DESCRIPCIÓN

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención pertenece al campo técnico de la microfluídica y, en particular, se refiere a un nuevo método de síntesis controlada de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas, así como a su empleo para el análisis SERS de analitos en disolución. Es asimismo objeto de la invención el chip microfluídico para llevar a cabo dicho método.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La espectroscopia SERS (dispersión Raman amplificada por la superficie, del inglés Surface-Enhanced Raman Scattering), es una técnica capaz de incrementar la intensidad de la señal Raman de compuestos orgánicos, reduciendo los límites de detección en hasta una decena de órdenes de magnitud, siendo incluso capaz de llegar a detectar moléculas individuales.

El método consiste en realizar un análisis Raman sobre muestras diluidas o colocadas en contacto con estructuras nanométricas cuyas propiedades plasmónicas fomentan la vibración coordinada de las moléculas, produciendo un efecto de resonancia que amplifica su señal Raman y facilita su detección. Al garantizar un límite de detección extremadamente bajo, la técnica SERS encuentra aplicación en todos aquellos campos de estudio en donde es importante identificar (o incluso semi-cuantificar) compuestos orgánicos presentes en muy bajas concentraciones, incluyendo el análisis de fármacos, explosivos, pesticidas o productos alimenticios, entre otros ejemplos. Adicionalmente, puesto que numerosas misiones espaciales activas y en fase de desarrollo contemplan el despliegue de espectrómetros Raman en los cuerpos celestes, el método SERS se considera uno de los posibles métodos a emplear para la detección de trazas de vida extraterrestre.

Desde el año del descubrimiento del efecto SERS en 1977, la comunidad científica ha propuesto una gran variedad de matrices plasmónicas a emplear para la amplificación de señales Raman. Entre ellas, los análisis SERS convencionales se basan en el uso de emulsiones compuestas por nanoesferas de oro o plata. Sin embargo, sabiendo que el efecto plasmónico es amplificado por la rugosidad de las nanopartículas, desarrollos más recientes proponen la síntesis de nanopartículas con una superficie altamente irregular, como por ejemplo las nanoestrellas (Garcia-Leis, A., et al., Journal of Physical Chemistry C 117, 7791-7795, 2013) y los nanoflores (Xie, J., et al., ACS Nano 2, 2473-2480, 2008).

Como demuestra la bibliografía pertinente, estas nanoestructuras complejas logran amplificar ulteriormente las señales Raman, permitiendo bajar el límite de detección en hasta cinco órdenes de magnitud respecto a lo alcanzado por emulsiones SERS convencionales (Garcia-Leis, A., et al., Journal of Physical Chemistry C 117, 7791-7795, 2013; Garcia-Leis, A., et al., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering 535, 49-60, 2017).

Reconociendo el potencial que conlleva su vasta aplicabilidad, en los últimos años se han publicado diversas patentes nacionales e internacionales dirigidas a distintos métodos de síntesis de nanoestrellas SERS (CN 109085150, CN111299570, CN 110658176, CN109128152).

A pesar de disminuir enormemente el límite de detección de compuestos orgánicos, una de las mayores limitaciones del SERS consiste en la baja reproducibilidad de los análisis. Esta limitación es principalmente debida a dos factores. Por un lado, al ser el efecto plasmónico muy sensible a la forma y tamaño de las nanopartículas empleadas, las contaminaciones y otras variaciones indeseadas (por ejemplo, pequeñas variaciones en los valores de pH o en la ratio de concentración de los reactivos), que pueden ocurrir durante el proceso de síntesis, pueden comprometer la forma y la estabilidad del coloide, afectando así la reproducibilidad de los análisis SERS (Chem. Sci. 11, 4563-4577, 2020). Por otro lado, numerosos estudios demuestran que la amplificación plasmónica de las señales Raman está inversamente relacionada con la edad del coloide empleado, ya que aumentar el tiempo de almacenamiento, aumenta también la probabilidad de oxidación de las nanopartículas y de la ocurrencia de fenómenos de floculación (Journal of Physical Chemistry C., 123, 16495-16507, 2019).

Aunque hayan sido experimentadas diferentes estrategias para limitar los fenómenos de oxidación y floculación como, por ejemplo, la aplicación de estabilizadores (capping agents) o capas protectoras (stabilizers), el tiempo de vida de los coloides SERS convencionales es típicamente del orden de algunas semanas o incluso días (Jiang, Y. et al., Applied Surface Science 450, 451-460, 2018).

Si el tiempo de vida garantizado por coloides SERS convencionales es compatible con la mayoría de las aplicaciones de laboratorio e industriales, esta durabilidad puede no ser suficiente en determinados campos de estudio. Tomando como ejemplo el campo de la exploración planetaria, ningún coloide o sustrato SERS actualmente disponible es capaz de garantizar prestaciones óptimas en los plazos de tiempo que requieren misiones espaciales hacia otros cuerpos celestes del sistema solar (en el orden de meses o incluso años). Por este motivo, la única estrategia posible para una posible aplicación de SERS en misiones planetarias consiste en la producción in-situ de las nanoemulsiones con prophedades plasmónicas.

Estudios conocidos han demostrado que la producción in-situ de nanoemulsiones con alta reproducibilidad de análisis puede ser llevada al cabo mediante el uso de sistemas de microfluídica. Según estos estudios, los dispositivos de microfluídica permiten automatizar el proceso de síntesis: 1) alcanzando un control preciso del tiempo de agregación, 2) reduciendo las variaciones mecánicas y ópticas de los coloides, 3) permitiendo una mezcla más eficiente entre coloide y analito, 4) minimizando el uso de recursos y 5) disminuyendo posibles contaminaciones (Journal of Physical Chemistry C 123, 5608-5615, 2019).

La primera patente publicada sobre el tema describe el uso de sistemas de microfluídica para la producción de nanoesferas SERS convencionales, siendo estas obtenidas mezclando dos o más disoluciones mediante canales microméthcos comunicantes (WO03038436). Sin embargo, patentes más recientes describen sistemas de microfluídica más elaborados (por ejemplo, que incluyen zonas de calentamiento y de reacción), los cuales permiten lograr la síntesis automatizada de coloides SERS de estructura más compleja. Por ejemplo, la solicitud de patente CN110666186 describe un chip de microfluídica que permite sintetizar nanoestrellas de oro.

En este contexto, cabe destacar que el efecto plasmónico de un determinado coloide está directamente relacionado con el tipo de fuente empleada para la excitación de la muestra. Por un lado, el pico de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) proporcionado por coloides de oro optimiza el efecto SERS que se consigue mediante el uso de instrumentos Raman equipados con láseres rojos (por ejemplo, de 633 nm). Por otro lado, los coloides de plata optimizan el efecto SERS cuando se usan fuentes de excitación verdes (532 nm) (Colloid and Polymer Science 296, 1029-1037, 2018).

En la actualidad, no se conoce ningún sistema de microfluídica que permita sintetizar nanoestrellas de plata, siendo el metal cuyo pico de resonancia plasmónica mejor se adapta a la longitud de onda (532nm) de la fuente de excitación empleada por los instrumentos Raman que operan en las misiones espaciales actuales (instrumento SuperCam, a bordo del rover NASA/Perseverance) y futuras (el espectrómetro RLS, a bordo del rover ESA/Rosalind Franklin o el instrumento RAX, a bordo del rover JAXA/MMX). La presente invención resuelve esta necesidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Es un primer objeto de la invención un chip microfluídico para la síntesis in-situ de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas caracterizado por que comprende, sobre su superficie:

. al menos un primer canal micrométrico para la entrada de una primera solución de mezcla, donde dicho primer canal micrométrico está conectado con un depósito de almacenamiento de dicha primera solución de mezcla y tiene una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente, entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente, entre 100 y 300 pm). De manera preferente, el primer canal micrométrico estará configurado para operar de manera automática, para lo cual podrá disponer a su entrada de al menos una bomba u otro dispositivo alternativo para aumentar la presión de la solución de mezcla como, por ejemplo, una jeringa. De manera alternativa, el primer canal micrométrico estará configurado para operar de manera manual;

. al menos un segundo canal micrométrico para la entrada de una segunda solución de mezcla, donde dicho segundo canal micrométrico está conectado con un depósito de almacenamiento de dicha segunda solución de mezcla y tiene una anchura entre 50 y 1000 pm (preferentemente, entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente, entre 100 y 300 pm). De manera preferente, el segundo canal micrométrico estará configurado para operar de manera automática, para lo cual podrá disponer a su entrada de al menos una bomba u otro dispositivo alternativo para aumentar la presión de la segunda solución de mezcla como, por ejemplo, una jeringa. De manera alternativa, el segundo canal micrométrico estará configurado para operar de manera manual; una primera zona de mezcla conectada con el primer canal micrométrico y con el segundo canal micrométrico, donde dicha primera zona de mezcla está configurada para llevar a cabo la mezcla pasiva entre la primera solución y la segunda solución, dando lugar a una tercera solución de mezcla (correspondiente a la mezcla de la primera solución y la segunda solución). De manera preferente, dicha primera zona de mezcla consistirá en un canal que contenga en su interior un sistema adecuado para la mezcla pasiva de microfluidos, siendo dicho sistema preferentemente seleccionado entre los que se describen en Lee, C.Y. et al., Chemical Engineering Journal 288, 146-160, 2016 (sistema de canales cruzados, sistema de canales en zigzag, sistema de mezcla por laminación, sistema en forma de serpentín, sistema de barreras empotradas, sistema de canales con diseño de espina de pescado o sistema de pozos inclinados, entre otros); al menos un tercer canal micrométrico para la entrada de aire (u otro medio inerte en forma de gas o líquido), donde dicho tercer canal está conectado con un depósito de almacenamiento de dicho medio inerte y tiene una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente entre 100 y 300 pm). De manera preferente, el tercer canal micrométrico estará configurado para operar de manera automática, para lo cual podrá disponer a su entrada de al menos una bomba u otro dispositivo alternativo para aumentar la presión del aire (u otro medio inerte) como, por ejemplo, una jeringa. De manera alternativa, el tercer canal micrométrico estará configurado para operar de manera manual, mediante el uso, por ejemplo, de un blister; al menos un cuarto canal micrométrico para la entrada de una cuarta solución de mezcla, donde dicho cuarto canal está conectado con un depósito de almacenamiento de dicha cuarta solución de mezcla y tiene una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente entre 100 y 300 pm). De manera preferente, el cuarto canal micrométrico estará configurado para operar de manera automática, para lo cual podrá disponer a su entrada de al menos una bomba u otro dispositivo alternativo para aumentar la presión de la cuarta solución de mezcla como, por ejemplo, una jeringa. De manera alternativa, el cuarto canal micrométrico estará configurado para operar de manera manual; al menos un quinto canal micrométrico para la entrada de una quinta solución de mezcla, donde dicho quinto canal micrométrico está conectado con un depósito de almacenamiento de dicha quinta solución de mezcla y tiene una anchura de entre 50 y 500 pm (preferentemente entre 100 y 200 pm) y una longitud de entre 50 y 200 pm (preferentemente entre 100 y 200 pm). De manera preferente, el quinto canal micrométrico estará configurado para operar de manera automática, para lo cual podrá disponer a su entrada de al menos una bomba u otro dispositivo alternativo para aumentar la presión de la quinta solución de mezcla como, por ejemplo, una jeringa;

. una segunda zona de mezcla conectada con el tercer, cuarto y quinto canal micrométrico, así como con la primera zona de mezcla a través de un conducto de unión con dicha primera zona de mezcla. Dicha segunda zona de mezcla está configurada para llevar a cabo una mezcla activa entre la tercera, cuarta y quinta solución, dando lugar a la síntesis de una nanoemulsión de nanoestrellas de plata. Para llevar a cabo dicha mezcla podrá emplearse cualquier dispositivo adecuado para la mezcla activa de soluciones, como por ejemplo un dispositivo generador de presión, ultrasonidos, fuerzas dielectroforéticas, fuerzas electrocinéticas, fuerzas térmicas o fuerzas magnéticas, entre otras posibilidades. Finalmente, la segunda zona de mezcla comprende asimismo un conducto de salida de la nanoemulsión de nanoestrellas de plata.

El chip microfluídico reivindicado permite replicar en escala micrométrica el proceso de síntesis de nanoestrellas convencional, según se describe en Garcia-Leis et al., J. Phys. Chem. C 117, 7791-7795, 2013. Ello es una gran ventaja, ya que permite optimizar los recursos, lo cual cobra especial importancia en la utilización del chip microfluídico reivindicado en misiones de exploración espacial, siendo ésta una de las principales aplicaciones del objeto de la invención.

Otra de las ventajas del chip microfluídico reivindicado es que permite la síntesis in-situ de nanoemulsiones altamente reproducibles. Adicionalmente, las nanoestrellas de plata obtenidas a partir del dispositivo y método reivindicado presentan una morfología equiparable a la que presentan las nanoestrellas de plata preparadas mediante el método convencional.

En una realización particular de la invención, el chip microfluídico desarrollado podrá emplearse tanto para la síntesis in-situ de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas, como para el análisis SERS de al menos un analito en disolución empleando las nanoestrellas de plata sintetizadas previamente. En dicha realización particular, el chip microfluídico comprenderá, además de los elementos anteriormente descritos, los siguientes elementos:

. al menos un sexto canal micrométrico para la entrada de la solución a analizar (analito), donde dicho sexto canal está conectado con un depósito de almacenamiento de dicha sexta solución de mezcla y tiene una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente entre 100 y 200 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente entre 100 y 200 pm). De manera preferente, el sexto canal micrométrico estará configurado para operar de manera automática, para lo cual podrá disponer a su entrada de al menos una bomba u otro dispositivo alternativo para aumentar la presión de la solución a analizar como, por ejemplo, una jeringa. De manera alternativa, el sexto canal micrométrico estará configurado para operar de manera manual;

. una tercera zona de mezcla conectada con el sexto canal micrométrico y con el conducto de salida de la segunda zona de mezcla. Dicha tercera zona de mezcla está configurada para llevar a cabo una mezcla pasiva entre la nanoemulsión obtenida en la segunda zona de mezcla y la solución a analizar (analito). De manera preferente, dicha tercera zona de mezcla consistirá en un canal cuya forma y/o estructura favorezca la mezcla pasiva de microfluidos, siendo dicho sistema preferentemente seleccionado entre los que se describen en Lee, C.Y. et al., Chemical Engineering Journal 288, 146-160, 2016, tales como los que han sido anteriormente descritos para llevar a cabo la primera mezcla (sistema de canales cruzados, sistema de canales en zigzag, sistema de mezcla por laminación, sistema en forma de serpentín, sistema de barreras empotradas, sistema de canales con diseño de espina de pescado o sistema de pozos inclinados, entre otros);

. al menos un séptimo canal micrométrico conectado con la tercera zona de mezcla con una anchura de entre 50 pm y 20 mm (preferentemente entre 100 y 300 pm) y una longitud de entre 50 pm y 10 mm (preferentemente entre 100 y 300 pm). Dicho séptimo canal comprende adicionalmente al menos una cámara de análisis SERS, lo cual implica que al menos uno de los lados de la cámara sea de un material transparente al láser de excitación del espectrómetro Raman empleado por el análisis SERS de la muestra, así como a la luz dispersa por la misma, pudiendo ser seleccionado entre al menos un polímero, vidrio amorfo y cuarzo, entre otros, siendo preferentemente de vidrio de baja dispersión y de bajo índice de difracción (por ejemplo, vidrio borosilicatado). A su vez, el lado de la cámara SERS opuesto al anterior puede metalizarse (preferentemente, mediante un recubrimiento de aluminio), lo que permite la reflexión del haz láser incidente sobre la muestra, aumentando de este modo la densidad de energía que recibe la muestra a analizar;

. el séptimo canal se encuentra conectado con al menos un octavo canal micrométrico de salida, donde dicho canal micrométrico de salida tiene una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente entre 100 y 300 pm).

Es asimismo objeto de la invención un método de síntesis controlada de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas, basado en tecnología de microfluídica, donde dicho método se lleva a cabo mediante el chip microfluídico para la síntesis in-situ de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas anteriormente descrito y se caracteriza por que comprende las siguientes etapas:

. introducir entre 5 y 50 pl de una primera solución de mezcla que comprende hidroxilamina en una concentración de entre 1.2*10" ² y 6.0*10" ² M a través de al menos un primer canal micrométrico con una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente, entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente, entre 100 y 300 pm). De manera preferente, esta etapa se llevará a cabo de manera automática, mediante el empleo de al menos una bomba localizada a la entrada del primer canal micrométrico;

. introducir entre 5 y 50 pl de una segunda solución de mezcla que comprende hidróxido de sodio en una concentración entre 1.0*10" ² y 5.0*10" ² M a través de al menos un segundo canal micrométrico con una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente, entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente, entre 100 y 300 pm). De manera preferente, esta etapa se llevará a cabo de manera automática, mediante el empleo de al menos una bomba localizada a la entrada del segundo canal micrométrico;

. mezclar la primera solución y la segunda solución de mezcla, en una primera zona de mezcla conectada con el primer canal micrométrico y con el segundo canal micrométrico, dando lugar a una tercera solución de mezcla. De manera preferente, la mezcla se puede favorecer mediante el empleo de un sistema adecuado para la mezcla pasiva de microfluidos, siendo dicho sistema preferentemente seleccionado entre los que se describen en Lee, C.Y. et al., Chemical Engineering Journal 288, 146-160, 2016, tal y como se ha descrito anteriormente. Esta mezcla es introducida a continuación en una segunda zona de mezcla conectada con el tercero, cuarto y quinto canal micrométrico, así como con la primera zona de mezcla a través de un conducto de unión con dicha primera zona de mezcla; introducir gota a gota en la segunda zona de mezcla entre 50 y 250 pl de una cuarta solución de mezcla que comprende nitrato de plata en una concentración entre 1.0*10 ^-3 y 3.6*10 ^-3 M a través de al menos un cuarto canal micrométrico con una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente, entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente, entre 100 y 300 pm). De manera preferente, esta etapa se llevará a cabo de manera automática, mediante el empleo de al menos una bomba localizada a la entrada del cuarto canal micrométrico. De este modo, se llevará a cabo la mezcla bajo agitación de la solución de nitrato de plata con la mezcla la solución de hidroxilamina e hidróxido de sodio. transcurridos entre 1 y 30 minutos, preferentemente entre 2 y 10 minutos, introducir en la segunda zona de mezcla entre 1 y 50 pl de una quinta solución de mezcla que comprende citrato de sodio en una concentración entre 1.6 •10" ³ y 4.13*10" ² M a través de al menos un quinto canal micrométrico con una anchura de entre 50 y 500 pm (preferentemente, entre 100 y 200 pm) y una longitud de entre 50 y 200 pm. De manera preferente, esta etapa se llevará a cabo de manera automática, mediante el empleo de al menos una bomba localizada a la entrada del quinto canal micrométrico;

De manera preferente, la molaridad y el ratio de concentración entre las soluciones descritas anteriormente será modulada de manera que la mezcla final obtenida en la segunda zona de mezcla tenga un valor de pH entre 4.5 y 7 y comprenda hidroxilamina en una concentración entre 2.0 y 4.0*10" ³ M, nitrato de plata en una concentración entre 0.2 y 1.2*10 ^-3 M, y citrato de sodio en una concentración entre 0.1 y 1*10" ³ M; llevar a cabo la mezcla activa entre la tercera, cuarta y quinta solución de mezcla en la segunda zona de mezcla durante un tiempo de al menos 5 minutos, preferentemente entre 10 e 20 minutos y más preferentemente de 15 minutos, dando lugar a una nanoemulsión de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas. Esta mezcla podrá ser favorecida mediante el empleo de un dispositivo generador de presión, ultrasonidos, fuerzas dielectroforéticas, fuerzas electrocinéticas, fuerzas térmicas o fuerzas magnéticas, entre otras opciones; finalmente, se introduce en la segunda zona de mezcla aire (u otro medio inerte, líquido o gas) a través de un tercer canal micrométrico con una anchura de entre 50 y 1000 m (preferentemente, entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente, entre 100 y 300 pm). De manera preferente, esta etapa se llevará a cabo de manera automática, mediante el empleo de al menos una bomba localizada a la entrada del tercer canal micrométrico. La cantidad de aire (u otro medio inerte) introducido en la segunda zona de mezcla será preferentemente de un volumen igual o superior al 30% del volumen de dicha segunda zona de mezcla. El aire (u otro medio inerte) introducido en la segunda zona de mezcla favorecerá la salida de la nanoemulsión de nanoestrellas de plata obtenida en la etapa anterior a través de un conducto de salida de dicha segunda zona de mezcla.

Es asimismo objeto de la invención un método de utilización de las nanoestrellas de plata obtenidas mediante el método anteriormente descrito para el análisis SERS de al menos un analito en disolución. De este modo, el método anteriormente descrito, según cualquiera de sus alternativas, puede comprender adicionalmente las siguientes etapas: . introducir la solución a analizar (analito) a través de al menos un sexto canal micrométrico con una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente entre 100 y 200 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente entre 100 y 200 pm). De manera preferente, esta etapa se llevará a cabo de manera automática, mediante el empleo de al menos una bomba localizada a la entrada del sexto canal micrométrico;

. mezclar la nanoemulsión obtenida en la segunda zona de mezcla y la solución a analizar (analito) en una tercera zona de mezcla conectada con el sexto canal micrométrico y con el conducto de salida de la segunda zona de mezcla. De manera preferente, dicha mezcla será favorecida mediante el empleo de un sistema adecuado para la mezcla pasiva de microfluidos, tales como los que se describen en Lee, C.Y. et al., Chemical Engineering Journal 288, 146-160, 2016;

. conducir la mezcla de la nanoemulsión y la solución a analizar a través de al menos un séptimo canal micrométrico conectado con la tercera zona de mezcla, y someter a la mezcla a un análisis SERS mediante una cámara de análisis SERS localizada en dicho séptimo canal;

. una vez analizada, la muestra es conducida al exterior a través de al menos un octavo canal micrométrico de salida con una anchura de entre 50 y 1000 pm (preferentemente entre 200 y 400 pm) y una longitud de entre 50 y 400 pm (preferentemente entre 100 y 300 pm). El método anteriormente descrito ofrece múltiples ventajas frente a los métodos alternativos del estado de la técnica. En particular, permite un importante ahorro de reactivos, así como lograr un resultado preciso de la síntesis llevada a cabo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción un juego de dibujos donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

. Figura 1 : Vista frontal del chip microfluídico de la invención desarrollado para la síntesis de nanoestrellas de plata y el análisis SERS de analitos en disolución.

. Figura 2: Espectro UV-Vis de las nanoestrellas de plata sintetizadas siguiendo el método convencional (a) y empleando el chip microfluídico representado en Figura 1 (b).

. Figura 3: Imágenes SEM de nanoestrellas de plata sintetizadas mediante el método convencional (a y b) y mediante el chip microfluídico representado en Figura 1 (c y d).

. Figura 4: Espectros Raman convencionales de adenina diluida en agua milliQ a diferentes concentraciones. Las bandas visibles alrededor de 1600 cm' ¹ y entre 3000 y 3600 cm' ¹ son debidas a las vibraciones O-H del agua.

. Figura 5: Espectros SERS de adenina diluida en agua milliQ a diferentes concentraciones. Los análisis han sido llevados a cabo mediante el chip microfluídico de la Figura 1. Las bandas visibles alrededor de 1600 cm' ¹ y entre 3000 y 3600 cm' ¹ son debidas a las vibraciones O-H del agua.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A continuación, se describe una realización particular de la invención, tal y como se muestra en la Figura 1 que acompaña a esta descripción.

En dicha Figura 1 se muestra una realización particular del chip microfluídico para la síntesis in-situ de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas, así como para el análisis SERS de al menos un analito en disolución, el cual comprende:

. al menos un primer canal micrométrico (1) para la entrada de una primera solución de mezcla, con una anchura de 100 pm y una longitud de 100 pm. Dicho primer canal micrométrico (1) comprende a su entrada al menos una bomba con un sistema de control de flujo y presión;

. al menos un segundo canal micrométrico (2) para la entrada de una segunda solución de mezcla, con una anchura de 100 pm y una longitud de 100 pm. Dicho segundo canal micrométrico (2) comprende a su entrada al menos una bomba con un sistema de control de flujo y presión;

. una primera zona de mezcla (3) conectada con el primer canal micrométrico (1) y con el segundo canal micrométrico (2) que consiste en un canal con una anchura de 200 pm y una longitud de 100 pm que contiene en su interior una estructura de espina de pescado (en inglés, staggered herringbone structure)’,

. al menos un tercer canal micrométrico para la entrada de aire (4), con una anchura de 200 pm y una longitud de 100 pm;

. al menos un cuarto canal micrométrico (5) para la entrada de una cuarta solución de mezcla, con una anchura de 200 pm y una longitud de 100 pm. Dicho cuarto canal micrométrico (5) comprende a su entrada al menos una bomba con un sistema de control de flujo y presión;

. al menos un quinto canal micrométrico (6) para la entrada de una quinta solución de mezcla, con una anchura de entre 50 pm y una longitud de 50 pm. Dicho quinto canal micrométrico (6) comprende a su entrada al menos una bomba con un sistema de control de flujo y presión;

. una segunda zona de mezcla (7) conectada con el tercer, cuarto y quinto canal micrométrico (4, 5, 6), así como con la primera zona de mezcla a través de un conducto de unión con dicha primera zona de mezcla (3). Dicha segunda zona de mezcla (7) está constituida por un mezclador accionado por una barra de agitación con una capacidad de 250 pl;

. al menos un sexto canal micrométrico (8) para la entrada de la solución a analizar (analito), con una anchura de 200 pm y una longitud de 100 pm. Dicho sexto canal micrométrico (8) comprende a su entrada al menos una bomba con un sistema de control de flujo y presión;

. una tercera zona de mezcla (9) conectada con el sexto canal micrométrico (8) y con el conducto de salida de la segunda zona de mezcla (7). Dicha tercera zona de mezcla (9) consiste en un canal con una anchura de 400 pm y una longitud de 100 pm que contiene en su interior una estructura de espina de pescado (en inglés, staggered herringbone structure)’,

. al menos un séptimo canal micrométrico conectado con la tercera zona de mezcla (9), donde dicho séptimo canal comprende al menos cámara de análisis SERS (10). Dicho séptimo canal tiene una anchura de 200 y una longitud de 300 pm. Tanto la cara superior como la cara inferior de la cámara de análisis SERS (10) es de cuarzo;

. finalmente, la cámara de análisis SERS (10) se encuentra conectada con al menos un octavo canal micrométrico de salida (11).

A continuación, se describe el método de síntesis controlada de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas, así como de análisis SERS de al menos un analito en disolución llevado a cabo empleando el chip micrométrico anteriormente descrito. En particular, dicho método se caracteriza por que comprende las siguientes etapas:

. introducir 12 pl de una primera solución de mezcla que comprende hidroxilamina en una concentración 6*10" ² M a través del primer canal micrométrico (1) mediante la bomba con control de flujo y presión situada a la entrada de dicho primer canal;

. introducir 12 pl de una segunda solución de mezcla que comprende hidróxido de sodio en una concentración 5*10" ² M a través del segundo canal micrométrico (2) mediante la bomba con control de flujo y presión situada a la entrada de dicho segundo canal;

. mezclar pasivamente la primera solución y la segunda solución de mezcla, en una relación 1 :1 , en la primera zona de mezcla (3), dando lugar a una mezcla que es enviada a la segunda zona de mezcla (7). El flujo y presión a la entrada del primer canal micrométrico (1) y del segundo canal micrométrico (2) son controlados para introducir 20 pl de la tercera solución (obtenida de la mezcla de la primera solución y la segunda solución) a la segunda zona de mezcla (7);

. introducir gota a gota en la segunda zona de mezcla (7) 216 pl de una cuarta solución que comprende nitrato de plata en una concentración 1*10" ³ M a través del cuarto canal micrométrico (5), donde el flujo y presión de dicha cuarta solución son controlados mediante la bomba localizada a la entrada de dicho canal;

. transcurridos cinco minutos, introducir en la segunda zona de mezcla (7) 6 pl de la quinta solución de mezcla que comprende citrato de sodio en una concentración 4.13*10" ² M a través del quinto canal micrométrico (6), donde el flujo y presión de dicha quinta solución son controlados mediante la bomba localizada a la entrada de dicho canal;

. llevar a cabo la mezcla activa entre la tercera, cuarta y quinta solución de mezcla en la segunda zona de mezcla (7), dando lugar a una nanoemulsión de nanoestrellas de plata con propiedades plasmónicas. Esta mezcla activa es favorecida mediante el empleo de una barra de agitación contenida en el interior de la segunda zona de mezcla (7);

. transcurridos quince minutos, introducir en la segunda zona de mezcla (7) aire a través del tercer canal (4), favoreciendo la expulsión de la nanoemulsión de nanoestrellas de plata de la segunda zona de mezcla (7) hacia una tercera zona de mezcla (9);

. introducir la solución a analizar (analito) a través del sexto canal micrométrico (8) mediante la bomba localizada a la entrada de dicho canal;

. mezclar la nanoemulsión obtenida en la segunda zona de mezcla (7) y la solución a analizar (analito) en la tercera zona de mezcla (9) y conducir la mezcla obtenida a través del séptimo canal que comprende la cámara de análisis SERS (10);

. llevar a cabo el análisis SERS aplicando una fuente de excitación del espectrómetro Raman a través de la ventana de material transparente de la cámara de análisis SERS (10) y, una vez obtenidos los espectros SERS deseados, conducir la mezcla al exterior a través del octavo canal micrométrico (11).

Para demostrar el efecto técnico logrado mediante el chip micrométrico y el método reivindicados, se llevaron a cabo una serie de ensayos para evaluar las características morfológicas y plasmónicas de las nanoestrellas de plata sintetizadas. Para ello, la nanoemulsión generada en la segunda zona de mezcla (7) fue analizada mediante un espectrómetro UV-vis y un microscopio electrónico de barrido (SEM). Los resultados obtenidos fueron comparados con las nanopartículas de plata generadas siguiendo el método convencional descrito en Garcia-Leis et al., J. Phys. Chem. C 117, 7791-7795, 2013.

La Figura 2 muestra una comparación entre el espectro de absorbancia de la nanoemulsión preparada con el método convencional (a) con aquella sintetizada mediante el chip microfluídico anteriormente descrito, objeto de la presente invención (b). Ambos espectros presentan el punto máximo de absorbancia en 376 nm y un mínimo alrededor de 346 nm. El perfil de los dos espectros encaja perfectamente con los resultados UV-Vis presentados en Garcia-Leis et al., J. Phys. Chem. C 117, 7791-7795, 2013, lo que confirma la síntesis de nanoestrellas de plata de alta calidad.

Los análisis SEM se llevaron a cabo con objeto de determinar la morfología de las nanoestrellas de plata sintetizadas. Como se puede observar en la Figura 3, las nanoestrellas descritas en Garcia-Leis et al., J. Phys. Chem. C 117, 7791-7795, 2013 (Figura 3a y 3b) tienen un tamaño de entre 300 y 400 nm. Como se detalla en el trabajo de Garcia-Leis et al., Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp. 535, 49-60, 2017, el número y la complejidad de las ramificaciones de cada nanoestrella depende, entre otros factores, del grado de madurez de la muestra. Como se puede observar en la Figura 3c y 3d, el tamaño y forma de las nanoestrellas sintetizadas mediante el chip microfluídico reivindicado coinciden con las obtenidas empleando el método convencional.

Una vez confirmada la eficacia del método para la síntesis de nanoestrellas de plata con las propiedades morfológicas deseadas, se llevaron a cabo una señe de estudios adicionales para determinar el efecto plasmónico de las mismas. Para ello, el límite de detección alcanzado mediante un análisis Raman convencional fue comparado con el proporcionado por la nanoemulsión sintetizada mediante el chip microfluídico reivindicado. En particular, se empleó adenina como biomarcador de referencia. Adicionalmente, el compuesto se disolvió en agua milliQ en diferentes rangos de concentraciones (de 10' ¹ a 10' ⁹ M). En el primer experimento, las disoluciones fueron introducidas en el chip microfluídico a través del sexto canal micrométñco (8) y fueron dirigidas directamente hacia la cámara de análisis SERS (10), donde fueron analizadas mediante un espectrómetro equipado con un láser de 532 nm, siendo ésta la longitud de onda empleada por la mayoría de los instrumentos Raman desarrollados para misiones de exploración planetaria. Como se puede observar en la Figura 4, los análisis Raman convencionales permitieron detectar el biomarcador hasta una concentración de 1*10' ² M (el pico de referencia de la adenina se detecta en 733 nm).

En un experimento adicional, el chip microfluídico fue empleado para sintetizar la emulsión de nanoestrellas de plata y mezclarla con la solución de adenina en la tercera zona de mezcla (9), antes de alcanzar la cámara de análisis SERS (10). Los análisis SERS llevados al cabo empleando el mismo espectrómetro Raman descrito anteriormente permitieron detectar el biomarcador hasta una concentración de 1*10' ⁹ M.

La comparativa entre los resultados que se muestran en las Figuras 4 y 5 demuestran que, empleando el chip microfluídico reivindicado, es posible producir nanoestrellas cuyas propriedades plasmónicas permiten llevar al cabo análisis SERS con un límite de detección inferior en 6 órdenes de magnitud respecto a los análisis Raman convencionales.