Die Monooxygenase mit der Bezeichnung P450 BM-3 ist ein Cytochrom P450-Enzym aus Bacillus megaterium und besitzt eine ausgeprägte Sequenzhomologie mit P450-Enzymen aus Säugern (1). Aufgrund die- ser Übereinstimmungen stellt P450 BM-3 ein ausgezeichnetes Mo- dellsystem für diese Klasse von P450-Enzymen dar. P450 BM-3 hy- droxyliert in erster Linie langkettige gesättigte Fettsäuren an ihrem-1-,-2-und-3-Kohlenstoffatom. Amide oder Alkoholana- loga und Epoxide langkettiger ungesättigter Fettsäuren werden ebenfalls umgesetzt (1-3). Die katalytische Aktivität für gesät- tigte Fettsäuren ist abhängig von der Kettenlänge, wobei das Ket- tenlängen-Optimum bei 14 bis 16 Kohlenstoffatomen liegt. Das En- zym zeigt keine katalytische Aktivität für Fettsäuren mit einer Kettenlänge von weniger als 12 Kohlenstoffatomen (1).

Zusammenfassung der Erfindung Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Cytochrom P450-Monooxygenase-Mutanten bereitzustellen, welche im Vergleich zum Wildtyp-Enzym ein modifiziertes Substratprofil zeigen. Insbe- sondere sollten neue Mutanten bereitgestellt werden, welche ge- sättigte aliphatische Carbonsäuren in anderer Kettenposition hy- droxylieren und/oder eine veränderte Substratspezifität besitzen.

Vor allem sollten Mutanten bereitgestellt werden, welche kataly- tische Aktivität gegenüber aliphatischen Carbonsäuren mittlerer Kettenlänge, insbesondere mit einer Kettenlänge von 8 bis 12, wie z. B. 8 bis 10 Kohlenstoffatomen besitzen, und diese subterminal, vor allem an den Positionen-1,-2 und/oder-3 hydroxylieren.

Diese Aufgaben wurden überraschenderweise gelöst durch Bereit- stellung modifizierter Cytochrom P450-Monooxygenasen, welche durch eine Kombination aus gerichteter Evolution und ortsspezifi- scher Mutagenese ihres Substrat-bindenden Bereichs im Vergleich zum Wildtyp ein verändertes Reaktivitätsmuster bzw. Substratpro- fil bei der terminalen und/oder subterminalen enzymatischen Hy- droxylierung von aliphatischen Carbonsäuren zeigen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Für erfindungsgemäße Mutanten ist im Vergleich zum Wildtyp-Enzym ein"verändertes Substratprofil"zu beobachten. Ein"verändertes Substratprofil"bedeutet in Rahmen der vorliegenden Erfindung a) eine Verbesserung der Reaktivität, wie z. B. eine Erhöhung der spezifischen Aktivität (ausgedrückt als nmol umgesetzte Carbon- säure/Minute/nmol P450-Enzym) und/oder wenigstens eines kineti- schen Parameters, ausgewählt unter Kcat, Km und Kcat/Km, z. B. um mindestens 1 %, wie z. B. 10 bis 1000 %, 10 bis 500 %, oder 10 bis 100 %, der Mutante gegenüber zumindest einer hydroxylierbaren aliphatischen Carbonsäure oder einem hydroxylierbaren Derivat ei- ner aliphatischen Carbonsäure und/oder b) eine Veränderung, ins- besondere Erhöhung, der Regioselektivität bei der Carbonsäure-Hy- droxylierung. So ist z. B. eine Verschiebung der bevorzugten ter- minalen oder subterminalen (#-1, #-2, #-3, #-4, insbesondere #-1 bis-3) Hydroxylierungsposition an wenigstens einer hydroxylier- baren Carbonsäure oder einem hydroxylierbaren Derivat einer ali- phatischen Carbonsäure. Hydroxylierbare aliphatische Carbonsäuren oder Derivate davon, bei denen erfindungsgemäß ein"verändertes Substratprofil"zu beobachten ist, sind verzweigte oder vorzugs- weise geradkettige Carbonsäuren mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen.

Die erfindungsgemäße Veränderung des Substratprofils kann dabei über den gesamten Größenbereich (d. h. Ce-C30) oder nur in Teilbe- reichen, z. B. bei C8-Cl2-, C1o-Cl2-, C12-C30-, C12-C25-oder C12-C2o-Carbonsäuren oder bei einzelnen Carbonsäuren aus diesen Teilbereichen ausgeprägt sein.

Als nichtlimitierende Beispiele für erfindungsgemäß hydroxylier- bare Carbonsäuren sind zu nennen : Capryl-, Pelargon-, Caprin-, Undecan-, Laurin-, Tridecan-, Myristin-, Pentadecan-, Palmitin-, Margarin-, Stearin-, Nonadecan-, Arachin-, Behen-, Lignocerin-, Cerotin-und Melissinsäure. Beispiele für geeignete Carbonsäure- derivate sind C1-C4-Alkylester, Amide oder Anhydride mit vorzugs- weise kurzkettigen C1-C4-Carbonsäuren.

Die erfindungsgemäßen Monooxygenasen sind vorzugsweise abgeleitet von Cytochrom P450 Monooxygenasen der Enzymklasse E. C. 1.14.-.-, insbesondere aus der P450-Familie CYP102, und sind eukaryotischen oder prokaryotischen, insbesondere bakteriellen Ursprungs.

Eine besonders bevorzugte Gruppe von Mutanten ist abgeleitet von Cytochrom P450 Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium mit ei- ner Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, welche wenigstens eine funktionale Mutation in einem der folgenden Aminosäuresequenzbe- reiche aufweist : 24-28,45-51,70-72,73-82 (helix 5), 86-88 (he- lix 6), 172-224 (F/G-loop) und 352-356 (ß-strand 8), mit der Maß-

gabe, dass mehr als einer dieser Bereiche mutiert ist, wenn das Enzym die Mutation F87A trägt ; sowie funktionale Äquivalente die- ser Mutanten.

Die jeweilige Mutation wird im Rahmen der vorliegenden Beschrei- bung im Aminosäure-Einbuchstabencode angegeben. Vor der Zahl, welche die Sequenzposition der Mutation bezeichnet, ist die ur- sprüngliche Aminosäure, nach der Zahl die modifizierte Aminosäure angegeben.

Eine"funktionale Mutation"im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst einen Aminosäureaustausch in den genannten Sequenzberei- chen, welcher zu einem"veränderten Reaktivitätsmuster"bzw.

"veränderten Substratprofil"gemäß obiger Definition führt.

Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß P450 BM-3-Monooxygenase- Mutanten (Gruppe (A)), welche wenigstens je eine funktionale Mu- tation in den Aminosäuresequenzbereichen 86-88,172-224,73-82, 45-51 und 24-28 (gemäß SEQ ID NO : 2) einzeln oder in Kombination umfassen.

So kann beispielsweise Phe87 ersetzt sein durch eine Aminosäure mit aliphatischer Seitenkette, wie z. B. Ala, Val, Leu, insbeson- dere Val oder Ala ; Leul88 kann ersetzt sein durch eine Aminosäure mit Amin-oder Amid-Seitenkette, wie z. B. Asn, Gln, Arg oder insbesondere Lys, oder Aminosäuren wie Ala, Gly, Ser und Trp ; Ala74 kann ersetzt sein durch eine andere Aminosäure mit alipha- tischer Seitenkette, wie z. B. Val und insbesondere Gly ; Arg47 kann ersetzt sein durch eine Aminosäure mit ringförmiger Seiten- gruppe, wie z. B. His, Tyr oder insbesondere Phe ; und Val26 kann ersetzt sein durch eine Aminosäure mit Hydroxyl-Seitengruppe, wie z. B. Ser oder insbesondere Thr.

Bevorzugte Gruppe (A)-Mutanten weist wenigstens eines der folgen- den Aminosäuresubstitutionsmuster auf : a) F87V ; b) F87A, L188K ; c) F87V, L188K ; d) F87A, L188K ; A74G ; e) F87V, L188K, A74G ; f) F87A, L188K, A74G, R47F ; g) F87V, L188K, A74G, R47F ; h) F87A, L188K, A74G, R47F, V26T ; oder i) F87V, L188K, A74G, R47F, V26T ;

sowie funktionale Äquivalente davon.

Eine weitere Gruppe, Gruppe (B), geeigneter Mutanten weist eine einzelne Aminosäuresubstitution in einem der oben genannten Se- quenzbereiche oder in einem der Sequenzbereiche 70-72 und 352-356 auf. In den beiden letztgenannten Sequenzbereichen kann bei- spielsweise Ser72 ersetzt sein durch eine Aminosäure mit alipha- tischer Seitenkette, wie z. B. Ala, Val, Leu, Lle und insbeson- dere Gly, und Met354 kann ersetzt sein duech eine Aminosäure mit Hydroxyl-Seitengruppe, wie z. B. Ser oder insbesondere Thr.

Insbesondere weisen Mutanten der Gruppe (B) eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen auf : a) V26T, b) R47F, c) S72G, d) A74G, e) F87V, f) L188z, worin z für K, R, W, Q, N, G, A oder S steht, und g) M354T ; sowie funktionale Äquivalente davon.

Unter"funktionalen Äquivalenten"versteht man erfindungsgemäß Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenz- positionen eine andere als die konkret genannte Aminosäuresubsti- tution aufweisen, aber trotzdem zu einer Mutante führen, die ebenso wie die konkret genannte Mutante ein gegenüber dem Wildtyp "verändertes Substratprofil"gemäß obiger Definition zeigen.

Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Veränderungen im Reaktivitätsmuster qualitativ übereinstim- men.

"Funktionale Äquivalente"umfassen natürlich auch P450-Monooxyge- nase-Mutanten, welche in gleicher Weise wie die konkret genannten P450 BM3-Mutanten durch Mutation von P450-Enzymen aus anderen Or- ganismen zugänglich sind. Beispielsweise lassen sich durch Se- quenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen. Mit den modernen Methoden des Molecular Modeling können dann in An- lehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente, das Reaktionsmuster beeinflussende Mutationen vorgenommen werden.

"Funktionale Aquivalente"umfassen ebenso die durch eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure-Additionen,-Substituenten,-Dele- tionen und/oder-Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die ge-

nannten zusätzlichen Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit"verändertem Substratprofil"im obigen Sinne führen.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Nukleinsäuresequenzen, ko- dierend für eine mutierte Monooxygenase oder ein"funktionales Aquivalent"gemäß obiger Definition. Diese Sequenzen sind vor- zugsweise von SEQ ID NO : 1 durch Austausch von Codons entspre- chend der obigen Aminosäuresubstitutionsmuster erhältlich.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs-oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten davon. Erfindungsgemäß mit umfasst sind außerdem durch Degeneration des genetischen Co- des (d. h. ohne Veränderung der korrespondierenden Aminosäurese- quenz) oder konservative Nukleotidsubstitution (d. h. die korres- pondierende Aminosäure wird durch eine andere Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhaltene Abwandlungen der Nukleinsäuresequenzen, ebenso wie durch Nukleo- tidaddition,-insertion,-inversion oder-deletion veränderte Se- quenzen, welche für eine erfindungsgemäße Monooxygenase mit"ver- ändertem Substratprofil"kodieren, sowie die korrespondierenden komplemetären Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nuklein- säuresequenzen eine für eine erfindungsgemäße Mutante kodierende Nukleinsäuresequenz ; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stro- maufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regu- lativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestim- mungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknupfbare Se- quenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Selektionsmarker, Amplifia- tionssignale, Replikationsursprünge und dergleichen.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die na- türliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürli- che Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zu- sätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht ent- fernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mu- tiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Beispiele für Promotoren sind : cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR-oder 1-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram- negativen Bakterien Anwendung finden ; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin-oder Phaseolin-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula- tionssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch syn- thetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Ex- pression der Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann bei- spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs- weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder"En- hancer"verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Monooxygenase-Nu- kleotidsequenz sowie einem Terminator-oder Polyadenylierungssi- gnal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations-und Klonierungs- techniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in

T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecu- lar Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fach- mann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Trans- posons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirku- läre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsor- ganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikro- organismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens ei- nem erfindungsgemäßen Vektor transformierbar sind und zur Produk- tion der Mutanten eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und expri- miert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs-und Transfektionsmethoden verwendet, wie beispiels- weise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, re- trovirale Transfektion und dergleichen, um die genannten Nuklein- säuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen.

Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate er- möglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Be- vorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomy- ces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tie- ren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organis- men wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere oder Pflanzen handeln, in denen das korrespondierende endo- gene Gen ausgeschaltet wurde, wie z. B. durch Mutation oder par- tielle oder vollständige Deletion.

Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expres- sionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farb- gebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformier- ten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zell- sortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor trans- formierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikare- sistenzgen (z. B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden se- lektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie bei- spielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen X, [L oder andere temperente Phagen oder Transposons und/ oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff"Expres- sionssystem"die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geei- gnet sind, zu verstehen.

Wie oben beschrieben, kann das Genprodukt vorteilhaft auch in transgenen Tieren, z. B. Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Ebenso ist es möglich, zellfreie Translationssysteme mit der von der Nukleinsäure abgeleiteten RNA zu programmieren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Monooxygenase, wobei man einen Monooxyge- nase-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Monooxygenase induziert und die Monooxygenase aus der Kultur isoliert. Die erfindungsgemäße Monooxygenase kann so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C und einem pH- Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F.

Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) be- schrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Monooxygenase nicht in das Kul- turmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und die Monooxygenase nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewon- nen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultra- schall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen En- zymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufge- schlossen werden.

Eine Aufreinigung der Monooxygenase kann mit bekannten, chromato- graphischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromato- graphie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionen- austausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisa- tion, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte"Tags", wie z. B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epi- tope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (be- schrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press).

Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem üb- liche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem biochemische Verfahren zur enzymatischen Herstellung von terminal oder subterminal ( (O-l bis w-4) hydroxylierten aliphatischen Carbonsäuren, die dadurch ge- kennzeichnet sind, dass man al) einen erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismus in Ge- genwart eines Kulturmediums, das wenigstens eine hydroxylier- bare Carbonsäure oder wenigstens ein hydroxylierbares Carbon- säurederivat enthält, aerob kultiviert ; oder a2) ein Reaktionsmedium, enthaltend wenigstens eine hydroxylier- bare Carbonsäure oder wenigstens ein hydroxylierbares Carbon- säurederivat, mit einer erfindungsgemäßen Mutante aerob inku- biert ; und b) das gebildete hydroxylierte Produkt oder Produktgemisch aus dem Medium isoliert.

Im erfindungsgemäßen Verfahren sind die Carbonsäuren per se, oder Derivate davon, wie insbesondere Cl-C4-Alkylester oder Carbonsäu- reamide, einsetzbar.

Bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren als hydroxylier- bare Carbonsäure C8-C3o-Monocarbonsäuren oder Derivate davon ein- setzt.

Besonders bevorzugt verwendet man im erfindungsgemäßen Verfahren als hydroxylierbare Carbonsäure eine C8-Cl2-Monocarbonsäure oder ein Derivat davon und als Monooxygenase eine Mutante gemäß obiger Gruppe (A).

Gemäß einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man als hydroxylierbare Carbonsäure eine C12-C3o-Monocarbonsäure oder ein Derivat davon und als Monooxygenase eine Mutante ausgewählt unter den Einfachmutanten F87A, F87V, V26T, S72G, A74G und M354T, und den Mehrfachmutanten f) bis i) gemäß obiger Gruppe (A) einsetzt.

Die erfindungsgemäße Oxidationsreaktion wird gewöhnlich in Gegen- wart von Luftsauerstoff sowie in Gegenwart eines Elektronendonors (oder Reduktionsäquivalents), wie insbesondere NADH, NADPH und

Zn/Co (III) sepulchrat, durchgeführt. Die Verwendung von Zn/Co (III) sepulchrat ist beispielsweise in der DE-A-199 35 115 beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Wird die erfindungsgemäße Hydroxylierung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z. B. TB-oder LB-Medium bei ei- ner Kultivierungstemperatur von etwa 20 bis 40 °C und einem pH- Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Die Zugabe von exogenem Substrat erfolgt je nach Bedarf. Um die Oxidationsreaktion besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren, insbesondere temperaturindu- zierbaren, Promotors. Man erhöht dabei die Temperatur auf die er- forderliche Induktionstemperatur, z. B. 42 °C beim PrPl-Promotor, behält dies über einen ausreichenden Zeitraum, z. B. 1 bis 10 oder 5 bis 6 Stunden, zur Expression der Monooxygenase-Aktivität bei und verringert anschließend der Temperatur wieder einer Wert von etwa 30 bis 40 °C. Die Kultivierung wird dann in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt.

Wird die erfindungsgemäße Oxidation dagegen mit gereinigtem oder angereichertem Enzym durchgeführt so löst man die erfindungsge- mäße Enzymmutante in einem exogenes Substrat enthaltenden Medium (etwa 0,01 bis 10 mM, oder 0,05 bis 5 mM), und führt die Umset- zung, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff, bei einer Tempe- ratur von etwa 10 bis 50 °C, wie z. B. 30 bis 40 °C, und einem pH- Wert von etwa 6 bis 9 (wie z. B. eingestellt mit 100 bis 200 mM Phosphat-oder Tris-Puffer), sowie in Gegenwart eines Reduktions- mittels durch, wobei das Substrat-haltige Medium außerdem bezogen auf das zu oxidierende Substrat einen etwa 1-bis 100-fachen mola- ren Überschuß an Reduktionsäquivalenten qufweisen kann. Die Zu- gabe des Reduktionsmittels kann falls erforderlich portionsweise erfolgen.

Falls erforderlich kann Sauerstoff in an sich bekannter Weise in das Reaktionsmedium eingeleitet werden.

Werden die erfindungsgemäßen Verfahren mit angereichertem oder gereinigtem Enzym durchgeführt, so kann man beispielsweise fol- gende Reaktionbedingungen einstellen : Substratkonzentration : 0, 1 bis 20 mg/ml Enzymkonzentration : 0,1 bis 10 mg/ml Reaktionstemperatur : 20 bis 40 °C

pH : 6 bis 8 Puffer : 0,05 bis 0,2 M Kaliumphosphat, oder Tris/HCl Elektronendonor : wird bevorzugt portionsweise zu- gegeben (Anfangskonzentration etwa 0,1 bis 2 mg/ml).

Vor dem Start der Reaktion durch Zugabe der Elektronendonors kann zur Aktivitätssteigerung Aceton in einer Konzentration von 1 bis 5 % (v/v) zugegeben und kurzzeitig (1 bis 5 Minuten) vorinkubiert werden (bei etwa 20 bis 40 °C).

Der Fachmann kann, abweichend davon, durch routinemäßige Versuche die jeweiligen Reaktionsbedingungen optimieren.

Zur Erzeugung von Varianten mit modifizierten enzymatischen Ei- genschaften stehen im Rahmen des Protein-Engineerings zwei unter- schiedliche Strategien zur Verfügung : zum einen die Methode des "rationalen Designs" (4) sowie die Methode der"gezielten Evolu- tion" (5-7). Für ein erfolgreiches rationales Design ist ein hochaufgelöstes dreidimensionales Strukturmodell sowie eine ver- tiefte Kenntnis des Enzymmechanismus von zentraler Bedeutung.

Während für das rationale Design die Fähigkeit gezeigt wurde, En- zymmutanten zu erzeugen, welche hohe Aktivität gegenüber nicht- natürlichen Substraten besitzen (4) ist der Effekt punktförmiger einzelner Aminosäuresubstitutionen auf die Stabilität, Aktivität und Spezifität der Mutanten häufig nicht vorhersagbar.

Obwohl Röntgenstrukturen von P450 BM-3 in der Protein-Data Bank (8) hinterlegt wurden, ist die Konformation von Substrat und P450 während des kritischen Hydroxylierungsschrittes weiterhin unklar (9-11). Für die Methode der gezielten Evolution ist eine effi- ziente Nachweismethode für ein schnelles Screening großer Biblio- theken von Zufallsmutanten von zentraler Bedeutung. Ein optischer Test für die P450 BM-3-Mutante F87A, welche-para-Nitrophenoxy- carbonsäuren (pNCA) verwendet, hat sich als brauchbar erwiesen (12,13). Die Einzelmutante F87A verschiebt die Hydroxylierungs- position von Fettsäuren von der Position-1,-2 und-3 in Richtung der-Position (13) und führt außerdem zu einer voll- ständigen Umwandlung von 12-pNCA im Vergleich zu einer 33 % igen Umwandlung, welche man für das Wildtyp-Enzym beobachtet (12). Da jedoch die Monooxygenase-Domäne von P450 BM-3 mehr als 400 Amino- säuren umfasst, kommt das Screening einer Bibliothek von Zufalls- mutanten der Suche nach einer Nadel im Heuhaufen gleich.

Zur Verbesserung der Effizienz der Suchprozedur wurde erfindungs- gemäß das Verfahren des rationalen Designs mit dem Verfahren der gezielten Evolution kombiniert, um Mutanten mit modifizierter Reaktivität, insbesondere zur Erzeugung von Mutanten mit Spezifi- tät für Fettsäuren mittlerer Kettenlänge, zu erzeugen. Die erfin- dungsgemäße Methode der"rationalen Evolution"basiert auf einem Computer-unterstützten Protein-Modeling, um eine virtuelle Zu- falls-Bibliothek zu erzeugen und um Reste zu identifizieren, die mit hoher Wahrscheinlichkeit die gewünschten Eigenschaften beein- flussen. Eine Unter-Bibliothek wird durch Randomisierung dieser Reste erzeugt und auf positive Mutanten gescreent. Ausgehend von einem Strukturmodell beginnt man mit der Bestimmung von Resten, welche möglicherweise für die Kettenlängenspezifität von Bedeu- tung sind. Zur Erzeugung von Mutanten mit verbesserten Eigen- schaften wird die durch das Modell vorgeschlagene Mutationsstelle mit Hilfe der Sättigungsmutagene modifiziert. Anschließend werden dann die Einzelmutanten mit den besten Eigenschaften unter Be- rücksichtigung des rationalen Designs miteinander kombiniert. Un- ter Anwendung dieser kombinierten Strategie konnte insbesondere die Aktivität von P450 BM-3 für Substrate mittlerer Kettenlänge verbessert werden.

Unter Anwendung dieser Strategie und aufgrund der Sequenzhomolo- gie zu P450-Enzymen anderen Ursprungs wird es dem Fachmann ermög- licht in analoger Weise weitere Mutanten herzustellen, welche ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind.

Die vorliegende Erfindung wird nun durch folgende experimentelle Beschreibung und unter Bezugnahme auf beiliegende Figuren näher erläutert. Dabei zeigt : Figur 1 die schrittweise Optimierung von P450 BM-3 für das neue Substrat 8-pNCA. Die katalytische Effizienz gegenüber 8-pNCA ist für jede Mutante (in der Einheit s-lM-l) angegeben ; und Figur 2 ein Modell des Komplexes der P450 BM-3-Mutante LARVF mit dem Substrat 8-pNCA. Die Seitenketten, welche die fünf besten Mutationspositionen aufweisen und die zur Mutante LARVF kombi- niert wurden, sind dargestellt (V26T, R47F, A74G, F87V, L188K).

Methode 1 : Modellierung des Substrat-P450 BM-3-Komplexes Die Modellierung des Substrat-Enzym-Komplexes basierte auf der kristallographisch bestimmten Struktur von P450 BM-3, komplexiert mit Palmitoleinsäure (9). Diese Struktur ist bei der Protein-Data Bank hinterlegt (8). Die beschriebene Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,9 A enthält vier Moleküle in einer asymmetrischen

Einheitszelle. Kette A wurde als Referenz für den modellierten Komplex ausgewählt. Als Substratmolekül wurde ein Modell von 8-pNCA unter Verwendung des"Molecule Builder"von SYBYL (Tripos, Inc., St. Louis, USA) erzeugt. Die F87A-Mutation wurde unter Ver- wendung des Biopolymer-Tools von SYBYL erzeugt. Die C-Atome 1 bis 4 des Substrats wurden in die Bindungsstelle entsprechend den C- Atomen 6 bis 9 der gebundenen Palmitoleinsäure plaziert. Die Tor- sionswinkel der Fettsäurekette wurden entsprechend der Trans-Kon- figuration gewählt. NMR-Untersuchungen für P450 BM-3-Laurat-und -12-Bromlaurat-Komplexe zeigten, dass die Protonen der hydroxy- lierten C-Atome (C10 und Cll) etwa 3,0 A vom Häm-Eisen in der Oxidationsstufe II entfernt sind (10,13). Auf der Basis dieses Ergebnisses wurden die entsprechenden Atome C7 und C8 von 8-pNCA in einem Abstand von 4 A bzw. 3,6 Å vom Häm-Eisen platziert. Die para-Nitrophenoxygruppe wurde manuell in der Bindungstasche an- geordnet. Außerdem wurde die Energie des Komplexes über fixierte Backbone-Atome minimiert.

Methode 2 : Sättigungsmutaqenese Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten wurden mit Hilfe der Sättigungsmutagenese unter Verwendung des Stratagene QuikChange Kit (La Jolla, Kalifornien, USA) hergestellt. Neun Positionen in der Umgebung des Substrat-Bindungskanals, und zwar P25, V26, R47, Y51, S72, A74, F87, L188 und M354, wurden für die Mutation über das P450 BM-3-Modeling ausgewählt. Die Primer für jede dieser Positionen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 : ausge-Primer Sequenz Nr. wählte Posi- tionen P25 5'-gttattaaacacagataaannngttcaagctttgatg-3'SEQ ID NO : 9 5'-catcaaagcttgaacnnntttatctgtgtttaataac-3'SEQ ID NO : 10 V26 5'-gttattaaacacagataaaccgnnncaagctttgatg-3'SEQ ID NO : 11 5'-catcaaagcttgnnncggtttatctgtgtttaataac-3'SEQ ID NO : 12 R47 5'-cgaggcgcctggtnnngtaacgcgctacttatc-3'SEQ ID NO : 13 5'-gataagtagcgcgttacnnnaccaggcgcctcg-3'SEQ ID NO : 14 Y51 5'-cctggtcgtgtaacgcgcnnnttatcaagtcagc-3'SEQ ID NO : 15 5'-gctgacttgataannngcgcgttacacgaccagg-3'SEQ ID NO : 16 S72 5'-gctttgataaaaacttannncaagcgcttaaatttgtacg-3'SEQ ID NO : 17 5'-cgtacaaatttaagcgcttgnnntaagtttttatcaaagc-3'SEQ ID NO : 18 A74 5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3'SEQ ID NO : 7 5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3'SEQ ID NO : 8 L188 5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3'SEQ ID NO : 5 5'-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3'SEQ ID NO : 6

M354 5'-ggcgacgaactannngttctgattcctcag-3'SEQ ID NO : 19 5'-ctgaggaatcagaacnnntagttcgtcgcc-3'SEQ ID NO : 20 F87 5'-gcaggagacggggttgnnnacaagctggacg-3'SEQ ID NO : 3 5'-cgtccagcttgtnnncaaccccgtctcctgc-3'SEQ ID NO : 4 Die Reaktionsbedingungen waren für alle mutagenen PCR-Verfahren identisch, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, welche in fol- gender Weise variiert wurde : 50 °C für die Positionen 25,26,188 und 354 ; 52 °C für die Positionen 47 und 51 ; und 46 °C für die Positionen 72,74 und 87. Die Reaktionen wurden in 50 1 Reakti- onsvolumen durchgeführt, wobei jeder Ansatz 17,5 pmol jedes Pri- mers, 20 pmol der Template-Plasmid-DNA, 3 U der Pfu-Polymerase und 3,25 nmol jedes dNTP enthielt. Die Reaktion wurde bei 95 °C, 4 Minuten, gestartet, anschließend wurde 20-mal folgender Thermo- cyclus durchlaufen : 95 °C, 1 Min. ; 46-52 °C, 2,5 Min. ; 72 °C, 17 Min. ; nach diesen 20 Cyclen wurde die Reaktion 15 Minuten bei 72 °C fortgesetzt. Für die ortsspezifische Mutagenese durch PCR wurde ein Einzelcodon für den Austausch einer Aminosäure verän- dert. Für die Randomisierung einer spezifischen Aminosäure wurden Primer verwendet, in denen"nnn"für die spezifische Aminosäure codiert. Alle PCR-Produktlösungen wurden mit 20 U DpnI bei 37 °C über 3 Stunden behandelt, um die ursprüngliche, nicht-mutierte Template-DNA zu verdauen. Anschließend erfolgte die Transforma- tion in E. coli DH5a.

Methode 3 : Expression und Reinigung von Wildtyp-Enzym sowie der Mutanten Das P450 BM-3-Wildtyp-Gen und dessen Mutanten wurden unter der Kontrolle des starken, Temperatur-induzierbaren PRPL-Promotors pCYTEXPl in E. coli Stamm DH5a (supE44, lacU169 [801acZ M15] hsdRl7 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl) exprimiert. Die einzelne Punktmutation F87A wurde, wie aus dem Stand der Technik bekannt (12), eingeführt. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Agar- platten ausplattiert, welche 100 µg/ml Ampicillin enthielten.

Nach 12-bis 24-stündigem Wachstum wurden die Kolonien mit steri- len Zahnstochern aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Ver- tiefungen plaziert, wobei jede Vertiefung 200 µl TB-Medium (12 g Tryptophan, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glyzerin, H20 (dest.) ad. 1 Li- ter) mit 100 Fg/ml Ampicillin enthielt. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 40 p1 aus jeder Vertiefung entnommen und in Kulturröhrchen überführt, welche 2 ml TB-Medium mit 100 Fg/ml Ampicillin enthielt, und anschließend wurde 2 Stunden bei 37 °C und dann 6 Stunden bei 42 °C inkubiert.

Die Zellen wurden bei 4000 Upm 5 Minuten abzentrifugiert, mit Ly- sozym aus Hühnereiweiß (1 U/ml) behandelt und dann zweimal gefro- ren und aufgetaut. Die Zell-Rohextrakte erhielt man durch 10-mi- nütige Zentrifugation bei 14000 Upm. Der so erhaltene Überstand

wurde für die Aktivitätsmessung eingesetzt. Zur Herstellung gro- ßer Enzymmengen wurde ein 2 1-Schüttelkolben mit 300 ml TB-Medium mit 100 Ag/ml Ampicillin verwendet, bei 37 °C inkubiert und 2 Stunden bei 200 Upm geschüttelt (OD578nm = 0, 8 bis 1,0) und an- schließend 6 Stunden bei 42 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 4000 Upm gesammelt und in 15 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4 suspendiert. Die eisgekühlte Suspension wurde mit Hilfe eines Branson Sonifiers W25 (Dietzen- bach, Deutschland) (80 W, 2 Minuten, 3 Cyclen) aufgeschlossen.

Die Suspension wurde 20 Minuten bei 32570 x g zentrifugiert. Die Rohextrakte wurden zur Bestimmung der Enzymaktivität oder zur En- zymreinigung verwendet.

Die Enzymreinigung wurde wie in (14) beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch eine BioPilot-Chromatographieanlage (Pharmacia, Schweden) verwendet wurde. Die Reinheit des Enzyms wurde durch Bestimmung des Gesamtproteins sowie der Menge des Enzyms festge- stellt. Die Konzentration an gereinigtem Enzym wurde über die Differenz zwischen dem Extinktionsspektrum des Carbonylkomplexes der Eisen- (II)-form im Vergleich zur Eisen- (II)-form unter Ver- wendung einer molekularen Absorptivität von 91 mM-1 cm-1 für das Wellenlängenpaar 450 nm und 490 nm bestimmt (1).

Methode 4 : Isolierung von Mutanten mit höherer Aktivität für Sub- strate kürzerer Kettenlänge Die Mutante F87A von P450 BM-3 wurde anstelle des Wildtyps als Template-DNA verwendet. Die Mutationen für die jeweilige Position wurden wie oben beschrieben hergestellt. Jeweils etwa 100 Kolo- nien wurden zur Durchmusterung des Sequenzraumes an jeder Posi- tion gepickt, in Kulturröhrchen kultiviert und Zellen wurden da- raus isoliert und lysiert. Die Zell-Rohextrakte einer jeden aus- gewählten Kolonie wurden für den Aktivitätstest verwendet. Sämt- liche Mutanten, die im Vergleich zu F87A eine höhere Aktivität für wenigstens ein Substrat mit einer kürzeren Kettenlänge als 15-pNCA zeigten, wurden zur Bestimmung der Mutationen sequen- ziert.

Die Mutante mit der jeweils höchsten Aktivität für 12-pNCA, 10-pNCA oder 8-pNCA von allen Mutanten für die gleiche Position wurde für eine spätere Kombination mit anderen Mutationen ausge- wählt. Die kombinierte Mutation wurde schrittweise durch ortsspe- zifische Mutagenese ausgeführt. Der Kombinationsweg ist in Figur 1 dargestellt. Sechs Kolonien wurden für jeden Kombinations- schritt für die Bestimmung der Substratspezifität isoliert. Eine Kolonie mit repräsentativer Substratspezifität wurde ausgewählt und die Substratspezifität wurde für das reine Enzym bestimmt.

Das Plasmid der ausgewählten Kolonie wurde für den nächsten Schritt der ortsspezifischen Mutagenese verwendet. Die Mutationen in der Endmutante wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt (ABI PRISMR BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit und ABI PrismTM 377 DNA Sequencer).

Methode 5 : Enzym-Aktivitätstest Für den pNCA-Aktivitätstest wurden 8 µl einer 10 mM pNCA-Lösung in DMSO in einer Einwegküvette in einem Endvolumen von 1 ml ver- wendet. Nach Zugabe von 850 1 Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 8,2) und 0,1 bis 0,4 nmol P450 zu der jeweiligen pNCA-DMSO-Lösung wur- den die Proben 5 Minuten vorinkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer wässrigen Lösung von 1 mN NADPH gestartet wurde. Zur Bestimmung von Kcat und Km wurde eine Konzentrations- reihe für die verschiedenen pNCA-Substrate erstellt (bezüglich Details des Nachweisverfahrens kann auf (12) verwiesen werden).

Zur Durchführung des pNCA-Tests in einer Mikrotiterplatte wurde eine Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner, Frickenhausen, Deutsch- land) verwendet. Der Reaktionsansatz enthielt in einem Gesamtre- aktionsvolumen von 250 1 in Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 8,2) ent- weder 60 nmol 8-pNCA, 15 nmol 10-pNCA, 15 nmol 12-pNCA oder 15 nmol 15-pNCA, jeweils gelöst in 2,5 1 DMSO. Nach 5-minütiger Vorinkubation mit 40 1 P450 BM-3-Proben wurde die Reaktion durch Injektion von 30 µl einer 1 mM NADPH-Lösung in jede Vertiefung gestartet. Die Platten wurden unmittelbar nach Zugabe der NADPH- Lösung auf einem Platten-Lesegerät bei 405 nm vermessen.

Methode 6 : Umsetzung von Carbonsäuren mit erfindungsgemäßen Mu- tanten und Bestimmung der Produkte a) Chemische Reaktion Für die Hydroxylierung der Fettsäuren in Anwesenheit von P450 BM-3 bzw. seiner Mutanten wurde folgender Ansatz gewählt : P450 BM-3-Mutante 20 mg Reaktionspuffer 20 ml (Tris/HCl 50mM, KC1 250mM, pH 7,8) Fettsäure 10 mg Aceton 400 µl (2 % v/v) (beschleunigt Reaktion um Faktor 2)

Das Enzymlyophylisat wurde vor der Reaktion in 1 ml Reaktionspuf- fer gelöst und zunächst 30 min bei 36 °C inkubiert. Die Inkubation führt wie die Zugabe von 2 Vol.-% Aceton zu einer Aktivitätsstei- gerung von 60 bzw. 75 %.

Nach 5-minütiger Inkubation erfolgte die Zugabe von 500 1 der vorbereiteten NADPH-Lösung (12,5 mg/ml). Der Verlauf der Reaktion wurde durch Absorptionsmessungen bei 340 nm verfolgt, wobei der Verbrauch von NADPH beobachtet werden kann. Für eine stöchiome- trische Umsetzung wären theoretisch 4 ml NADPH-Lösung notwendig, eine zu hohe Konzentration an NADPH in der Reaktionslösung führt jedoch zur Inaktivierung des Enzyms, deshalb wird der Cofaktor in 500 pl-Schritten zugegeben.

Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung mit 5M Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert. Dabei fallen die Fettsäu- ren bzw. hydroxylierten Fettsäuren aus und führen zu einer sicht- baren Trübung der Lösung. Danach wurde zweimal mit je 10 ml Dich- lormethan extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Nach der Filtration über einen Faltenfilter erfolgte die Entfernung des Dichlormethans am Rotationsverdampfer oder durch Eindampfen mit Stickstoff. Der verbliebene weiße Feststoff wurde dann wieder in 2 ml Dichlormethan aufgenommen und für die GC-Analyse verwendet. b) Gaschromatographische Analyse Für die Analyse wurde ein Fisons Gaschromatograph (Fisons Instru- ments Mega Series, Mainz, Deutschland) mit FID verwendet (Optima 5-Säule, 25 m x 0,25 mm ID, Macherey & Nagel, Düren, Deutsch- land).

Zur Analyse wurden Edukte und Produkte mit MSHFBA silyliert. Da- bei werden alle Hydroxyl-und Säuregruppen in die entsprechenden Trimethylsilylether bzw.-ester umgewandelt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Probe wasserfrei ist, da es sonst zu Nebenreak- tionen mit dem Silylierungsagens kommt. Zu 10 1 der hydroxyfett- säurehaltigen Dichlormethan-Lösung wurden 15 1 MSHFBA pipettiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 25 1 Dichlormethan erfolgte die GC-Analyse.

Dazu wurde 1 il der silylierten Proben in den Gaschromatographen eingespritzt. Injektor-und Detektortemperatur lagen bei 350 °C.

Folgende Temperaturprogramme wurden verwendet :

Caprylsäure 5/min 10°/min 100 oc (2 min) 50/min-0-200 200 °C l0°/min 300 °C (5 min) Caprinsäure 100 50/min 140 °C (5 min) o 300 C (5) Laurinsäure 5/min 10/min 50/min 170 °C (5 min) o 300 C () Beispiel 1 : Selektion der Anfangsmutante Die Einzelmutante F87A von P450 BM-3 wurde als Ausgangs-Template verwendet. Wie bereits erwähnt, wird durch diese Mutation die Hy- droxylierungsposition in gesättigten C12-und C14-Fettsäuren von und#-3#-1,#-2 in Richtung verschoben(13).Für#-Position die Umsetzung von 12-pNCA und 15-pNCA wurde ebenfalls gezeigt, dass die-Hydroxylierung im Vergleich zum Wildtyp signifikant verstärkt wird (12). Für die w-Hydroxylierung von 12-pNCA erhielt man eine vollständige Umwandlung, verglichen mit einer 33 % igen Umwandlung für den Wildtyp. Zusätzlich zur erhöhten Regioselekti- vität beobachtete man auch erhöhte Aktivitäten für 12-pNCA und 15-pNCA (vergleiche Tabelle 2).

Tabelle 2 : Spezifische Aktivität ausgewählter P450 BM-3-Mutanten pNCA-DerivatemitunterschiedlicherKettenlänge1fürverschiede ne Sub-WT F87A L188K V26T R47F S72G A74G M354T strat 15-pNCA 405 410 288 519 258 439 474 560 12-pNCA 141 284 316 555 233 596 517 480 10-pNCA 339 92 207 106 52 150 103 171 8-pNCA 15 2 69 16 13 3 6 4 1 Einheiten spezifischer Aktivität : nmol/min/nmol P450 Die erhöhte Regioselektivität von F87A ist anhand des Strukturmo- dells verständlich. Die Substitution des sperrigen Restes F87 durch Alanin vergrößert die Bindungstasche für die p-Nitropheno- xygruppe, welche durch F87, außerdem durch V78, A82, T260, I263 und A264 gebildet wird. Außerdem wird der Zugang der großen p-Ni- trophenoxygruppe zur Bindungstasche erleichtert und die steri- schen Wechselwirkungen zwischen F87 und den C-Atomen-2 und-1 der pNCA werden eliminiert. Dies ermöglicht eine vorteilhaftere Orientierung der-Position gegenüber dem Häm-Eisenatom. Beispiel 2 : Selektion einzelner Mutationspositionen durch Mode- ling, ortsspezifische Randomisierungsmutagenese ausqewählter Positionen und Screening

1. Selektion der Mutationspositionen Das Modell des gebundenen C8-pNCA-Substrats zeigt, dass sich das Carboxylat in einem Abstand von 9 und 11 Å zu den Carboxylat-bin- denden Resten R47 bzw. Y51 befindet. Um Aktivität gegenüber C8-Substraten zu induzieren, ist es erforderlich, eine neue Bin- dungsstelle zu erzeugen, welche sich in geeigneter Distanz zur Carboxylatgruppe des Substrats befindet. Zur Erleichterung der Bindung von 8-pNCA sollten zusätzliche Reste innerhalb der Bin- dungsstelle positioniert werden. Folgende Reste wurden ausge- wählt : Die Reste R47 und Y51, welche die ursprüngliche Carboxy- lat-Bindungsstelle bilden. Für R47 wird die Bildung eines Ionen- paares zwischen dessen Guanidiniumgruppe und dem Carboxylatrest des Substrats vorgeschlagen ; Y51 bildet eine H-Brücke mit der Carboxylatgruppe des Substrats (9). Für den Palmitoleinsäure/P450 BM-3-Komplex beträgt die Distanz zwischen dem Ca-Atom von R47 und dem C-Atom der Fettsäurecarboxylatgruppe 12 A. Sämtliche Reste in der Hemisphäre mit einem 12 A-Radius um die Carboxylatgruppe des 8-pNCA-Modells wurden bestimmt und nur solche innerhalb der Bin- dungstasche mit Seitenketten, die in Richtung der Carboxylat- gruppe der Fettsäure weisen, wurden ausgewählt. So wurden P25, V26, S72, A74, L188 und M354 ausgewählt, welche wahrscheinlich eine neue Carboxylat-Bindungsstelle für kurzkettige pNCA-Verbin- dungen ausbilden könnten. Diese sechs ausgewählten Reste befinden sich auf sekundären Strukturelementen mit flexibler Konformation (11).

2. Mutation und Screening Mutanten von jedem der acht ausgewählten Reste wurden durch orts- spezifische Randomisierung des Wildtyp-Codons an den entsprechen- den Positionen erzeugt. Um sicherzustellen, dass die meisten der 19 möglichen Arten von Aminosäuren getestet werden, wurden 100 Kolonien einer jeden Position isoliert, kultiviert und auf Akti- vität getestet. (Damit beträgt die Wahrscheinlichkeit, jede Ami- nosäure zu testen, mehr als 95 %, ausgenommen einer Wahrschein- lichkeit von 79 % für Tryptophan und Methionin). Die Mutanten mit einem höheren Aktivitätswert für wenigstens ein Substrat mit kür- zerer Kettenlänge als 15-pNCA wurden für die Sequenzierung zur Bestimmung der Mutation (Mutationen) ausgewählt.

Es zeigte sich, dass Position 188 relativ variabel ist. Die mei- sten der 100 Kolonien zeigten Aktivität für pNCA. Daraus wurden entsprechend ihrer Aktivität gegenüber 8-pNCA 37 Kolonien ausge- wählt. 16 verschiedene Aminosäuretypen, einschließlich dem Wild- typ wurden detektiert. Dieses Ergebnis bestätigte außerdem, dass die Auswahl von 100 Kolonien ausreichend war, um sicherzustellen, dass die meisten der 20 möglichen Aminosäuren getestet werden können. Von den 15 Substitutionen erhöhten die Substitutionen K, R, W, Q, N, G, A und S signifikant die katalytische Aktivität für Substrate mit kürzerer Kettenlänge. Die Substitution von L durch negativ geladene Aminosäuren führte zu einer Verringerung der Ak- tivität gegenüber 10-pNCA, 12-pNCA und 15-pNCA um das Drei-bis Siebenfache.

Die anderen sieben Positionen wurden in ähnlicher Weise wie Posi- tion 188 randomisiert. Von jeder Position wurden 7 bis 19 Kolo- nien für die DNA-Sequenzierung zum Nachweis der Mutation (Muta- tionen) ausgewählt. Die meisten dieser Gene waren entweder nicht mutiert oder das Genprodukt zeigte eine verringerte Aktivität für Substrate kürzerer Kettenlänge (Tests wurden mit reinem Enzym durchgeführt). Jeweils nur eine Mutante der Positionen 26,47,74 und 354, zwei Mutanten der Position 72 und keine Mutante der Positionen P25 und Y51 zeigte im Vergleich zu 15-pNCA für Sub- strate kürzerer Kettenlänge eine höhere Aktivität. Die Mutante mit der höchsten Aktivität für 8-pNCA in Position 188 und Posi- tion 72 sowie sämtliche Einzelmutanten der Positionen 26,47,74 und 354 wurden für eine Kombination ausgewählt. Diese Mutationen, welche in obiger Tabelle 2 aufgelistet sind, enthalten folgende Substitutionen : V26T, R47F, S72G, A74G, L188K und M354T. Im Ver- gleich zu F87A erhöhte sich die spezifische Aktivität gegenüber 8-pNCA um den Faktor 0,5 bis 33,5. Jede dieser Mutationen wurde mit der Ursprungsmutation F87A schrittweise kombiniert.

Beispiel 3 : Mehrfachmutanten, hergestellt durch schrittweise Kom- bination von Mutanten und deren Screening 1. Mutante L (F87A, L188K) Die Auswahl der ersten Mutante ist kritisch, da die Kombination von Einzelmutanten nicht notwendigerweise in einer Kumulation der Einzeleffekte resultiert. Eine falsche Auswahl der ersten Muta- tion könnte in die Richtung eines Evolutionsweges lenken, der nicht zu einer optimalen Mehrfachmutation führt. Im Falle eines großen Ausgangspools von Einzelmutanten ist daher eine enorme kombinatorische Vielfalt wahrscheinlich, und das Auffinden der gewünschten Mehrfachmutante ist folglich unwahrscheinlich.

Zwei Kriterien sprechen für die Auswahl der Mutante L als Aus- gangspunkt : deren erhöhte Aktivität gegenüber 8-pNCA im Vergleich zu allen anderen Mutanten (Tabelle 2) sowie die Veränderungen in der Enzym-Substratwechselwirkung und den Eigenschaften der Bin- dungsstelle. Zur Verifizierung dieser Veränderungen wurden Struk- turmodelle der ausgewählten Mutanten dadurch erzeugt, dass man die Seitenketten der Mutationspositionen mit Hilfe der SYBYL-Me- thode ersetzte. L188 ist am C-Terminus der a-Helix F lokalisiert.

Diese Helix und die benachbarten G Helices erfahren die größte Verschiebung durch eine Substratbindung (9). Das Modell veran- schaulicht, dass ein Austausch von Leucin durch Lysin zur Bildung einer neuen putativen Carboxylat-Bindungsstelle führt. Der Ab- stand zwischen der Aminogruppe von K188 und dem Carboxylatrest von 8-pNCA beträgt 6 A und ist somit vergleichbar mit dem experi- mentell bestimmten Abstandswert für die Carboxylatgruppe der Pal- mitoleinsäure und der Guanidiniumgruppe von R47 (dem ursprüngli- chen Bindungsrest). Die Distanz zwischen der Guanidiniumgruppe von R47 und der Carboxylatgruppe von 8-pNCA beträgt 11,4 Å. Es kann daher vorgeschlagen werden, dass die Ionenpaar-Wechselwir- kungen zwischen der Carboxylatgruppe des Substrates und K188 zu- sammen mit dem hydroxylierten C8-Atom in reaktiver Distanz zum Häm-Eisenatom erfolgen.

Die anderen fünf Mutanten wurden schrittweise mit der Mutante L durch ortsspezifische Mutagenese kombiniert (vergleiche Figur 1).

Für jeden Mutagenese-Schritt wurde ein Strukturmodell der selek- tierten Mutanten erzeugt. Anhand dieses Modells wurden die Ein- flüsse der erzeugten Mutanten auf die Substratbindung untersucht und eine rationale Erklärung für die optimierten Eigenschaften der Mutanten und ihrer Kombinationen wurde davon ausgehend vorge- schlagen.

2. Mutante LA (F87A, L188K, A74G) Die katalytische Effektivität gegenüber 8-pNCA erhöhte sich durch Einführung der Mutation A74G in die Mutante L. A74 befindet sich am N-Terminus der a-Helix B'. Da die Seitenkette von A74 sterisch mit der Aminogruppe von K188 interagiert, wird durch einen Aus- tausch von A74 durch Glycin diese Wechselwirkung eliminiert, wo- durch eine vorteilhaftere Orientierung der Seitenkette gegenüber der Carboxylatgruppe des Substrats ermöglicht wird.

3. Mutante LAR (F87A, L188K, A74G, R47F) Die Verbesserung der katalytischen Effizienz für 8-pNCA gelang durch Einführung der zusätzlichen Mutation R47F. Die Mutation R47F hat zwei mögliche Effekte. Phenylalanin behindert die ur-

sprüngliche Carboxylatbindung und vergrößert den dem Lösungsmit- tel ausgesetzten hydrophoben Abschnitt am Eingang des Bindungska- nals, der von den Resten Fll, L14, L17, P18, P45 und A191 gebil- det wird (vergleiche Figur 2). Dieser hydrophobe Abschnitt ist von besonderer Bedeutung für die Substratanbindung (11).

4. Mutante LARV (F87A, L188K, A74G, R47F, V26T) Wird die Mutation M354T der Mutante LAR hinzugefügt, so verrin- gert sich Kcat für 8-pNCA. M354T wurde deshalb aus weiteren Kom- binations-Versuchen ausgeklammert. Fügt man jedoch die Mutation V26T der Mutante LAR zu, so zeigt die resultierende Mutante LARV einen geringfügig höheren Kcat-Wert und einen geringfügig gerin- geren Km-Wert als LAR. Die katalytische Effizienz gegenüber 8-pNCA erhöhte sich. Wird statt dessen die Mutation S72G in der Mutante LAR durchgeführt, so verringerte sich Kcat für 8-pNCA.

Aus diesem Grund wurde die Mutante LARV für weitere Mutationen ausgewählt.

V26 ist am N-Terminus der a-Helix A lokalisiert. Das Modell weist darauf hin, dass T26 die Rolle des ursprünglichen Restes Y51 der Bindungsstelle übernehmen könnte und die Carboxylatgruppe des Substrates durch Ausbildung einer H-Brücke stabilisieren könnte.

Der Abstand zwischen der Hydroxylgruppe von T26 und der Amino- gruppe von K188 beträgt 6,9 &. Verglichen mit der ursprünglichen Bindungsstelle ist dieser Abstand um etwa 2 Å größer (4,8 Å zwi- schen der Hydroxygruppe von Y51 und der Guanidiniumgruppe von R47). Es besteht somit die Möglichkeit, dass die K188-haltige F- Helix weiteren Konformations-Änderungen unterzogen wird, aufgrund derer 8-pNCA tiefer in der Bindungsregion festgehalten wird und die Distanz zwischen T26 und K188 verringert wird.

5. Mutante LARVF (F87V, L188K, A74G, R47F, V26T) Es konnte gezeigt werden, dass Position 87 von besonderer Bedeu- tung für die katalytische Aktivität und die Substratspezifität des Enzyms ist (3,13). Die Mutante LARV wurde deshalb in Posi- tion 87 durch ortsspezifische randomisierte Mutagenese optimiert.

Von 100 Kolonien wurde eine Mutante erhalten, welche eine kataly- tische Effizienz von 3,5*104 s-l M-1 gegenüber 8-pNCA zeigte. Die DNA-Sequenzdaten ergaben, dass Alanin in Position 87 durch Valin ersetzt war.

Aus der Kristallstruktur (11) und früheren Experimenten (3,13) ist bekannt, dass R87 wichtig für den Zugang des Substrates zum Häm-Eisen ist. Die sperrige para-Nitrophenylgruppe dieses Sub- strats machte es notwendig, die Größe der Bindungsstelle durch

den Austausch von Phenylalanin durch Alanin zu erhöhen. Durch den Austausch von A87 durch Valin wird der Kontakt von C. mit dem Häm- Eisenatom aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen dem Ethersauerstoff und der Seitenkette von V87 verbessert.

Die Daten zeigen, dass zwei Schlüsselschritte, F87A zu L und LARV zu LARVF, die katalytische Effizienz gegenüber 8-pNCA erhöhten.

Es stellt sich deshalb die Frage, ob die anderen Mutationen in der Mutante LARVF wieder rückgängig gemacht werden können, ohne die Aktivität für 8-pNCA zu verlieren. Deshalb wurden Mutanten hergestellt, die statt der Mutation F87A die Mutation F87V ent- halten. Diese Mutanten tragen folgende Bezeichnungen : 1.) L7V mit den Mutationen F87V L188K 2.) AL7V mit den Mutationen F87V L188K A74G 3.) ARL7V mit den Mutationen F87V L188K A74G R47F Bei den Aktivitätstests wurden folgende Ergebnisse erhalten : Tabelle 3 : Kinetische Parameter von P450 BM-3-Mutanten für pNCA- Derivate unterschiedlicher Kettenlänge, ermittelt bei pH 8,0 und 25 °C Kcat (s-1) Km (M) Kcat/Km (s-lM-lj 12 10 8 12 10 8 12 10 8 F87V 0,71, 813, 88, 511, 7-1052, 1-1051 L7V 2,8 4, 7-6, 4 14, 2-4, 3-105 3, 3-105 AL7V 2,2 5, 9 4, 3 15, 1 122, 7 197, 6 1, 4-105 12, 6-105 2, 0. 104 ARL7V 3,98,917,541,41,7#1053,1#1059,3#1045,5, 7,20,212,344,86,59,2#1041,6#1053,5#104ARVLF1,4 Die Ergebnisse zeigen, dass die Mutanten F87V und L7V für das Substrat 8-pNCA keinen messbaren Umsatz zeigen. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die Vierfachmutante ARL7V eine noch bes- sere katalytische Effizienz aufweist als die Fünffachmutante ARVLF.

Die Mutanten ARL7V und ARVLF zeigen weiterhin hohe Aktivitäten für Caprinsäure (C10), die um zwei Kohlenstoffatome kürzer ist als das native kürzeste Fettsäure-Substrat des Wildtyp-Enzyms. Außerdem wurden-4-monohydroxylierte Produkte beobachtet, wenn Laurinsäure (C12) als Substrat verwendet wird, wohingegen das Wildtyp-Enzym von P450 BM-3 nur in den Positionen-1,-2 und cl-3 aktiv ist.

Beispiel 4 : Bestimmung der bevorzugten Hydroxylierungsposition für Carbonsäuren unterschiedlicher Kettenlänge und verschiedene Mutanten und Vergleich mit dem Wildtyp-Enzym

Die Reaktionsansätze werden gemäß oben beschriebener Methode 6 aufgearbeitet und analysiert.

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4 : Hydroxylierungs- # Caprinsäure (C10) Laurinsäure (C12) positionen Wildtyp 34#-3- w-2 28 38#-1- Mutante L7V 53#-3- 30#-2- 17#-1- Mutante F87V 51#-3- 25#-2- 24#-1- Mutante AL7V 28#-3- w-2-54 w-1-18 MutanteARL7V 35#-314 c)-2 33 50 15#-153 Mutante ARVLF 34#-315 53#-230 13#-155 Auffallend bei der Hydroxylierung von Laurinsäure ist zunächst ein Wechsel der Regioselektivität beim Übergang vom Wildtyp zu P450 BM-3 F87V, das eine-3-Hydroxylierung bevorzugt kataly- siert, ebenso wie P450 BM-3 L7V. Beim Übergang zur Dreifachmu- tante ändert sich die Regioselektivität erneut, P450 BM-3 AL7V,

P450 BM-3 ARL7V und P450 BM-3 ARVLF dirigieren die Hydroxylierung bevorzugt in die w-2-Position.

Alle GC-Analysen zeigen, dass Caprinsäure nur von P450 BM-3 ARVLF und P450 BM-3 ARL7V umgesetzt wird, bei den anderen Mutanten wurde ein Umsatz unter 1 % festgestellt. Beide Enzyme weisen fast identische Regioselektivität, mit der Bevorzugung-l-Position auf.

Zur Bestimmung der Reaktionsausbeuten wurden Gaschromatogramme von Standards aufgenommen. Als Eduktstandard fand eine Caprin- säure-bzw. Laurinsäurelösung mit Dichlormethan als Lösungsmittel (Konzentration 0,5 mg/ml) Verwendung. Aufgrund der FID-Detekti- onsmethode können die Peakflächen von Edukt und Produkten nicht einfach zueinander ins Verhältnis gesetzt werden, da Moleküle un- terschiedlicher Struktur-und Summenformel bei der Verbrennung unterschiedliche Ionenströme erzeugen. Diese Ionenströme sind nicht proportional zum Stoffmengenverhältnis von Edukt und Pro- dukten. Als Produktstandard wurde deshalb käuflich erwerbbare 10-Hydroxycaprinsäure bzw. 12-Hydroxylaurinsäure verwendet. Die Summenformeln der Standards und der Produkte sind gleich, und die Struktur unterscheidet sich nur in der Stellung der Hydroxyl- gruppe, weshalb bei gleichen Stoffmengen annähernd von gleichen detektierbaren Ionenströmen ausgegangen wird.

Bei den Hydroxylierungen von Caprinsäure mit P450 BM-3 ARVLF und P450 BM-3 ARL7V-Katalyse betrugen die kumulierten Ausbeuten an Produkt 57 % bzw. 38 %. Bei den Hydroxylierungen von Laurinsäure betrug die Ausbeute bei P450 BM-3 ARVLF-Katalyse 51 %, bei allen anderen Mutanten und dem Wildtyp zwischen 38 % und 40 %.

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