Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereich der Demenzerkrankungen und im Besonderen den Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen, wobei die vorliegende Erfindung maßgeblich auf die Alzheimer-Krankheit fokussiert.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung den Bereich der präklinischen und klinischen Vorstufen der Alzheimer-Erkrankung.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen neuartigen neuro- chemischen Ansatz bzw. eine neuartige neuro-chemische Analyse bestimmter Parameter in einer Probe des zu untersuchenden Probanden bzw. Patienten, wobei eine signifikant verbesserte Prognose hinsichtlich des Auftretens bzw. der Entwicklung einer Alzheimer-Krankheit ermöglicht bzw. auf das Vorliegen einer Alzheimer-Krankheit bzw. deren präklinischer und klinischer Vorstufen geschlossen werden kann.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines quantitativen Verhältnisses aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta- Peptiden in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Probanden bzw. eines Patienten zur Bestimmung dessen Wahrscheinlichkeit, an einer Alzheimer- Krankheit zu erkranken bzw. zur Bestimmung dessen Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung entsprechende Verfahren, mit denen die Wahrscheinlichkeit eines Probanden bzw. Patienten bestimmt werden kann, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. mit denen auf das Vorliegen einer solchen Erkrankung geschlossen werden kann.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, anhand dessen Mittel bereitgestellt werden, mit denen die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit eines Patienten bzw. Probanden, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. die Bestimmung auf das Vorliegen einer präklinischen bzw. klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit bei dem in Rede stehenden Probanden bzw. Patienten ermöglicht wird.

BESTÄTIGUNGSKOPIE Unter Demenzerkrankungen wird im Allgemeinen ein Defizit bei den davon betroffenen Probanden bzw. Patienten in Bezug auf kognitive, emotionale bzw. soziale Fähigkeiten verstanden, was bei Voranschreiten der Erkrankung zu einer mitunter tiefgreifenden Beeinträchtigung der Lebensalltags der davon betroffenen Individuen einhergeht. Maßgeblich für eine Demenzerkrankung ist der Verlust bereits erworbener Fähigkeiten, wobei diesbezüglich die Sprache, die Motorik und die Persönlichkeitsstruktur betroffen sein können. Eine Demenzerkrankung geht in der Regel mit einer deutlichen Verschlechterung des Kurzzeitgedächtnisses sowie einer starken Beeinträchtigung des Denkvermögens einher.

Einen großen Bestandteil der Demenzerkrankungen nehmen so genannte neu- rodegenerative Erkrankungen, wie die in Rede stehende Alzheimer-Krankheit, eine frontotemporale Demenz sowie eine Lewy-Körperchen-Demenz, ein.

Als neurodegenerative Erkrankungen werden im Allgemeinen eine Gruppe von meist langsam fortschreitenden, erblich oder sporadisch auftretenden bzw. bedingten Erkrankungen des Nervensystems verstanden. Kennzeichnend für derartige Erkrankungen ist der fortschreitende Verlust von Nervenzellen, was zu verschiedenen neurologischen Symptomen führen kann. Neurodegenerative Erkrankungen können grundsätzlich in allen Lebensalterstufen auftreten, wobei jedoch mit zunehmendem Alter die Gefahr, an einer derartigen Erkrankung zu erkranken, deutlich zunimmt. Neurodegenerative Erkrankungen verlaufen in der Regel diffus oder generalisiert und gehen im Allgemeinen mit jeweils charakteristischen histologischen Schädigungsmustern einher.

Eine der häufigsten Formen der neurodegenerativen Erkrankungen stellt die Alzheimer-Krankheit dar, welche synonym auch als Morbus Alzheimer bezeichnet und im Allgemeinen und auch im Nachfolgenden durch das Akronym "AD" verkürzend bezeichnet wird. Die Alzheimer-Krankheit ist gleichermaßen eine neurodegenerative Erkrankung, welche insbesondere bei älteren Menschen auftritt. So tritt die Alzheimer-Krankheit in ihrer häufigsten Form bei Personen jenseits des 65. Lebensjahrs auf, wobei die entsprechenden Vorläuferformen der Alzheimer-Krankheit bzw. präklinische und/oder klinische Vorstufen der Alzheimer-Krankheit auch deutlich früher auftreten können. Die Prävalenz neurodegenerativer Erkrankungen und insbesondere der Alzheimer-Krankheit ist stark zunehmend. So wurde die Anzahl der von der Alzheimer-Krankheit betroffenen Menschen zum Ende des Jahres 2009 auf weltweit etwa 35 Millionen Menschen geschätzt, wobei diesbezügliche Abschätzungen davon ausgehen, dass die Anzahl der von der Alzheimer-Krankheit betroffenen Personen bis zum Jahr 2050 auf über 100 Millionen Menschen ansteigt.

Die Verbreitung neurodegenerativer Demenzerkrankungen steigt weltweit stetig an, wodurch die öffentlichen Gesundheitssysteme in Zukunft schwerwiegenden sozio-ökonomischen Belastungen ausgesetzt sein werden. Die Alzheimer-Krankheit ist hierbei die am weitesten verbreitete Demenzerkrankung.

Was die Ursachen bzw. die Verteilung der Alzheimer-Krankheit anbelangt, so ist eine gewisse familiäre Häufung festzustellen, wonach nämlich etwa 15 % bis 20 % der erfassten Alzheimer-Fälle mit einer bestimmten familiären Häufung im Zusammenhang steht. Bei derartigen Fällen handelt es sich insbesondere um solche, bei denen neben dem Betroffenen selbst auch Personen aus dem Kreis der Geschwister, Eltern bzw. Großeltern etc. von einer Alzheimer- Krankheit betroffen sind. Nur bei einem sehr geringen Teil der Erkrankten ist auch eine genetische Prädisposition mitentscheidend, wobei es sich hierbei insbesondere um Mutationen in Präsenilin-Genen und im APP-Gen (Amyloid- Precursor-Gen) handelt. In Bezug auf die Gesamtfälle an Alzheimer- Erkrankungen beträgt der genetisch bedingte Anteil jedoch wenigster als 0,5 %, so dass im Ergebnis der weitaus größere Teil der aller Alzheimer-Fälle sporadischen Ursprungs ist.

Was die Alzheimer-Krankheit als solche weiterhin anbelangt, so geht diese mit einer im zeitlichen Verlauf der Erkrankung zunehmenden Verschlechterung der kognitiven Leistungsfähigkeit einher, die in der Regel mit einer Abnahme der täglichen Aktivitäten, Verhaltensauffälligkeiten und neuropsycho- logischen Symptomen einhergeht. In diesem Zusammenhang wird dann im Allgemeinen auch von einer Alzheimer-Demenz gesprochen. Die Alzheimer- Demenz stellt gewissermaßen die Folge bzw. das Resultat der den Krank- heitsprozess beschreibenden Alzheimer-Krankheit dar. Von einer Alzheimer- Demenz wird somit vorrangig dann gesprochen, wenn das Ausmaß der Hirn- Schädigung so groß ist, dass kognitive Defizite nicht mehr erfolgreich durch noch intakte Neurone kompensiert werden können. Im Allgemeinen ist der Begriff der Alzheimer-Demenz von dem Begriff der Alzheimer-Krankheit mitumfasst.

Pathognostisch für die Alzheimer-Krankheit sind die sich im Gehirn des Betroffenen bildenden Plaques, welche maßgeblich fehlerhaft gefaltete Amyloid- beta-Peptide aufweisen, sowie die sich in den Neuronen anlagernden Neurofibrillen. Die intrazellulär gelegenen Neurofibrillenbündel bestehen im Wesentlichen aus dem Tau-Protein, welches dann zu den in Rede stehenden Fibrillen aggregiert, wenn es übermäßig phosphoryliert ist.

Im Krankheitsverlauf wird durch das Absterben von Neuronen eine Hirnatrophie manifest; außerdem wird der Botenstoff Acetylcholin nicht mehr in ausreichenden Mengen produziert, was insbesondere auch durch eine Verminderung des Gehalts an Cholinacetyltransferase bedingt ist.

Die Amyloid-beta-Peptide, welche synonym auch als A-beta-Proteine, A-beta-Peptide, A-beta bzw. als Aß-Peptide bezeichnet werden, entstehen aus dem so genannten Amyloid-Precursor-Protein (APP), bei welchem es sich um ein integrales Membranprotein handelt. Beim APP handelt es sich um ein so genanntes Typ I-Transmembranprotein mit einem sich auf der extrazellulären Seite befindlichen aminoterminalen Ende. Der Carboxyl-Terminus des Proteins befindet sich entsprechend auf der intrazellulären Seite. APP wird von bestimmten Proteinasen, den so genannten Sekretasen, gespalten, wobei hier insbesondere der ß-Sekretase sowie der γ-Sekretase eine besondere Bedeutung zukommt. Durch die Spaltung von APP kommt es zur Freisetzung der A-beta- Peptide aus dem Vorläufer-Protein, wobei im Rahmen des so genannten amy- loidogenen Wegs APP in einem ersten Schritt auf der extrazellulären Seite von der ß-Sekretase geschnitten wird. In einem nachfolgenden Schritt erfolgt ein weiterer Schnitt durch die γ-Sekretase, welcher innerhalb der Transmembrandomäne von APP erfolgt und zu einer Freisetzung der A-beta- Peptide führt. Bei den A-beta-Peptiden handelt es sich somit um ein durch die Aktivität von ß- und γ-Sekretase gebildetes potenziell neurotoxisches Bruchstück aus dem Amyloid-Precursor-Protein, welches im Allgemeinen eine Länge von 37 bis 42 Aminosäuren aufweist. Der in diesem Zusammenhang entstehenden Haupttyp der A-beta-Peptide ist das 40 Aminosäuren lange Aß(l-40), während ein kleinerer Anteil aus Aß(l-42) gebildet wird, welches entsprechend 42 Aminosäuren aufweist. Das längere Aß(l-42) weist dabei eine höhere Tendenz zur Aggregation auf als das kleinere Aß(l-40). Darüber hinaus können eine Reihe weiterer A-beta-Peptide entstehen, wie beispielsweise am amino- terminalen Ende trunkierte A-beta-Peptide, wie Aß(2-40) und Aß(2-42).

Im Stand der Technik werden A-beta-Peptide in Zusammenhang mit der pathologischen Ausbildung der Alzheimer-Krankheit gebracht.

Vor dem zuvor genannten Hintergrund sind im Stand der Technik zahlreiche therapeutische Ansätze zu realisieren versucht worden, welche eine therapeutische Behandlung der Alzheimer-Krankheit an sich ermöglichen sollen. So liegt ein therapeutischer Fokus darauf, eine Immunisierung gegenüber den zuvor beschriebenen A-beta-Peptiden zu erreichen, insbesondere im Zusammenhang mit der Anregung der Biosynthese von diesbezüglich spezifischen Antikörpern. Ein weiterer therapeutischer Ansatz besteht in der Entwicklung und Anwendung spezifischer Sekretase-Inhibitoren, welche insbesondere spezifisch im Hinblick auf die vorgenannte ß-Sekretase bzw. γ-Sekretase sein sollen. Die diesbezüglichen Ansätze sind jedoch aus therapeutischer Sicht noch in keiner Weise zufriedenstellend bzw. mit mitunter schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden.

Ein weiterer therapeutischer Ansatz ist in der gezielten Applikation von so genannten Acetylcholinesterase-Inhibitoren zu sehen, anhand derer die enzy- matische Spaltung des bei Alzheimer-Erkrankten in zu niedrigen Mengen vorkommenden Acetylcholins vermindert werden soll. Hierbei handelt es sich jedoch um einen nicht die Krankheit an sich beeinflussenden therapeutischen Ansatz. Denn die Applikation von Acetylcholinesterase-Inhibitoren, wie Do- nepezil, Rivastigmin und Galantamin, zielt auf eine symptomatische Behandlung der Alzheimer-Krankheit ab. Auf Basis eines derartigen Ansatzes ist es lediglich möglich, die kognitive Leistungsfähigkeit für einen begrenzten Zeitraum leicht zu verbessern bzw. auf einem stagnierenden Niveau zu erhalten.

Im Ergebnis ist im Stand der Technik bislang kein therapeutischer Ansatz gefunden worden, anhand dessen die Alzheimer-Krankheit geheilt werden kann. Insbesondere auch vor dem Hintergrund eines bislang fehlenden wirksamen therapeutischen Ansatzes zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit kommt einer möglichst frühzeitigen Diagnose der Erkrankung eine sehr große Bedeutung zu, wobei die Diagnose bereits in einem frühklinischen oder sogar präklinischen Stadium der Alzheimer-Krankheit gestellt werden sollte. Denn auf dieser Basis ist zum einen nicht nur eine Prognose bzw. die Bestimmung einer Wahrscheinlichkeit möglich, ob ein Proband bzw. Patient an der Alzheimer-Krankheit erkranken könnte, sondern zum anderen kann auf dieser Basis dem weiteren progressiven Krankheits verlauf bereits in einem sehr frühen Stadium entgegengewirkt werden. So ist es im Allgemeinen anerkannt, dass beispielsweise regelmäßige Bewegung, gezielte Gedächtnisübungen sowie eine gezielte Optimierung der Lebensweise den Krankheitsverlauf verzögern bzw. abmildern sowie den eigentlichen Ausbruch, d. h. die klinische Diagnose der Alzheimer-Krankheit, herauszögern können. Eine möglichst frühe Diagnose der Alzheimer-Krankheit, welche bereits auf Ebene der präklinischen oder frühklinischen Vorstufen ansetzt, ist auch im Hinblick auf neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit von großer Bedeutung.

Vor diesem Hintergrund sind im Stand der Technik bereits zahlreiche Ansätze untersucht worden, anhand derer eine möglichst frühzeitige Diagnose der Alzheimer-Krankheit ermöglicht werden soll. So sind in diesem Zusammenhang allgemein etablierte klinische Verfahren von Bedeutung, welche maßgeblich auf einer Differentialdiagnose beruhen, wobei speziell ausgerichtete kognitive Leistungstests und auch eine Fremdanamnese - also die Berücksichtigung von Beobachtungen der Angehörigen einer betroffenen Person - um- fasst werden. Auch bildgebende Verfahren, wie die Computertomographie oder Magnetresonanztomographie werden angewendet, um eine Diagnose der Alzheimer-Krankheit zu ermöglichen. Die vorgenannten Ansätze sind jedoch mit dem Nachteil behaftet, dass sie zum einen mitunter apparativ aufwendig sind und im Allgemeinen eine Diagnose der Alzheimer-Krankheit erst in einem späteren bzw. fortgeschrittenen klinischen Stadium ermöglichen.

Ein weiterer Ansatz zur frühzeitigen Diagnose der Alzheimer-Krankheit be- steht in einer Liquoruntersuchung eines Probanden bzw. Patienten, wobei diesbezüglich insbesondere der so genannte Liquor cerebrospinalis bzw. die Cerebrospinal-Flüssigkeit (CSF) für die Untersuchung herangezogen wird. Dabei wird vornehmlich auf die Analyse bestimmter Biomarker abgezielt, wobei in diesem Zusammenhang auch spezielle, im Liquor vorkommende A-beta-Peptide zur Analyse herangezogen werden. Nachteilig ist, dass dabei die Probe jedoch über eine aufwendige wie nicht risikolose und mitunter schmerzhafte Punktion entnommen werden muss, was mitunter auch mit unerwünschten Infektionen einhergehen kann. Somit eignet sich eine Liquorent- nahme nur eingeschränkt zur Untersuchung bei einem ersten Verdacht auf ei- ne mögliche Alzheimer-Erkrankung, wie er beispielsweise bei Patienten mit einer leichten kognitiven Störung vorliegen kann, und auch nur eingeschränkt zur Risikoabschätzung einer drohenden Alzheimer-Demenz.

Im Stand der Technik wurden spezielle Biomarker für Demenzerkrankungen in der Cerebrospinal-Flüssigkeit identifiziert, wodurch die diagnostische Genauigkeit eines verlässlichen Nachweises der Alzheimer-Krankheit in einem frühen oder sogar vorklinischen Stadium in gewisser Weise verbessert werden soll. Im Vergleich zu Blutuntersuchungen sind die neuro-chemischen CSF- Diagnoseverfahren zur Erkennung von Demenzerkrankungen (CSF-Based Neurochemical Dementia Diagnostics (CSF-NDD)) im höheren Maße invasiv und zudem schmerzhafter, teurer und zeitaufwendiger. Routinemäßige Wiederholungsuntersuchungen im Rahmen von Verlaufskontrollen sind daher nicht durchführbar. Es besteht folglich ein großer Bedarf an alternativen Testverfahren mit vereinfachter und weniger belastenden Probengewinnung, welche darüber hinaus auch die Überwachung des Krankheitsverlaufs oder des Therapieerfolgs ermöglichen sollen. Vor dem zuvor angeführten Hintergrund besteht somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, neue und effiziente Konzepte im Hinblick auf spezielle Verfahren und Verwendungen bereitzustellen, auf Basis derer eine Aussage über das Vorliegen einer Alzheimer-Krankheit bzw. eine Prognose im Hinblick auf eine mögliche Erkrankung an der Alzheimer-Krankheit in einem möglichst frühen, insbesondere in einem präklinischen oder frühklinischen Stadium, ermöglicht werden soll.

Insbesondere soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein entsprechendes Konzept bzw. Verfahren bereitgestellt werden, welches leicht durchzufuhren ist und mit möglichst wenigen Nebenwirkungen verbunden ist. Dabei soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch sichergestellt sein, dass die Bereitstellung bzw. Entnahme von im Rahmen des erfindungsgemäßen Konzeptes zu analysierende Proben für den Probanden möglichst schmerzfrei und mit möglichst geringen bzw. keinen Nebenwirkungen verbunden ist.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Kit bereitzustellen, anhand dessen eine einfache und standardisierte Durchführung des erfindungsgemäßen Konzeptes zur Ermittlung einer Alzheimer-Krankheit ermöglicht wird, insbesondere was die in Rede stehenden frühen Formen der Erkrankung anbelangt.

Schließlich besteht eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, ein Verfahren bzw. eine Verwendung bzw. ein Kit der vorgenannten Art bereitzustellen, welches bzw. welche jeweils die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden bzw. diese zumindest zu verringern imstande sind.

Insbesondere sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung in gezielter Weise spezifische Biomarker aus einer speziellen Probe verwendet werden, um auf dieser Basis eine möglichst frühzeitige Aussage im Hinblick auf das Vorliegen bzw. auf eine etwaige Entwicklung einer Alzheimer-Erkrankung zu ermöglichen. Insbesondere soll auf Basis der vorliegenden Erfindung darüber hinaus auch die Möglichkeit eröffnet werden, in einfacher und sicherer Weise den Verlauf einer bereits ausgebrochenen Alzheimer-Krankheit zu beobachten bzw. die Wirksamkeit von Therapieansätzen nachzuvollziehen.

Zur Lösung der zuvor geschilderten Aufgabenstellung schlägt die vorliegende Erfindung - gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung - die Verwendung mindestens eines quantitativen Verhältnisses aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden in einer Probe einer Körperflüssig- keit eines Probanden bzw. Patienten zur Bestimmung dessen Wahrscheinlichkeit, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. zur Bestimmung dessen Wahrscheinlichkeit, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. zur Bestimmung dessen Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit gemäß Anspruch 1 vor; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Erfin- dungsaspekts sind Gegenstand der diesbezüglichen Unteransprüche.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung - sind Verfahren zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit eines Probanden bzw. Patienten, an einer Alzheimer- Krankheit zu erkranken, nach Anspruch 31 bzw. nach Anspruch 32; eine weitere, vorteilhafte Ausgestaltung dieser Erfindungsaspekte ist Gegenstand des betreffenden Unteranspruchs.

Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem wiederum weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein Kit nach Anspruch 34, welches insbesondere zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit eines Patienten bzw. Probanden, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. welches insbesondere zur Bestimmung dessen Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit verwendet werden kann; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Erfindungsaspekts sind Gegenstand der betreffenden Unteransprüche.

Es versteht sich von selbst, dass im Folgenden besondere Ausgestaltungen, Ausführungsformen oder dergleichen, welche nur im Zusammenhang mit ei- nem Erfindungsaspekt beschrieben sind, auch in Bezug auf die anderen Erfin- dungsaspekte entsprechend gelten, ohne dass dies einer ausdrücklichen Erwähnung bedarf.

Darüber hinaus gilt, dass alle nachfolgend angeführten experimentellen Untersuchungen bzw. Studien oder dergleichen grundsätzlich mit dem Fachmann an sich bekannten bzw. genormten bzw. explizit angegebenen Methoden bzw. Verfahren durchgeführt werden können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem e r s t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist somit die Verwendung mindestens eines quantitativen Verhältnisses (Quotienten) aus zwei voneinander verschiedenen Amy- loid-beta-Peptiden (A-beta; Aß) in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Probanden und/oder Patienten zur Bestimmung dessen Wahrscheinlichkeit (Risikos), an einer Alzheimer-Krankheit (Morbus Alzheimer, AD) zu erkran- ken und/oder zur Bestimmung (Diagnose) dessen Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, wobei die Amyloid-beta-Peptide ausgewählt werden aus (a) Aß(l-42), (b) Aß(2-40) und (c) Aß(2-42) und wobei das quantitative Verhältnis aus (a) / (b) oder vice versa und/oder aus (a) / (c) oder vice versa gebildet wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es somit völlig überraschend, dass die Aufgabenstellung durch die zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verwendung eines Verhältnisses auf Basis spezieller Amyloid-beta-Peptide gelöst werden kann.

In diesem Zusammenhang ist es gleichermaßen völlig unerwartet, dass das in Rede stehende Verhältnis herangezogen werden kann, und das Vorliegen einer Alzheimer-Krankheit verlässlich festzustellen bzw. um die Entwicklung einer Alzheimer-Krankheit verlässlich prädiktiv zu bestimmen.

Zwar ist im Stand der Technik der Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Amyloid-beta-Peptiden als solchen und der Alzheimer-Krankheit grundsätzlich bekannt, und auch der allgemeine Aspekt des Einsatzes von Amyloid- beta-Peptiden in Bezug auf die Diagnose der Alzheimer-Krankheit wird im Stand der Technik in Betracht gezogen; jedoch ist es bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung im Stand der Technik in keiner Weise in Erwägung gezogen worden, ein derart spezielles, erfindungsgemäß zugrundeliegendes Verhältnis von Amyloid-beta-Peptiden - und dies darüber hinaus insbesondere auf Basis der Verwendung einer sehr speziellen Probe, wie nachfolgend noch angeführt - in Erwägung zu ziehen, um so eine fundierte bzw. verlässliche Aussage über das Vorliegen einer Alzheimer-Krankheit bzw. eine verlässliche Prognose bzw. Prädiktion der Ausbildung bzw. Entwicklung einer Alzheimer-Erkrankung bei einem Probanden/Patienten zu ermöglichen.

Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung vollkommen überraschend, dass das spezielle Verhältnis bestimmter Amyloid-beta-Peptide hinsichtlich des Vorliegens einer Alzheimer-Krankheit von hoher Signifikanz ist und somit das spezielle Verhältnis bestimmter Amyloid-beta-Peptide als verlässlicher Indikator für das Vorliegen einer Alzheimer-Krankheit auch in einem frühen Stadium der Erkrankung, wie beispielsweise präklinischen und frühklinischen Formen der Alzheimer-Erkrankung, herangezogen werden kann.

Dabei handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung um eine Verwendung bzw. ein Verfahren, welche bzw. welches ex vivo bzw. in vitro auf Basis vorliegender Proben von Körperflüssigkeiten, insbesondere blutbasierten Proben, durchgeführt werden kann, was eine gute Standardisierung bei leichter Durchführbarkeit gewährleistet. Zudem stellt die erfindungsgemäße Konzeption eine deutliche Entlastung des Probanden/Patienten dar, da die zugrundeliegende Probe, insbesondere auf Basis von Blut, ohne nennenswerte Beeinträchtigung bzw. Nebenwirkung gewonnen werden kann.

Eine grundlegende Idee der vorliegenden Erfindung ist somit darin zu sehen, auf Basis der Ermittlung des quantitativen Verhältnisses zweier spezifischer Amyloid-beta-Peptide eine aussagekräftige bzw. verlässliche Prognose bzw. Prädiktion hinsichtlich der Entwicklung einer Alzheimer-Krankheit zu ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht nur eine aussagekräftige Prädiktion bzw. Prognose hinsichtlich der Entwicklung bzw. des Fortschreitens einer Alzheimer-Krankheit möglich; vielmehr erlaubt die vorliegende Erfindung auf Basis der Analyse des qualitativen Verhältnisses zweier spezieller Amyloid-beta-Peptide in der vorliegenden Probe eine aussagekräftige Bestimmung bzw. Diagnose hinsichtlich des etwaigen Vorliegens ei- ner Alzheimer-Erkrankung bzw. einer Alzheimer-Demenz - und dies bereits in einem sehr frühen Stadium der Erkrankung, welche nämlich bereits in der präklinischen bzw. frühen klinischen Phase bestimmt werden kann.

In diesem Zusammenhang hat die Anmelderin in völlig überraschender Weise herausgefunden, dass gerade das spezifische Verhältnis des Amyloid-beta- Peptids Aß(l-42) einerseits zu dem Amyloid-beta-Peptid Aß(2-40) bzw. zu dem Amyloid-beta-Peptid Aß(2-42) andererseits aus einer Probe einer Kör- perflüssigkeit, vorzugsweise Blut, zu besonders aussagekräftigen Ergebnissen hinsichtlich der Analyse des Vorliegens einer Alzheimer-Krankheit bzw. der Prognose des Auftretens einer Alzheimer-Krankheit führt.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Prinzip fokussiert somit auf eine neuro-chemische Analyse einer Probe einer Körperflüssigkeit, insbesondere auf Basis von Blut, im Hinblick auf die spezifischen, zuvor genannten Amyloid-beta-Peptide im Sinne von spezifisch für die Alzheimer-Krankheit bzw. ihre Vorstufen indikativen Biomarkern, um auf diese Weise die zuvor angeführten Aussagen hinsichtlich einer Alzheimer-Krankheit bei einem Probanden bzw. Patienten zu ermöglichen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es gleichermaßen möglich, eine differenzielle Diagnose der Alzheimer-Krankheit mit einem Ausschluss anderer Demenzerkrankungen zu ermöglichen, da - in völlig unerwarteter Weise - die Anmelderin herausgefunden hat, dass die sehr speziellen Verhältnisse der vorgenannten Amyloid-beta-Peptide in einer definierten Probe sehr spezifisch hinsichtlich der Alzheimer-Krankheit bzw. ihrer Vor- bzw. Frühformen sind. Hierin ist ein weiterer zentraler Vorteil der vorliegenden Erfindung zu sehen.

Erfindungsgemäß fungieren die vorgenannten speziellen Amyloid-beta- Peptide - nämlich Aß(l-42) einerseits und Aß(2-40) bzw. Aß(2-42) andererseits - demnach als indikative Biomarker, welche nämlich hinsichtlich einer jeweils speziellen Konzentration und - daraus resultierend - mit einem speziellen Verhältnis zueinander spezifisch für das Vorliegen einer Alzheimer- Krankheit bei einem Patienten bzw. Probanden sind. Die in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptide und deren spezifischen Konzentrationen bzw. Mengen in einer Probe stehen somit im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit. Die in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptide sind somit gewissermaßen Indikatoren für pathologische Vorgänge im Rahmen der Alzheimer-Krankheit.

Die erfindungsgemäße Konzeption ist zum einen besonders aussagekräftig, da sie auf der Analyse definierter neuro-chemischer Biomarker in einer definierten Probe basiert, welche im direktem Zusammenhang mit einer Alzheimer- Krankheit stehen. Zum anderen sind darüber hinaus die erfindungsgemäße Verwendung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren, wie nachfolgend noch ausführlich beschrieben, gegenüber den im Stand der Technik eingesetzten Verfahren, wie psychometrischen Verfahren, neuro-bildgebenden Verfahren oder dergleichen, deutlich vereinfacht und kostengünstig durchzuführen.

Auf Basis der Verwendung spezieller Biomarker bzw. Bioindikatoren der vorgenannten Art ist - neben einer Aussage, ob bei einem Probanden bzw. Patienten eine Alzheimer-Krankheit vorliegt bzw. ob hinsichtlich des Probanden bzw. Patienten eine gewisse Wahrscheinlichkeit vorliegt, dass dieser an einer Alzheimer-Krankheit erkrankt - auch eine weiterführende Aussage möglich, inwiefern etwaige therapeutisch wirksame Substanzen eine positive Wirkung auf den Verlauf einer Alzheimer-Krankheit haben, d. h. die Biomarker können gleichermaßen als Indikatoren für etwaige Arzneimittelwirkungen herangezogen werden.

Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass auf Basis der erfindungsgemäßen Konzeption eine schnelle sowie aussagekräftige Analyse hinsichtlich einer Alzheimer-Erkrankung bzw. hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer solchen Erkrankung möglich ist, welche zudem für den Patienten insbesondere im Hinblick auf die Probenbereitstellung nicht bzw. nur wenig belastend ist.

Durch die erfindungsgemäß gegebene Möglichkeit der Bestimmung einer Alzheimer-Erkrankung bereits in einem präklinischen bzw. frühen klinischen Stadium bzw. durch die Möglichkeit, eine Aussage über das etwaige Auftreten einer Alzheimer-Erkrankung im weiteren Lebensverlauf des Probanden bzw. Patienten zu treffen, kann bereits in einem sehr frühen Stadium bzw. im Sinne eines präventiven Ansatzes auf die mögliche Alzheimer-Erkrankung reagiert werden, beispielsweise im Hinblick auf eine entsprechend optimierte Lebens- fuhrung des Probanden bzw. Patienten bzw. im Hinblick auf die zweckgerichtete Verabreichung von Medikamenten, welche beispielsweise die kognitiven Fähigkeiten des Probanden bzw. des Patienten verbessern bzw. den progressiven Verlauf der Erkrankung verzögern können.

Bei dem zugrundeliegenden Peptid Aß(l-42) handelt es sich insbesondere um ein Amyloid-beta-Peptid mit einer Länge von 42 Aminosäuren, dessen erste Position bzw. dessen aminoterminales Ende durch Aspartat gebildet wird, während es sich bei Aß(2-40) bzw. Aß(2-42) um Amyloid-beta-Peptide handelt, welche eine Länge von 40 Aminosäuren bzw. 42 Aminosäuren aufweisen und jeweils an ihrem aminoterminalen Ende trunkiert sind. Die in Rede stehenden speziellen Amyloid-beta-Peptide sind dem Fachmann sowohl hinsichtlich ihrer Struktur als auch hinsichtlich ihrer Nomenklatur als solche wohlbekannt, so dass es diesbezüglich keiner weiterführenden Ausführungen bedarf.

Der Begriff "quantitatives Verhältnis" bzw. "Quotient", wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, fokussiert insbesondere auf die relative Konzentration bzw. die relative Menge der zuvor genannten Amyloid- beta-Peptide zueinander und somit auf eine relative Quantifizierung der in Rede Amyloid-beta-Peptide. Die Ermittlung der jeweiligen Konzentration bzw. Menge und der daraus resultierenden Verhältnisse der entsprechenden Amyloid-beta-Peptide kann auf Basis von dem Fachmann an sich wohlbekannten Analyseverfahren bestimmt bzw. ermittelt werden. Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der jeweiligen Verhältnisse auf Basis einer Immunpräzipitation mit einem nachfolgenden Proteinauftren- nungs- und -nachweisverfahren wird nachfolgend noch detailliert angeführt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem Probanden bzw. Patienten im Allgemeinen um ein menschliches oder tierisches Lebewesen, insbesondere um einen Säuger (Säugetier), handeln. Insbesondere handelt es sich bei dem Probanden bzw. Patienten um ein menschliches Lebewesen. Was die Probe- bzw. Körperflüssigkeit des Probanden bzw. Patienten anbelangt, so kann es sich hierbei in nicht beschränkender Weise um Flüssigkeiten handeln, welche vom Körper des Probanden stammen bzw. von diesem gebildet werden. Bei der Probe bzw. der Körperflüssigkeit kann es sich insbesondere um Blut, Plasma, Lymphe, Urin und/oder Cerebrospinal-Flüssigkeit [Liquor ce- T EP2011/001724

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rebrospinalis (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit)] handeln. Wie nachfolgend noch detailliert angeführt, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Körperflüssigkeit auf Basis von Blut, wie z. B. Blutplasma bzw. Blutserum, von besonderem Vorteil, insbesondere da sich auf dieser Basis - in völlig überraschender Weise - besonders aussagekräftige Ergebnisse erzielen lassen und zudem die Probenahme vereinfacht ist.

Was weiterhin den Probanden bzw. Patienten als solchen anbelangt, dessen Probe einer Körperflüssigkeit im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter Zugrundelegung der Verwendung bzw. des Verfahrens nach der Erfindung analysiert werden soll, so kann dieser Symptome einer insbesondere leichten Gehirnleistungsstörung, vorzugsweise einer insbesondere leichten Gedächtnisstörung, aufweisen. Was den Probanden bzw. Patienten weiterhin anbelangt, so kann dieser insbesondere Symptome einer leichten kognitiven Beeinträchtigung (Mild Cpgnitive Impairment, MCI) aufweisen.

Bei der leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI) kann es sich insbesondere um eine inzipiente Demenzerkrankung bzw. um eine isolierte Beeinträchtigung des Gedächtnisses handeln. Im Allgemeinen weisen die Probanden bzw. Patienten, welche im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens in Betracht kommen bzw. weiterführend untersucht werden, kognitive Beeinträchtigungen bzw. Schwächen auf, welche stärker ausgeprägt sind als bei Individuen vergleichbaren Alters bzw. vergleichbarer Konstitution. Insbesondere ist die leichte kognitive Beeinträchtigung (MCI) dadurch gekennzeichnet, dass die Symptome noch nicht bzw. nicht derart ausgeprägt sind, dass sie zu einer nachhaltigen Beeinträchtigung des Probanden bzw. Patienten in seinem täglichen Handeln führen.

Die erfindungsgemäße Verwendung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren ist auch insbesondere in Bezug auf Patienten bzw. Probanden mit einer leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI) von großem Interesse, da im Allgemeinen Personen mit einer leichten kognitiven Beeinträchtigung mit erhöhter Wahrscheinlichkeit im weiteren Verlauf an einer Alzheimer-Krankheit erkranken. So zeigen Studien, dass 10 % bis 15 % der von einer leichten kognitiven Beeinträchtigung betroffenen Personen pro Jahr an einer Alzheimer-Krankheit erkranken. 724

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Die vorliegende Erfindung ist jedoch im Allgemeinen nicht auf Probanden bzw. Patienten mit einer leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI), bei welchen unter Einsatz der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens diagnostisch abgeklärt werden kann, ob eine Alzheimer- Erkrankung vorliegt oder ob die Gefahr besteht, im weiteren Verlauf eine Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, beschränkt. Vielmehr können auch solche Probanden bzw. Patienten ohne konkrete Symptome einer kognitiven Beeinträchtigung bzw. - insbesondere im Hinblick auf eine Differenzialdiagnose - auch solche Patienten bzw. Probanden untersucht werden, bei denen zumindest der Verdacht auf eine von der Alzheimer-Krankheit verschiedenen Demenzerkrankung vorliegt.

Was die Vorstufe der Alzheimer-Krankheit anbelangt, welche auf Basis der vorliegenden Erfindung ermittelt bzw. diagnostiziert werden kann, so handelt es sich hierbei insbesondere um eine präklinische bzw. subklinische Stufe der Alzheimer-Krankheit. Bei der präklinischen Vorstufe der Alzheimer- Krankheit kann es sich insbesondere um eine inzipiente bzw. prodromale Alzheimer-Krankheit, welche synonym auch als incipient AD bezeichnet wird, handeln. Mit anderen Worten kann es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei der Vorstufe der Alzheimer-Krankheit um eine beginnende bzw. wahrscheinliche Alzheimer-Krankheit handeln. Insbesondere kann es sich bei der inzipienten Alzheimer-Krankheit um eine Vorstufe der Alzheimer- Krankheit handeln, welche mit im Stand der Technik etablierten Diagnoseverfahren in diesem Krankheitsstadium noch nicht als eine Alzheimer- Erkrankung diagnostiziert werden kann.

Erfindungsgemäß kann es sich bei der Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, welche auf Basis der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden kann, auch um eine klinische Stufe der Alzheimer-Krankheit handeln. Insbesondere kann es sich bei der Vorstufe der Alzheimer-Krankheit um eine frühe Alzheimer-Krankheit, welche synonym auch als early AD bezeichnet wird, handeln. Insbesondere kann es sich bei der frühen Alzheimer-Krankheit um eine bereits auf Basis der im Stand der Technik bekannten Verfahren klinisch diagnostizierbaren Alzheimer-Erkrankung im frühen Stadium handeln. Insbesondere kann es sich bei Vorstufe der Alzheimer-Krankheit um ein solches Stadium der Alzheimer-Krankheit mit zwar fortgeschrittenen kognitiven Defiziten handeln, wobei die kognitiven Defizite jedoch noch nicht so weit vorangeschritten sind, dass diese zu einer tiefgreifenden Beeinträchtigung des Probanden bzw. Patienten im Alltag führen.

Erfindungsgemäß ist es somit insbesondere unter Berücksichtigung der obigen Ausführungen zu dem Begriff der Alzheimer-Demenz möglich, auf Basis der erfindungsgemäßen Konzeption eine Aussage über das Vorliegen bzw. über die künftige Entwicklung einer Alzheimer-Demenz bei einem Probanden bzw. Patienten zu ermöglichen, insbesondere auf Grundlage der entsprechenden präklinischen und/oder klinischen Phasen der Alzheimer-Demenz auf Basis und/oder als Folge einer zugrunde liegenden Alzheimer-Erkrankung.

Auf dieser Basis kann die erfindungsgemäße Verwendung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren somit vor dem Hintergrund durchgeführt werden, um bereits in einem frühen Stadium Maßnahmen einzuleiten, welche den Verlauf der Alzheimer-Krankheit verzögern bzw. abschwächen können, um so die Lebensqualität des Patienten bzw. Probanden möglichst lange aufrecht zu erhalten.

In bevorzugter Weise handelt es sich bei dem Verhältnis der in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptide um ein mengen- bzw. konzentrationsbezogenes Verhältnis.

Besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der Feststellung einer Alzheimer- Erkrankung bzw. hinsichtlich der Ermittelung des Risikos, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, können erfindungsgemäß erreicht werden, wenn das Verhältnis aus (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2-40) [d. h. Aß(l-42)/Aß(2-40)- Verhältnis oder (a)/(b)- Verhältnis] und/oder das Verhältnis aus (a) Aß(l- 42) / (c) Aß(2-42) [d. h. Aß(l-42)/Aß(2-42)-Verhältnis oder (a)/(c)- Verhältnis], vorzugsweise das Verhältnis aus (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2-40) [d. h. Aß(l-42)/Aß(2-42)- Verhältnis oder (a)/(c Verhältnis], gebildet wird. Gleichermaßen ist es erfindungsgemäß im besonderen Maße bevorzugt, wenn Blut des Probanden bzw. Patienten als Probe zur Ermittlung des quantitativen Verhältnisses der in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptide eingesetzt wird. In diesem Zusammenhang ist es von besonderem Vorteil, wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung Blutplasma (Plasma) bzw. Blutserum (Serum), vorzugsweise Blutplasma (Plasma), des Probanden bzw. Patienten als Probe eingesetzt wird.

In diesem Zusammenhang ist es nämlich völlig überraschend, dass im Blut des Probanden bzw. Patienten und insbesondere im Plasma bzw. Serum eine signifikante Veränderung der in Rede stehenden Verhältnisse der bestimmten Amyloid-beta-Peptide im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit (und dies insbesondere auch im Hinblick auf frühe Stadien der Erkrankung) vorliegt.

In diesem Zusammenhang basiert die vorliegende Erfindung somit auf der völlig überraschenden Erkenntnis der Anmelderin, dass - ohne sich auf diese Theorie beschränken zu wollen - im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung - und dies auch bereits in frühen Stadien der Erkrankung - gewissermaßen eine ganzheitliche bzw. übergeordnete pathologische "Verstellung" des gesamten Organismus bzw. Körpers vorliegt, was auch mit einer signifikanten Veränderung der jeweiligen Konzentrationen der in Rede stehenden Amyloid-beta- Peptide im Blut einhergeht.

Dass ausgerechnet Blut bzw. Blutplasma und/oder Blutserum zur Diagnose des Vorliegens einer Alzheimer-Krankheit herangezogen werden kann, ist umso überraschender, als bislang maßgeblich davon ausgegangen worden ist, dass Amyloid-beta-Peptide als solche nicht im Blut, sondern vorrangig im Gehirngewebe selbst bzw. in den mit dem Gehirn in Zusammenhang bzw. in Verbindung stehenden Flüssigkeiten, wie der Cerebrospinal-Flüssigkeit, im Rahmen der Erkrankung beeinflusst sind und somit Blut gewissermaßen als periphere und vom Gehirn selbst abgetrennte Körperflüssigkeit im Hinblick auf Veränderungen der Amyloid-beta-Peptide im Stand der Technik nicht maßgeblich herangezogen worden ist. Die völlig überraschende Eignung der Verwendung von Blut bzw. Blutplasma und/oder Blutserum als zu analysierende Probe basiert auch auf der völlig ü- berraschenden Erkenntnis der Anmelderin, dass insbesondere auch im Frühstadium der Alzheimer-Krankheit eine grundsätzliche "Verstellung" bestimmter physiologischer Parameter im Körper der von der Erkrankung Betroffenen vorliegt, welche sich in spezieller Weise auch im Blut des Betroffenen widerspiegelt, und zwar insbesondere, was die in Rede stehenden Verhältnisse der zuvor genannten speziellen Amyloid-beta-Peptide anbelangt.

In diesem Zusammenhang ist es gleichermaßen völlig überraschend, dass insbesondere das spezielle Amyloid-beta-Peptid Aß(2-40) herangezogen werden kann, welches nämlich in vielen anderen Geweben bzw. Körperbestandteilen so nicht nachzuweisen ist.

Auch in diesem Lichte ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung völlig unerwartet, dass im Blut bzw. im Blutplasma und/oder Blutserum ein spezielles Verhältnis von Amyloid-beta-Peptiden, nämlich von Aß(l-42) einerseits und Aß(2-40) bzw. Aß(2-42) andererseits, herangezogen werden kann, um eine verlässliche Aussage hinsichtlich der Bestimmung einer Alzheimer- Krankheit bzw. hinsichtlich der Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, an einer solchen Krankheit zu erkranken, zu ermöglichen.

Dabei ist zusätzlich von Vorteil, dass Blut in einfacher Weise zur Verfügung gestellt werden kann und die diesbezügliche Entnahme schmerzfrei und im Wesentlichen risikolos für den Patienten bzw. Probanden ist. Hierin ist ein weiterer entscheidender Vorteil der vorliegenden Erfindung zu sehen.

Gemäß dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird somit insbesondere eine blutbasierte bzw. auf Bluttests basierende neuro- chemischen Analyse bzw. Bestimmung zur Erkennung von Demenzerkrankungen bereitgestellt, welche beispielsweise im Rahmen eines entsprechenden Diagnoseansatzes eingesetzt werden kann {blood based neurochemical dementia diagnostics (blood-ΝΌΌ)). Im Ergebnis zeichnet sich die erfindungsgemäße Konzeption dadurch aus, dass einerseits ein hinsichtlich der Bestimmung einer Alzheimer-Erkrankung aussagekräftiges Konzept - und dies trotz der im Allgemeinen geringen Konzentrationen der zu analysierenden Amyloid-beta-Peptide in der Probe - und andererseits ein den Patienten schonendes Konzept bereitgestellt wird, welches sich zur wiederholten Anwendung, beispielsweise im Rahmen einer Verlaufskontrolle oder dergleichen, eignet.

Was die Durchführung der Analyse der Probe zur Ermittlung der relevanten Verhältnisse anbelangt, so können diesbezüglich eine Reihe von im Stand der Technik bekannten Aufreinigungs- und Analyseverfahren eingesetzt werden.

Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die Amyloid-beta-Peptide, insbesondere (a) Aß(l-42) einerseits und (b) Aß(2-40) und /oder (c) Aß(2-42) andererseits, aus der Probe, gewissermaßen nach Art eines vorgeschalteten Aufreinigungs- bzw. Separierungsschrittes, insbesondere mittels Immunpräzi- pitation abgetrennt bzw. isoliert werden. Dabei kann die Aufreinigung derart durchgeführt werden, dass gewissermaßen ein Ensemble an verschiedenen Typen von Amyloid-beta-Peptiden, darunter auch (a) Aß(l-42) und (b) Aß(2- 40) und /oder (c) Aß(2-42), aus der zugrundeliegenden Probe abgetrennt wird. Hierdurch wird die Analysegenauigkeit erhöht.

In diesem Zusammenhang kann insbesondere im Rahmen der Immunpräzipi- tation mindestens ein für Amyloid-beta-Peptide spezifischer bzw. hieran bin- dender Ligand, vorzugsweise mindestens ein Antikörper, eingesetzt werden.

Diesbezüglich kann der mindestens eine Ligand, vorzugsweise der mindestens eine Antikörper, spezifisch für Amyloid-beta-Peptide vom Typ (a) Aß(l-y) und/oder Aß(2-y) sein, wobei y eine ganze Zahl von 37 bis 43 ist. In diesem Zusammenhang charakterisiert die Variable y insbesondere die Länge des Peptids in Bezug auf dessen carboxyterminalen Ende.

Was den Liganden bzw. den Antikörper weiterhin anbelangt, so ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn dieser spezifisch für (a) Aß(l-42) und/oder (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) ist. 24

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Weiterhin kann der mindestens eine Ligand, vorzugsweise Antikörper spezifisch für das aminoterminale Ende von (a) Aß(l-42) und/oder (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) sein.

Insbesondere kann erfindungsgemäß ein Ligand bzw. Antikörper eingesetzt werden, welcher zumindest im Wesentlichen eine identische Sensitivität bzw. Spezifität zumindest für die in Rede stehenden speziellen Amyloid-beta- Peptide Aß(l-42), Aß(2-40) und Aß(2-42) aufweist, was mit dem Vorteil einhergeht, dass im Rahmen des Aufreinigungsschrittes lediglich ein einziger Liganden- bzw. Antikörpertyp eingesetzt zu werden braucht.

Darüber hinaus ist aber auch der Einsatz mehrerer verschiedener Typen von Liganden bzw. Antikörpern mit jeweiliger Spezifität für das zu isolierende bzw. zu analysierende Amyloid-beta-Peptid möglich.

Beispielsweise kann erfindungsgemäß der Antikörper vom Typ 1E8 eingesetzt werden. Der Antikörper ist insbesondere sensitiv für Amyloid-beta-Peptide, welche hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz an Position 1 Aspartat aufweisen, wie (a) Aß(l-42), bzw. an Position 2 Alanin, wie (b) Aß(2-40) bzw. (c) Aß (2-42). Der Antikörper vom Typ 1E8 kann beispielsweise handelsüblich von der Bayer Schering Pharma AG, Berlin, Deutschland, bezogen werden. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Antikörper ist insbesondere in der EP 1 270 592 AI beschrieben, deren gesamter Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist.

Was die Analyse der in Rede stehenden Probe weiterhin anbelangt, so kann - insbesondere nach der zuvor durchgeführten Isolierung bzw. Auftrennung bzw. Aufreinigung der zu bestimmenden Amyloid-beta-Peptide - der Nachweis, insbesondere die Bestimmung der Menge bzw. des Gehaltes und/oder der Konzentration, der jeweiligen Amyloid-beta-Peptide, insbesondere von (a) Aß(l-42) einerseits und (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) andererseits, auf Basis von Proteinauftrennverfahren bzw. auf Basis von insbesondere quantitativen immundetektiven Proteinnachweisverfahren, vorzugsweise auf Basis einer Kombination von Proteinauftrennverfahren und insbesondere quantitativen immundetektiven Proteinnachweisverfahren, durchgeführt werden. Dabei kann erfindungsgemäß insbesondere derart vorgegangen werden, dass die im P2011/001724

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Rahmen des zuvor beschriebenen Aufreinigungsverfahrens erhaltene Fraktion mit den verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden entsprechend weiter bearbeitet bzw. einer weiteren Analyse unterzogen wird.

In diesem Zusammenhang kann beispielsweise als Proteinauftrenn- bzw. Proteinnachweisverfahren ein gelelektrophoretisches Verfahren, insbesondere eine zweidimensionale Gelelektrophorese, vorzugsweise eine harnstoffbasierte zweidimensionale Gelelektrophorese, eingesetzt werden.

Weiterhin kann als Proteinauftrenn- bzw. Proteinnachweisverfahren ein We- sternblot- Verfahren eingesetzt werden.

Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erreicht, wenn der Nachweis der in Rede stehenden speziellen Amyloid-beta-Peptide auf Basis einer Kombination einer insbesondere harnstoffbasierten zweidimensionalen Gelelektrophorese mit einem nachgeschalteten Westernblot- Verfahren (2D-Aß-WIB) durchgeführt wird.

Was das im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommende Proteinauftrenn- bzw. Proteinnachweisverfahren weiterhin anbelangt, so kann auch im Rahmen des insbesondere qualitativen immundetektiven Proteinnachweisverfahrens, vorzugsweise bei dem Westernblot- Verfahren, mindestens ein Ligand, vorzugsweise Antikörper, zur Markierung der Amyloid-beta- Peptide eingesetzt werden, insbesondere nach Art eines Primärliganden bzw. Primärantikörpers, welcher im Rahmen eines ersten Markierungsschrittes direkt an die in Rede stehende Amyloid-beta-Peptide bindet bzw. hiermit inter- agiert. In diesem Zusammenhang sollte der mindestens eine Ligand, vorzugsweise Antikörper, spezifisch für Amyloid-beta-Peptide der Form Aß(l-y) und Aß(2-y) sein, wobei y eine ganz Zahl von 37 bis 43 ist. Weiterhin sollte der im Rahmen des insbesondere quantitativen immundetektiven Proteinnachweisverfahrens eingesetzte Ligand bzw. Antikörper spezifisch für (a) Aß(l-42) und/oder (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) sein. Zu dem sollte der mindestens ein Ligand, vorzugsweise Antikörper, spezifisch für das ami- noterminale Ende von (a) Aß(l-42) bzw. (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) sein. Auch für das insbesondere quantitative immundetektiven Proteinnachweisverfahren gilt, dass sowohl ein Ligandentyp bzw. Antikörpertyp eingesetzt werden kann, welcher eine zumindest im Wesentlichen identische Sensitivität gegenüber den zuvor genannten Amyloid-beta-Peptiden aufweist. Beispielsweise kann der zuvor beschriebene Antikörper vom Typ 1E8 eingesetzt werden. Darüber hinaus ist auch der Einsatz verschiedener Typen von Liganden bzw. Antikörper mit jeweiliger spezifischer Sensitivität für einzelne Amyloid-beta- Peptide möglich.

Die konkrete Detektion kann über den Einsatz entsprechender, dem Fachmann an sich wohlbekannter Sekundärliganden bzw. Sekundärantikörper erfolgen, an denen zu Zwecken der Detektion beispielsweise Enzyme oder Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, gekoppelt sein können, wobei das resultierende Konjugat ein detektierbares und auswertbares Messsignal zu liefern imstande ist.

Eine Identifizierung bzw. Zuordnung der speziellen Amyloid-beta-Peptide kann beispielsweise anhand von Referenzspuren erfolgen. Das zugrundeliegende Prinzip ist dem Fachmann wohlbekannt.

Für weitergehende Ausführungen zu den im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbaren Verfahren zur Analyse der in Rede stehenden Probe kann insbesondere verwiesen werden auf die wissenschaftliche Publikation von Maler, J. M.: "Urea based two-dimensional electrophoresis of beta-amyloid peptides in human plasma: Evidence for novel Aß species", Proteomics, 2007, 7, 3815-3820, deren gesamter Offenbarungsgehalt hiermit vollumfänglich durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Auf Basis der zuvor angeführten Kombination zur quantitativen Bestimmung der in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptide in der Probe auf Basis einer vorgeschalteten Immunpräzipitation und eines nachfolgenden, insbesondere quantitativen immundetektiven Proteinnachweisverfahrens wird eine hohe Genauigkeit hinsichtlich der quantitativen Bestimmung der jeweiligen Amyloid-beta-Peptide gewährleistet. Aufgrund der im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Verfahrensführung zur quantitativen Bestimmung der Amyloid-beta-Proteine in der Probe können äußerst geringe Konzentration der - 24 -

in Rede stehenden Peptide detektiert bzw. erfasst werden, wobei diesbezüglich sogar Mengen bzw. Gehalte im attomolaren Bereich detektiert werden können.

Was die Auswertung bzw. Einordnung der im Rahmen der Analyse der Probe aufgefundenen speziellen Verhältnisse der in Rede stehenden Amyloid-beta- Peptide im Hinblick auf die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit (Risikos) des Probanden bzw. Patienten, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. im Hinblick auf die Bestimmung dessen Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit anbelangt, so kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise derart vorgegangen werden, dass das quantitative Verhältnis aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden, insbesondere wie zuvor definiert, mit hierzu entsprechenden Referenz- Verhältnissen korreliert bzw. verglichen bzw. diesen Referenzverhältnissen zugeordnet wird.

Mit anderen Worten kann die Einordnung der anhand der analysierten Probe gewonnenen Verhältnisse von Amyloid-beta-Peptiden auf Basis eines Vergleiches mit einem Bezugssystem bzw. einem Bezugswert bzw. einem Bezugswertebereich erfolgen, wobei die entsprechenden Bezugsgrößen, wie nachfolgend noch ausgeführt, beispielsweise anhand eines als Referenz dienenden Kollektivs von Probanden bzw. Patienten in Form von statistischen Werten ermittelt wird.

Dies kann beispielsweise derart erfolgen, dass zunächst eine Gruppe von Referenzprobanden auf das Vorliegen von kognitiven Störungen bzw. von Vorstufen der Alzheimer-Krankheit untersucht werden, beispielsweise auf Basis von im Stand der Technik bekannten Diagnoseverfahren, wie psychometrischen, neuro-chemischen und/oder neuro-bildgebenden Verfahren, gegebenenfalls unter rückschlüssigem Einbezug einer nachfolgenden tatsächlichen Ausbildung einer Alzheimer-Krankheit, und dass auf dieser Basis eine Phäno- typisierung hinsichtlich des diagnostischen Befundes bzw. eine Klassifizierung in jeweilige Referenz-Gruppen mit dem jeweiligen Krankheitsbild bzw. der jeweiligen Diagnose erfolgt und bei diesen zuvor ermittelten bzw. gebildeten Referenz-Gruppen gleichermaßen die speziellen Verhältnisse von Amy- 001724

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loid-beta-Peptiden in einer Probe gleicher Art analysiert und insbesondere statistisch zusammengefasst werden.

Die Einordnung des zu untersuchenden Probanden bzw. Patienten erfolgt dann auf Basis einer Korrelation bzw. eines Vergleichs der bei dem in Rede stehenden Probanden bzw. Patienten gefundenen speziellen Verhältnisse mit den bei den in Rede stehenden Referenz-Gruppen aufgefundenen Verhältnissen gleicher Art. So kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung derart vorgegangen werden, dass anhand des Vergleiches bzw. der Korrelation des quantitativen Verhältnisses mit den hierzu entsprechenden Referenz- Verhältnissen die Wahrscheinlichkeit bestimmt wird, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, und/oder das Vorliegen einer Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit bestimmt bzw. diagnostiziert wird.

In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff "entsprechend", wie er im Rahmen der zu vergleichenden Verhältnisse eines zu untersuchenden Probanden bzw. Patienten einerseits und einer Referenz-Gruppe andererseits verwen- det wird, insbesondere auf von ihrer Art her gleichen bzw. vergleichbaren Verhältnisse, d. h. insbesondere auf einander entsprechende Verhältnisse gleicher Amyloid-beta-Peptide. So kann beispielsweise und in nicht beschränkender Weise das Verhältnis aus (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2-40) eines Probanden mit dem hierzu korrelierenden ermittelten Verhältnis (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2-40) der Referenz-Gruppe verglichen werden. Dabei handelt es sich bei dem für die Referenz-Gruppe ermittelten Verhältnis insbesondere um einen statistischen (Mittel-) Wert oder um einen Wertebereich eines zu dieser Gruppe gehörenden Kollektivs. Bei den ermittelten Referenz- Verhältnissen handelt es sich somit insbesondere um in Bezug auf ein Kollektiv von Referenz-Probanden bzw. Referenz- Patienten ermittelte Werte bzw. Wertebereiche im Sinne eines statistischen Verhältnisses auf Basis zahlreicher Probanden, welches beispielsweise zuvor erstellt worden sein kann. In diesem Zusammenhang handelt es sich insbeson- dere um statistisch ermittelte Wertebereiche bzw. statistische Mittelwerte mit einer entsprechenden Standardabweichung, welche der Zuordnung zugrundeliegen können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die quantitativen Referenz-Verhältnisse auf Basis eines Referenz-Probandenkollektivs und/oder eines Referenz-Patientenkollektivs zu bestimmen bzw. zugrundezulegen.

In diesem Zusammenhang können die Referenz-Probanden des Referenz- Probandenkollektivs bzw. die Referenz-Patienten des Referenz-Patientenkollektivs insbesondere im Rahmen einer biostatistischen Evaluierung auf das Vorliegen oder Nicht- Vorliegen einer leichten kognitiven Beeinträchtigung (Mild Cognitive Impairment, MCI) und/oder einer präklinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere einer inzipienten bzw. prodromalen Alzheimer-Krankheit (incipient AD), und/oder einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere einer frühen Alzheimer-Krankheit (early AD), untersucht werden.

Dabei kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung weiterhin vorgesehen sein, dass die Untersuchung bzw. Evaluierung auf Basis von Untersuchungsverfahren, welche ausgewählt sind aus der Gruppe von neuro-chemi sehen Verfahren, neuro-bildgebenden Verfahren, psychometrischen Verfahren und Kombinationen aus mindestens zwei der vorgenannten Verfahren, vorzugsweise auf Basis einer Kombination sämtlicher der vorgenannten Verfahren, durchgeführt wird. Auf diese Weise wird gewissermaßen eine Einteilung der entsprechenden Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten hinsichtlich ihres Krankheitsbildes ermöglicht.

Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Untersuchung bzw. Evaluierung hinsichtlich des Referenz-Probandenkollektivs bzw. des Referenz-Patientenkollektivs auf Basis mindestens eines Goldstandards (GS), insbesondere ausgewählt aus der Gruppe von klinischen Goldstandards, neuro-chemischen Goldstandards, psychometrischen Goldstandards und Kombinationen aus mindestens zwei der vorgenannten Goldstandards, vorzugsweise auf Basis einer Kombination sämtlicher der vorgenannten Goldstandards, durchgeführt wird. Der Begriff "Goldstandard" (synonym auch als GS bezeichnet), wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich insbesondere auf einen zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt allgemein anerkannten (Untersuchungs-)Standard, welcher bezüglich der Diagnose einer Erkrankung im Sinne eines "besten Handelns" zu besonders aussagekräftigen Ergebnissen führt. Der Goldstandard bildet somit im Allgemeinen den tatsächlichen bzw. maßgebenden Standard. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hinsichtlich der Analyse der Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten eingesetzten Goldstandards sind dem Fachmann als solche hinlänglich bekannt. Insbesondere kann die Untersuchung bzw. Evaluierung hinsichtlich der Referenzwerte auf Basis von Goldstandards durchgeführt werden, welche psychometrische, neuro-chemische bzw. neuro-bildgebende Verfahren bzw. Parameter umfassen.

Beispielsweise kann die Untersuchung bzw. Evaluierung auf Basis eines neu- ro-chemischen Verfahrens durchgeführt werden, wobei das neuro-chemische Verfahren die Bestimmung von Parametern der Cerebrospinal-Flüssigkeit (CSF) umfasst; dabei kann insbesondere das Verhältnis von Aß(x-42) / Aß(x- 40) [AßratioTGC], wobei x, unabhängig voneinander, den Wert 1 oder 2 einnehmen kann, und/oder der Gehalt an Aß(l-42) [Aßl42Inn] und/oder der Gesamtgehalt an Tau und/oder der Gehalt an Phospho-Tau 181 bestimmt werden.

Weiterhin können im Rahmen der Klassifizierung der Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten auch neuro-bildgebende Verfahren eingesetzt werden, wobei die neuro-bildgebenden Verfahren insbesondere Hirnatrophie- Untersuchungen, vorzugsweise auf Basis von bildgebenden Verfahren, bevorzugt SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) und/oder MRI (Magnet Resonance Imaging), umfassen.

Zudem kann das erfindungsgemäß einsetzbare psychometrische Verfahren Untersuchungen auf Basis von MMSE (Mini-Mental State Examination) umfassen. Insbesondere kann in die Untersuchung bzw. Evaluierung das spätere Auftreten einer Alzheimer-Krankheit in die Diagnose zum Untersuchungszeitpunkt des jeweiligen Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten einbezogen werden, insbesondere im Hinblick auf die Beurteilung des Vorliegens einer präklinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit zum Untersuchungszeitpunkt, sofern diese nicht hinreichend anhand der vorgenannten Diagnoseverfahren bestimmt werden kann.

Auf Basis der durchgeführten Untersuchung bzw. Diagnose bei den Referenz- Patienten bzw. Referenz-Probanden kann somit eine Einteilung der Referenz- Personen in jeweilige Klassen mit dem entsprechenden Krankheitsbild erfolgen, beispielsweise in eine Gruppe mit Patienten, die an einer kognitiven Beeinträchtigung (MCI) leiden, und in mindestens eine weitere Gruppe, deren Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit leiden. Dies kann beispielsweise auf Basis einer Wertung der jeweiligen Diagnoseverfahren durchgeführt werden, wobei beispielsweise abgestufte Werte bzw. so genannte cut-off-Werte etabliert werden können, welche gewissermaßen als jeweilige Grenzwerte für die Zuordnung in eine der vorgenannten Gruppen fungieren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es insbesondere vorgesehen sein, dass die Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten in Abhängigkeit von der auf Basis der Untersuchung bzw. Evaluierung gestellten Diagnose in verschiedene Referenz-Gruppen eingeteilt werden.

In diesem Zusammenhang können die jeweiligen Referenz-Gruppen (A) bzw. (B) gebildet werden aus Referenz-Probanden bzw. Referenz-Patienten (A) ohne eine diagnostizierte Alzheimer-Krankheit bzw. ohne eine diagnostizierte Vorstufe der Alzheimer-Krankheit und (B) mit einer diagnostizierten Alzheimer-Krankheit bzw. mit einer diagnostizierten Vorstufe einer Alzheimer- Krankheit, insbesondere mit einer präklinischen Vorstufe der Alzheimer- Krankheit, insbesondere einer inzipienten bzw. prodromalen Alzheimer- Krankheit incipient AD), und/oder mit einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere einer frühen Alzheimer-Krankheit (early AD). Was die Gruppe (B) mit der diagnostizierten Alzheimer-Krankheit bzw. der diagnostizierten Vorstufe einer Alzheimer-Krankheit anbelangt, so kann diesbezüglich eine weitere Differenzierung erfolgen: Beispielsweise kann eine Referenz-Gruppe (B l) mit einer präklinischen Vorstufe der Alzheimer- Krankheit, insbesondere einer inzipienten bzw. prodromalen Alzheimer- Krankheit (incipient AD), eine weitere Referenz-Gruppe (B2) mit einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere einer frühen Alzheimer-Krankheit (early AD), sowie gegebenenfalls eine dritte Referenz-Gruppe (B3) mit einer diagnostizierten Alzheimer-Krankheit im weiter fortgeschrittenen Stadium gebildet werden.

Wie zuvor angeführt, können für die jeweiligen Referenz-Gruppen jeweils quantitative Referenz- Verhältnisse (Referenz-Quotienten) aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden, insbesondere wie zuvor definiert, ausgehend von einer Probe einer Körperflüssigkeit, insbesondere wie zuvor definiert, der jeweiligen, einer Referenz- Gruppe angehörenden Referenz- Probanden bzw. Referenz-Patienten ermittelt und zusammengefasst werden. Insbesondere handelt es sich bei der zu Zwecken der Korrelation in Bezug auf die in Rede stehenden Referenz-Patienten bzw. Referenz-Probanden der jeweiligen Referenz-Gruppen verwendeten Probe gleichermaßen um Blut bzw. Blutplasma und/oder Blutserum.

Diesbezüglich kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere derart vorgegangen werden, dass das quantitative Verhältnis aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden, insbesondere wie zuvor definiert, mit der hierzu entsprechenden Referenz-Gruppe korreliert bzw. verglichen bzw. der entsprechenden Referenz-Gruppe zugeordnet wird, um auf diese Weise die Wahrscheinlichkeit des Patienten bzw. des Probanden zu bestimmen, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. um auf diese Weise die Erkrankung des Patienten bzw. Probanden an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit zu bestimmen.

Mit anderen Worten wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere derart vorgegangen, dass das quantitative Verhältnis aus (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2-40) bzw. das quantitative Verhältnis aus (a) Aß(l-42) / (c) Aß(2-42) in einer Blutprobe bzw. einer Probe aus Blutserum und/oder Blutplasma be- stimmt und mit den jeweils entsprechenden, insbesondere statistischen Referenz-Werten - d. h. mit den entsprechenden Verhältnissen gleicher Art, welche insbesondere anhand einer Vielzahl an Individuen der jeweiligen Referenz-Gruppe gewonnen wurden - aus den Blutproben bzw. den Proben aus Blutserum bzw. Blutplasma der entsprechenden Referenz-Gruppe korreliert und der entsprechenden Referenz-Gruppe zugeordnet wird.

Dabei erfolgt die Zuordnung bzw. Korrelation der entsprechenden quantitativen Verhältnisse aus den jeweiligen Amyloid-beta-Peptiden insbesondere der- art, dass diese dem in einer vergleichbaren Größenordnung liegenden Bereich zugeordnet werden, welcher für die jeweilige Referenz-Gruppe ermittelt worden ist. Bei den zu vergleichenden bzw. zu korrelierenden Verhältnissen von Probanden bzw. Patienten einerseits und Referenz-Gruppen andererseits handelt es sich somit vorzugsweise um entsprechende Verhältnisse desselben Größenbereiches, d. h. ein für einen Probanden bzw. Patienten ermitteltes Verhältnis kann demjenigen Wertebereich des entsprechenden Verhältnisses einer Referenz-Gruppe zugeordnet werden, wenn der für den Probanden bzw. Patienten ermittelte Wert in den Wertebereich der jeweiligen Referenzgruppe fällt.

Auf Basis dieser Korrelation kann beispielsweise dem Probanden bzw. Patienten eine geringere oder keine (d. h. eine nicht vorliegende bzw. nicht gegebene) Wahrscheinlichkeit zugeordnet werden, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. kann dem Probanden und/oder Patienten eine Nichterkran- kung an einer präklinischen Stufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer inzipienten und/oder prodromalen Alzheimer-Krankheit {incipient AD), und/oder an einer klinische Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer frühen Alzheimer-Krankheit (early AD), zugeordnet werden, wenn das bei dem Probanden bzw. Patienten bestimmte Verhältnis in den Bereich der entsprechenden Referenz- Verhältnisse der Referenz-Gruppe (A) ohne diagnostizierte Alzheimer-Krankheit und/oder ohne diagnostizierte Vorstufe der Alzheimer-Krankheit fällt.

Zudem kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung dem Probanden bzw. Pa- tienten eine erhöhte Wahrscheinlichkeit zugeordnet werden, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. kann dem Probanden bzw. Patienten die 24

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Erkrankung an einer präklinischen Stufe der Alzheimer Krankheit, insbesondere an einer inzipienten und/oder prodromalen Alzheimer-Krankheit {inci- pient AD), bzw. an einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer frühen Alzheimer-Krankheit {early AD), zugeordnet werden, wenn das bei dem Probanden bzw. Patienten bestimmte Verhältnis in den Bereich der entsprechenden Referenz- Verhältnisse der Referenzgruppe (B) mit diagnostizierter Alzheimer-Krankheit bzw. mit diagnostizierter Vorstufe einer Alzheimer-Krankheit fällt.

Auf Basis der zuvor getroffenen Aussagen ist es gleichermaßen möglich, eine weitere Zuordnung bzw. Unterdifferenzierung durchzuführen, sofern die zuvor genannte Gruppe (B), wie zuvor beschrieben, in weitere Untergruppen (Bl) und (B2) und gegebenenfalls (B3) unterteilt wird, d. h. in eine erste Untergruppe (Bl) mit einer präklinischen Stufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere mit einer inzipienten bzw. prodromalen Alzheimer-Krankheit (inci- pient AD), sowie in eine zweite Untergruppe (B2) mit einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere mit einer frühen Alzheimer- Krankheit {early AD).

Im Allgemeinen kann erfindungsgemäß das bei dem Probanden bzw. Patienten bestimmte Verhältnis einer der zuvor beschriebenen Referenz-Gruppen (d. h. insbesondere der Referenz-Gruppe (A), (B) bzw. (Bl), (B2) oder gegebenenfalls (B3)) zugeordnet werden, wenn das bei dem Probanden bzw. Patienten bestimmte Verhältnis höchstens 40 %, insbesondere höchstens 30 %, vorzugsweise höchstens 25 %, bevorzugt höchstens 20 %, besonders bevorzugt höchstens 10 %, vom statistischen Mittelwert des Referenz- Verhältnisses der jeweiligen Referenz-Gruppe, bezogen auf den zuvor genannten Mittelwert, abweicht. Gleichermaßen kann, wie zuvor angeführt, das bei dem Probanden bzw. Patienten bestimmte Verhältnis einer der zuvor beschriebenen Referenz-Gruppen zugeordnet werden, wenn das bei dem Probanden bzw. Patienten bestimmte Verhältnis in den Größenbereich des für die jeweiligen Referenz-Gruppe statistisch ermittelten Wertebereichs bzw. in den Bereich der berechneten Standardabweichung des für die jeweilige Referenz-Gruppe ermittelten statistischen Mittelwerts liegt. 2011/001724

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Auf Basis der zuvor beschriebenen Zuordnung ist erfindungsgemäß somit eine Aussage im Hinblick auf das Krankheitsbild bzw. den prädiktiven Krankheitsverlauf des jeweiligen Probanden bzw. Patienten möglich.

Insbesondere ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch möglich, dem Probanden und/oder Patienten eine erhöhte Wahrscheinlichkeit zuzuordnen, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bzw. dem Probanden und/oder Patienten die Erkrankung an einer präklinischen Stufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer inzipienten und/oder prodromalen Alzheimer-Krankheit (incipient AD), und/oder an einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer frühen Alzheimer-Krankheit (early AD), zuzuordnen, wenn die Menge und/oder Konzentration an (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42), insbesondere an (b) Aß(2-40), im Vergleich zu den hierzu entsprechenden Mengen und/oder Konzentrationen der Referenz-Gruppe ohne diagnostizierte Alzheimer-Krankheit und/oder ohne diagnostizierte Vorstufe einer Alzheimer-Krankheit erhöht ist und folglich gleichermaßen das Verhältnis (a) Aß(l -42) / (b) Aß(2-40) bzw. (a) Aß(l-42) / (c) Aß(2-42) verringert ist.

Mit anderen Worten liegt bei einer Erhöhung der zuvor genannten Einzelwerte der in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptide im Vergleich zu den entsprechenden Werten der Referenz-Gruppe und bei einem folglich verringertem, wie zuvor definierten Verhältnis ein erhöhtes Risiko vor, an einer Alzheimer- Krankheit zu erkranken bzw. eine derartige Erkrankung, insbesondere im Hinblick auf die vorgenannten präklinischen und klinischen Vorstufen, aufzuweisen. Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform kann somit sozusagen auf die jeweiligen Einzelheiten der in Rede stehenden Amyloid-beta- Peptide fokussiert werden.

Denn die Anmelderin hat in diesem Zusammenhang in überraschender Weise herausgefunden, dass insbesondere die Menge bzw. Konzentration von amino- terminal trunkierten Amyloid-beta-Peptiden des Typs 2-y, wie von den in Rede stehenden Amyloid-beta-Peptiden Aß(2-40) und Aß(2-42), insbesondere im Blut solcher Patienten erhöht ist, die eine frühe Vorstufe der Alzheimer- Erkrankung, insbesondere eine präklinischen bzw. klinische Vorstufe der Alz- EP2011/001724

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heimer-Krankheit, im Zusammenhang mit einer leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI) aufweisen.

Weiterhin ist es im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung möglich, dass dem Probanden und/oder Patienten eine erhöhte Wahrscheinlichkeit zugeordnet wird, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken, und/oder dass dem Probanden und/oder Patienten die Erkrankung an einer präklinischen Stufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer inzipienten und/oder prodromalen Alzheimer-Krankheit (incipient AD), und/oder an einer klinischen Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, insbesondere an einer frühen Alzheimer-Krankheit (early AD), zugeordnet wird, wenn das relative Verhältnis aus Aß(l-42) / Aß(2-y) im Vergleich zu den hierzu entsprechenden Referenz- Verhältnissen der Referenz-Gruppe ohne diagnostizierte Alzheimer-Krankheit und/oder ohne diagnostizierte Vorstufe einer Alzheimer-Krankheit verringert ist, wobei y eine ganze Zahl von 37 bis 43, insbesondere 40 oder 42, ist, und/oder wenn das relative Verhältnis von (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2-40) und/oder (a) Aß(l-42) / (c) Aß(2-42), insbesondere (a) Aß(l-42) / (b) Aß(2- 40), im Vergleich zu den hierzu entsprechenden Referenz- Verhältnissen der Referenz-Gruppe ohne diagnostizierte Alzheimer-Krankheit und/oder ohne diagnostizierte Vorstufe einer Alzheimer-Krankheit verringert ist.

Gemäß dieser erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform wird somit auf eine Analyse der zuvor genannten spezifischen Verhältnisse als solcher aus den jeweiligen Amyloid-beta-Peptiden abgestellt. Denn in Ergänzung zu den zuvor für die Einzelwerte getroffenen Aussagen hat die Anmelderin gleichermaßen völlig überraschend gefunden, dass eine präklinische bzw. klinische Alzheimer-Krankheit, insbesondere eine inzipiente bzw. prodromale Alzheimer-Krankheit, mit einer signifikante Abnahme der vorgenannten Verhältnisse, insbesondere im Blut, einhergeht.

Dieser seitens der Anmelderin erstmalig aufgezeigte Zusammenhang ist auch vor dem Hintergrund völlig überraschend, dass im Allgemeinen kein direkter Zusammenhang zwischen den entsprechenden Demenz-Biomarkern in anderen Bestandteilen des Körpers, wie der Cerebrospinal-Flüssigkeit, mit den nunmehr insbesondere im Blut aufgefundenen speziellen Verhältnissen von Amyloid-beta-Peptiden der vorgenannten Art besteht. Insbesondere durch die gezielte Kombination von speziellen Diagnoseverfahren im Rahmen der Klassifizierung der Referenz-Gruppen ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelungen, die Korrelation bzw. den Zusammenhang der vorgenannten Amyloid-beta-Peptide und der entsprechenden speziellen Verhältnisse im Blut insbesondere mit speziellen Vorformen der Alzheimer-Krankheit aufzuzeigen, so dass dieser Zusammenhang im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Grundlage eines unter Verwendung von standardisierten Methoden durchzuführenden und aussagekräftigen Tests auf Basis einer Blutanalyse im Hinblick auf das Vorliegen einer Alzheimer-Krankheit bzw. einer entsprechenden Vorstufe ist.

Die Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Verwendung von speziellen Verhältnissen von Amy loid-beta-Peptiden insbesondere auf Basis einer Blutprobe ist umso überraschender, als im Allgemeinen bekannt ist, dass gerade keine direkte Verbindung zwischen den spezifischen Demenz-Biomarkern, beispielsweise in der Cerebrospinal-Flüssigkeit, zu denen im Blut vorliegt. Diesbezüglich ist auch beachtlich, dass in Bezug auf Blut als solches zahlreiche periphere Zellsysteme bzw. Zellpopulationen, wie beispielsweise Leberzellen, Blutplättchen, Monozyten oder dergleichen, einen Einfluss auf die in Rede stehenden Verhältnisse aufweisen können, so dass im Allgemeinen gerade nicht von der spezifischen Ausbildung von A-beta-Peptiden in der Cerebrospinal-Flüssigkeit auf die diesbezüglichen Verhältnisse im Blut oder vice versa geschlossen werden kann.

Daher ist es erfindungsgemäß nicht vorhersehbar gewesen, dass eine belastbare und verlässlichere Aussage hinsichtlich des Vorliegens von Alzheimer- Vorstufen der vorgenannten Art auf Basis einer Analyse einer Blutprobe möglich ist.

Die erfindungsgemäße Verwendung kann auch in Kombination mit weiteren Analyseverfahren, beispielsweise in Kombination mit einer speziellen Analyse des Verhältnisses von Aß(l-42) / Aß(l-40), insbesondere in der Cerebrospinal-Flüssigkeit, durchgeführt werden, was die Aussagekraft noch weiter verbessert. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem z e i t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit (Risikos) eines Probanden und/oder Patienten, an einer Alzheimer-Krankheit (Morbus Alzheimer, AD) zu erkranken, wobei in einer Probe einer Körperflüssigkeit des Probanden und/oder Patienten mindestens ein quantitatives Verhältnis (Quotient) aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden (A-beta; Aß) ermittelt wird, wobei die Amyloid-beta-Peptide ausgewählt werden aus (a) Aß(l-42), (b) Aß(2-40) und (c) Aß(2-42) und wobei das quantitative Verhältnis aus (a) / (b) oder vice versa und/oder aus (a) / (c) oder vice versa gebildet wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen - gemäß einem d r i t t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit (Risikos) eines Probanden und/oder Patienten, an einer Alzheimer-Krankheit (Morbus Alzheimer, AD) zu erkranken, insbesondere wie zuvor definiert,

(a) wobei in einer Probe einer Körperflüssigkeit des Probanden und/oder Patienten mindestens ein quantitatives Verhältnis (Quotient) aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta-Peptiden (A-beta; Aß) ermittelt wird, wobei die Amyloid-beta-Peptide ausgewählt werden aus (a) Aß(l- 42), (b) Aß(2-40) und (c) Aß(2-42) und wobei das quantitative Verhältnis aus (a) / (b) oder vice versa und/oder aus (a) / (c) oder vice versa gebildet wird;

(b) wobei das so erhaltene Verhältnis mit hierzu entsprechenden Referenz- Verhältnissen verglichen und/oder korreliert wird und/oder wobei das so erhaltene Verhältnis hierzu entsprechenden Referenz- Verhältnissen zugeordnet wird; und

(c) wobei anschließend auf Basis des Vergleichs und/oder der Korrelation und/oder der Zuordnung die Wahrscheinlichkeit des Patienten und/oder Probanden bestimmt wird, an einer Alzheimer-Krankheit zu erkranken.

Für weitergehende Ausführungen kann zur Vermeidung unnötiger Wiederholungen auf die übrigen Aspekte der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche in Bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend gelten. 724

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Schließlich ist weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem v i e r t e n Aspekt der vorliegenden Erfindung - ein erfindungsgemäßes Kit, insbesondere zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit (Risikos) eines Patienten und/oder Probanden, an einer Alzheimer-Krankheit (Morbus Alzheimer, AD) zu erkranken und/oder insbesondere zur Bestimmung (Diagnose) dessen Erkrankung an einer Vorstufe der Alzheimer-Krankheit, wobei das Kit Komponenten und/oder Mittel zur Bestimmung eines quantitativen Verhältnisses (Quotienten) aus zwei voneinander verschiedenen Amyloid-beta- Peptiden (A-beta; Aß) in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Probanden und/oder Patienten umfasst, wobei die Komponenten und/oder Mittel derart ausgewählt sind, dass diese die quantitative Bestimmung von Amyloid-beta- Peptiden aus der Gruppe von (a) Aß(l-42), (b) Aß(2-40) und (c) Aß(2-42) zu Zwecken der Ermittlung des quantitativen Verhältnisses aus (a) / (b) oder vice versa und/oder aus (a) / (c) oder vice versa ermöglichen.

Bei den Komponenten bzw. Mitteln des erfindungsgemäßen Kits kann es sich insbesondere um Mittel bzw. Komponenten zur Aufreinigung, Aufkonzentrierung, Auftrennung, Separierung oder dergleichen der zu untersuchenden Amyloid-beta-Peptide handeln. Diesbezüglich kommen auch dem Fachmann an sich geläufige Mittel bzw. Komponenten zur Proteinauftrennung, wie sie beispielsweise im Rahmen von immundetektiven Verfahren bzw. von an sich bekannten Auftrennverfahren, wie gelelektrophoretischen Verfahren, Verwendung finden, in Betracht.

Insbesondere kann es sich bei den Mitteln bzw. Komponenten aber auch um die zu analysierenden Amyloid-beta-Peptide markierende bzw. hiermit inter- agierende Substanzen, wie Liganden bzw. Antikörper, handeln.

In diesem Zusammenhang kann das erfindungsgemäße Kit mindestens einen für Amyloid-beta-Peptide spezifischen und/oder hieran bindenden Liganden, vorzugsweise Antikörper, aufweisen. Diesbezüglich kann der mindestens eine Ligand, vorzugsweise Antikörper, spezifisch für Amyloid-beta-Peptide des Typs Aß(l-x) und Aß(2-y) sein, wobei y eine ganze Zahl von 37 bis 43 ist.

Zudem kann der mindestens eine Ligand, vorzugsweise Antikörper, spezifisch für (a) Aß(l-42) und/oder (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) sein. T EP2011/001724

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Weiterhin kann der mindestens eine Ligand, vorzugsweise Antikörper, spezifisch für das aminoterminale Ende von (a) Aß(l-42) und/oder (b) Aß(2-40) und/oder (c) Aß(2-42) sein.

In Bezug auf weitergehende Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Kit kann auf die obigen Ausführungen zu der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. den erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen werden, welche in entsprechender Weise für das erfindungsgemäße Kit gleichermaßen gelten.

Weitere Vorteile, Merkmale, Eigenschaften und Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich auch aus den nachfolgenden, die erfindungsgemäße Konzeption im Detail beschreibenden Ausführungen mitsamt den nachfolgenden Ausführungsbeispielen sowie den beigefügten Figurendarstellungen:

Die vorliegende Erfindung fokussiert hinsichtlich der Probenanalyse insbesondere auf eine Methode bzw. ein Verfahren der aminoterminal-selektiven Immunpräzipitation mit einem nachfolgenden attomolar-sensitiven, insbesondere harnstoffbasierten zweidimensionalen Western-Immunblot (2D-Aß- WIB), um die komplexe beta-Amyloid-Peptid-Signatur im EDTA-Blutplasma von Probanden (n = 42), welche aus Fällen mit früher oder inzipienter Alzheimer-Erkrankung (eiAD, n = 21) und Kontrollprobanden (Con, n = 21) gebildet werden, zu untersuchen.

Die vorliegende Erfindung betrifft dabei insbesondere die Identifikation bestimmter A-beta-Peptid- Verhältnisse (A-beta-Peptid-Quotienten) im Blut, welche hochsignifikante Unterschiede zwischen eiAD- und Con-Patienten zeigen.

Insbesondere ist die Bildung von Aß(2-y)-Spezies in Relation zu Aß(l-42) bei eiAD-Patienten erhöht. Überraschenderweise ist der genannte Effekt besonders stark in präklinischen Stadien (inzipiente AD) ausgeprägt, z. B. bei Patienten mit leichten kognitiven Beeinträchtigungen (Mild Cognitive Impair- ment, MCI), welche nach dem Demenz-Biomarkermuster ihrer Cerebrospinal- Flüssigkeit eine prodromale Alzheimer-Krankheit aufweisen. Folglich können erfindungsgemäß spezifische A-beta-Peptid- Verhältnisse von Aß(l-42) zu bestimmten Aß(2-y)-Spezies, insbesondere die Verhältnisse Aß(l-42) / Aß(2-40) sowie Aß(l-42) / Aß(2-42), zur neuro-chemischen Diagnose einer frühen und/oder inzipienten Alzheimer-Krankheit durch Analyse von Körperflüssigkeiten, vorzugsweise Blut, verwendet werden (z. B. in Kombination mit dem Verhältnis Aß(l-42) / Aß(l-40)). Dies ermöglicht insbesondere eine blut- bzw. bluttestbasierte neuro-chemische Demenz- Erkrankungsdiagnose von inzipienter (präklinischer/prodromaler) Alzheimer- Krankheit (AD). Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit auch neu ausgerichtete Strategien zur sekundären präventiven Behandlung insbesondere von Hochrisikopatienten.

Die Anmelderin hat in diesem Zusammenhang zum Beleg ihrer Erfindung eine aminoterminal-selektive Immunpräzipitation mit nachfolgendem attomo- lar-empfindlichen harnstoffbasierten zweidimensionalen Western-Immunblot (attomolar sensitive urea-based two-dimensional western-immunoblot (2D- Aß-WIB)) durchgeführt, um die komplexe beta-Amyloid-Peptid-Signatur in EDTA-Blutplasma von Probanden (n = 42), welche Fälle mit früher oder inzipienter Alzheimer-Erkrankung (early or incipient Alzheimer 's dementia (ei- AD, n = 21)) und eine Krankheitskontrollgruppe (disease controls (Con, n = 21)) umfassen, zu untersuchen.

Die klinische Phänotypisierung der Patienten mit Alzheimer-Krankheit wird durch CSF-NDD und in einer Mehrzahl der Fälle durch neuro-bildgebende Verfahren (MRI / SPECT) unterstützt. Zur biostatistischen Auswertung werden die Patienten entsprechend einem klinischen Goldstandard, einem neuro- chemischen Goldstandard und Goldstandards (GS), welche psychometrische (MMSE) und neuro-chemische Parameter (CSF dementia biomarkers) sowie auch neuro-chemische Parameter (CSF dementia biomarkers) und neuro- bildgebende Verfahrensparameter (SPECT) kombinieren, geschichtet bzw. klassifiziert. Dabei werden durch Biomarker gestützte Goldstandards (neuro- chemische GS; kombinierte neuro-chemische GS und SPECT GS) eingesetzt, um eine objektive Einordnung der Patienten zu erreichen, wodurch eine Kreuzvalidierung der klinisch gestützten Phänotypisierung der frühen oder inzipienten Alzheimer-Krankheit erreicht wird. 2011/001724

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Die 2D-Ab-WIB-Analyse der Blut-Signatur von A-beta-immunreaktiven Peptiden zeigt ein stabiles Muster von 18 Feldern (Spots), welche unter Bezugnahme auf eine Mischung aus A-beta-Standardpeptiden quantifiziert wurde. Die biostatistische Analyse ergibt dabei, dass keines der einzelnen A-beta- immunreaktiven Felder einen signifikanten Unterschied zwischen den Patientengruppen eiAD und Con zeigte. Lediglich Feld 4, welches Aß(l-42) entspricht, zeigt einen Trend für einen krankheitsspezifischen Unterschied. Spezifische A-beta-Peptid- Verhältnisse zeigen hochsignifikante Unterschiede zwischen eiAD- und Con-Patienten. Dieser Effekt wird in erster Linie durch das Verhältnis von Aß(l-42) (Feld 4) zu anderen A-beta-Peptid-Spezies bestimmt, welche an der ersten Aminosäure, in diesem Fall Aspartat, aminoter- minal trunkiert sind (Aß(2-x)-Spezies). Folglich unterscheidet das Verhältnis von Aß(l-42) zur Summe der Aß-Spezies (2-42) (Feld 14), (2-40) (Feld 15), (2-39) (Feld 16), (2-38) (Feld 17) und (2-37) (Feld 18) die eiAD- und Con- Gruppe signifikant voneinander, wohingegen dies bei den Verhältnissen der anderen Aß(l-x)-Spezies (z. B. Aß(l-40)) zur Summe von Aß(2-x)-Spezies oder zu einzelnen Aß(2-x)-Spezies nicht der Fall ist.

In der Gruppe der Aß(l-x)-Peptide lässt nur das Verhältnis Aß(l-42) (Feld 4) zu Aß(l-40) (Feld 5) eine statistisch signifikante Unterscheidung der Patientengruppen eiAD und Con zu. Eine verfeinerte Datenanalyse zeigt, dass die verbesserte diagnostische Leistungsfähigkeit des Verhältnisses von Aß(l-42) zur Summe der Aß(2-x)-Spezies in erster Linie durch das Verhältnis von Aß(l-42) zu Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15), gefolgt von dem Verhält- nis Aß(l-42) zu Aß(2-42) (Verhältnis der Felder 4/14) erklärt wird. Die diagnostische Genauigkeit des Verhältnisses von Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15) ist im Verhältnis Aß(l-42) / Aß(l-40) (Felder 4/5), welches derzeit als Goldstandard für blutbasierte neuro-chemische Diagnosever- fahren zur Erkennung von Demenzerkrankungen, insbesondere der Alzhei- mer-Krankheit, angesehen wird, deutlich überlegen.

Die Korrelationsanalyse lässt zudem den Schluss zu, dass das Verhältnis von Aß(l-42) zu aminoterminal trunkierten Aß(2-x)-Spezies, insbesondere Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15), deutlich enger mit den CSF- Biomarkern für Demenzerkrankungen korreliert als das Verhältnis Aß(l-42) / Aß(l-40). Dieser Zusammenhang ist am stärksten für die Korrela- tion des Verhältnisses Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15) zu dem Gesamtgehalt an Tau-Protein (Total-Tau) ausgeprägt. Darüber hinaus kann eine signifikante Korrelation des Verhältnisses Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15) mit routinemäßigen Gehirndurchblutungs- SPECT-Analysen ( ^99m Tc-SPECT) beobachtet werden, wohingegen eine solche Korrelation nicht für das Verhältnis Aß(l-42)/Aß(l-40) (Verhältnis der Felder 4/5) beobachtet werden kann. Darüber hinaus ist das Verhältnis Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15) enger mit dem ApoE-e4- Genotyp, einem nachgewiesenen Risikofaktor für die Alzheimer-Krankheit, korreliert als das Verhältnis Aß(l-42)/Aß(l-40). Andererseits ist Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15) signifikant enger mit dem Alter der Patienten korreliert als das Verhältnis Aß(l-42) / Aß(l-40).

Eine signifikante Korrelation wird auch zwischen dem Alter und Total-Tau beobachtet, was aus der Literatur bekannt ist. Da die Patientengruppen eiAD und Con nicht altersgleich sind, kann nicht ausgeschlossen werden, dass einige der Beobachtungen in erster Linie durch das Alter und nicht durch krankheitsbedingte Unterschiede zu erklären sind. Alter ist jedoch der bedeutendste bekannte Risikofaktor für die Alzheimer-Krankheit und Total-Tau wurde kürzlich als der leistungsfähigste einzelne CSF-Biomarker zur Vorhersage von inzipienter Alzheimer-Krankheit bei MCI-Patienten identifiziert. Dieser Effekt war unabhängig vom Alter der MCI-Patienten. Darüber hinaus zeigt eine andere aktuelle Gehirndurchblutungs-SPECT-Studie, dass unter den CSF- Biomarkern zur Erkennung von Demenzerkrankungen (Phospho-Tau, Total- Tau, Aß(l-42)) Total-Tau und Phospho-Tau - aber nicht Aß(l-42) - signifikant mit lokalen Durchblutungsstörungen (linker parietaler Kortex) bei früher Alzheimer-Krankheit und MCI korreliert sind.

Überraschenderweise kann die Anmelderin eine auffällige Abnahme des Verhältnisses Aß(l-42) / Aß(2-40) (Verhältnis der Felder 4/15) im Blut von MCI- Patienten mit prodromaler Alzheimer-Krankheit (inzipienter Alzheimer- Krankheit) beobachten, wobei die Alzheimer-Krankheit entsprechend der CSF-Biomarker-Signatur indiziert ist. Dieser Befund konnte nicht für das Verhältnis Aß(l-42) / Aß(l-40) (Verhältnis der Felder 4/5) im Blut beobachtet werden. Hinweise aus der biochemischen Analyse von beta-Amyloid-Plaques aus Hirngewebe in unterschiedlichen Krankheitsstadien der menschlichen T EP2011/001724

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Alzheimer-Krankheit zeigen in eindeutiger Weise, dass die Bildung von ami- noterminal trunkierten A-beta-Peptid-Spezies ein sehr frühes Ereignis in der molekularen Pathogenese der Alzheimer-Krankheit ist. Folglich kann die gesteigerte Bildung von Aß(2-x)-Spezies in Relation zu Aß(l-42) in vorklinischen Stadien (inzipienter Alzheimer-Krankheit) besonders ausgeprägt sein, z. B. in MCI-Patienten mit prodromaler MCI Alzheimer-Krankheit.

In diesem Zusammenhang verhält sich die Menge bzw. der Gehalt an A-beta- Peptiden in Bezug auf Blut bzw. Blutplasma und/oder Blutserum als zu analysierende Probe derart, dass die dort gefundenen Mengen bzw. Gehalte an A-beta-Peptiden nicht signifikant mit CSF-A-beta-Peptiden korreliert sind, d. h. das A-beta-Peptid-Blutprofil ist nicht als eine Art "verdünntes" CSF- Profil anzusehen. Darüber hinaus ist die Menge bzw. der Gehalt an A-beta- Peptid im Blut in weitaus komplexerer Art und Weise von anderen Faktoren abhängig als das CSF-Muster, da zahlreiche periphere Zellsysteme bzw. Zellpopulationen (Leberzellen, Blutplättchen, Monozyten etc.) zu dem Muster beitragen bzw. dieses beeinflussen. Dementsprechend ist es weder möglich noch gerechtfertigt, Befunde bzw. Zusammenhänge aus Untersuchungen an A-beta-Peptiden, welche als CSF-Biomarker zur Erkennung von Demenzerkrankungen identifiziert wurden, auf das Blut bzw. auf Bluttests zu transferieren bzw. diese zu verallgemeinern. So lassen sich beispielsweise - im Gegensatz zum Blut - keine Hinweise für vergleichbar hohe Konzentrationen an Aß(2-40) (relativ zu Aß(l-42) oder zu dem Gesamtgehalt an A-beta-Peptiden) in CSF-Proben finden.

Die vergleichende ROC- Analyse (Fig. 5) der Verhältnisse der Felder 4/5, 4/14 und 4/15 zeigen deutlich, dass die kombinierte Anwendung der Verhältnisse der Felder 4/5, 4/14 und 4/15 einen gesteigerten diagnostischen Wert besitzt: Bei mittlerer Empfindlichkeit bzw. Sensitivität (z. B. 70 bis 80 %) zeigt das Verhältnis der Felder 4/15 eine verbesserte Spezifität, wohingegen bei hoher Empfindlichkeit bzw. Sensitivität (90 bis 100 %) die Verhältnisse der Felder 4/5 und 4/14 bessere Ergebnisse liefern. Dies wird besonders dann ersichtlich, wenn eine logistische Regressionsanalyse Statistical Package of Social Sciences, SPSS, Version 17) angewendet wird (genaue Analyse nicht gezeigt), um die Patienten nach dem klinischen oder neuro-chemischen Goldstandard zu klassifizieren. Wenn alle drei Verhältnisse angewendet werden, werden 81 % bzw. 85,7 % der Patienten nach dem klinischen bzw. neuro-chemischen Goldstandard richtig klassifiziert. Wird nur das Verhältnis der Felder 4/5 angewendet, so werden lediglich 66,7 % bzw. 61,9 % der Patienten nach dem klinischen bzw. dem neuro-chemischen Goldstandard richtig klassifiziert.

1. Methoden

1.1 Patientenkohorten und klinische Phänotypisierung

Die komplexe beta-Amyloid-Peptid-Signatur in den EDTA-Blutplasmen von 42 Probanden wird untersucht. Sämtliche Patienten werden in der psychiatrischen Abteilung der Universität Erlangen/Nürnberg, Deutschland rekrutiert. Die Studienpopulation ist in 21 Patienten mit früher oder inzipienter Alzheimer-Krankheit (eiAD; D Code l = 1) und 21 Kontrollpatienten (Con; D Code l = 0) geschichtet bzw. unterteilt. Die Kontrollfälle umfassen Patienten mit heterogenen neuropsychiatrischen Krankheiten, einschließlich anderer Demenzerkrankungen. CSF-basierte neuro-chemische Diagnoseverfahren zur Erkennung von Demenzerkrankungen sind für sämtliche Patienten der Studie verfügbar. Der klinische Goldstandard {clinical GS) für die Phänotypisierung der 42 Patienten, präanalytische Probenbehandlung und CSF-gestützte neuro- chemische Diagnoseverfahren zur Erkennung von Demenzerkrankungen (CSF-NDD) richten sich nach internationalen Diagnoserichtlinien des Deutschen Kompetenznetzes Demenzen (www.kompetenznet-demenzen.de; Korn- huber et al.: "Early and differential diagnosis of dementia and mild cognitive impairment: design and cohort baseline cha acter istics of the German Dementia Competence Network. ", Dement. Geriatr. Cogn. Disord., 2009, 27, 404-417; Wiltfang et al.: "Consensus paper of the WFSBP Task Force on Bio- logical Markers of Dementia: the role of CSF and blood analysis in the early and differential diagnosis of dementia. ", World J. Biol. Psychiatry, 2005, 6, 69-84; Lewczuk et al.: "The German Competence Net Dementias: Standard operating procedures for the neurochemical dementia diagnostics. ", J. Neural Transm., 2006, 1 13, 1075-80; Lewczuk und Wiltfang: "Neurochemical dementia diagnostics: State of the art and research perspectives." Proteomics 2008, 8, 1292-301). Darüber hinaus werden zur weiteren Validierung der Diagnose der Alzheimer- Krankheit bevorzugt Patienten mit früher/inzipi enter Alzheimer-Krankheit (eiAD) in die Studie einbezogen, bei welchen neuro-bildgebende Verfahren (SPECT und/oder cMRI) die Diagnose der Alzheimer-Krankheit unterstützen. eiAD-Patienten mit einem neuro-bildgebendem Befund, welcher auf das Vorliegen anderer Demenzerkrankungen (z. B. vaskulärer Demenz oder fronto- temporale Demenz) hindeutet, werden nicht in die Studie einbezogen.

Um eine weitgehend standardisierte Interpretation der Daten aus routinemäßigen neuro-bildgebenden Verfahren zu ermöglichen, werden folgenden Unterteilungskriterien verwendet:

1,5 Tesla MRI oder ^99m Tc-SPECT_Score "3": frontotemporoparietale Atrophie, frontotemporoparietales Durchblutungsdefizit, Bild ist als typisch für die Alzheimer-Krankheit eingeordnet, keine signifikanten Läsionen, kein Neoplasma;

- Score "2": andere Hirnatrophie, generalisierte Atrophie, signifikante Anzahl an Läsionen, Hinweise auf Neoplasma;

- Score "1": andere pathologische Befunde;

- Score "0": keine pathologischen Befunde.

MRI- bzw. SPECT-neuro-bildgebende Verfahren sind für 39 bzw. 37 Patienten verfügbar. Darüber hinaus werden bevorzugt eiAD-Patienten in die Studie eingebunden, bei welchen die klinische Diagnose durch ein für die Alzheimer- Krankheit typisches CSF-Demenz-Biomarker-Muster gestützt wird (herabgesetzt: Aß(l-42), Verhältnis Aß42 / Aß40; erhöht: Total-Tau, Phospho- Taul81). Im Gegensatz hierzu werden Kontrollfälle mit für die Alzheimer- Krankheit typischem CSF-NDD ausgeschlossen. Bei den Patienten wird ein Risiko für inzipiente Alzheimer-Krankheit festgestellt, wenn sie bereits das die Alzheimer-Krankheit indizierende CSF-Demenz-Biomarker-Muster zeigen und ihr kognitives Defizitmuster eine leichte kognitive Beeinträchtigung indizierte.

Zusätzlich zu dem klinischen Goldstandard wird ein auf CSF-Biomarkern zur Erkennung von Demenzerkrankungen basierender neuro-chemischer Goldstandard angewendet. Der neuro-chemische Goldstandard berücksichtigt die quantitative Information, welche durch alle vier CSF-Biomarker zur Erken- P2011/001724

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nung von Demenzerkrankungen bereitgestellt wird (Total-Tau, Phospho- Taul 81, Aß(l-42) und Aß(l-40)). Diese Information wird genutzt, um den NDD Score (Ordinalskala) und einen abgeleiteten dichotomen NDD Code zu erhalten. Der NDD Code wird mit den Ergebnissen des Mini-Mental-Status- Test (Mini Mental State Examination Test, MMSE) kombiniert, um die neuro- chemischen Diagnoseverfahren zur Erkennung von Demenzerkrankungen und den Kognitionscode (Cognition code (NDD Cog-Code)) zu erhalten bzw. zu begründen. Beide Codes ermöglichen eine objektive (NDD Code; n = 42) o- der weitgehend objektive (NDD Cog Code; n = 38) Phänotypisierung der Patienten, basierend auf deren molekularen und/oder kognitiven Biomarker- Information.

Da die qualitative Evaluation der CSF-Biomarker bereits zur Unterstützung des klinischen Goldstandards verwendet wird (siehe oben), wird ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen dem klinischen und dem neuro- chemischen Goldstandard erreicht. Die Definition des NDD Code und des NDD Cog Code ist im Folgenden detailliert ausgeführt. Schließlich werden der NDD Score (Bereich: -1 bis +2) und der SPECT_Score (Bereich: 0 bis 3) kombiniert, um den NDD SPECT Score (Bereich: -1 bis +5; n = 37) zu erhalten. Der NDD SPECT Score korrespondiert zur Summe der NDD- und SPECT-Scores.

1.2 Molekulare Phänotypisierung und neuro-chemischer Goldstandard: Ableitung des NDD Score

Die Ungenauigkeit der klinischen Diagnose der frühen Alzheimer-Krankheit (AD) ist signifikant. Nach durch Autopsien gestützten Studien beträgt die Genauigkeit selbst in mittleren bis weit fortgeschrittenen Stadien der Alzheimer- Krankheit bestenfalls 85 bis 90 %. Da das klinische Syndrom in frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit noch sehr viel heterogener ist, dürfte in diesem Fall die Genauigkeit der klinischen Diagnose nicht über 85 % hinausgehen.

Es gibt einen gewichtigen Hinweis aus der Meta-Analyse mehrerer großer internationaler Multizenterstudien sowie aus autopsiegestützten Studien, dass eine spezifische Biomarker-Signatur für Demenzerkrankungen in der Ce- rebrospinal-Flüssigkeit (CSF) die richtige Diagnose von früher und sogar in- zipienter (präklinischer) Alzheimer-Krankheit stark stützt. Dies erklärt, weshalb CSF-gestützte neuro-chemische Diagnoseverfahren zur Erkennung von Demenzerkrankungen (CSF-NDD) im Jahr 2010 in die nationalen neuro- psychiatrischen S3-Richtlinien für die verbesserte Diagnose früher Demenzerkrankungen aufgenommen wurden. Die klinische Relevanz von CSF-NDD wird durch eine Vielzahl an Literaturbelegen aufgezeigt (Hansson et al.: "Association between CSF biomarkers and incipient Alzheimer's disease in pa- tients with mild cognitive impairment: a follow-up study ", Lancet Neurol., 2006, 5, 228-234; Engelborghs et al.: , "Neuropsychological and behavioural correlates of CSF biomarkers in dementia ", Neurochem. Int., 2006, 48, 286- 295; Engelborghs et al.: "No association of CSF biomarkers with APOEepsi- lon4, plaque and tangle bürden in definite Alzheimer's disease." Brain, 2007, 130, 2320-2326).

Da die im Rahmen der hier beschriebenen Studie untersuchte Patientenkohorte hauptsächlich aus Patienten mit früher oder inzipienter (präklini- scher/prodromaler) Alzheimer-Krankheit besteht, wird die Information aus der CSF-Biomarker-Signatur für Demenzerkrankungen als Bemessungsgrundlage für eine objektive diagnostische Schichtung bzw. Unterteilung der Patientengruppe (neuro-chemischer Goldstandard) verwendet, welche unabhängig von den konventionellen klinischen Stadien ist. Dies wird durch die Begründung bzw. Etablierung eines neuro-chemischen Demenz-Erkrankungscodes (NDD Code) erreicht, welcher wiederum aus einem gemittelten neuro- chemischen diagnostischem Score für Demenzerkrankungen (avNDD Score) erhalten wird.

Der NDD Score basiert auf den Informationen der folgenden vier Biomarker für Demenzerkrankungen in der Cerebrospinal-Flüssigkeit (CSF):

Verhältnis der A-beta-Peptide Aß(x-42) zu Aß(x-40) (AßratioTGC). Zur Bestimmung werden zwei ELISA-Tests der Firma THE GENETICS COMPANY, Zürich, verwendet, welche die Aß(l-42)- und Aß(l-40)- Peptide nicht spezifisch messen, sondern auch deren aminoterminal- trunkierte Spezies;

Aß(l-42) (Aßl42Inn): ELISA-Test von INNOGENETICS, Gent, misst spezifisch Aß(l-42);

- Total-Tau (ELISA-Test von INNOGENETICS);

Phospho-Tau 181 (ELISA-Test von INNOGENETICS). CSF-Biomarker-Informationen für Demenzerkrankungen sind für sämtliche Patienten verfügbar, jedoch nicht für alle Biomarker bei sämtlichen Patienten (Total-Tau: n = 42, Aßl42Inn: n = 42, Phospho-Tau: n = 29, AßratioTGC n - 20).

Patienten mit einer CSF-Biomarker-Konzentration für Demenzerkrankungen im hohen normalen Bereich bekommen willkürlich bzw. frei gewählt einen NDD-Score von zugewiesen. Im Gegensatz hierzu bekommen Patienten mit pathologischen Werten für CSF-Demenzerkrankungs-Biomarker in der Nähe des Grenzwerts {cut-off-value), über dem Grenzwert und weit über dem Grenzwert NDD-Scores von "0", "1" bzw. "2" zugeordnet. Da nicht für jeden einzelnen Patienten alle vier Biomarker zur Erkennung von Demenzerkrankungen zugänglich sind, wurde ein gemittelter NDD Score (average NDD Score, avNDD Score) berechnet, d. h. £Score/n. Ein avNDD Score von -1 bzw. +2 korrespondiert zu einem minimalen bzw. einem maximalen Risiko einer inzipienten oder offenkundigen klinischen Alzheimer-Krankheit.

Der ordinale avNDD Score wird verwendet, um den dichotomen NDD Code zu erhalten: Ein avNDD Score von < 1 korrespondiert zu einem geringen Risiko für eine inzipiente oder offenkundig klinische Alzheimer-Krankheit (NDD Code = 0), wohingegen ein avNDD Score von > 1 zu einem hohen Risiko für inzipiente oder offenkundige klinische Alzheimer-Krankheit (NDD Code = 1) korrespondiert.

Die Grenzwerte, welche die Klassifikationsbereiche des NDD Scores definieren, werden der Literatur entnommen oder aus eigenen Laborarbeiten abgeleitet (z. B. AßratioTGC): Total-Tau = 350 pg/ml; Phospho-Taul81 = 60 pg/ml; Aßl42Inn = 530 pg/ml; AßratioTGC = 0,09. Die Bereiche der Konzentrationen für CSF-Biomarker zur Erkennung von Demenzerkrankungen, welche die verschiedenen NDD_Score- Werte definieren, sind in Tabelle 1 zusammenge- fasst. Tabelle 1 : CSF-Demenz-Biomarker- Werte, die den NDD-Score begründen

Gemäß dem neuro-chemischen Goldstandard wurden 18 Patienten als eiAD (NDD_Code=l) und 24 Patienten als Con (NDD_Code=0) geschichtet bzw. eingeteilt.

1.3 Kombinierte molekulare und kognitive Phänotypisierung: Der neuro- chemische Demenzerkrankungs- und Kognitionsscore

Der Score für neuro-chemische Diagnoseverfahren bei Demenzerkrankungen und Kognition (NDD-Cog-Code) kombiniert den CSF-gestützten neuro- chemischen Nachweis für inzipiente oder offenkundige Alzheimer-Krankheit - wie durch den NDD Code ausgedrückt - mit der Bestimmung der kognitiven Defizite - wie durch den Mini-Mental-Status-Test (MMSE) ausgedrückt. Einen MMSE-Score von weniger als 25 Einheiten indiziert eine Demenzerkrankung, wobei ein Maximalscore von über 30 Einheiten leichte kognitive Beeinträchtigungen nicht ausschließt, da der MMSE nicht empfindlich genug ist, um subtile kognitive Defizite anzuzeigen. Die Parametervorgaben, welche den NDD-Cog_Code definieren, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2: Parametereinstellungen für den NDD Cog Code

1.4 Aminoterminal-selektive Immunpräzipitation und attomolar-sensitiver harnstoffbasierter zweidimensionaler Western-Immunblot (2D-Aß-WIB)

Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen werden eine aminoterminal- selektive Immunpräzipitation und ein attomolar-sensitiver harnstoffbasierter zweidimensionaler Western-Immunblot (2D-Aß-WIB) nach Maler et al., 2007 verwendet, um die komplexe beta-Amyloid-Peptid-Signatur in EDTA- Blutplasma zu untersuchen. Einzelne Peptidkonzentrationen werden durch Western-Immunblots in Relation zu einer Mischung aus synthetischen A-beta- Peptiden quantifiziert, welche als eindimensionale Markerspur auf der Seite eines jeden zweidimensionalen Western-Immunblots mitlaufen. A-beta- immunreaktive Felder, welche durch 2D-Aß-WIB aufgetrennt werden, werden durch ihr zweidimensionales Migrations- bzw. Wanderungsverhalten im Vergleich zu bekannten synthetischen A-beta-Peptiden und durch amino- und carboxyterminalselektive Immunpräzipitation und nachfolgende 2D-Aß-WIB identifiziert. Darüber hinaus wurde ein weiterer molekularer Nachweis aus einer unabhängigen Arbeit (Schieb H. et al., Veröffentlichung in der Vorbereitung) verwendet, welcher aus der Analyse von Hirnproben transgener Mausmodelle der Alzheimer-Krankheit (mouse model APP23) erhalten wird, wobei die Himhomogenate durch 2D-Aß-WIB getrennt und die Felder nachfolgend massenspektrometrisch analysiert werden.

1.5 Biostatistische Datenanalyse

Aufgrund der verzerrten Datenverteilung mehrerer A-beta-Peptide aus dem Blutplasma, welche durch 2D-Aß-WIB getrennt wurden, werden die Rohkonzentrationen logarithmisch transformiert. Dementsprechend werden die biostatistischen Berechnungen (SPSS™) mit den logarithmierten Daten durchgeführt, einschließlich der Berechnung der Verhältnisse (Quotienten).

Weitere Vorteile, Merkmale, Eigenschaft und Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich auch aus den beigefügten Figurendarstellungen. Es zeigt:

Fig. 1 : eine beispielhafte zweidimensionale Auftrennung und Markierung von A-beta-Peptiden im Blut auf Basis einer fotographischen Abbildung eines 2D-Aß-WIB. Die Figurendarstellung zeigt ein stabiles 2D-Muster der entsprechenden Blut-A-beta-Peptide;

Fig. 2: eine frei gewählte Bezeichnung bzw. Nummerierung von insgesamt 18 mittels 2D-Aß-WIB aufgetrennten bzw. separierten Amy- loid-beta-Peptiden aus Blutplasma. Insbesondere zeigt Fig. 2 ein beispielhaftes 2D-Aß-WIB mit der entsprechenden Aufschlüsselung der entsprechenden Felder (spots) der Amyloid-beta-Peptide 1 bis 18. Die 18 Felder sind auf jeder der untersuchten bzw. analysierten Membranen der 2D-Blots zugegen (n = 42). Synthetische Amyloid-beta-Peptide 1-37/38/39/40/42 werden in der 1D-Linie (STD) aufgetrennt, welche aufzeigt, dass ihre Wanderungs- bzw. Migrationsposition in der zweiten Dimension nicht präzise ausgerichtet ist. Des Weiteren zeigt Fig. 2 die Ausrichtung bzw. Positionierung von Punkten bzw. Feldern von humanen Amyloid-beta- Peptiden: (4) Aß(l-42) ; (5) Aß(l-40); (6) Aß(l-39); (7) Aß(l-38); (8) Aß(l-37); (14) Aß(2-42); (15) Aß(2-40); (16) Aß(2-39); (17)

Aß(2-38); (18) Aß(2-37). Die Identität der Aß-immunreaktiven Felder (1) und (2) sowie (10) bis (13) wird nicht weiter untersucht;

Fig. 3: einen Vergleich von A-beta-Peptid- Verhältnissen (a) 4/15

(Aß(l-42) / Aß(2-40)), (b) 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)) und (c) 4/5 (Aß(l-42) / Aß(l-40)) in der Population der Gesamtstudie (n = 42), wobei eine Einteilung bzw. Schichtung in Patienten mit früher / inzipienter AD (eiAD; D Code l = 1) und eine Kontrolle (Con; D Code l = 0) gemäß dem klinischen Goldstandard erfolgt (Darstellung in Form von Feldern {box plots); Mann-Whitney-U- Test mit beidseitiger Angabe der Signifikanz bzw. Aussagekraft);

Fig. 4: einen Vergleich der A-beta-Peptid- Verhältnisse (a) 4/5

(Aß(l-42) / Aß(l-40)), (b) 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)), and 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40)) für eine untersuchte Population, welche in eine Gruppe mit eiAD (NDD Code = 1, n = 18) und eine Gruppe Con (NDD Code = 0, n = 24) gemäß dem neuro-chemischen Goldstandard unterteilt bzw. geschichtet ist (Darstellung in Form von Feldern (box plots); Mann-Whitney-U-Test mit beidseitiger Anga- be der Signifikanz bzw. Aussagekraft);

Fig. 5: eine vergleichende ROC-Analyse für die A-beta-Peptid- Verhältnisse 4/5 (Aß(l-4) / Aß(l-40)), 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)), und 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40)) bei Patienten mit früher / inzipien- ter AD (eiAD, n = 21, D Code l = 1) versus Kontrolle (Con, n = 21, D Code l = 0), welche gemäß dem klinischen Goldstandard unterteilt bzw. geschichtet sind. Die ROC-Analyse wird auf die Identifizierung von "wahrer AD" gesetzt, d. h. mit D_Code_l = 1. 24

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Fig. 5 wird anhand der nachfolgenden Tabelle weiterführend spezifiziert:

Fig. 6: eine vergleichende ROC-Analyse für A-beta-Peptid- Verhältnisse

4/5 (Aß(l-42) / Aß(l-40)), 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)), und 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40)) in Patienten mit früher/inzipienter AD (ei AD, n = 18, NDD Code = 1) versus Kontrolle (Con, n = 24, NDD Code = 0), unterteilt bzw. ermittelt gemäß dem neuro- chemischen Goldstandard. Die ROC-Analyse wird auf die Identifizierung von "wahrer AD" gesetzt bzw. eingestellt, d. h. D_Code_l = 1.

Fig. 6 wird anhand der nachfolgenden Tabelle weiter spezifiziert:

Die ROC-Analyse (NDD Code = 1) resultiert bei einer vorgegebenen bzw. festgesetzten Sensitivität von 83,3 % in Spezifitäten von 79,2 % (cut-ojpN ert: 0,0938), 58,3 % (cut-off- ert: 1,0296) und 37,5 % (cut-oJf-Wert: -0,8737 für logratio4vsl5, logratio4vsl4, und logratio4vs5;

eine vergleichende Analyse auf Basis einer Darstellung in Form von Feldern (box plot) mit einer nicht-parametrischen Evaluierung der Signifikanz bzw. Aussagekraft (Kruskal-Wallis-H) für (a) Aß- Peptid- Verhältnisse 4/5 (Aß(l-42) / Aß(l-40)), (b) 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)) und (c) 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40)) für Patienten, bei denen CSF-Demenz-Biomarker und eine Aussage über die Leistungsfähigkeit im Rahmen eines kognitiven Tests auf Basis einer MMSE vorliegen (n = 38). Der NDD Cog Code wird als kombinierter molekularer und kognitiver Goldstandard zur Patienteneinteilung eingesetzt: NDD Cog Code = 3: Andere Demenzerkrankungen (oD);

MMSE < 25 und AvNDD_Scor < 1,0; (n = 3);

NDD_Cog_Code = 2: frühe Alzheimer-Krankheit (eAD);

MMSE < 25 und AvNDD_Score > 1,0; (n=15);

NDD Cog Code = 1 : inzipiente Alzheimer-Krankheit (iAD);

MMSE 25 - 30 und AvNDD_Score > 1,0; (n = 2);

NDD Cog Code - 0: keine Alzheimer-Krankheit (non AD bzw.

noAD): MMSE 25 - 30 und AvNDD Score < 1,0; (n = 18);

Fig. 7a: das spezielle A-beta-Peptid- Verhältnis 4/5 (Aß(l-42) / Aß(l-40));

log- Werte; Signifikanzwert: p = 0,132;

Fig. 7b: das spezielle A-beta-Peptid- Verhältnis 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42));

log- Werte; Signifikanzwert: p = 0,027

Fig. 7c: das spezielle A-beta-Peptid- Verhältnis 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40));

log- Werte; Signifikanzwert: p = 0,013.

Die nachfolgenden Figuren zeigen jeweils ein Streudiagramm (scatterplot) des avNDD_Score versus (a) Aß-Verhältnisse 4/5 (Aß(l-42) / Aß(l-40)), (b) 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)) und (c) 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40)). Im Einzelnen zeigt

Fig. 8a: ein entsprechendes Streudiagramm, wobei die Grenzlinie bzw. cut- i -Linie y = -0,8737 aus der ROC-Analyse für log4vs5, NDD Code = 1 herrührt (vgl. Fig. 6); die AvNDD Score- Grenzlinie wird frei auf x = 0,9 gesetzt, da eine AvNDD-Score > 1,0 einem Subjekt bzw. einer Testperson ein Risiko einer frühen oder inzipienten AD (d.h. NDD_Code=l) zuordnet;

Fig. 8b: ein weiteres Streudiagramm, wobei die Grenzlinie bzw. cut-off- Linie y = 1,0296 aus der ROC-Analyse für log4vsl4, NDD_Code=l herrührt (vgl. Fig. 6); die AvNDD Score-Grenzlinie wird frei auf x = 0,9 gesetzt, da eine AvNDD-Score > 1,0 einem Subjekt bzw. einer Testperson ein Risiko einer frühen oder inzi- pienten AD (d.h. NDD_Code=l) zuordnet;

Fig. 8c: Ein wiederum weiteres Streudiagramm, wobei die Grenzlinie bzw.

cut-off-Lm ^' ie y = 0,0938 aus einer ROC-Analyse für log4vsl5, NDD Code = 1 herrührt (vgl. Fig. 6); die AvNDD Score- Grenzlinie wird frei auf x = 0,9 gesetzt, da eine AvNDD-Score > 1,0 einem Subjekt bzw. einer Testperson ein Risiko einer frühen oder inzipienten AD (d.h. NDD_Code=l) zuordnet.

Die nachfolgenden Figuren stellen jeweils Streudiagramme (scatterplots) der NDD_SPECT_Score versus A-beta- Verhältnisse (a) 4/5 (Aß(l-42) / Aß(l- 40)), (b) 4/14 (Aß(l-42) / Aß(2-42)) und (c) 4/15 (Aß(l-42) / Aß(2-40)); bei einer Gruppengröße von n = 37 dar. Es zeigt im Einzelnen

Fig. 9a: zeigt ein entsprechendes Streudiagramm, wobei die Grenzlinie bzw. cut-off-Lm ^' ie y = -0,8737 aus der ROC-Analyse für log4vs5, NDD Code = 1 herrührt (vgl. Fig. 6); die NDD_SPECT_Score- Grenzlinie wird frei auf x = 2,9 gesetzt, da bei einer NDD_SPECT_Score > 3,0 nach dem klinischen Goldstandard eingeteilte bzw. klassifizierte Patienten überlappungsfrei separiert bzw. differenziert werden können;

Fig. 9b: zeigt ein weiteres Streudiagramm, wobei die Grenzlinie bzw. cut- off-Lm ^' ie y = 1,0296 aus der ROC-Analyse für log4vsl4, NDD Code - 1 (vgl. Fig. 6) stammt; die NDD SPECT Score- Grenzlinie wird frei auf x = 2,9 gesetzt, da bei einer NDD_SPECT_Score > 3,0 nach dem klinischen Goldstandard eingeteilte bzw. klassifizierte Patienten überlappungsfrei separiert bzw. differenziert werden können;

Fig. 9c: zeigt ein entsprechendes Streudiagramm, wobei die Grenzlinie bzw. cut-off-Lm ^' ie y = 0,0938 aus der ROC-Analyse für log4vsl5, NDD Code = 1 (vgl. Fig. 6) stammt; die NDD_SPECT_Score- Grenzlinie wird frei auf x = 2,9 gesetzt, da bei einer NDD_SPECT_Score > 3,0 nach dem klinischen Goldstandard eingeteilte bzw. klassifizierte Patienten überlappungsfrei separiert bzw. differenziert werden können. Tabelle 3 : Korrelationsmatrix (Spearman-Rho; beidseitige Signifikanzhöhe) von A-beta-Peptid- Verhältnissen im Blut, CSF-Demenz- Biomarkern, Alter, diagnostischem Goldstandard, kognitiven Parametern, neuro-bildgebenden Daten und ApoE-epsilon-4- Genotyp logratio logratio logratio AvNDD NDD SPECT 4vs5 4vsl4 4 vsl 5 Score Score corr. coeff. 1 ,000 ,472 ^** ,392 ^* -,258 -,172 logratio4vs5 sig. (2- 0,00160 0,01022 0,09953 0,3081 1

n 42 42 42 42 37 corr. coefF. 0,472" 1 ,000 0,593" -0,328 ^* -0,362 ^* logratio4vsl4 sig. (2- 0,00160 0,00003 0,03399 0,02758

n 42 42 42 42 37 corr. coeff. 0,392 ^* 0,593 ^* ' 1 ,000 -0,386 ^* -0,442 ^** logratio4vsl 5 sig. (2- 0,01022 0,00003 0,01 153 0,00619

n 42 42 42 42 37 corr. coeff. -0,258 -0,328 ^* -0,386 ^* 1 ,000 0,904 ^**

AvNDD Score sig. (2- 0,09953 0,03399 0,01 153 0,00000

n 42 42 42 42 37 corr. coeff. -0,172 -0,362 ^* -0,442" 0,904 ^** 1 ,000

NDD_SPECT_Score sig. (2- 0,3081 1 0,02758 0,00619 0,00000

n 37 37 37 37 37 corr. coeff. -0,374 ^* -0,456" -0,540" 0,397 ^** 0,512" logAGE sig. (2- 0,01473 0,00241 0,00023 0,00922 0,00120

n 42 42 42 42 37 corr. coeff. 0,212 0,071 -0,216 -0,101 -0, 107

Gender sig. (2- 0,17690 0,65594 0,16883 0,52514 0,53020

n 42 42 42 42 37

ApoE Code l corr. coeff. -0,251 -0,282 -0,430 ^** 0,391 ^* 0,310 sig. (2- 0,10857 0,07001 0,00452 0,01045 0,06185 n 42 42 42 42 37 corr. coeff. 0,146 -0,149 -0,289 0,223 0,312 logAßx40TGC sig. (2- 0,46772 0,45836 0,14407 0,26322 0,14751 n 27 27 27 27 23 corr. coeff. 0,254 -0,075 -0,203 -0,585" -0,628 ^** logAßx42TGC sig. (2- 0,27960 0,75273 0,39067 0,00674 0,00916 n 20 20 20 20 16 corr. coeff. 0,215 0,289 0,226 -0,844" -0,736 ^** logAßl 42Innx sig. (2- 0,17184 0,06312 0,14962 0,00000 0,00000 n 42 42 42 42 37 corr. coeff. 0,286 0,122 0,075 -0,878" -0,875" logAßratioTGC sig. (2- 0,22203 0,60896 0,75273 0,00000 0,00001 n 20 20 20 20 16 corr. coeff. 0,131 0,404 ^* 0,366 -0,786" -0,788 ^** logCSFratio

sig. (2- 0,51402 0,03686 0,06068 0,00000 0,00001 Aßl42vsAß40

n 27 27 27 27 23 corr. coeff. -0,247 -0,300 -0,438" 0,809" 0,787" logTotalTau sig. (2- 0,1 1425 0,05367 0,00376 0,00000 0,00000 n 42 42 42 42 37 corr. coeff. -0,375 ^* -0,471 " -0,343 0,866" 0,875 ^** logPhospho Taul 81 sig. (2- 0,04480 0,00984 0,06864 0,00000 0,00000 n 29 29 29 29 25 corr. coeff. 0,464" 0,270 0,254 -0,728" -0,71 1 ^** logMMSE sig. (2- 0,00332 0,10133 0,12369 0,00000 0,00000 n 38 38 38 38 35

NDD Cog _Code corr. coeff. -0,369 ^* -0,417" -0,315 0,749 ^** 0,760" sig. (2- 0,02254 0,00917 0,05379 0,00000 0,00000 n 38 38 38 38 35 corr. coeff. -0,238 -0,369 ^* -0,308 0,540 ^** 0,590 ^**

MRI_Score sig. (2- 0,14413 0,02072 0,05683 0,00039 0,00015 n 39 39 39 39 36 corr. coeff. -0,067 -0,281 -0,376' 0,640 ^** 0,868 ^**

SPECT_Score sig. (2- 0,69445 0,09261 0,02176 0,00002 0,00000 n 37 37 37 37 37