BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues therapeutisches oder diagnostisches Mittel, das als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure enthält, und insbesondere zur Diagnose oder/und Therapie von Tumoren geeignet ist.

Proteine, die eine Homöobox enthalten, spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von vielzelligem diffenziertem Gewebe. Man nimmt an, daß die transkriptionale Regulation durch die Homöoboxproteine die genaue räumliche und zeitliche Abfolge von Wachstum und Differenzierung in dem sich ent¬ wickelnden Embryo koordiniert. Aus der Literatur (sie z.B. K. Kongsuwan, J.M. Adams, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 1881- 1891; C. Blatt, D. Aberdam, R. Schwartz, L. Sachs, EMBO J. 7 (1988), 4283-4290; C. Blatt, Cancer Cells 2 (1990), 186-189; T.H. Rabbitts Cell 647 (1991), 641-644; A.W. Sasaki, J. Doskow, C.L. Macleod, M.B. Rodgers, L.J. Goudas, M.F. Wilkinson, MOD34 (1991), 155-164) ist bekannt, daß einige Homöobox-enthaltende Gene mit der Onkogenese in Zusammenhang stehen.

Eine Multigenfamilie, die ein gemeinsames konserviertes Se¬ quenzmotiv, die "Paired"-Box aufweist, steht ebenfalls mit der Entwicklungskontrolle und der Gewebespezifität in ver¬ schiedenen Organismen im Zusammenhang. Die von der "Paired"- Box kodierte "Paired"-Domäne stellt eine DNA-bindende Domäne dar (J. Treisman, E. Harris, C. Desplan, Genes.Dev. 5 (1991), 594-604; G. Chalepakis, R. Fritsch, H. Fickenscher, 0. Deutsch, M. Goulding, P. Gruss, Cell 66 (1991), 873-884) und wurde in verschiedenen Organismen, wie etwa Drosophila, Maus,

Schildkröte, Zebrafisch, Nematoden und Menschen identifi¬ ziert. Ein Zusammenhang der "Paired"-Domäne mit der Onkogene- se war bisher nicht bekannt.

In der medizinischen Forschung werden große Anstrengungen auf die Bereitstellung neuer therapeutischer und diagnostischer Mittel im Zusammenhang mit der Entstehung von Tumoren unter¬ nommen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereit¬ stellung eines neuen Mittels, das insbesondere zur Diagnose und Therapie von Tumoren geeignet ist.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Tumordiagnostik oder/und Tumor¬ therapie gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Wirksubstanz, die

(a) mindestens eine Nukleinsäure, die mit einem Pax-Gen hybridisiert,

(b) mindestens ein Pax-Protein, oder/und

(c) mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein oder ein Derivat davon enthält, gegebenenfalls mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Verdünnungsmitteln formuliert.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Pax-Proteine, d.h. Proteine, welche die "Paired"-Domäne enthalten, die Onkogenese fördern können und somit als neue Gruppe von star¬ ken Onkoproteinen klassifiziert werden können, welche die Zellproliferation, das Verankerungs-unabhängige Wachstum und die Angiogenese induzieren. Es wurde festgestellt, daß mit Pax-Genen transformierte Zellen alle klassischen Malignitäts- erkmale, wie z.B. Kontaktinhibierung im "Focusassay", Wachs¬ tum in Weichagar und Tumorinduzierung in der Nacktmaus zeigten.

Das erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Mittel kann somit als molekulare Sonde in der Tumordiagnostik einge¬ setzt werden, da die Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einer für ein Pax-Protein kodierenden Nukleotidsequenz hybri¬ disiert, eine qualitative und quantitative, zell- und gewebs- spezifische Bestimmung der Expression des jeweiligen Pax-Gens ermöglicht.

Das erfindungsgemäße Mittel ist jedoch auch als Antisense- Nukleinsäure zur spezifischen Hemmung der Expression von Genen, welche die Pax-Sequenz enthalten, und somit auch als therapeutisches Mittel geeignet.

Ein erfindungsgemäßes Mittel muß zum diagnostischen Nachweis oder/und zur therapeutischen Behandlung mindestens eine Nu¬ kleinsäure enthalten, welche eine Bindung mit einem Pax-Gen eingeht. Vorzugsweise hybridisiert die erfindungsgemäße Nu¬ kleinsäure unter "stringenten Bedingungen" an ein Pax-Gen. Stringente Bedingungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind als solche Bedingungen definiert, die eine selektive und nachweisbare spezifische Bindung der Nukleinsäure an ein be¬ stimmtes oder mehrere Pax-Gene oder Pax-Transkripte ermögli¬ chen. Eine derartige Hybridisierung unter stringenten Bedin¬ gungen bedeutet vorzugsweise, daß nach einer Hybridisierung bei 68°C in einer wäßrigen Lösung oder bei 42°C in 50 % Form- a id und anschließendem Waschen des Filters bei 65°C in einer wäßrigen Lösung noch eine Bindung der Sonde an das Pax-Gen oder die Pax-RNA nachweisbar ist. Bei Verwendung von kürzeren Nukleinsäuren als Sonden kann es jedoch erforderlich sein, weniger drastische Hybridisierungs- oder/und Waschbedingungen zu verwenden.

Das erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Mittel enthält vorzugsweise als Wirksubstanz mindestens eine Nu-

kleinsäure, die (a) die für ein Pax-Protein kodierende Nu¬ kleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedin¬ gungen hybridisierende (siehe oben) Nukleotidsequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komple¬ mentäre Nukleotidsequenz umfaßt.

Wenn gewünscht wird, daß die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus einem konservierten Bereich des Pax-Gens, d.h. aus der für die "Paired"-Domäne kodierenden Nukleotidsequenz stammen soll, verwendet man vorzugsweise eine Nukleinsäure, die (a) eine für die Aminosäuren 1 bis 74 einer "Paired"-Domäne ko¬ dierende Nukleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform für den obigen Zweck enthält das erfindungsgemäße Mittel mindestens eine Nukleinsäure, die (a) eine für die Aminosäuren 5 bis 19, 35 bis 41, 68 bis 74, 95 bis 100 oder/und 115 bis 120 einer "Paired"-Domäne kodierende Nukleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidse¬ quenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a) , (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.

Die voranstehend genannte Nomenklatur der Aminosäuren richtet sich dabei nach der Arbeit Walther et al., Genomics 11 (1991), 424-434, insbesondere Figur 2, die hiermit durch Bezugnahme zu einem Teil der Beschreibung wird.

Wenn es jedoch erforderlich ist, ein einziges Pax-Gen spezi¬ fisch nachzuweisen oder zu hemmen, wird man zweckmäßigerweise

eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz aus einem nicht- konservierten Bereich des jeweiligen Gens verwenden, d.h. vorzugsweise aus dem nicht für die "Paired"-Domäne kodieren¬ den Bereich.

Das erfindungsgemäße Mittel enthält eine Nukleinsäure, die aus einem beliebigen Pax-Gen stammt. Beispiele für geeignete Pax-Gene sind Pax-1 (Deutsch et al., Cell 53 (1988), 617- 625), Pax-2 (Dressler et al., Development 109 (1990), 787- 795; Nornes et al., Development 109 (1990), 797-809), Pax-3 (Goulding et al., EMBO J. 10 (1991), 1135-1147), Pax-4, Pax-5 und Pax-6 (Walther et al. (1991), supra), Pax-7 (Jostes et al., MOD 33 (1990), 27-38), Pax-8 (Plachov et al., Develop¬ ment 110 (1990), 643-651), HuPl, HuP2, HuP48 (Burri et al., EMBO J. 8 (1989), 1183-1190), prd, BSH4 und BSH9 (Bopp et al., Cell 47 (1986), 1033-1040) und Pox neuro und Pox meso (Bopp et al., EMBO J. 8 (1989), 3447-3457). Die oben genann¬ ten Literaturstellen werden durch Bezugnahme zu einem Teil der Beschreibung. Besonders bevorzugt sind menschliche Pax- Gene.

Die Nukleinsäure in dem erfindungsgemäßen Mittel ist - je nach Erfordernis - vorzugsweise eine unmodifizierte oder modifizierte DNA oder RNA. Auch die Länge der Nukleinsäure richtet sich nach dem jeweiligen Anwendungsgebiet.

Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels als molekulare Sonde in der Tumordiagnostik handelt es sich vorzugsweise um eine DNA-Sonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise 12 bis 50 Nukleotiden. Weiterhin ist es bevor¬ zugt, daß die Nukleinsäure eine radioaktive oder nicht-radio¬ aktive Markierung trägt, die zum Nachweis der Bindung an ein Pax-Gen dient.

Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels als Antisense- Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression handelt es sich vorzugsweise um eine RNA, die gegebenenfalls modifizierte Basen enthalten kann, um ihre Stabilität im Körper gegenüber einem Abbau durch Ribonukleasen zu erhöhen.

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels als molekulare Sonde oder/und als therapeutisches Mittel zur Hemmung der Genexpression erfolgt auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannte Weise.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirksubstanz mindestens ein Pax-Protein enthält. Das Pax-Protein ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, HuP48, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro und Pox meso ausgewählt. Die Aminosäuresequenz dieser Proteine ist aus den oben genannten Veröffentlichungen ersichtlich, die in Zu¬ sammenhang mit der Nukleinsäuresequenz genannt worden sind. Besonders bevorzugt sind menschliche Pax-Proteine.

Das Mittel wird vorzugsweise in der Tumordiagnostik oder/und Tumortherapie verwendet.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel, welches da¬ durch gekennzeichnet ist, daß es als Wirksubstanz mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein enthält. Bevorzugt sind Antikörper, die gegen ein oder mehrere Pax-Proteine aus der Gruppe bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, HuP48, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro und Pox meso gerichtet sind. Besonders bevorzugt sind Antikörper gegen menschliche Pax-Proteine.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind vorzugsweise monoklo- nale Antikörper, die auf bekannte Weise nach der Köhler- Millstein-Methode durch Immunisierung eines Versuchstieres, vorzugsweise einer Maus, mit dem entsprechenden Pax-Protein oder/und einem Gemisch von Pax-Proteinen, Gewinnung von Anti- körper-produzierenden B-Zellen oder Milzzellen aus dem immu¬ nisierten Versuchstier und anschließender Fusionierung der Antikörper-produzierenden Zellen mit einer geeigneten Leukä¬ miezelle zur Erzeugung von Hybridomen erhältlich sind. Beispiele für geeignete Antikörper sind Pax-1, Pax-2- und Pax-6-Antikörper (Abb.2).

Die erfindungsgemäßen Antikörper können vorzugsweise in vitro oder/und in vivo als Mittel in der Tumordiagnostik oder/und Tumortherapie verwendet werden. Dabei können die Antikörper auch als Fragmente (z.B. Fab oder F(ab) ₂ Fragmente) und gege¬ benenfalls gekoppelt an eine nachweisbare Gruppe (Enzym, Fluoreszenzmarker, radioaktiver Marker, Kernresonanzmarker etc.) oder an ein Toxin (z.B. Rizin, Diphterietoxin etc.) verwendet werden. Die Herstellung derartiger Antikörper-Deri¬ vate erfolgt auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Immuno¬ logie bekannte Weise (z.B. durch kovalente Kopplung über einen bi-funktionellen Linker).

Das folgende Beispiel dient in Verbindung mit Abb. 1 und 2 zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung.

Abb. 1 zeigt den schematischen Aufbau der untersuchten Pax- Proteine Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-6 und Pax-8 sowie des muta- genisierten Pax-Proteins Un.

Abb. 2 zeigt Westernblots von Pax-Protein exprimierenden Zellextrakten nach Inkubation mit spezifischen Antikörpern und enzymatischem Nachweis der Antikörper-Protein-Bindung.

Beispiel

1. Untersuchte Pax-Proteine

Es wurde die Wirkung der Proteine Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-6 und Pax-8 sowie einem mutagenisierten Pax-Protein (Un) unter¬ sucht. In Abbildung 1 ist die schematische Struktur dieser Pax-Proteine gezeigt. Die konservierten Domänen innerhalb der Proteine sind als Balken gezeigt, die auch ihre annähernden Positionen innerhalb der offenen Leserahmen angeben. Pax-1 ist das einzige Pax-Protein, von dem ein vollständiges Fehlen der Homöodomäne bekannt ist. Pax-3 und Pax-6 enthalten voll¬ ständige Homöodomänen zusätzlich zur "Paired"-Domäne. Beide DNA-Bindungsmotive sind durch mindestens 100 Aminosäuren voneinander getrennt. Die Proteine Pax-2 und Pax-8 enthalten nur 23 Aminosäuren der α-Helix der Homöodomäne. Die Punktmu¬ tation von G zu A in dem für das Un-Protein kodierenden Gen ist durch den resultierenden Austausch von Gly nach Ser ge¬ kennzeichnet. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind für Pax-1 bei Deutsch et al. (Cell 53 (1988), 617-625), für Pax-2 bei Dressler et al. (Development 109 (1990), 787-795), für Pax-3 bei Goulding et al. (EMBO J. 10 (1991), 1135-1147), für Pax-6 bei Walther und Gruss (Development 113 (1991), 1435- 1439) und für Pax-8 bei Plachov et al. (Development 110 (1990), 643-651) offenbart.

2. Transformationstest

Die Pax-cDNAs wurden in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pCMV5 (Anderson et al., J.Biol.Chem. 264 (1989), 8222-8229) insertiert. Diese Konstrukte wurden zusammen mit pGKneo als selektierbarer Marker (Soriano et al., Cell 64 (1991), 693-702) in 208- und NIH 3T3-Zellen kotransfiziert. Die 208-Zellen wurden in DMEM (Biochrome) und Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (Boehringer Mannheim) kultiviert. Die NIH

3T3-Zellen wurden in DMEM mit 5 % neugeborenem Kälberserum (Boehringer Mannheim) kultiviert. 2 μg des jeweiligen pCMV- Pax-Expressionsplasmids wurden zusammen mit 1 μg pGKneo und 7 μg Träger-DNA auf 70 % konfluenten Einzelzellschichten einer 100 mm Gewebekulturplatte unter Verwendung der Calciumphos- phatmethode mit Modifikationen (Weber und Schaffner, Nature 315 (1984), 75-77) transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden nach 24 Stunden in drei Gruppen aufgeteilt. Eine Grup¬ pe wurde für 2 bis 4 Wochen abhängig vom Anfang der Focusbil- dung stehengelassen. Danach wurden die Zellen mit einigen Tropfen Glutaraldehyd (Sig a) und mit 1 % Methylenblau (Sig- ma) in Wasser angefärbt. Die Gewebekulturplaten wurden mit Wasser gespült und die Foci gezählt.

Ein weiteres Drittel der Zellen wurde entweder in 0,6 %, 0,9 % oder 1,2 % Weichagar ausgesät, wie bei Fidler et al., Anti- cancer Res. 11 (1991), 17-24 beschrieben ist. Das verbleiben¬ de Drittel wurde zur DNA-Aufnähme durch Zugabe von G418 (Gibco) 24 Stunden nach dem Schock für die Zellen ausgewählt. Bei den 208-Zellen wurden 0,4 mg/1 und bei den NIH 3T3-Zellen 0,6 mg/ml G418 zugesetzt. Die morphologisch transformierten Foci wurden gepickt und danach kultiviert. Diese Zellisolate wurden durch kontinuierliche Inkubation im Selektionsmedium vermehrt und für die Expressionsanalyse und die Transforma- tionstests verwendet.

3. Ergebnisse der Transformationstests

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse einer Transformation von 208-Zellen mit Pax-Proteinen gezeigt. Die linke Spalte listet die DNAs auf, die in die Zellen eingeführt wurden. pCMV be¬ deutet Zellen, die nur das pCMV-Konstrukt als negative Kon¬ trolle enthalten, pSV ist das als positive Kontrolle verwen¬ dete T-Antigen (SV40-Virus) Expressionskonstrukt. Die ver¬ schiedenen pCMV-Pax-Expressionskonstrukte sind durch den

Namen des Pax-Proteins angegeben, das sie exprimieren. Das Wachstum der Zellen wurde in 0,6 %, 0,9 % und 1,2 % Weichagar getestet. Die Zellkolonien wurden 2 bis 3 Wochen nach dem Plattieren gezählt. Die Experimente wurden für jeden Zelltyp mindestens 2 mal durchgeführt. + bedeutet Wachstum in Weich¬ agar. - bedeutet kein Wachstum. +- bedeutet widersprechende Ergebnisse in zwei Experimenten.

Die nächste Spalte listet auf, ob die entsprechenden trans¬ formierten Zellen in der Lage waren, bei Vermischen mit nor¬ malen 208-Zellen eine Focusbildung zu induzieren oder nicht. Dieses Mischexperiment wurde 2 mal ausgeführt.

Die letzte Spalte zeigt die Anzahl von injizierten Nacktmäu¬ sen und die Anzahl von Injektionen, die zu einer Tumorbildung führten. Männliche nackte NMRI Mäuse wurden hierzu subkutan in der Flanke im Alter von 4 Wochen mit 1 bis 5 x 10 ⁵ trans¬ formierten Zellen injiziert. Die Zellen wurden vor der Injek¬ tion trypsinisiert und 2 x mit Phosphat-gepufferter Salzlö¬ sung gewaschen, um stimulierende Effekte aus dem Serum auszu¬ schließen. Die Tiere wurden für maximal 3 Monate auf einer wöchentlichen Basis auf die Bildung von Tumoren untersucht.

Tabelle 1

Transfizierte Weichagar-Test Focus- Tumorigenizität DNA test Anzahl von Injektio¬ nen/Anzahl von Tumo¬ ren in Nacktmäusen

0,6% 0,9% 1,2%

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen das onkogene Potential der Pax-Gene bzw. der "Paired"-Domäne. Bei dem Test, der die unterschiedlichen Pax-Proteine exprimierenden Klone in Weich¬ agar mit unterschiedlichen Konzentrationen zeigt, kann das Wachstum der ansteigenden Weichagarkonzentrationen mit der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tumoren in Beziehung gesetzt werden. Zellen, die nur den pCMV-Expressionsvektor enthielten, zeigten bei 0,6 % Weichagar und mehr kein Wachs¬ tum. Zellen, die das Pax-1-, Pax-2-, Pax-3-, Pax-6- bzw. Pax- 8-Protein exprimierten, konnten hingegen bei Konzentrationen bis zu 1,2 % Weichagar wachsen. Ein Wachstum in diesem halb¬ festen Medium zeigt, daß die Pax-Proteine den Zellen die Fähigkeit zum Verankerungs-unabhängigen Wachstum verleihen. Das mutierte Un-Protein war zu einer vollständigen Transfor¬ mation dieser Zellen nicht in der Lage, wie durch das Fehlen

von Verankerungs-unabhängigem Wachstum bei höheren Weichagar- Konzentrationen ersichtlich ist.

Die durch Injektion von pCMV-Pax-Expressionskonstrukten er¬ zeugten Tumore wurden durch Standard in situ Hybridisierungs- protokolle (Goulding, EMBO J. 10 (1991), 1135-1147) analy¬ siert. Die Zellen in den Pax-Tumoren sind spindelförmig. Die Tumore sind gut mit Gefäßen versorgt und zeigen eine starke extrazelluläre Matrixproduktion. Alle Tumore waren fest und verkapselt.

Weiterhin wurde ein Methylenblau-Test durchgeführt, um die Fähigkeit der Zellen zur Überwindung der Kontakthemmung zu bestimmen. Dieser Test wurde 2 mal in unbehandelten Zellen nach Trans ektion durchgeführt. Zellen, welche die transfor¬ mierende DNA aufgenommen haben, sind in der Lage, nicht transformierte Zellen zu überwachsen, was in dunkel markier¬ ten Zellfoci resultiert. In den mit Pax-Genen transformierten Zellen wurden - wie in der positiven Kontrolle mit pSV - die Bildung von Zellfoci beobachtet, während in den mit der nega¬ tiven Kontrolle pCMV transformierten Zellen und in den nicht transformierten Zellen (208- und NIH 3T3-Zellen) deutlich weniger Foci sichtbar waren.

Die Ergebnisse des Weichagar-Tests stehen mit dem Auftreten von stark gefärbten Foci im Methylenblau-Test bei 208- und NIH 3T3-Zelltransfektionen unter Verwendung von Pax-Protei- nen, die funktionelle "Paired"-Domänen enthalten, und der Tumorentstehung in der Nacktmaus im Einklang.

4. Immunologischer Nachweis der Pax-Expression in transfi- zierten Zellen

Aus den nach Punkt 2 transfizierten NIH 3T3- und 208-Zellen wurden nach bekannten Protokollen (Balling et al., Cell 55, (1988), 531-535) Gesamtzellextrakte hergestellt. Nach Be¬ stimmung der Proteinkonzentration wurden jeweils 50 μg der Zellextrakte auf einem 12,5 % SDS-Polyacrylamidgel aufge¬ trennt und auf eine Immobilon-P-Membran durch halbtrockenen elektrischen Transfer überführt. Die Membran wurde in 5 % Trockenmilchpulver/phosphatgepufferter Salzlösung blockiert und über Nacht mit einer 1:200-Verdünnung der jeweiligen Pax- Antikörper inkubiert und mit der Peroxidase/Diaminobenzidin- Reaktion entwickelt (Balling et al., Supra) . Aus Abb. 2 ist ersichtlich, daß Antikörper gegen Pax-1, Pax-2, Pax-3 und Pax-6 eine Reaktion mit den entsprechenden transfizierten Zellen zeigten. Der Pax-2-Antikörper zeigte eine Kreuzreak¬ tion mit Pax-8 und ermöglichte eine Bestätigung der Pax-8- Expression mit den jeweiligen Zellextrakten (nicht darge¬ stellt) . Das Molekulargewicht der Pax-Proteine wurde durch Vergleich mit dem Regenbogen-Proteinmarker (Amersham) be¬ stimmt. Das scheinbare Molekulargewicht der Proteine ist in kD angegeben. Sowohl 208- als auch NIH 3T3-Zellextrakte ent¬ hielten etwa ähnliche Mengen der jeweiligen Pax-Proteine pro 50 μg Zellextrakt. Dies zeigt an, daß der CMV-Promotor in beiden Zellinien gleichermaßen gut funktioniert. Der Western- blot von Pax-1 zeigt, daß Pax-1 und das mutierte Un-Protein in etwa gleichen Mengen exprimiert werden. Ein weiterer Zell¬ extrakt, der durch Transfektion von Zellen mit einem pSV40 Promotor/Pax-1-Konstrukt hergestellt worden war, enthielt noch höhere Mengen des Pax-Proteins. In allen Fällen zeigten die Westernblots, daß mit pCMV transfizierte Kontrollzellen sehr viel weniger oder keine nachweisbaren Mengen an Protein erzeugten.