L'HEPATITE B.

L'invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope situé dans la région pré-Sl de la grande protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV). L'invention a également pour objet les applications de cet anticorps monoclonal, notamment pour le diagnostic in vitro de l'évolution de la maladie chez un individu atteint d'hépatite B chronique, ainsi que pour le traitement de l'hépatite B, et la vaccination contre cette maladie.

L'enveloppe de l'HBV contient trois types de protéines de surface (protéines S) . Les protéines S sont les seuls composants viraux trouvés dans les particules antigéniques de surface de l'hépatite B (particules HBsAg) qui sont exprimées en grande quantité par rapport au virus lui-même lors d'une infection. Ces particules HBsAg se présentent sous forme sphérique ou tubulaire avec un diamètre plus faible (22 nm) que les particules d'HBV infectieuses (42 nm) .

Ces trois protéines S sont les suivantes :

- la "petite" protéine S, ou protéine S majeure ou HBsAg constituée de la séquence (ou région) S de 226 acides aminés, (PETERSON, D.L. et al, (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 7±, 1530-1534) ;

- la pru -éine S "moyenne" constituée de la séquence S sus-mentionnée et de 55 acides aminés N-teπninaux

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additionnels codés par la région pré-S2 de l'ADN de l'HBV (HACHIDA, A. et al (1984), Gastroenterology, 86^ 910-918) ;

- la "grande" protéine S constituée des séquences S, pré-S2 et de 108 (sous-type antigénique ad) ou 119 (sous-type antigénique ay_) acides aminés N-terminaux additionnels codés par la région pré-Sl de l'ADN de l'HBV (HEERMANN, K. et al (1984), J. Virol., 5£, 396-402 ; ONG, D.T. et al (1985) J. Virol., 55, 223-231).

Ces trois protéines S existent sous différentes formes glycosylées :

- les protéines majeures P24 et GP27,

- les protéines moyennes GP33 et GP36,

- les grandes protéines P39 et GP42.

Les protéines moyennes et grandes ont été trouvées en plus forte concentration dans les particules infectieuses d'HBV (qui contiennent également l'antigène du core du virus, HBcAg) que dans les particules HBsAg sus-mentionnées (HEERMANN, K.H. , et al précédemment cité, et TAKAHASHI, K. et al (1986) J. Immunol., 13j5 , 3467-3472).

Ces protéines jouent donc probablement un rôle dans l'assemblage ou le fonctionnement des particules HBV infectieuses.

Il est estimé que les régions pré-S2 et pré-Sl des protéines S jouent un rôle dans les mécanismes de reconnaissance et de pénétration du virus dans les hépatocytes des individus infectés par l'HBV. Ainsi le site de liaison d'HBV au récepteur des hépatocytes serait localisé entre les acides aminés situés aux

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positions 21 et 47 de la région (ou séquence) pré-Sl (NEURATH, A.R. et al, (1986) CE11, 46, 429-436).

Ces auteurs ont également démontré que l'interaction entre HBV et les cellules de l'hépato e HepG2 est fortement inhibée par des anticorps dirigés contre un peptide s'étendant entre les résidus d'acides aminés aux positions 21 et 47 de la séquence pré-Sl (d'où la désignation "anticorps anti-pré-S(21-47)") ainsi que par des anticorps anti-pré-S(32-53) .

Compte tenu du rôle vraisemblablement important de la région pré-Sl dans la mécanisme infectieux de l'HBV, et notamment dans la reconnaissance des récepteurs des hépatocytes, les anticorps reconnaissant spécifiquement cette région, et plus particulièrement l'épitope responsable de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, seraient probablement d'une grande valeur dans le domaine de la lutte contre l'hépatite B. Néanmoins, les anticorps monoclonaux connus à ce jour ne se sont pas avérés présenter les propriétés voulues à cet effet ; on notera que l'anti-pré-S(32-53) sus¬ mentionné, a été obtenu à l'aide de la séquence pré- S(32-53) qui n'induit pas de réponse anti-HBV dans les sérum de malades. La vaccination à l'aide d'une telle séquence s'avère par conséquent peu envisageable.

Afin de disposer d'anticorps plus spécifiques de la région pré-Sl que ne le sont les actuels anticorps polyclonaux sus-mentionnés, d'autres anticorps monoclonaux ont été préparés à partir de -lymphocytes d'animaux immunisés avec des particules HBV (TAKAHASHI, K. et al (1986) précédemment cité) , ou avec des peptides synthétiques tels que pré-Sl(1-11) et pré-

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S(13-21) (OHNUMA, H, et al (1986) Gastroenterology, 90, 695-701). Ceux-ci n'ont pas été caractérisés en détail.

Un anticorps monoclonal (ACM) a été plus particulièrement décrit dans la demande de brevet européen publiée le 07/05/1986 sous le numéro 0 180 012 de GERLICH et al. Cet anticorps monoclonal (MA18/7) reconnaît spécifiquement la séquence pré-S(38-121) de la région pré-Sl, mais ne permet pas l'identification du site spécifique de liaison du virus sur les hépatocytes.

Cet ACM MA18/7 présente également l'inconvénient de donner lieu à des réaction i munologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV, ce qui représente un inconvénient majeur pour son utilisation dans des procédés de diagnostic in vitro.

La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal présentant l'avantage par rapport aux anticorps anti-pré-S1 connus, d'une part, d'être plus spécifiques de la séquence en acides aminés de la région pré-Sl impliquée dans le mécanisme de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, et, d'autre part, de ne pas donner lieu à des réactions immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV.

L'invention concerne également une nouvelle méthode de détection, et de dosage in vitro de la grande protéine pré-Sl plus précise et informative que celles élaborées à l'aide des anticorps connus, ainsi que l'application de cette méthode au diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique.

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L'invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement de l'hépatite B et pour la vaccination contre cette maladie.

Il sera fait référence dans la description qui suit aux dessins dans lesquels :

- la figure 1 est une représentation schématique du virus de l'hépatite B (HBV),

- la figure 2a représente les résultats d'un dosage radio-immunologique (RIA) des séquences S, pré-S2, et pré-Sl dans les particules HBsAg et l'HBV. La figure 2b représente la spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal de 1'invention déterminée par la technique des immuno-empreintes,

- la figure 3 représente les séquences d'acides aminés des régions pré-S(21-53) , et pré-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant à 5 sous-types antigéniques de l'HBV,

- la figure 4 (a et b) représente les résultats d'un dosage radio-immunologique impliquant des pepti ≈s pré-Sl et des antigènes viraux, réalisé à l'aide e l'anticorps monoclonal de l'invention,

- la figure 5 représente les effets inhibiteurs des peptides spécifiques de la région pré-Sl et des particules HBV vis-à-vis de la liaison de l'anticorps monoclonal de l'invention avec le peptide pré-S(32-53) (figure 5a), ou avec l'HBV sous-type ad (figure 5b),

- la figure 6 représente la sensibilité de l'anticorps monoclonal de l'invention pour la détection de la région pré-Sl,

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- la figure 7 représente les résultats de la digestion des particules d'HBV par la trypsine ou la protéase V8,

- la figure 8 représente un gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad) , et la corrélation entre la détection des épitopes F35-25 et la présence de virions complets dans les sérums.

- la figure 9 représente la détection de la séquence pré-Sl(32-53) dans les particules d'HBV purifiées et suivant le système du dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps.

- la figure 10 représente l'analyse quantitative des antigènes S et des antigènes pré-S (pré-SlAg et pré- S2Ag) dans les sérums de porteurs chroniques,

- la figure 11 représente la signification clinique de l'expression de l'antigène pré-Sl (ou encore du récepteur hépatocytaire pré-Sl) chez les patients atteints d'hépatite B chronique.

L'invention concerne un anticorps monoclonal (ci- après désigné par ACM F35-25) défini par la combinaison des propriétés suivantes :

- il forme un complexe immunologique avec : un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-Sl, la région pré-Sl de la grande protéine S d'enveloppe de l'HBV,

. les grandes protéines d'enveloppe de l'HBV, P39 et GP42,

. la très grande protéine d'enveloppe de l'HBV de 66 kd (kilodaltons) ,

. chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette

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dernière avec la trypsine, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pré-Sl de ladite grande protéine S et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500,

. chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la protéase V8 de S. aureus, et dont les poids moléculaires sont de 15000, 16500, et 29000, respectivement, - il ne forme pas de complexe im unologique avec :

. les (glyco)protéines S moyennes d'enveloppe de l'HBV, GP33 et GP 36 ;

. les glycoprotéines S majeures d'enveloppe de l'HBV P24 et GP27 ;

. la sérum-albumine-humaine (HSA) ;

. la sérum-albumine humaine polymérisée (pHSA) ;

. les im unoglobulines G, A et M ;

. les divers constituants de sérums d'individus non infectés par l'HBV.

Les anticorps monoclonaux selon 1'invention appartiennent de préférence à la classe des immunoglobulines Gl(IgGl).

L'anticorps monoclonal sus-mentionné peut être obtenu par un procédé comprenant la fusion de cellules myélomateuses et de cellules spléniques prélevées sur un animal immunisé avec des particules HBV, suivant la technique générale d'obtention des hybridomes, et la détection et la récupération de ceux des hybridomes qui sécrètent 1 -S anticorps monoclonaux possédant les propriétés définies ci-dessus.

L'invention vise également les hybridomes susceptibles de sécréter des anticorps monoclonaux ci- dessus définis, notamment ACM F35.25.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'hybridome sécrétant l'ACM F35.25 et qui a été déposé à la COLLECTION NATIONALE DES CULTURES DE MICRO¬ ORGANISMES (C.N.C.M.) de l'INSTITUT PASTEUR à PARIS sous le numéro 1-796 le 5 août 1988.

L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de la présence éventuelle de la grande protéine S (comprenant la région pré-Sl) dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite protéine, cette méthode comprenant :

- la mise en contact de l'échantillon biologique sus¬ mentionné avec l'ACM F35.25 dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe im unologique formé entre la région pré-Sl de la grande protéine S et l'ACM F35.25 ;

- la détection du susdit complexe immunologique.

Une telle méthode de détection in vitro peut être réalisée suivant toute technique en soi connue de l'homme du métier.

Cette méthode comprend par exemple les étapes suivantes :

- fixation sur un support solide de l'ACM F35.25 ;

- addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-Sl de la grande protéine et l'ACM F35.25. ;

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- addition ensuite sur le support solide d'autres anticorps a leur tour susceptibles de former un complexe immunologique avec le complexe précédent, tel que l'ACM F35.25 ; ces anticorps sont marqués, notamment de manière radioactive, ou enzymatique ; détection à l'aide de réactifs appropriés des anticorps marqués sus-mentionnés engagés dans le susdit complexe immunologique.

Une méthode originale de détection in vitro de l'antigène pré-Sl selon l'invention comprend encore les étapes suivantes :

- fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux, susceptibles de former un complexe immunologique avec la région S des protéines S;

- addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre les anticorps sus-mentionnés et la région S des protéines S contenues dans l'échantillon ;

- addition de l'ACM F35.25, ou de tout autre anticorps susceptible de former un complexe immunologique avec le complexe obtenu à l'étape précédente, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre celles des protéines S contenues dans l'échantillon et portant la région pré-Sl (c'est-à-dire les grandes protéines S) et l'ACM F35.25 ;

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- détection à l'aide de réactifs appropriés de l'ACM F35.25 marqué et qui est engagé dans le susdit complexe immunologique,

- ou, si l'ACM F35.25, n'est pas marqué, détection du dernier complexe immunologique sus-mentionné à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées (obtenues chez un animal d'une espèce différente de celui utilisé pour l'obtention des anticorps fixés sur le support solide) susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 engagé dans le dernier complexe immunologique obtenu lors de l'étape précédente.

Selon un mode de réalisation plus détaillé d'une méthode de détection in vitro préférée de l'invention, cette dernière comprend les étapes suivantes : fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux (obtenus par exemple par immunisation de lapins) susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S d'enveloppe de l'HBV;

- rinçage du support afin d'éliminer ceux des susdits anticorps non fixés sur le support ;

- addition sur le support de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre les anticorps polyclonaux sus-mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans ledit sérum ; rinçage du support afin d'éliminer les différents constituants dudit sérum non reconnus par les anticorps sus-mentionnés ;

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addition sur le support des anticorps monoclonaux ACM F35.25 selon l'invention, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre lesdits anticorps mdnoclonaux et celles des protéines S engagées dans le complexe immunologique précédent et comprenant la région pré-Sl des çrandes protéines ;

- rinçage du support afin d'éliminer ceux des anticorps monoclonaux non engagés dans une réaction immunologique avec ladite région pré-Sl des grandes protéines S ; addition sur le support d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 (obtenues par immunisation d'une espèce animale identique à celle utilisée pour l'obtention de l'ACM F35.25, et différente de celle utilisée pour l'obtention des anticorps polyclonaux fixés sur le support solide ; ces anti-immunoglobulines peuvent être obtenues dans l'exemple présent par immunisation de souris) dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique final formé entre lesdites anti- immunoglobulines et l'ACM F35.25 engagé dans le complexe immunologique obtenu à l'étape précédente;

- détection de la quantité d'anti-immunoglobulines marquées engagées dans le complexe immunologique final sus-mentionné, cette quantité pouvant être corrélée à la quantité de protéines S portant la région pré-Sl, ou encore grandes protéines S, présentes dans ledit sérum.

D'une manière plus générale, l'invention a plus particulièrement pour objet la méthode de détection in vitro telle que décrite ci-dessus dans laquelle l'ACM

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F35.25 est remplacé par tout anticorps susceptible de former une réaction immunologique avec le complexe formé entre l'anticorps polyclonal fixé sur le support solide et les protéines S contenues dans l'échantillon biologique, et dans laquelle les anti-immunoglobulines marquées sont susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps remplaçant l'ACM F35.25. Dans une telle méthode de détection in vitro, l'ACM F35.25 est remplacé notamment par un anticorps monoclonal susceptible de former une réaction immunologique avec la région pré-Sl des protéines S.

L'invention concerne également l'application de la méthode de détection in vitro sus-mentionnée au diagnostic in vitro de l'hépatite B aiguë ou chronique réalisé à partir d'un échantillon biologique, tel que du sérum, prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par HBV.

L'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez un individu porteur symptomatique ou asymptomatique des protéines S de l'HBV.

La méthode de diagnostic in vitro sus-mentionnée est avantageusement réalisée par la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de détection in vitro de la quantité de grande protéine S sus-mentionnée, d'une méthode de détection in vitro de la protéine S majeure. Cette dernière méthode est réalisée suivant les mêmes étapes que celles décrites ci-dessus pour la détection de la grande protéine, et dans lesquelles, d'une part, l'ACM F35.25, est remplacé par un anticorps, de

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préférence monoclonal, susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et d'autre part, les anti- immmunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25 sont remplacées par des anti-immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM sus¬ mentionné reconnaissant la protéine S majeure.

Parmi les anticorps monoclonaux susceptibles de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, et que l'on peut utiliser dans la méthode sus-mentionnée, on citera notamment l'ACM F39.20 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) J. Gen. Virol., 68, 2759-2767.

La comparaison des quantités détectées de grande protéine S et de protéine S majeure dans, un même échantillon permet de connaître, a un temps donné, la proportion de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure présente dans ledit échantillon.

La mise en oeuvre répétée de la méthode sus¬ mentionnée permet de suivre l'éventuelle variation de cette proportion en fonction du temps.

La détection d'une diminution de cette proportion en fonction du temps chez un individu atteint d'hépatite B chronique, permet d'émettre l'hypothèse que la maladie évolue favorablement chez cet individu ; c'est-à-dire qu'elle évolue probablement vers un état de guérison totale ou partielle (pseudo-guérison) , qui se caractérise par une disparition complète de la grande protéine S dans 1'échantillon prélevé chez ledit individu.

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Le principe de la méthode de détection in vitro de la grande protéine S sus-mentionnée peut également être appliqué a la détection de la protéine S moyenne en utilisant, au lieu de l'ACM F35.25 et des anti- immunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25, un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la région pré-S2 de ladite protéine S moyenne (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois) , et des anti- immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec 1'anticorps monoclonal, sus¬ mentionné reconnaissant la région pré-S2. A titre d'exemple de ce dernier type d'anticorps monoclonal, on citera l'ACM F124 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) précédemment cité.

Ainsi la méthode de 1'invention permet la détection dans un échantillon biologique prélevé chez un individu atteint d'hépatite B chronique, de la proportion de la grande protéine S par rapport à la protéine S moyenne d'une part, et par rapport à la protéine S majeure d'autre part. Une telle méthode permet donc de suivre en fonction du temps les variations des proportions des trois protéines S les unes par rapport aux autres, et ainsi de juger de 1'évolution favorable ou non de la maladie en fonction de ces variations.

La méthode de diagnostic in vitro de 1'invention est réalisée à partir d'échantillons biologiques (prélevé chez des individus) , tels que le sérum, ou des biospies du foie. Etant donné que l'expression des protéines S dans les lymphocytes se faisant de manière

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identique à celle de ces mêmes protéines S dans les cellules hépatiques, il est plus avantageux, compte tenu de l'opération délicate que constitue une biopsie du foie, de réaliser la méthode de diagnostic de l'invention à partir d'un prélèvement de lymphocytes.

Avantageusement, la méthode de diagnostic in vitro de l'invention permet le suivi thérapeutique des patients atteints de l'hépatite B et qui sont traités avec des compositions pharmaceutiques comprenant, notamment, de l'interféron, ou avec des antiviraux, tels que la vidarabine.

La détection d'un diminution de la quantité de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure, et/ou la protéine S moyenne, chez un de ces patients, permet d'émettre l'hypothèse que la thérapeutique utilisée donne des résultats favorables, et que ce patient évolue vers la guérison.

L'invention concerne également l'utilisation de l'ACM F35.25 pour la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de diagnostic in vitro de l'invention, d'une méthode de détection in vitro des produits de clivage de la grande protéine S issus de la digestion in vivo de cette dernière par la trypsine, ou par des enzymes possédant des activités du type de la trypsine et présentes dans l'organisme de l'individu à partir duquel l'échantillon biologique a été prélevé.

Cette méthode de détection est réalisée suivant la technique des immuno-empreintes (ou Western blot) à partir d'un échantillon tel que les lymphocytes, et comprend les étapes suivantes :

- électrophorèse sur gel afin d'obtenir un séparation des divers constituants antigéniques de l'échantillon,

- transfert de ces constituants ainsi séparés sur un support tel qu'une membrane de nitrocellulose, - incubation avec l'ACM F35.25, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre l'ACM F35.25 et chacun des produits de clivage de la grande protéine S, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pré-Sl, et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500,

- détection à l'aide de réactifs appropriés de l'ACM F35.25 marqué engagé dans un complexe immunologique sus-mentionné avec un produit de poids moléculaire de 13500 ou 14500,

- ou, dans le cas où l'ACM F35.25 n'est pas marqué, détection à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 engagé dans un complexe immunologique tel que défini ci-dessus.

Une telle méthode permet de quantifier la proportion de grandes protéines éventuellement dégradées dans l'organisme d'un individu et de déterminer ainsi le degré de résistance à 1•infection par HBV de cet individu qui est fonction de la plus ou moins grande quantité de produits de clivage de la grande protéine S par la trypsine ainsi détectée.

L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits, pour la mise en oeuvre d'une des méthodes de l'invention décrites ci-dessus.

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A titre d'exemple, un kit selon l'invention comprend :

- une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux fixés sur un support solide et susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S,

- une quantité déterminée de l'anticorps monoclonal F35.25.

- éventuellement une quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure d'enveloppe de l'HBV,

- éventuellement un quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S moyenne d'enveloppe de l'HBV,

- avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les anticorps sus¬ mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique,

- avantageusement des réactifs marqués, notamment des immunoglobulines marquées, permettant la détection des complexes immunologiques dans lesquels sont engagés les anticorps monoclonaux sus-mentionnés.

L'invention a également pour objet l'utilisation de l'anticorps monoclonal F35.25 de l'invention pour le traitement de l'hépatite B et plus particulièrement pour la prévention des phénomènes de réinfection du greffon lors de greffe du foie chez les individus atteints de l'hépatite B.

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A ce titre, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques pour les traitements indiqués ci- dessus, et qui comprennent l'ACM F35.25 associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La transplantation hépatique chez les patients, chez lesquels on peut détecter une réplication active du virus de l'Hépatite B, est associée à un risque élevé de réinfection du greffon (TORISU et al, 1971, Annals of Surgery, 174, 620-637) . Jusqu'à présent, l'état porteur chronique de l'HBsAg était considéré comme une contre-indication pour une greffe de foie, surtout dans le cas de porteurs positifs pour l'HBeAg (c'est-à-dire d'individus porteurs de l'antigène HBe qui est un antigène de la nucléocapside) . Une immunoprophylaxie à court-terme avec des immunoglobulines spécifiquement dirigées contre les protéines S majeures d'HBV (anti-HBs) s'est avéré être un échec (van Thiel DH et al (1984), Hepatology 4.79S-83S). Récemment, un protocole d*immunoprophylaxie passive à long-terme a été mis au point, utilisant des doses élevées d'immunoglobulines, associé à une immunoprophylaxie active par vaccination. Ce protocole apparaît plus efficace pour prévenir la réinfection, mais seulement dans le cas de greffés chez lesquels on ne peut détecter de réplication du virus HBV avant la transplantation, (Mûller R. et al, Viral Hepatitis and Liver Disease, pages 810-812 (1988) Alan R.Liss, Inc.)

Ainsi, les seules immunoglobulines anti-HBs ne semblent pas efficaces pour empêcher la réinfection du greffon en présence de virions complets circulant dans le sérum de ces malades avant la transplantation. En

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effet, l".BsAg s'exprime en très larges excès sous forme de particules défectives (particules de 22nm constituées de l'enveloppe du virus mais pas de la nucléocapside) non infectieuses qui sont spécifiquement neutralisées par ces anticorps. Par contre, les particules virales infectieuses se trouvent proportionnellement en très petit nombre, d'où la nécessité d'utiliser des doses très élevées d'immunoglobulines anti-HBs, ce qui constitue une thérapie coûteuse pour un résultat très décevant. Or, les virions complets responsables de la réinfection expriment sélectivement la spécificité pré-Sl, contrairement aux formes défectives d'HBsAg.

Par sa spécificité anti-pré-Sl, et plus précisément par sa spécificité dirigée contre les sites de reconnaissance de l'HBV par les hépatocytes, ces sites étant exprimés à la surface des virions complets, l'ACM F35.25 s'avère particulièrement intéressant à exploiter en vue d'un protocole d'immunoprophylaxie passive à court-terme, (par exemple 3 à 4 injections en un mois) à la place ou en association avec une immunoprophylaxie passive à long terme (plusieurs années) avec des immunoglobulines anti-HBs, complété par une immunoprophylaxie active par vaccination. En effet, il a été récemment montré que la vaccination avec l'Hevac-B (PASTEUR VACCINS), obtenu à partir de sérums humains, était capable d'induire la production d'anticorps anti-pré-Sl.

Ainsi, l'invention concerne plus particulièrement d«2s ompositions pharmaceutiques comprenant en a-ssocation avec un véhicule pharmaceutiquement

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acceptable, une quantité déterminée d'ACM F35.25 associée avec des immunoglobulines anti-HBs, (notamment celles obtenues à partir de donneurs de sang ayant fait une séroconversion HBs/anti-HBs) , et le cas échéant, aVec un vaccin contre l'hépatite B, notamment l'Hevac-B sus-mentionné, ou encore l'anticorps monoclonal anti- idiotype décrit ci-dessous.

L'invention concerne également l'anticorps monoclonal anti-idiotype caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal F35.25.

L'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné est obtenu par immunisation d'un animal à l'aide d'un anticorps moncoclonal F35.25 selon l'invention, suivi de la récupération de ceux des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps moncoclonal F35.25.

L*invention a également pour objet des compositions pour la vaccination contre l'hépatite B caractérisées par 1'association de 1'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Des caractéristiques supplémentaires de 1'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de l'obtention et de la caractérisation de l'anticorps moncoclonal F35.25, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.

I MATERIELS ET METHODES 1) Obtention de l'anticorps monoclonal F35.25

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Les particules HBV ont été purifiées à partir du sérum d'un individu atteint d'hépatite B chronique (sous type ad) comme il a été décrit dans PETIT et al (1985) Molec. I munol., 22_, 1279-1287, et ont été utilisées comme immunogène. Des souris BALB/c ont été inoculées intrapéritonéalement avec 100 μg de virus purifié dans l'adjuvant complet de Freund, puis une semaine plus tard avec 100 μg de virus dans l'adjuvant incomplet de Freund. Les trois souris immunisées ont développé de hauts titres en anticorps contre HBsAg, et qui ont été détectés par dosage radioimmunologique RIA. Deux semaines plus tard, les souris ont été inoculées avec 50 μg de virus dans un tampon phosphate. Après cinq jours, l'injection a été répétée, et trois jours plus tard, leur rate ont été retirées pour réaliser une fusion avec les cellules du myélome X63 selon la procédure décrite par BUTTIN et al (1978), 81, 27-36.

Les surnageants de la culture d'hybridomes ont été sélectionnés pour leur présence en anticorps spécifique d'HBV par RIA indirect en utilisant le virus purifié immunisant en tant que phase solide (PETIT et al (1987)J. Gen. Virol., 68, 2759-2767). 30 % des clones de l'hybridome produit des anticorps contre HBV. Les hybrides donnant le plus fort signal (P/N>10) (P = positif, N = négatif) avec les particules HBV sur la phase solide ont été reclonés par dilution limitante, et leur spécificité polypeptidique a été déterminée par Western . Blot en utilisant des protéines virales dissociées en tant que sonde antigénique (PETIT et al (1986) Molec. Immunol, 27, 511-523).

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Les clones sélectionnés ont .ensuite été injectés à des souris BALB/c pour la production d'ascites.

L'anticorps monoclonal spécifique de la région pré-Sl, F 35.25, a été purifié à partir du surnageant d'une culture cellulaire d'hybridomes par précipitation avec 50 % (NH jSO* saturé, et par filtration sur gel SEPHADEX G-200 (PHAMACIA - FRANCE), suivi d'une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-trisacryle M (IBF - FRANCE). L'isotype a été déterminé par immunodiffusion contre des antisérums de lapin spécifique pour les immunoglobulines M de souris (IgM) , IgGl, IgG2A, IgG2B et IgG3 (NORDIC IMMUNOLOGY - TILBURG-BERCHEM - LONDON)

2) Test d'immunotransfert (technique de Western Blot)

La spécificité polypeptidique de l'ACM F 35.25 a été déterminée par immunotransfert en utilisant des préparations de virus non traités, ou digérés, en tant qu'antigènes (PETIT et al (1986) et (1987) précédemment cité) .

La digestion par la protéase V8 de S.aureus (type XVII de chez SIGMA) et par la trypsine (type XII de chez SIGMA) a été réalisée dans du bicarbonate d'ammonium 0,1N, pH 7,8, a 37 ' C pendant trois heures.

Le rapport de la quantité d'enzymes au substrat était de 1:40-50 (par poids), et la concentration de protéine était de 1 mg/ml. La réaction a été arrêtée par addition d'un tampon contenant 2 % de SDS et 5 % de 2-mercaptoéthanol.

Les particules sphériques HBsAg de 22-nm ont été co-purifiées avec l'HBV provenant d'un sérum HBsAg

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positif, montrant seulement une réactivité pré-S2 (PETIT et al (1987) précédemment cité) , une sérum albumine humaine (0,22 mg/ml) et un sérum humain normal dilué au 1/500 ont été utilisés en parallèle en tant qu'antigènes de contrôle. L'HBV purifié a été utilisé à différentes concentrations allant de 0,2 à 1 mg/ml. Après électrophorèse utilisant le système de tampon décrit dans LAEMMLI (1970) Nature, London, 227, , 680-685, des bandes protéiniques ont été éluées électrophorétiquement et transférées sur des membranes de nitrocellulose pour y être détectées comme il a été décrit dans PETIT et al (1987) précédemment cité) . Les bandes de transfert ont été incubées soit avec les surnageants de cellules d'hybridomes à une dilution de 1:2 dans un tampon bloquant (tris-NaCl contenant de l'albumine de sérum de boeuf et 50 % de sérum foetal de boeuf) ou avec 10 ng/ml d'IgG monoclonal purifié de souris.

3) Test radjoimunologique (RIA) La liaison de l'ACM F 35.25 soit au virus à l'état natif, soit à des peptides synthétiques dérivant de la séquence pré-Sl de la grande protéine d'enveloppe HBV sous-type adw2 (NEURATH et al (1986) précédemment cité) a été mesurée par RIA en utilisant un fragment F(ab) ' ₂ anti-souris marqué radioactivement avec de l'iode I ¹²⁵ (immunoglobuline de mouton, AMERSHAM FRANCE) . Des billes de polystyrène ont été enduites avec des antigènes individuels dilués dans un tampon TN (0,01 M-tris-HCl, 0,14 M-NaCl, pH 7,2) à une concentration de 20 μg/ml.

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Après deux heures à. 37*C et une nuit à 4'C, les solutions d'antigène ont été retirées et les billes ont été saturées avec 5 % (en poids par volume) de sérum d'albumine de boeuf dans un tampon TN pendant 6 heures à 'température ambiante.

Les billes enduites ont alors été incubées avec une dilution au 1:2 de surnageant de culture de cellules d* ybridomes pendant une nuit à température ambiante, lavées plusieurs fois avec de l'eau distillée et incubées pendant une heure à 37*C avec le fragment F(ab*) ² anti-immunoglobuline de souris marqué avec de l'iode I ¹²⁵ . Le diluant utilisé était constitué de sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum foetal de boeuf dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et comptées dans un compteur gamma.

Le surnageant a également été testé par RIA en utilisant des billes enduites de particules HBsAg recombinantes (produit du gène pré-S2 et du gène S) décrit dans MICHEL et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 81 7708-7712) de la sérum albumine humaine polymérisee (pHSA) et de la sérum albumine de boeuf polymérisé (pBSA) .

Des expériences d'inhibition compétitive d'antigène ont été utilisées pour étudier l'effet inhibiteur du virus à l'état natif ou de l'antigène peptidique sur la liaison de l'anticorps F 35.25 au virus et aux peptides synthétiques. Les échantillons de virus ou de peptides libres (20 μg/ml) ont d'abord été pré-incubés avec l'anticorps monoclonal dilué, purifié à partir du fluide de culture d'hybridomes (correspondant à 0,2 ng d'immunoglobuline de souris/ml) pendant 1 heure à 37*C.

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Les mélanges ont été transfères dans des puits enduits soit avec un peptide synthétique de la région pré-Sl (5 μg) ou avec des particules HBV (10 μg/ml) purifiées à partir de sérum humain. La quantité d'anticorps monoclonal lié à la phase solide a été déterminée comme il a été décrit ci-dessus.

4) Test de RIA à double spécificité d'anticorps polyclonal-monoclonal (test PAS-RIA) .

Ce test RIA a été réalisé afin de déterminer la présence de séquences pré-Sl dans les particules HBV purifiées à partir de sérum HBsAg positif de porteurs chroniques d'HBsAg par la procédure précédemment décrite dans PETIT et al (1985).

Cette technique a également été utilisée pour la quantification d'épitopes pré-Sl en relation avec l'activité HBsAg.

Des billes de polystyrène ont été enduites avec des IgG polyclonaux de lapin dirigés contre HBsAg (PETIT et al (1986)) à une concentration de 20 μg/ml, et ont été alors incubées avec une série de préparations virales diluées de 10 en 10 (10 μg à 1 ng/ml) .

Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les billes ont été lavées avec de l'eau distillée et incubées pendant quatre heures à 37*C avec une dilution au 1:2 de la culture d'hybridomes.

La liaison de l'anticorps monoclonal F 35.25 spécifique de pré-Sl a alors été détectée par incubation (1 heure à 37*C) avec le fragment F(ab')2 marqué à l'aide de l'iode I ¹²⁵ d'anti-immunoglobulines de souris. Le diluant utilisé était constitué de 5 % de

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sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum normal de lapin dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et leur radioactivité a été déterminée. Les résultats sont exprimés en cpm (coups par minute) d*anticorps marqué à l'iode I ¹²⁵ .

Dans les étapes finales de la purification de l'HBV, les aliquotes de chaque fraction de gradient entre 10 et 60 % de saccharose ont été sélectionnés par cette technique. Après quoi, les préparations virales ont été calibrées pour leur séquence pré-Sl avec l'anticorps F 35.25.

L'anticorps MA18/7 spécifique de la région de pré-Sl (HEERMANN et al (1984)), et les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes spécifiques des régions S et pré-S2 (PETIT et al (1987)) ont été utilisés en parallèle afin de déterminer des relations quantitatives entre les trois régions antigéniques de la protéine env. II RESULTATS

1) Spécificité fine pré-Sl de l'anticorps monoclonal F 35.25.

Un test d'immunodiffusion contre une gamme d'antisérum mono spécifique a permis de déterminer que l'ACM F 35.25 appartient à la classe d'anticorps IgGl.

La spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal F 35.25 a été déterminée par sa réactivité vis-à-vis des trois composants d'enveloppe des particules virales purifiées à partir de plasma d'un porteur chronique d'HBV (sous type ad) .

Deux préparations obtenues à partir de l'étape finale de centrifugation dans un gradient de saccharose

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ont été sélectionnées : A, particule sphérique de HBsAg 22-ira présentant une réactivité pré-S2, mais ne présentant pas d'épitopes pré-Sl détectable (30 % de saccharose, figure 2a), et B, particules d'HBV 42-nm positives en ce qui concerne l'activité DNA polymérase et l'ADN d'HBV, présentant une quantité importante (> 1 ng/ml) d'épitopes pré-S2 et pré-Sl (40 % de saccharose, figure 2a) . Comme il est illustré dans la figure 2b, ligne B, l'ACM F 35.25 se lie seulement aux protéines pré-Sl, P39 et GP42, dans les parties d'HBV purifiées. CP42 a été plus intensément révélé que P39. De plus, F 35.25 réagit également avec un composant de 66000 ; par contre, aucune réactivité n'a été observée entre l'ACM F35.25 et toutes les protéines provenant de particules défectives d'HBsAg et pré-S2 positives (figure 2b, ligne A), ainsi qu'avec la sérum albumine humaine (HSA) ou avec du sérum humain normal (NHS) sans marqueur viral (figure 2b, lignes C et D respectivement) . Les antigènes de contrôle ont été testés en parallèle à une concentration similaire à celle des protéines HBV (environ 200 μg/ml) . Ces résultats suggèrent que l'anticorps F 35.25 est spécifique pour la région pré- Sl de la protéine env d'HBV (l'expression protéine env est également utilisé pour désigner les protéines S d'une manière générale) . De plus, sa réactivité avec la très grande protéine HBV(VL-) de 66000 confirme la présence d'épitopes(s) spécifique(s) de pré-Sl sur ce composant VL HBsAg d'HBV (PETIT et al (1987)), qui est distinct de la protéine HSA présent dans NHS.

La localisation précise de l'épitope reconnu par F 35.25 a été été étudiée par un test RIA impliquant

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des peptides synthétiques spécifiques de pré-Sl au niveau de la phase solide. Des peptides correspondant à la région pré-Sl de la protéine env d'HBV sous type adw2 ont été sélectionnés, synthétisés et purifiés comme il l'a été décrit précédemment (NEURATH et al (1986)). Des analogues synthétiques de séquences pré- S(l-21), (12-32), (32-53), (53-73) et (94-11) ont été utilisées (voir figure 3) dans un test RIA à double anticorps. Comme il est indiqué dans la figure 4a, seulement le peptide pré-S(32-53) a été reconnu de manière efficace par F35.25 (P/N > 70). Une faible réaction a également été observée avec le peptide synthétique pré-S (94-117) .

On peut remarquer que ces deux peptides possèdent une région N-terminale commune : proline (positions 32 et 94) et alanine (positions 33 et 95) (voire figure 3). Le double RIA impliquant l'utilisation de puit enduit avec des particules HBsAg recombinant à partir de cellules CHO (MICHEL et al (1981)), avec des particules d'HBV purifiées à partir de sérum (sous type ad) ainsi qu'avec HSA, pBSA et pHSA, a également été développé et révèle une liaison significative de F 35.25 seulement aux virions complets (P/N = 13, figure 4b). Ceci démontre la stricte spécificité HBV de l'ACM F 35.25 dirigé contre la séquence pré-Sl(32-53) .

Les résultats de la liaison compétitive utilisant 20 μg/ml des antigènes suivants : peptide pré-S(32-53) et des particules d'HBV purifiées en tant qu'antigène pré-Sl natif, ont démontré : (i) que la région pré- S(32-53) contient l'épitope F 35.25, (ii) qu'un tel épitope est exprimé à la surface des virions. En effet,

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la réaction de F 35.25 avec l'antigène natif F (HBV) est complètement inhibée par pré-S(32-53) , mais pas par une autre séquence pré-S(1-21) (figure 5b). Réciproquement, les particules d'HBV utilisées en tant qu'inhibiteurs présentent également un puissant effet de suppression (> 70 %) de la liaison de F 35.25 à la séquence de pré-S(32-53) (figure 5a).

Afin de déterminer la sensibilité de F 35.25 pour détecter la séquence pré-Sl, ce dernier anticorps se liant soit au peptide pré-S(32-53) ou au virus à l'état natif, des quantités décroissantes d'IgG purifiées spécifiques de souris (1 ng à 0,1 pg/ml) ont été utilisées dans la phase liquide du double RIA (figure 6) . La limite de détection de HBV ainsi que celle de l'antigène peptidique a été trouvé comme étant du domaine du pg d'IgGl monoclonal, montrant que F 35.25 possède une affinité de liaison très forte. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'anticorps monoclonal purifié à partir de liquide d'ascites..

Enfin, e manière à déterminer la topographie de l'épitope pre-Sl reconnu par F 35.25 dans la protéine env d'HBV, la réactivité de F 35.25 a été étudiée par immunotransfert après digestion protéolytique limitée des particules purifiées d'HBV (sous type ad) . Le traitement par la trypsine ou la protéase V8 de l'antigène a été réalisé dans des conditions bien définies de temps d'incubation, de tampon, de pH et de rapport enzyme-substrat : 3 heures à 37*c dans du bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 7,8 à une concentration finale de 20 μg/ml d'enzymes pour 1 mg/ml d'antigènes, ces conditions étant différentes ' des

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conditions utilisées dans les expériences précédemment citées (HEERMAN et al (1984); PETIT et al (1987)). Ainsi, les résultats du clivage protéolytique révèle des peptides qui réagissent avec F 35.25 (figure 7). Il est intéressant de noter que deux bandes protéiniques correspondant à des poids moléculaires de 13500 et 14500, résultant du clivage par la trypsine (figure 7) , et réagissent fortement avec F 35.25, mais pas avec l'anticorps monoclonal F 376 spécifique de la région pré-S2 (figure 7; ligne 5), ni avec l'anticorps monoclonal 6-16A15 spécifique de la région S (COURROUCE et al (1983)) (figure 7, ligne 8). Ces produits tryptiques sont probablement générés à partir de P39 et GP42 par clivage de la séquence pré-Sl au niveau des résidus arginine en position 99 et/ou 103, et en position 113 (voir figure 3). Ainsi l'épitope reconnue par F 35.25 est localisé sur la séquence pré-Sl entre pré-S(33) au niveau N-terminal et pré-S(53)-pré-S(99) au niveau C-terminal. De plus, la sensibilité du domaine pré-S2 pour la digestion par la trypsine a été confirmée (STIBBE et GERLICH, (1983) Develop. Biol. Standard, 54, 33-43 ; HEERMANN et al (1984) ; PETIT et al (1987)) (figure 7, ligne 5 et figure 7, ligne 8). Après traitement par la protéase V8 de la protéine HBV, F 35.25 se lie à un fragment de poids moléculaire 16500 (figure 7, ligne 3) qui a été très probablement produit par clivage au niveau de l'acide glutamique en position 2 (GLU-176) du produit du gène S (HEERMANN et al, (1984)). La protéase V8 génère également deux fragments dont les poids moléculaires sont de 15000 et de 29000 réagissant avec F 35.25. Ceci suggère : (i) un

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autre clivage possible par la protéase dans le domaine pré-S2, donnant lieu à un fragment plus petit contenant les séquences pré-Sl, et (ii) un clivage au niveau du résidu GLU-338 dans la séquence du gène S.

Ce dernier site semble effectivement accessible dans la structure secondaire prédite de la protéine env d'HBV (NEURATH et al (1987) Microbiol. Sci., 4_, 45-51). Finalement, la figure 7, ligne 6 et la figure 7, ligne 9 illustrent la relative résistance des protéines pré-S2 (GP33 et GP36) à la digestion par la protéase V8.

2) Détection de l'épitope F 35.25 dans les particules d'HBV à partir de sérum humain

Dans l'étape finale de fractionnement dans le gradient de saccharose (ou sucrose) , les particules d'HBV caractérisées par la présence d'ADN d'HBV et de la protéine majeure du core, P22c, (détectée par hybridation ou Western Blot respectivement) ont été trouvées dans les fractions 6-8 à 40-50 % de saccharose (figure 8) . Ces fractions HbsAg positives ont été étudiées pour ce qui concerne la présence de l'épitope spécifique de pré-Sl reconnue par F 35.25.

Le test DAS-RIA décrit précédemment dans le chapitre MATERIELS ET METHODES, a permis de détecter l'épitope F 35.25 chez les virions complets (figure 8, fractions 6-8, 40-50 % de saccharose). La quantité de séquences pré-Sl en relation avec l'activité HBsAg a été déterminée comme étant de l'ordre de 50 %.

II y a par conséquent une proche corrélation entre la présence de l'épitope reconnu par F35.25 et la

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présence de l'ADN d'HBV et de la protéine P22c dans les virions complets.

Les tests DAS-RIA ont aussi été appliqués afin d'évaluer la quantité des séquences pré-Sl dans 7 préparations d'HBV purifiés (sous type ad ou ay_) . Les particules d'HBV utilisées pour l'immunisation étaient des HBsAg sous type ad. L'ACM F 35.25 a réagit de façon significative avec l'HBV ad et l'HBV ay_ liés aux grains enduits d'anti-HBs polyclonaux (figure 9). Cependant, l'ACM F35.25 semble reconnaître de façon préférée les séquences pré-Sl d'HBV sous type ad. La proportion des séquences pré-Sl en relation avec HBsAg a été déterminée comme étant de l'ordre de 50 % seulement dans les préparations d'HBV de sous type ad, et seulement de 10 à 20 % dans les préparations HBV de sous type ay_. Cette différence peut être imputée à la spécificité ad relative de l'ACM F 35.25.

Par contre l'ACM MA18/7 obtenu par imunisation avec des particules HBV de sous-type ayw, réagit aussi bien avec les particules de sous-type adw que celles de sous-type ayw. L'unique acide aminé, compris à l'intérieur de la séquence pré-Sl(32-38) , et qui diffère suivant les sous-type ad et ay_, est situé en position 35 ; cet acide aminé en position 35 correspond à la glycine dans le sous-type ad, et à l'arginine dans le sous-type ay_. La substitution de la glycine en position 35 par l'arginine crée un site additionnel de clivage par la trypsine à l'intérieur de la séquence pré-S(21-47) impliquée dans la liaison aux récepteurs des hépatocytes. Par conséquent, la spécificité de sous-type relative de l'ACM F35.25 pourrait être

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attribuée à une perte de l'extrémité N-terminale de la séquence pré-Sl de l'HBV de sous-type ay. sous l'effet d'une enzyme de type de la tryspine. Ceci pourrait expliquer la plus grande instabilité des particules de sôus-type ay_ (teilles que RE, BAY, PEI.) que celles de sous-type ad (telles que LIS/88 et LAM.) .

Ainsi l'ACM F35.25 constitue un bon marqueur du caractère infectieux de l'HBV puisqu'il est capable de former un complexe immunologique, détetable in vitro, avec l'épitope pré-S(32-53) comprenant la glycine (35) impliquée dans le mécanisme de fixation de sous-type ad sur les hépatocytes.

L'ACM MA18/7 ne reconnaît pas la région comprenant la glycine en position 35, puisqu'il est spécifique de la séquence pré-S(38-121) , et n'est donc pas un aussi bon marqueur d'infectiosité des HBV circulants que ne l'est l'ACM F35.25.

La mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, de détection in vitro de la proportion de la grande protéine S par rapport aux protéines S moyennes et majeures à partir de sérums d'individus atteints d'hépatite B chronique, a donné les résultats suivants: 1) Chez un groupe d'individus porteurs chroniques symptomatiques, chez lesquels on peut détecter un réplication virale active (correspondant à la présence dans le sérum de ces individus d'ADN-polymérase, d'ADN d'HBV, et d'HBe qui est un antigène de la nucléocapside) , il a été détecté par la méthode de l'invention que

- Chez 36 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est supérieure à celle de

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la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement environ 35 à 40 %, et 20 % des protéines S contenues dans les sérums desdits individus.

- Chez 45 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est inférieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines s représentant respectivement 25 % et 50 % des protéines S présentes dans les sérums desdits individus.

- Chez 18 % des individus de ce groupe la quantité de grande protéine S est à peu près identique à celle de protéine S moyenne, et représente pour ces deux protéines environ 25 % de la quantité de protéine S présente dans les sérum desdits individus.

Parmi ce groupe d'individus, deux cas ont évolué vers la guérison. Il s'agit d'une part d'un individu ayant développé des anticorps anti-HBe, et d'autre part d'un individu ayant subi un traitement par l'interféron et chez lesquels on ne détecte plus, à l'aide de l'ACM F35 de grande protéine S, la quantité des protéines S à diminué de 60 %, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 55 % des protéines S présentes dans les sérums de ces deux individus. 2) Etude réalisée sur un groupe d'individus (désignés ci-après groupe II) porteurs symptomatiques chez lesquels la réplication virale (ADN d'HBV) détectable ou non dans le sérum et possédant des anticorps anti- HBe :

- chez 80 % de ces individus, la quantité de grande protéine S est nettement inférieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines représentant

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respectivement 15 % et 40 % des protéines S contenues dans le sérum desdits individus,

- chez 20 % de ces individus, on ne détecte plus de grande protéine S, et la protéine S moyenne détectée représente environ 35 % des protéines S contenues dans le sérum de ces individus.

Il faut noter que dans ce même groupe d'individus, la technique d'amplification d'ADN (technique PCR) conduit à la détection chez 80 % d'entre eux d'ADN d'HBV (correspondant à une réplication virale à bas bruit), tandis que chez 20 % d'entre eux, on ne détecte plus d'ADN de l'HBV. Il semble donc exister une bonne corrélation des résultats obtenus entre ces deux méthodes, celle de l'invention étant plus avantageuse que celle d'amplification de l'ADN, compte tenu de la complexité de de mise en oeuvre de cette dernière. 3) Etude menée sur un groupe d'individus porteurs asymtornatiques (ou encore porteurs "sains") chez lesquels la réplication virale est nulle, et qui sont porteurs d'anticorps anti-HBe :

- chez 25 % des individus de ce groupe, aucune protéine S n'a été détectée,

- chez 18 % des individus de ce groupe, ne sont détectées que des protéines S majeures,

- chez 46 % des indvidus de ce groupe, on ne détecte pas de grande protéine S, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 50 % des protéines S présentes dans les sérums de ces individus.

Une étude plus détaillée de la signification clinique de l'expression des antigènes pré-S (c'est-à- dire des grandes protéines S, ou encore designées par

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pré-SlAg, et des protéines moyennes, ou encore désignés par pré-S2Ag) dans les sérums de porteurs chroniques d'HBsAg a été réalisée suivants des techniques radio- imunologiques (RIA) utilisant :

1') des anticorps polyclonaux anti-HBs sur une phase solide utilisée pour capturer les particules d'HBsAg d'HBV par l'intermédiaire du composant majeur de l'enveloppe de l'HBV,

2 ' ) des anticorps monoclonaux afin de détecter sélectivement soit l'activité HBsAg ou les épitopes associés pré-S2 ou pré-Sl,

3*) des fragments F(ab') d'anti-immunoglobulines de souris marquées à I ¹²⁵ . a) MATERIELS ET METHODES - patients et sérums

Un groupe de 39 porteurs chroniques d'HBsAg a été sélectionné sur la base d'un screening sérologique de routine utilisant le test RIA commercialisé par les laboratoires ABBOTT (CHICAGO, IL) . Tous ces patients ne possèdent pas d'anticorps contre le virus de l'hépatite Δ. HBeAg et les anticorps anti-HBe ont été déterminés avec des kits RIA disponibles commercialement (Laboratoires ABBOTT) . L'ADN d'HBV dans les sérums a été mesuré par la technique d'hybridation décrite dans SCOTTO J. et al, Hepatology (1983) ; 2 ^:279 " ²⁸⁴ - Cette méthode permet de détecter 0,1 pg d'ADN d'HBV. Des biopsies de foies frais congelés provenant de certains patients ont été étudiées par immunofluorescence (IF) pour la détection d'HBcAg. La méthode IF utilisée a été décrite en détail dans TREPO C. et al, Gastroenterology, (1976) ; 71 : 804-808. Le diagnostic

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a été établi par les études cliniques, sérologiques et histologiques (CAH correspond à l'hépatite active chronique ; CPH correspond à l'hépatite chronique persistante et cirrhose) .

Les 39 cas ont été divisés en trois groupes suivant les mêmes critères que ceux utilisés pour distinguer les trois groupes de l'expérience précédente:

1*) Le groupe I est constitué de 11 patients (28,2 %) présentant de l'HBeAg (ou encore HBe positifs) et de l'ADN d'HBV dans leur sérum.

2*) Le groupe II est constitué de 8 patients (20,5 %) possédant des anticorps anti-HBe (ou encore anti-HBe positifs) et une activité pathologique persistante au niveau du foie et chez lesquels de l'ADN d'HBV peut être détecté ou non.

3') Le groupe III est constitué de 20 patients (51,3 %) qui sont des porteurs d'HBsAg, dont les tests du fonctionnement du foie sont normaux, présentant des anticorps anti-HBe mais chez lesquels la réplication d'HBV dans le sérum n'est pas détectable.

Des sérums humains normaux ne contenant pas d'HBV ont été utilisés comme contrôles négatifs.

8 patients ayant développé des anticorps anti-HBs après une infection aiguë par HBV ont également été testés en parallèle.

- Détection de HBsAg et des antigènes pré-S dans le sérum par RIA polyclonal-monoclonal (Pab-Mab)

Un test RIA a été développé pour la quantification précise des épitopes pré-Sl et pré-S2 associés à l'activité HBsAg dans le sérum. Des billes

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de polystyrène (NORTHUMBRIA BIOLOGICALS, Northumbria; U.K.) ont été enduites avec des inβunoglobulines polyclonales de lapin dirigées contre l'HBsAg sérique (PETIT et al , (1986)) à une concentration de 10 μg/ml, et' saturées avec 5 % (en poids par volume) d'albumine de sérum de boeuf dans le tampon TN (Tris-HCl 0,01 M, NaCl 0,14 M, pH 7.2). Des séries de dilutions de 10- ¹ à 10- ¹⁰ des échantillons de sérums humains ont alors été ajoutées aux billes enduites d'anticorps anti-HBs. Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les billes ont été lavées avec de l'eau distillée, et incubées pendant 4 heures à 37*C avec des anticorps monoclonaux. HBsAg a été déterminé en utilisant l'anticorps monoclonal F39.20 décrit ci- dessus, spécifique d'HBs (c'est-à-dire spécifiques de la protéine S majeure) . Les antigènes pré-S ont été détectés en utilisant l'anticorps monoclonal F124 spécifique de pré-S2, décrit ci-dessus ou en utilisant l'anticorps monoclonal spécifique de pré-Sl, à savoir l'anticorps monoclonal F35.25 dirigé contre le récepteur pour les hépatocytes d'HBV. F39.20 et F124 ont été utilisés en tant qu'immunoglobulines G partiellement purifiées à partir de fluides ascitiques à une concentration de 5 μg/ml. F35.25 a été utilisé à une dilution au demi du fluide de culture de l'hybridome. La liaison des anticorps monoclonaux spécifiques a été détectée par incubation (1 heure à 37*C) avec les fragments F(ab')2 d'anti- immunoglobulines de souris marqués avec ²⁵ I (AMERSHAM FRANCE, Les Ulis) . Le diluant utilisé ci-dessus consiste en 50 % de sérum de lapin normal, 5 %

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d'albumine de sérum de boeuf dans le tampon TN. Les billes ont été lavées et la radioactivité mesurée dans un compteur gamma.

Les résultats sont exprimés en cpm (coups par minute) d'anticorps marqués à ¹²⁵ I liés. De manière à déterminer les rapports quantitatifs entre les trois spécificités antigéniques (S, pré-S2 et pré-Sl) de l'enveloppe HBV dans le sérum, la détermination des titres a été réalisée et les rapports pré-SlAg/HBsAg ainsi que pré-S2Ag/HBsAg ont été calculés pour une dilution 10- ¹ ou 10- ² du sérum. b) RESULTATS

- Corrélation entre la détection des épitopes de F35.25 et la présence de virions complets dans les sérums.

Le sérum d'un porteur chronique d'HBsAg (sous-type ad) contenant de l'HBeAg et de l'ADN d'HBV, après une première centrifugation à faible vitesse (50.000 x g pendant 4 heures) a été soumis à une série d'étapes d'ultracentrifugation terminée par une centrifugation dans un gradient linéaire de saccharose de 10 à 60 % pendant 18 heures à 200,000 x g. Les fractions ont été récupérées et dosées avec l'anticorps monoclonal F39.20 spécifique d'HBs, et l'anticorps monoclonal F35.25 spécifique de pré-Sl en utilisant la technique RIA PAb-MAb décrite ci-dessus.

Les virions complets caractérisés par détection simultanée de l'ADN d'HBV et de la protéine majeure du core (noyau) , P22c, par hybridation et technique d'immuno-empreinte respectivement, ont été trouvés dans les fractions 6-8 correspondant aux bandes de

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centrifugation à 40-50 % de saccharose. Les résultats démontrent que la détection de l'épitope spécifique de pré-Sl par l'anticorps monoclonal F35.25 est associée étroitement à la présence d'HBV infectieux dans le sérum. Toutes les fractions correspondant à des concentrations plus faibles en saccharose (< 30 %) ne contiennent pas le récepteur hépatocytaire de pré-Sl d'HBV.

- Détection du récepteur hépatocytaire de pré-Sl (épitope F35.25) et de l'antigène pré-S2 (épitope F124) chez les porteurs chronique d'HBsAg : corrélation avec la présence d'ADN HBV dans le sérum, d'HBcAq dans le foie et du système HBe.

13 sur les 19 patients (soit 68.4 ) comportant des particules HBsAg (ou encore HBsAg positif) avec des pathologies chroniques du foie, sont porteurs d'ADN d'HBV (ou ADN-HBV positif) : ces 13 patients représentent tous les cas HBeAg du groupe I, mais seulement 2 sur les 8 cas anti-HBe du groupe II (tableau I). A l'intérieur du dernier groupe II, 6 (soit 75 %) comportent toutefois de l'HBeAg intrahépatique.

Sur les 19 patients présentant une pathologie chronique du foie, le récepteur hépatocytaire de pré-Sl d'HBV (épitope F35.25) a été détecté chez 17 de ces patients (soit 89.5 %) : ces épitopes F35.25 ont été détectés chez tous les patients HBeAg positif et chez 6 sur 8 (75 %) des cas anti-HBe positif. Seulement 2 (25 %) du groupe II sont négatifs en ce qui concerne l'antigène pré-Sl. Il a été observé que un sur ces deux

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patients est également négatif pour ce qui concerne l'HBeAg intrahépatique.

Par contre, le récepteur hépatocytaire de pré-Sl d'HBV n'a pas été détecté chez 18 sur les 20 (90 %) des porteurs sains d'HBsAg anti-HBe positif (groupe III) .

L'antigène pré-S2 (épitope F12 ) a été détecté dans tous les échantillons de sérum ( 19 sur 19, 100 %) provenant de patients HBsAg positif présentant des pathologies chroniques du foie, (groupes I et II) , e: chez 15 sur 20 (75 %) des porteurs d'HBsAg présentai des anticorps anti-HBe (groupe III) (tableau I) .

Tous les patients (8 sur 8) qui ont fait une séro-conversion anti-HBs après avoir fait une hépatite B aiguë ont été trouvés comme étant négatifs pour les antigènes pré-Sl et pré-S2 ainsi que les sérums humains normaux ne contenant pas de marqueur HBV dans le sérum.

Comme il est indiqué dans le tableau I, sur les 19 patients positifs pour le récepteur hépatocytaire de pré-Sl d'HBV, 13 (soit 68.4 %) présentent de l'ADN d'HBV circulant dans le sérum, 17 présentent de l'HBeAg dans le foie, (soit 89.5 %) , et 11 (soit 57.9 %) réagissent à l'HBeAg. Par conséquent, l'expression de l'antigène pré-Sl d'HBV dans les sérums des porteurs chroniques d ¹ HBsAg peut être corrélée de façon significative (P < 0.001) avec les deux marqueurs les plus directs de la réplication d'HBV (l'ADN d'HBV dans le sérum et l'expression hépatocytaire d'HBcAg) aussi bien qu'avec le système HBeAg/anti-HBe. Par opposition, l'expression de l'antigène pré-S2Ag semble suivre la production continuelle des protéines HBsAg, et ne présente pas de corrélation significative ( P > 0.5)

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avec l'ADN d'HBV, dans le sérum, HBcAg dans le foie et le système HBe.

ABLEAU I : Détection du récepteur hépatocytaire de pré-Sl (épitopep F35.25) épitopes FI24) chez les porteurs chroniques d' HBsAg : corrélation avec l' 'HB _' cAg dans le foie et le système HBe.

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Analyse quantitative d'HBsAg et des antigènes pré-S dans les différents groupes des porteurs d'HBsAg chroniques.

Les résultats présentés sur la figure 10 montrent que les titres en HBsAg et en pré-SlAg dans les cas HBeAg positif (figure 10A, 1:10 ^e et 1:10 ⁶ respectivement) sont plus forts que parmi les cas anti-HBe positifs (figure 10B, 1:10* et 1:10 ² respectivement). On peut remarquer qu'à l'intérieur du groupe I, 5 patients sur 11 (soit 45%) (figure 10A, sérum 7616) présentent un relativement faible titre d'antigène pré-S2 (1:10 ⁴ ), tandis que 6 (55%) présentent de hauts titres en pré-S2Ag qui vont jusqu'à 1:10 ⁸ (figure 10A, sérum 7936). Parmi les groupes II et III (figure 10B, sérum 7106 et figure 10C, sérum H535) , les titres en HBsAg et pré-S2Ag sont de 1:10 ⁴ et 1:10 ³ , respectivement. Ainsi, les titres en pré-S2Ag sont similaires aux titres en HBsAg chez 27 sur 34 patients (soit 79.4%) positifs en pré-S2Ag. A l'intérieur du groupe III, 5 sur 20 patients (soit 25%) réagissent pour HBsAg seul avec des titres allant jusqu'à 1:10 ⁵ (figure 10C, sérum H305) . Seulement 2 patients sur 20 (soit 10%) sont positifs pour les deux antigènes pré- S2Ag et pré-SlAg, mais les titres sont faibles avec un maximum de 1:10 ² (figure 10C, sérum H39) , tandis que le titre en HBsAg est de 1:10 ⁵ .

- Importance clinigue de l'expression du récepteur hépatocytaire de pré-Sl durant l'infection chronique par HBV.

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Dans la figure 11, sont représentés les rapports pré-SlAg/HBsAg et pré-S2Ag/HBsAg calculés pour une dilution 10- ¹ du sérum (cf. figure 10) chez les trois groupes. Dans le groupe I, 5 patients sur 11 (soit 45%) présentent un rapport pré-S2Ag/HBsAg plus faible (35%) que les 6 patients restant qui présentent le même profil sérologique HBV comportant HBeAg et l'ADN d'HBV. A l'exception de ce sous-groupe, le rapport pré- S2/HBsAg a été détecté comme étant haut (60%) et ne diffère pas de façon significative chez 27 sur 34 (soit 79.4%) de patients pré-S2 positif appartenant aux groupes 1, 2 ou 3. Ce résultat suggère que le rapport pré-S2Ag/HBsAg ne peut pas être considéré comme un indicateur fiable du niveau de la réplication virale et par conséquent de 1'infectivité relative durant l'infection chronique par HBV.

En revanche, les rapports pré-SlAg/HBsAg sont plus hauts (environ 50%) chez les patients HBeAg positif du groupe I avec une réplication virale active que chez les patients anti-HBe positif du groupe II (soit 20%) présentant une activité pathologique au niveau du foie, mais ayant un faible niveau de réplication d'HBV dans le sérum. Ce rapport est négatif chez 13 sur 15 patients (soit 89%) des porteurs sains du groupe III, qui sont positifs pour HBsAg et pré-S2Ag mais qui ne présentent pas de réplication d'HBV ni de pathologie du foie. Ainsi le rapport pré-SlAg/HBsAg semble être bien corrélable avec la réplication d'HBV.

De manière avantageuse la méthode de détection in vitro de l'invention permet la discrimination entre les différents groupes de porteurs chroniques de l'HBV et

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la comparaison de l'expression de trois spécificités antigéniques (S, pré-Sl et pré-S2) avec la même sensibilité.

Les résultats décrits ci-dessus montrent que la 'détection de pré-SlAg dans le sérum par le système RIA PAb-MAb sus-mentionné est corrélable avec la présence d ¹ HBcAg dans le foie, même lorsque l'ADN d'HBV et l'ADN polymérase ne sont pas détectables dans le sérum. Par conséquent pré-SlAg est un marqueur spécifique du niveau de réplication d'HBV pendant l'infection chronique par HBV.

La découverte de la présence de pré-SlAg dans le sérum et d'HBcAg dans le foie de malades atteints d'hépatite chronique présentant des anticorps anti-HBe (groupe II) suggère que:

- la réplication virale se fait dans le tissu,

- les virions complets continuent à être libérés dans le sérum

- la quantité d'ADN d'HBV présent dans le sérum peut être trop faible pour être détectée par les technologies classiques d'hybridation.

Par ailleurs, les résultats décrits ci-dessus montrent que le pré-S2Ag est présent chez la plupart (87,2%) de porteurs symptomatiques et asymptomatiques chroniques d'HBsAg. Le rapport pré-S2Ag/HBsAg détecté chez les porteurs sains (groupe III) n'est pas significativement différent de celui des patients des groupes I et II, et reste élevé (jusqu'à 60%) dans les différents stades de l'infection chronique par HBV. Ceci suggère la synthèse continue de protéines pré-S2 même chez les porteurs sains d'HBsAg.

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Les légendes des figures mentionnées dans la description détaillée qui précède sont les suivantes :

- figure 1 : représentation schématique de l'HBV ; structure, composants, et interaction(s) cellule-virus. RI est le récepteur cellulaire impliqué dans la liaison directe de l'HBV par l'intermédiaire des séquences pré-Sl ; R2 est le récepteur cellulaire pour la p(HSA) probablement impliqué dans la liaison indirecte de l'HBV et d'HBsAg par l'intermédiaire des séquences pré-S2 portant le récepteur viral pour la glutaraldehyde-pHSA.

- figure 2 : figure 2a ; dosage radio-immunologique des séquences S, pré-S2 et pré-Sl dans les particules HBsAg (A) et dans les préparations d'HBV purifié à partir de sérum humain (B) , et utilisées comme sondes antigéniques dans la figure 2b. Les billes enduites d'anticorps anti-HBs ont été mises en présence avec des concentrations décroissantes soit d'HBsAg soit d'HBV et l'antigène lié a été détecté en utilisant l'anticorps monoclonal F39.20 spécifique de la région S (•—•) et l'anticorps monoclonal F124 spécifique de la région pré-S2 ( A __ ), et l'anticorps monoclonal MA18/7 spécifique de la région pré-Sl ( Cl l ) (à une concentration finale de 5 μg/ml) . Figure 2b ; spécificité polypeptidique de l'anticorps F35.25 par la technique des immuno-empreintes (Western blot) . A, sérum HBs/pré-S2Ag ; B, sérum HBs/pré-S2/pré-SlAg (HBV); C, HSA (200 μg/ml) ; D, NHS (dilué au 1:500). La liaison des anticorps monoclonaux dans la figure 2a comme dans la figure 2b a été déterminée avec des

^'

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anti-immunoglobulines de souris, le fragment F(ab')2 marqué à I ¹²⁵ C2.10 ⁶ cpm par bille ou par bande de gel).

- figure 3 : séquence en acides aminés (déduites à partie des séquences d'ADN de l'HBV) des régions pré- S(21-53), et pré-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant à 5 sous-types antigéniques d'HBV. La localisation de l'épitope reconnu par F35.25 est indiquée sur la figure . Les résidus d'acides aminés communs aux 5 sous-types sont indiqués par des petits ronds sous chacun de ces acides aminés. Le dipeptide encadré PA est celui probablement requis pour la liaison à l'anticorps F35.25 ; la séquence peptidique encadrée s'étendant des acides aminés 40 à 47 (NPDWDFNP) , est conservée chez tous les sous-types HBV à l'intérieur du site de liaison de l'anticorps F35.25 ; T représente les sites de clivage par la trypsine accessibles dans les particules HBV complètes.

- figure 4 : dosage radio-immunologique (RIA) à double anticorps, réalisé avec un fluide d'hybridome dilué deux fois contenant F35.25 ( ^* ^ 10 ng/ml) . a, les peptides spécifiques de la région pré-Sl 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-117 ont été utilisés pour enduire des billes. F35.25 lié aux billes enduites de peptide synthétique a été détecté avec une anti-immunoglobuline de souris marquée avec I ¹²⁵ comme il l'a été décrit dans la figure 2. Figure 4b, les particules HBsAg contenant les séquences pré-S2 obtenues par recombinaison dans des cellules recombinantes CHO, les particules d'HBV purifiées, HSA, pBSA et pHSA ont été utilisées pour enduire des billes dans les mêmes conditions que pour

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la figure 4a. Chaque colonne représente deux déterminations.

- figure 5 : effet inhibiteur des peptides spécifiques de la région pré-Sl et des particules d'HBV purifiées (à une concentration finale de 20 μg/ml) sur la liaison de l'ACM F35.25 aux puits enduits avec soit pré- S(32-53) (figure 5a) ou avec HBV sous-type ad (figure 5b) . Les conditions de cette expérience ont été décrites dans le chapitre MATERIELS ET METHODES en utilisant un fluide d'hybrido e dilué deux fois comme dans la figure 4.

- figure 6 : sensibilité de l'ACM F35.25 pour détecter le peptide pré-S(32-53) et les séquences pré-Sl dans les particules d'HBV purifiées. Les puits enduits soit avec le peptide pré-S(32-53) ( ) (5 μg/ml) ou avec HBV sous-type ad ( A. ) (10 μg/ml) ont été mis en présence avec des concentrations décroissantes de F35.25 purifié à partir de surnageants de cellules d'hybridome.

- figure 7 : effet de la digestion par la trypsine ou la protéase V8 des particules HBV purifiées (sous-type ad) sur la liaison de l'ACM F35.25 (a), de l'anticorps monoclonal F376 spécifique de la région pré-S2 (b) et de l'anticorps 6-16 A15 spécifique de la région S (c) à la protéine env par technique d'immuno-empreinte. Le traitement de l'antigène a été réalisé comme il l'a été décrit dans le chapitre MATERIELS ET METHODES. Les lignes 1, 4, et 7 représentent des contrôles sans enzyme ; les lignes 2, 5 et 8 représentent les produits de la digestion par la trypsine ; les lignes 3, 6 et 9 représentent les produits de digestion par la protéase

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V8. les lignes 1 à 3 ont été sondées avec le surnageant d'hybridome dilué au 1:2, et les lignes 4 à 9 ont été sondées avec 5 μg/ml d'anticorps monoclonal purifié à partir de liquide d'ascites. L'anticorps se liant aux protéines transférées a été détecté avec l'anti- immunoglobuline de souris marquée avec I ¹²⁵ . les poids moléculaires des peptides ( x 10 ³ ) sont indiquées sur la gauche.

- figure 8 : gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad) . 1 ml de matériel enrichi en virus a été sédimenté dans un gradient linéaire de sucrose de 10 à 60 % dans un tampon TN pendant 18 heures à 160000 g et 4 "C. Les fractions ont été récupérées et analysées avec l'ACM F39.20 (- -), ou l'ACM F35.25

( _" ^~~ " ) par dosage radio-im unologique à double spécificité d'anticorps utilisant une phase solide portant des anticorps polyclonaux de lapin anti-HBs. La concentration de sucrose (-O-) a été testée par refraction. Les fractions 6-8 (40-50 % de sucrose) ont été testées pour leur teneur en ADN d'HBV par hybridation, et pour leur teneur en protéine majeure du core P22 ^c , par immunotransfert (+) .

- figure 9 : détection de la séquence pré-Sl (32-53) dans les particules d'HBV isolées (sous-type ad ou av) en utilisant le système de dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps, avec des immunoglobulines anti-HBs sur la face solide et l'anticorps F35.25 sur la face de révélation. Les particules d'HBV purifiées ont été utilisées à une concentration d'I μg/ml. La liaison de F35.25 a été

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détectée avec l'anti-immunoglobuline de souris marquée avec I ¹²⁵ , fragment F(ab')2.

- figure 10 : analyse quantitative des antigènes HBsAg et pré-S chez différents groupes de porteurs chroniques d'HBsAg.

HBsAg (protéine S majeure) (—•——#-) ; récepteurs hépatocytaire pré-Sl (-Q-D-) ; antigène pré-S2 (-o-o-) . Les tests ont été réalisés selon la méthode radioimmunologique PAb-MAb décrite ci-dessus.

- figure 11 : signification clinique de l'expression du récepteur hépatocytaire pré-Sl chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Le rapport pré- SlAg/HBsAg (colonnes représentées en noir) et le rapport pré-S2Ag/HBsAg (colonnes représentées en gris) ont été calculés pour une dilution 10 ^'2 du sérum (cf. figure 10B et 10C) ou 10- ³ (cf. figure 10A) .

Groupe I: patients HBeAg et ADN-HBV positifs présentant une pathologie chronique du foie. Groupe II: patients anti-HBe positifs présentant une pathologie chronique du foie. Groupe III: porteurs sains anti-HBe positifs.

Variations du rapport pré-SlAg/HBsAg ( ) et du rapport pré-S2Ag/HBsAg ( ) en fonction des différents stades virologiques de l'hépatite B chronique.

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