Pipettiereinheit 4 wird das Medium 3 abgesaugt (Schritt A). Fig. 5 zeigt die Wellplatte 1 , in die eine Waschlösung in Form beispielsweise einer PBS- Lösung (nicht gezeigt) gegeben wurde. Die Wellplatte 1 wird geschwenkt und gewaschen (durch Pfeile symbolisiert), anschließend wird die PBS-Lösung wieder abgesaugt (Schritt B). Es kann auch eine Waschlösung zugefügt und wieder entfernt werden. In der Fig. 6 ist die Wellplatte 1 zu sehen, bei der die Zellen 2 mit einer präparierten

Suspension 6 überdeckt werden. Nach Zugabe eines Enzyms zu den Zellen 2 wird ein Medium zugefügt, durch das die enzymatische Reaktion abgestoppt wird. Dies geschieht wieder mittels der Pipettiereinheit 4 in einem Schritt C. Der in der Fig. 7 dargestellte Schritt D zeigt schematisch die Funktionalisierung eines

Nanowellarrays 9. Auf dem Nanowellarray 9 sind vier Bereiche ausgebildet, die jeweils eine Anzahl Nanowells 17 aufweisen. Die in der Fig. 8dargestellten Schritte E und F umfassen die Schritte des Übertragens von Zellen 2 (nicht gezeigt) von der Wellplatte 1 auf ein Nanowellarray 9 (Schritt E). Die Zellen 2 werden dabei mittels eines Filters 7 gefiltert um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Anschließend wird deren Zellzahl mit einer Messeinrichtung 8 zur Messung der optischen Dichte bestimmt. Die Zellen 2 werden auf das Nanowellarray 9 ausgesät. Dabei wird die Einzelzellsuspension durch Schwenkbewegungen (durch die Pfeile symbolisiert) gleichmäßig verteilt, bevor sie wieder abgesaugt wird. Das Nanowellarray 9 beziehungsweise eine Anzahl besäter Nanowellarrays 9 kann beziehungsweise können in einem Schritt G mittels einer Zentrifuge 10 zentrifugiert werden, um beispielsweise die Zellen 2 durch Wirkung der Schwerkraft/Fliehkraft in die Nanowells 17 des Nanowellarrays 9 zu bewegen (Fig. 9). Ein seitlicher Schnitt durch einen Ausschnitt eines Nanowellarrays 9 ist in Fig. 10 dargestellt. In den beiden gezeigten Nanowells 17 ist jeweils eine Zelle 2 enthalten. In einem

Zwischenraum 18 zwischen den beiden Nanowells 17 befindet sich ebenfalls eine Zelle 2, die mittels der Pipettiereinheit 4 in einem Schritt H als überschüssige Zelle 2 abgesaugt wird. Am Boden jedes Nanowells 17 ist optional ein Ankerpunkt 1 1 ausgebildet, an dem die Zelle 2 gebunden ist. Die jeweilige überschüssige Zelle 2 kann mittels der Pipettiereinheit 4 in ein Nanowell 17 abgelegt werden, das zuvor als leer erkannt wurde.

Im Ergebnis wird ein Nanowellarray 9 erhalten, in dessen Nanowells 17 idealerweise jeweils nur eine Zelle 2 enthalten ist und dessen Zwischenräume 18 keine Zellen 2 enthalten.

Ein solches Nanowellarray 9 ist beispielhaft in Fig. 1 1 dargestellt.

In einem Schritt I wird das Nanowellarray 9, oder wie in Fig. 12 dargestellt mehrere

Nanowellarrays 9, mittels einer Bilderfassungseinheit 14, die auch als ein Mikroskop angesehen werden kann, mit einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung beleuchtet und eine resultierende Detektionsstrahlung ortsaufgelöst mittels eines geeigneten Detektors (nicht gezeigt) als Bilddaten erfasst. Die Ortsauflösung bezieht sich auf die Möglichkeit zur Angabe einer Position eines jeweiligen Ortes, beispielsweise eines Nanowells 17, von dem eine Detektionsstrahlung als ein Ereignis in der X- Y-Ebene erfasst wird.

Die Bilderfassungseinheit 14 ist derart konfiguriert, dass mit dieser ermittelt werden kann, ob ein betreffendes Nanowell 17 genau eine Zelle 2 enthält, ob sich Zellen 2 in Zwischenräumen 18 befinden und welche Grade spezifischer Produktivitäten Zellen 2 in den jeweiligen Nanowells 17 zeigen, in denen nur eine Zelle 2 vorliegt und die nicht benachbart zu einem Zwischenraum 18 mit einer Zelle 2 liegen. Die Auswertung der Bilddaten erfolgt mittels einer Auswerteeinheit 19. In Abhängigkeit der Auswertung werden Steuerbefehle generiert und die Pipettiereinheit 4 so angesteuert, dass nur Zellen 2 ausgewählter Nanowells 17 aufgenommen und auf ein Zielgefäß oder eine Zielwellplatte, beispielsweise in Form eines Zielnanowellarrays 15, übertragen werden (Schritt I).

Die Auswerteeinheit 19 steht mit einer Beleuchtungseinheit 13 und mit einer

Speichereinheit 12 in Verbindung. Die Beleuchtungseinheit 13 stellt eine Beleuchtungsund/oder Anregungsstrahlung zur Verfügung und erlaubt eine gezielte Beleuchtung des Nanowellarrays 9 beispielsweise in Form einer Abtastbewegung. Dazu kann die

Beleuchtungseinheit 13 einen Scanner umfassen. Die Speichereinheit 12 dient insbesondere dem Speichern der Dokumentationen der Verfahrensschritte, der erfassten ID und zugehöriger Produktivitäten. Die Auswerteeinheit 19 ist ferner dazu ausgebildet,

Steuerbefehle zu generieren und beispielsweise die Pipettiereinheit 4 und die

Beleuchtungseinheit 13 anzusteuern.

Die mittels der Pipettiereinheit 4 auf eines der Zielnanowellarrays 15 übertragenen Zellen 2 werden weiter inkubiert und deren Wachstum, Überleben und/oder Produktion bzw.

Sekretion spezifischer Stoffe oder Stoffgemische überwacht und dokumentiert (Schritt J). Die Inkubation erfolgt dabei in einem Inkubator 16 (Fig. 13).

Ein Ausführungsbeispiel eines Nanowellarrays 9 ist in Fig. 14 als Ausschnitt und in einer seitlichen Schnittdarstellung gezeigt. Die Nanowells 17 sind wesentlich größer als die Zellen 2 und weisen an ihrem jeweiligen Boden optional je einen Ankerpunkt 1 1 auf. Die Ankerpunkte 1 1 sind jeweils so dimensioniert, dass nur jeweils eine Zelle 2 an diesen binden kann. Überschüssige Zellen 2 können daher weggewaschen werden. Die Ankerpunkte 1 1 sind beispielsweise durch eine geeignete Beschichtung, eine lokale Oberflächenaufrauung oder -strukturierung gebildet.

Eine weitere Ausführung eines Nanowellarrays 9 ist in Fig. 15 dargestellt. Auf einer der Oberflächen sind Ankerpunkte 1 1 ausgebildet. Das Nanowellarray 9 weist keine

Nanowells 17 auf, so dass an den Ankerpunkten 1 1 gebundene Zellen 2 über ein überschichtendes Medium (nicht gezeigt) ungehindert miteinander kommunizieren können. In weiteren Ausführungen des Nanowellarrays 9 können flache Mulden als Nanowells 17 vorgesehen sein, in denen die Ankerpunkte 1 1 eingebracht sind. Die Mulden weisen eine Tiefe auf, die geringer als ein Durchmesser der Zellen 2 ist. Ausführungsbeispiel - Generierung, Identifizierung und Isolation eines

Hochproduzenten

Folgender Abriss soll am Beispiel von an Suspensionswachstum adaptierten CHO-K1-Zellen die einzelnen Arbeitsschritte illustrieren, die bis zur Isolation eines Interferon-gamma (IFN-γ)- Hochproduzenten notwendig sind:

- Transfektion

CHO-K1 Zellen werden klassisch mit einem Plasmid, das eine IFN-v- Expressionskassette aufweist, transfiziert. Anschließend werden die Zellen 2 für einige Stunden, beispielsweise mindestens 12 Stunden, maximal 48 Stunden, kultiviert, um die Expression des Transgens zu erlauben.

- Auswahl des Nanowellarrays

Es wird ein Nanowellarray 9 ausgewählt, bei dem die einzelnen Nanowells 17 des Nanowellarrays 9 nur wenig größer als die Zellen 2 sind: Bei einer durchschnittlichen Größe einer CHO-K1-Zelle von rund 12 μηη bis 15 μηη, ist ein Nanowellarray 9 mit runden 18 μηη Nanowells 17 geeignet. Die Nanowells 17 sind 18 μηη hoch. Das Arraydesign stellt somit sicher, dass sich nur eine Zelle 2 in einem Nanowell 17 befinden kann. - Vorbereiten des Nanowellarrays

Für die Detektion von IFN-v-Hochproduzenten wird das Nanowellarray 9 (analog einem klassischen Sandwich-ELISA) mit Fangantikörper beschichtet. Unspezifische Bindestellen werden blockiert. Der Nanowellarray 9 wird anschließend dreimal gründlich mit PBS gewaschen.

- Aussaat der Zellen in Nanowellarrays

Die transfizierten Zellen 2 werden durch einen 40 μηη Cell Strainer (Filter 7) gegeben, um möglicherweise vorhandene Zellaggregate aufzulösen und eine

Einzelzellsuspension zu erhalten.

Die Einzelzellsuspension wird auf den vorbereiteten Nanowellarray 9 mittels der Vorrichtung aufgetragen und durch Kippbewegungen gleichmäßig verteilt. Bei Bedarf werden mehrere Nanowellarrays 9 seriell oder parallel mit den

transfizierten Zellen 2 bestückt. Nach einer Inkubation von fünf Minuten, wird das Nanowellarray 9 drei Minuten bei 800 rpm zentrifugiert. Anschließend wird das Nanowellarray 9 mit frischem Zellkulturmedium gewaschen, um Zellen 2, die sich nicht in Nanowells 17 befinden, aus den Zwischenräumen 18 zu entfernen. Diese Zellen 2 werden in Folge in einem zweiten Nanowellarray 9 ausgesät, sodass auch sie für Detektion und Isolation zur Verfügung stehen und nicht verloren gehen.

Zellen 2, die in einem Nanowell 17 lokalisiert sind, werden durch den Waschschritt nicht aus dieser entfernt.

Detektion von Hochproduzenten in Nanowellarrays

Die transfizierten Zellen 2 werden nach der oben beschriebenen Aussaat für mindestens 30 Minuten im Nanowellarray 9 inkubiert, um die Sekretion von IFN-γ in die beschichteten Nanowells 17 zu erlauben. Anschließend wird das Nanowellarray 9 optional mit frischem Zellkulturmedium gewaschen, um nicht gebundenes IFN-γ aus den Nanowells 17 zu entfernen. Der Nanowellarray 9 wird nun mit einem Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper gegen IFN-γ (direkte Detektion) oder mit einem IFN-γ- Detektionsantikörper (nach einem Waschschritt) gefolgt von einem dagegen gerichteten Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper (indirekte Detektion zur Signalamplifikation) inkubiert. Nach einem optionalen Waschschritt mit frischem Zellkulturmedium wird das Nanowellarray 9 mit der Bilderfassungseinheit 14 der Vorrichtung gescannt. Dabei werden Aufnahmen in Hellfeld und Fluoreszenz (Alexa Fluor 488) gemacht. Anhand der Hellfeldaufnahmen werden die Zellen 2 in den Nanowells 17 identifiziert. Zudem überprüft die Vorrichtung, ob Zellen 2 außerhalb von Nanowells 17 vorliegen. Sollte dies der Fall sein, können benachbarte

Nanowells 17 vom Isolationsprozess ausgeschlossen werden, um zu verhindern, dass zusätzlich zu der gewünschten Einzelzelle noch weitere Zellen 2 im gleichen Schritt isoliert werden. Die Hellfelddetektion erlaubt es zudem, grundsätzliche Aussagen über die Viabilität einer Zelle 2 zu treffen, um tote oder sterbende Zellen 2 vom Isolationsprozess auszuschließen. Die Fluoreszenzbilder dienen der Detektion und relativen Quantifizierung der spezifischen Produktivität einer Einzelzelle 2, da sekretiertes IFN-γ von einem Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper gebunden wird (direkt über Detektionsantikörper oder indirekt: Detektionsantikörper und

Sekundärantikörper). Alle Aufnahmen werden bei der gleichen Belichtungszeit gemacht, sodass die Signalintensität die Menge sekretierten IFN-γ wiederspiegelt. Die Signale werden nach Fluoreszenzintensität sortiert und damit Hoch-, Mittel- und Niedrigproduzenten bzw. Zellen 2 ohne spezifische Produktivität identifiziert. Nach den Waschschritten, eventuell erfolgenden Färbesch ritten (analog zu den Waschschritten), erfolgt in einem weiteren bildgebenden Schritt durch die

Bilderfassungseinheit 14 an den im Rahmen einer Vorauswahl definierten

Nanowells 17 beispielsweise eine Detektion eines Fluoreszenz- oder

Lumineszenzsignals eines jeweiligen Nanowells 17 und der darin befindlichen Zelle 2. In einem weiteren Schritt erfolgt die Detektion der Zellen 2 im Hellfeld, um mehrere Zellen 2 in einem Nanowell 17 identifizieren zu können. Diese Kontrolle kann in zwei Bildaufnahmen oder durch Umschalten zwischen z. B. Fluoreszenz- und Hellfeldkanal in einer Aufnahmeposition erfolgen. Ebenso sind zusätzliche Detektionsebenen durch

Multifluoreszenzkanäle anwendbar.

Isolation von Hochproduzenten aus Nanowellarravs und Ablage in Zielstrukturen

Identifizierte Hochproduzenten und einige Mittelproduzenten werden von der

Vorrichtung automatisiert für die Isolation ausgewählt und vom Nutzer bestätigt.

Einzelzellen 2 oder Zellklone werden mit Hilfe der Pipettiereinheit 4 einzeln aus den Nanowells 17 des Nanowellarravs 9 isoliert. Dies wird durch die Aufnahme von Bildern vor und nach der Ernte sowie durch ein Video des eigentlichen Erntevorgangs dokumentiert. Zudem überprüft die Vorrichtung bildanalytisch, ob bei jedem einzelnen Isolationsschritt nur eine Zelle 2 aufgenommen wurde. Die Zellen 2 werden separat in Nanowells 17 einer 384-Well-Platte abgegeben. Die Vorrichtung überprüft vor der Zellabgabe, ob die Zielnanowells 17 leer vorliegen und stellt sicher, dass die

Zellabgabe ausschließlich in leere Zielnanowells 17 erfolgt. Nach der Zellabgabe überprüft die Vorrichtung bildanalytisch, dass nur eine Einzelzelle pro Zielnanowell 17 abgelegt wurde.

Durch die Pipettiereinheit 4, welche geeignete Kapillaren beispielsweise aus Glas, Keramik oder Kunststoff aufweist, werden ausgewählte Nanowells 17 angefahren. Die Auswahl der Nanowells 17 kann anhand der jeweiligen Signalintensitäten der

Detektionsstrahlung und/oder durch einen Nutzer erfolgen. Die Pipettiereinheit 4 nimmt den Inhalt des Nanowells 17 oder eine Zelle 2 von einem Zwischenraum 18 auf und gibt sie in ein Zielnanowell 17 ab. Eine Dokumentation des Vorgangs durch die Bilderfassungseinheit 14 ist möglich, um einen lückenlosen Nachweis der

Monoklonalität zu erhalten. - Vermehrung der Einzelzelle zum Zellklon

Die Proliferation der hochproduzierenden Einzelzellen 2 zum Zellklon wird von der Bilderfassungseinheit 14 durch die Aufnahme von Bildern dokumentiert. Die

Vorrichtung kann bildanalytisch die Konfluenz der Kultur bestimmen und teilt dem Nutzer mit, wenn der Zellklon in ein größeres Wellformat transferiert oder gesplittet werden sollte. Dieser Prozess kann mit Hilfe der Vorrichtung automatisiert werden.

Hierzu können die Zielnanowellarrays 15 gedeckelt von der Vorrichtung zur längeren Inkubation entnommen werden. Weitere bildgebende Scans oder Screenings zu definierten Zeiten können das Zellwachstum und die Expressionsstärke eines Transgens oder die Produktivität der entstehenden Klone dokumentieren und eine weitere Auswahl der produktivsten Klone ermöglichen. Diese Schritte können innerhalb einer entsprechend optional ausgestatteten Vorrichtung (integrierter Brutschrank 16) und der vorhandenen Bilderfassungseinheit 14 erfolgen. Der Transport ausgewählter Klone kann ebenso der Pipettiereinheit 4 der Vorrichtung erfolgen.

- Test spezifische Produktivität Zellklon

Anschließend wird in einem klassischen ELISA die spezifische Produktivität (IFN-γ Sekretion) der einzelnen Zellklone analysiert. Diese Tests werden wiederholt durchgeführt, um die Stabilität der IFN-v-Produktion eines Zellklons über die Zeit beurteilen zu können. Stabile Hochproduzenten werden so identifiziert.

Bezugszeichen

1 Wellplatte

2 Zelle

3 Medium

4 Pipettiereinheit

5 Reinraumgehäuse

6 Zellsuspension

7 Filter

8 Messeinrichtung

9 Nanowellarray

10 Zentrifuge

1 1 Ankerpunkt

12 Speichereinheit

13 Beleuchtungseinheit

14 Bilderfassungseinheit

15 Zielnanowellarray

16 Inkubator

17 Nanowell

18 Zwischenraum

19 Auswerteeinheit

A Absaugung Nährmedium

B Waschen und Absaugen der Waschlösung

C Zugabe von Enzym und Medium

D Filtervorgang und Zellzahlbestimmung

E Coating, Funktionalisierung

F Umlagerung in Nanowellarray

G Zentrifugation

H optionaler Waschschritt

I Bilderfassung, Auswertung und Umlagerung in Zielgefäß

J Überwachung der Produzentenzellen