Optisches Übertragungssvstem und Mikroskop mit einem solchen Übertraqungssystem

Die Erfindung betrifft ein optisches Übertragungssystem mit mindestens einer Linse, welches einen ausgewählten Bereich einer Probe, welche in einem ersten Medium in einer Objektebene auf oder in einem m indestens teilweise als planparallele Platte ausgebildeten Probenträger angeordnet ist, aus der Objektebene in eine Zwischenbildebene in einem zweiten Medium abbildend ausgestaltet ist. Bei der Abbildung befindet sich die planparallele Platte zwischen dem optischen Übertragungssystem und dem Bereich der Probe, die Objektebene und die Zwischenbiidebene schließen m it einer optischen Achse des Übertragungssystems einen Winkel zwischen 0° und 90° ein, wobei auch die das Intervall begrenzenden Winkel eingestellt werden können. Die Abbildung durch das optische Übertragungssystem kann optional objekttreu erfolgen, was bedeutet, dass das Ü bertrag ungssystem im Zusammenspiel m it den Medien in einem vorgebebenen Volumenbereich eine sowohl in der Tiefe als auch in der lateralen Ausdehnung maßstabsgetreue Abbildung realisiert. Der Maßstab der Abbildung ergibt sich dabei aus dem Verhältnis der Brechungsindizes der beiden Medien zueinander, d.h. die Vergrößerung beträgt M = ni/n ₂ , wobei n-, der Brechungsindex des ersten Mediums und n ₂ der Brechungsindex des zweiten Mediums ist.

Im Stand der Technik sind verschiedene mikroskopische Verfahren bekannt, bei denen eine auf einem Probenträger oder in einem abgedeckten Probengefäß befindliche Probe so beobachtet wird, dass das Licht nicht senkrecht durch den Probenträger oder die Abdeckung des Probengefäßes, die in diesem Bereich, durch den das Licht durchtritt, in der Regel die Eigenschaften einer planparallelen Platte aufweisen, sondern schräg hindurchtritt - die Objektebene, d.h. die Fokusebene des für die Beobachtung verwendeten Objektivs, schließt mit der Ebene, in der die Großflächen der planparallelen Platte liegen, einen von Null verschiedenen Winkel ein. Dies führt zu Ungenauigkeiten bei der Abbildung, schon bei geringen numerischen Aperturen wie NA = 0,3 - in Wasser - kommt es zu extremen Abbildungsfehlern wie beispielsweise zur sphärischen Aberrationen und zu Koma. Mit Standardobjektiven allein lässt sich dann bei den geforderten hohen Auflösungen keine zufriedensteiiende Bildgebung mehr erreichen. Ein Verfahren, bei dem solche, durch schrägen Lichtdurchtritt verursachte Aberrationen für bestimmte Aufbauten auftreten, ist die Lichtblattmikroskopie. Lichtblattmikroskope werden insbesondere bei der Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt. Die Beleuchtung der Probe erfolgt dabei mit einem Lichtblatt, dessen Ebene die optische Achse der Detektion in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet. Die Objektive sind jeweils in einem Winkel von 45° zur Normalen der Großflächen der planparallelen Platte von oben oder unten auf die Probe gerichtet. Ein solcher Aufbau wird beispielsweise in der WO 2012/1 10488 A2 und in der WO 2012/112027 A2 beschrieben. Üblicherweise schließt das Lichtblatt mit der Detektionsrichtung, welche in der Regel der optischen Achse des Detektionsobjektivs entspricht, einen rechten Winkel ein. Mit dieser auch aus SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichneten Technik lassen sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zur Schnittebene ist eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich.

Die SPIM-Technik wird bevorzugt in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, dort wird sie als LSF (Light Sheet Fluorescence Microscopy) bezeichnet. Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen- Mikroskopie weist die LSFM-Technik mehrere Vorzüge auf: Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM- Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesem Verfahren am geringsten, was unter anderem die Gefahr des Ausbleichens einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel beleuchtet wird.

Dabei kann sowohl ein statisches Lichtblatt, welches beispielsweise mit Hilfe von Zylinderlinsen erzeugt wird, verwendet werden, als auch ein quasi-statisches Lichtblatt. Letzteres kann erzeugt werden, indem die Probe mit einem Lichtstrahl schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, indem der Lichtstrahl einer schnellen Relativbewegung zu der beobachteten Probe unterworfen wird, und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinandergereiht wird. Dabei wird die Integrationszeit der Kamera, auf deren Sensor die Probe letztendlich abgebildet wird, so gewählt, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird. Anstelle einer Kamera mit einem zweidimensionalen Sensorfeld kann auch ein Zeilensensor in Kombination mit einem erneuten Abtasten in der Detektionsoptik verwendet werden. Die Detektion kann außerdem auch konfokal erfolgen.

Die SPIM-Technik ist in der Literatur inzwischen vielfach beschrieben, beispielsweise in der DE 102 57 423 A1 und der darauf aufbauenden WO 2004/053558 A1 oder in dem Übersichtsartikel „Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biotogy" von J.Huisken et at., erschienen im Jahr 2009 in der Zeitschrift Development, Bd. 136, S. 1963.

Eine der Hauptanwendungen der Lichtblattmikroskopie liegt in der Bildgebung mittelgroßer Organismen mit einer Größe von einigen 100 μιτι bis hin zu wenigen mm . in der Regel werden diese Organismen in ein Agarose-Gel eingebettet, welches sich wiederum in einer Glaskapillare befindet. Die Glaskapillare wird von oben bzw. von unten in eine wassergefüilte Probenkammer eingebracht und die Probe ein Stück aus der Kapiiiare herausgedrückt. Die Probe in der Agarose wird mit einem Lichtblatt beleuchtet und die Fluoreszenz mit einem Detektionsobjektiv, das senkrecht zum Lichtblatt und damit auch senkrecht zur Lichtblattoptik steht, auf den Detektor einer Kamera abgebildet.

Diese Methode der Lichtblattmikroskopie hat drei große Nachteile. Zum einen sind die zu untersuchenden Proben relativ groß, da sie aus der Entwicklungsbiologie stammen. Aufgrund der Probenpräparation und der Abmessungen der Probenkammer ist zudem das Lichtblatt relativ dick und somit wird die erzielbare axiale Auflösung eingeschränkt. Schließlich ist auch die Probenpräparation aufwendig und nicht kompatibel zu Standard-Probenpräparationen und Standard-Probenhalterungen, wie sie in der Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung einzelner Zellen üblich sind.

Um diese Einschränkungen zumindest teilweise umgehen zu können, wurde in den letzten Jahren ein SPIM-Aufbau realisiert, bei dem das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv senkrecht zueinander stehen und unter einem Winkel von jeweils 45° zu der Normalen einer Bezugsfläche von oben auf die Probe gerichtet sind. Ein solcher Aufbau wird beispielsweise in der WO 2012/1 10488 A2 und in der WO 2012/1 2027 A2 beschrieben.

Die Probe befindet sich bei solchen Aufbauten beispielsweise auf den Boden einer Petrischale, weiche mit Wasser gefüllt ist. Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv werden in die Flüssigkeit eingetaucht, das Wasser übernimmt auch die Funktion einer Immersionsflüssigkeit. Dieser Ansatz bietet den Vorteil einer höheren Auflösung in axialer Richtung, da ein dünneres Lichtblatt erzeugt werden kann. Aufgrund der höheren Auflösung können dann auch kleinere Proben untersucht werden. Auch ist die Probenpräparation bedeutend einfacher geworden. Dennoch entsprechen Präparation und Halterungen für die Proben weiterhin noch nicht dem Standard, wie er in der Fluoreszenzmikroskopie bei einzelnen Zellen derzeit gilt: So muss die Petrischale relativ groß sein, damit die beiden Objektive in die Schale eingetaucht werden können, ohne an den Rand der Schale anzustoßen. Mikrotiterplatten - auch als Multi-Well- Platten bezeichnet - sind der Standard in vielen Bereichen der Biologie und werden gerade auch bei der fluoreszenzmikroskopischen Analyse einzelner Zellen eingesetzt, können mit dem beschriebenen Verfahren jedoch nicht verwendet werden, da die Objektive nicht in die sehr kleinen Vertiefungen, welche rasterförmig auf der Platte angeordnet sind, eintauchen können. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass mit diesem Aufbau eine Analyse einer Vielzahl von Proben in kurzer Zeit - ein sogenanntes High-Throughput-Screening - nicht ohne weiteres möglich ist, da die Objektive beim Wechseln der Probe gereinigt werden müssen, um Kontaminierungen der verschiedenen Proben zu vermeiden.

Ein Weg zur Beseitigung dieser Nachteile liegt darin, auf der einen Seite die Konfiguration der Winkel von jeweils 45° beizubehalten, aber die beiden Objektive nicht von oben auf die Probe zu richten, sondern nach Art eines inversen Mikroskops von unten, wo Beleuchtung und Deiektion dann durch den transparenten Boden des Probengefäßes oder allgemein des Probenträgers erfolgen. Äquivalent kann die Detektion auch weiterhin von oben erfolgen, sofern das Probengefäß mittels eines transparenten Deckels abgedeckt ist. Auf diese Weise können alle typischen Probengefäße, wie beispielsweise Mikrotiterplatten, Petrischalen und Objektträger benutzt werden, insbesondere eine Kontaminierung der Proben bei einer Analyse mit hohem Durchsatz ist nicht mehr möglich.

Jedoch kommt es aufgrund der Tatsache, dass das Beobachtungs- oder Detektionslicht durch den Probenträger oder sein Deckglas hindurchtreten muss, schon bei geringen numerischen Aperturen wie NA = 0,3 in Wasser zu extremen Abbildungsfehlern, wie beispielsweise sphärischer Aberration, Koma und Astigmatismus aufgrund dieses schrägen Durchgangs. Eine korrekte Bildgebung bei der Nutzung von Standardobjektiven ist auf diese Weise nicht mehr möglich.

Im Stand der Technik sind verschiedene Ansätze beschrieben, wie man das Problem der Aberrationen bei schiefem Lichtdurchtritt lösen kann, wobei das Lichtblattmikroskop nur eine von mehreren mikroskopischen Anordnungen ist, bei der schräger Lichtdurchtritt eine Rolle spielt, schräger Lichtdurchtritt kann beispielsweise auch bei materialmikroskopischen Anwendungen von Bedeutung sein. In der deutschen Patentanmeldung Nr. 10 2013 107 297.6 wird vorgeschlagen, Korrekturmittel in Form von Korrekturlinsen oder Linsengruppen in das jeweilige Mikroskopobjektiv zu integrieren. Als Korrekturlinsen werden dort beispielsweise Zylinderiinsen, gegen die optische Achse verkippte Linsen oder nicht axial angeordnete Linsen vorgeschlagen, wobei die Korrekturlinsen auch solche Elemente mit asphärischen Flächen oder mit Freiformflächen umfassen. Zusätzlich werden für den Objektträger Materialien verwendet, die annähernd den Brechungsindex des Immersionsmediums haben, wobei zur Beseitigung weiterer Fehler adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- und / oder des Detektionslichtes vorgeschlagen werden. Dies hat jedoch zur Folge, dass die Objektive mindestens teilweise neu entworfen werden müssen, es handelt sich also um eine recht aufwendige Lösung. In der US 2011/0261446 A1 wird ein Aufbau beschrieben, welcher ein Übertragungssystem beschreibt, welches aus einer spiegelsymmetrischen Aneinanderkopplung zweier abbildender Systeme besteht. Die beiden abbildenden Systeme sind bezüglich ihrer optischen Elemente spiegelsymmetrisch angeordnet, wobei die Spiegelebene der ursprünglichen Bildebene des ersten abbildenden Systems entspricht, bei der bei schrägem Lichtdurchtritt der beleuchtete Bereich der Probe im Bild die Bildebene schräg schneidet. Die Vergrößerung des Übertragungssystems wird so gewählt, dass sie dem Verhältnis der Brechzahlen eines ersten Mediums, in dem sich die Probe befindet, zu einem zweiten Medium, in dem das Zwischenbild lokalisiert ist, entspricht. Die Objektebene kann auf diese Weise bezüglich der Zwischenbildebene unverzerrt und nur unwesentlich vergrößert dargestellt werden. Um eine vergrößerte Darstellung der Probe zu erhalten, wird ein Mikroskopobjektiv so positioniert, dass seine optische Achse senkrecht auf der Zwischenbildebene steht und das Mikroskopobjektiv auf die Zwischenebene fokussiert ist. Auf diese Weise kann eine unverzerrte Abbildung der Probe, d.h. eine Abbildung frei von Aberrationen mit einer vom Mikroskop abhängigen Vergrößerung auf einen Detektor erfolgen.

Diese Vorgehensweise, ein Übertragungssystem zu verwenden, wird in der deutschen Patentanmeldung 10 2013 107 297.6 weiter verbessert, indem die Verwendung von katadioptrischen Linsen vorgeschlagen wird. Auf diese Weise kann die Anzahl der für das Übertragungssystem verwendeten Linsen reduziert werden, die Baueinheit kann kompakter gestaltete werden. Zusätzlich wird noch die Verwendung eines zweiten Mediums vorgeschlagen, in welchem sich die Zwischenbildebene befindet, und welches ebenfalls mit dem Übertragungssystem in Kontakt steht, so dass es als Immersionsmittel wirkt. Auch diese Lösung verwendet jedoch noch eine Vielzahl von Linsen, aufgrund der Größe des Übertragungssystems ist auch hier eine Integration in bestehende Aufbauten nur schwer möglich. Grundsätzlich können bei der Verwendung eines solchen Übertragungssystems jedoch bereits vorhandene Objektive weiterbenutzt werden.

Andererseits ist es möglich, Abbildungsfehler bereits mit sehr wenig Linsen zu korrigieren, wie beispielsweise in der US 4,412,723 beschrieben ist. Dort ist eine einzige Linse beschrieben, die ausreicht, Abbildungsfehler, die entstehen, wenn die Objektebene nicht parallel zu einer Großfläche eines Strahlteilers liegt, das Licht also unter einem von Null verschiedenen Winkel durch diesen Strahlteiler tritt.

Fasst man den Strahlteiler, der als planparallele Platte ausgestaltet ist, als Probenträger auf, so ist diese einzelne Korrekturlinse jedoch zwischen dem Bereich der Probe, der abgebildet werden soll, also der Objektebene oder auch Fokusebene, und dem Probenträger bzw. dem Deckglas angeordnet. Zudem befinden sich bei der in der US 4,412,723 vorgeschiagenen Lösung Probe, Korrekturlinse und Probenträger in dem Medium Luft. Bei der Mikroskopie an Proben kleinster Größe, wie beispielsweise einzelnen Zellen, insbesondere aber bei der Analyse mikroskopischer Proben mit hohem Durchsatz ist die Verwendung einer solchen einzelner Korrekturlinse, wie sie in der US 4,412,723 vorgeschlagen wird, daher ausgeschlossen.

Aufgabe der Erfindung ist daher, ein Überiragungssystem zu entwickeln, welches einerseits die Verwendung bereits vorhandener Standard-Mikroskopobjektive erlaubt und dabei gleichzeitig die Anzahl der optischen Elemente in dem Übertragungssystem so gering wie möglich zu halten und somit einen einfachen Aufbau zu realisieren, wobei Aberrationen, die durch die schiefe Lage der Fokusebene bzw. Objektebene relativ zu einem Probenträger bzw. dem Deckglas eines Probengefäßes, wodurch das Licht somit schief hindurchtritt, korrigiert werden sollen. Andererseits soll auch die Mikroskopie an kleinsten Proben ermöglicht werden, so dass das Übertragungssystem auch geeignet sein soll, bei der Analyse von Proben mit hohem Durchsatz verwendet zu werden.

Diese Aufgabe wird für ein optisches Überiragungssystem der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass das optische Überiragungssystem relativ zum ausgewählten Bereich der Probe so positioniert ist, dass sich der Bereich der Probe innerhalb der Brennweite der probennächsten Linse des optischen Übertragungssystems befindet, und sich die Zwischenbildebene und die Objektebene auf derselben Seite des optischen Übertragungssystems befinden. Das Übertragungssystem ist also im Mikroskop so integriert bzw. angeordnet, dass sich bei der mikroskopischen Analyse die Probe innerhalb der Brennweite befindet. Bei dem Zwischenbild handelt es sich um ein virtuelles Bild, wie durch die Tatsache, dass sich die Zwischenbildebene auf derselben Seite wie die Objektebene befindet, impliziert wird.

Im Unterschied zu den bisher bekannten Übertragungssystemen, bei denen ein reales, zugängliches Bild erzeugt wird, entsteht bei der Verwendung des erfindungsgemäßen optischen Übertragung ss ystems ein virtuelles, nicht zugängliches Bild. Das optische Übertragungssystem wird daher im folgenden schlagwortartig auch als virtuelles Relay bezeichnet. Auch hier kann optional nicht nur die Objektebene maßstabsgetreu abgebildet werden, sondern, wie auch bei der in der deutschen Anmeldung Nr. 10 2013 105 586.9 beschriebenen Anordnung, ein Volumenbereich einer gewissen Größe.

Das zweite Medium, in welchem sich die Zwischenbildebene befindet, kann beispielsweise Luft sein. Dann kann das virtuelle Volumenbild mit beliebigen, für das zweite Medium korrigierten Objektiven, insbesondere also auch mit Trockenobjektiven, betrachtet werden. Für das Detektionsobjektiv erscheint das virtuelle Bild - bei einer objekttreuen Abbildung - als Volumen- Objekt, und die Fokussierung auf bestimmte Ebenen eines solchen Volumen-Objekts findet wie gewöhnlich durch Änderung des Arbeitsabstandes des Mikroskopobjektivs oder durch innere Fokussierung desselben statt.

Dabei werden die sphärischen Aberrationen, die durch die planparallele Platte des Probenträgers bzw. des Deckglases des Probengefäßes verursacht werden, wenn die gewünschte Fokusebene mit den Normalen der Großflächen dieser Platte einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, gleichzeitig durch das virtuelle Relay korrigiert. Auch höhere sphärische Aberrationen können mit diesem optischen Übertragungssystem korrigiert werden, sofern es entsprechend ausgelegt wird.

Ein großer Vorteil bei der Erzeugung eines virtuellen Zwischenbüdes mit dem vorgeschlagenen optischen Übertragungssystem liegt darin, dass dazu überraschenderweise nur wenige Linsen verwendet werden müssen. Ein optimales Ergebnis hinsichtlich der Anzahl der Linsen einerseits und der Güte der Korrekturen andererseits erreicht man bereits mit zwei rotationssymmetrischen Linsen. Die Flächen dieser Linsen können alle sphärisch sein, bevorzugt ist jedoch mindestens eine der Linsen mit einer asphärisch geformten Fläche versehen, was es insbesondere ermöglicht, die Korrekturen in einem weiten Winkelbereich von nahezu 90° zur Normalen der Großflächen der planparallelen Platte mit ausreichender Güte ermöglicht. Optimale Ergebnisse erreicht man jedoch, wenn man den korrigierten Bereich auf einen Öffnungswinkel von etwa 82° beschränkt. Bei der Verwendung von Immersionsmedien lassen sich auf diese Weise hohe numerische Aperturen realisieren, beispielsweise NA = 1 ,32 für Wasser oder physiologische Kochsalzlösungen und NA = 1 ,52 für Öl. Bei der Verwendung im Mikroskop wird das optische Übertragungssystem dabei so positioniert, dass seine optische Achse zu den beiden Normalen der Großflächen der planparallelen Platte parallel liegt.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das optische Ü bertrag ungssystem so ausgestaltet, dass es den Bereich der Probe mit einer Vergrößerung M = η^'ξ abbildend ausgestaltet ist. n-, ist dabei der Brechungsindex des ersten Mediums und n ₂ der Brechungsindex des zweiten Mediums. Das erste Medium ist dabei das Medium, in welchem sich die Probe befindet, also beispielsweise Wasser oder eine Nährlösung, z.B. eine physiologische Kochsalzlösung. Auch die Verwendung von Luft als erstem Medium ist prinzipiell möglich. Das zweite Medium ist im Prinzip ebenfalls frei wählbar und kann bei der Auslegung eines konkreten virtuellen Relays berücksichtigt werden. Vorteilhaft ist es jedoch, als zweites Medium Luft zu verwenden, da dann Standard-Mikroskopobjektive für die Beobachtung in Luft, sogenannte Trockenobjektive, verwendet werden können. Dies bringt erhebliche Kostenvorteile mit sich, da dann bereits bestehende Mikroskope relativ preisgünstig nachgerüstet werden können, was in der Regel ohne weiteres möglich ist, da das virtuelle Relay sehr kompakt gebaut ist und nach Art eines Adapters in den Mikroskopaufbau ohne weiteres Integriert werden kann. Die Vergrößerung kann dabei durch den Parameter ξ weiter variiert werden. Dabei handelt es sich um einen im Prinzip frei wählbaren Faktor, der beim optischen Design, der Konstruktion des virtuellen Relays berücksichtigt wird. Bevorzugt liegt der Faktor in einem Bereich zwischen 0,5 und 2, davon abweichende Werte sind allerdings ebenfalls möglich. Besonders vorteilhaft ist jedoch ξ = 1 , da dann die sogenannte Sinusbedingung - die Bedingung für eine komafreie Abbildung der Objektebene in die Zwischenbiidebene - und die sogenannte Herschelbedingung - die Bedingung für eine öffnungsfreie Abbildung in der Tiefe - gleichzeitig erfüllt sind, so dass die laterale Vergrößerung und die Vergrößerung in der Tiefe gleich sind und die Abbildung in kleinen Volumenbereichen auf der Achse koma- und öffnungsfehlerfrei ist.

Da das vom virtuellen Relay erzeugte Zwischenbild innerhalb eines gewissen Volumens alle Eigenschaften des Volumen-Objekts innerhalb der korrigierten numerischen Apertur des optischen Übertragungssystems darstellt - wenn ξ =1 ist, auch unverzerrt, so kann das Volumen-Bild im Prinzip unter beliebigen Winkeln mit einem Mikroskopobjektiv betrachtet werden, solange die numerische Apertur des Mikroskopobjektivs kleiner oder gleich der (korrigierten) numerischen Apertur des optischen Übertragungssystems ist, wobei diese durch die Wahl eines Immersionsmediums zwischen planparalleler Platte und Frontlinse des Übertragungssystems abhängt; auch zwischen den Linsen des Übertragungssystems kann sich ein Immersionsmedium befinden, Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, einen möglichst großen Öffnungs inkel von mehr als 75° bzw. eine möglichst hohe numerische Apertur für das optische Übertragungssystem zu wählen, beispielsweise einen Wert von NA = 1 ,32 mit dem Immersionsmedium Wasser, entsprechend einem Öffnungswinkel von etwa 83°.

Das optische Übertragungssystem lässt sich im Prinzip mit beliebigen Mikroskopaufbauten verwenden und sein Einsatz ist überall dort sinnvoll, wo aufgrund der Analysemethode oder des Aufbaus die Fokusebene des jeweiligen Mikroskopobjektivs, d.h. die Objektebene, nicht parallel zu den Grenzflächen der planparallelen Platte als Teil eines Probenträgers oder Probengefäßes liegt.

Die Probe ist dabei in einem ersten Medium in einer Objektebene auf einem oder in einem mindestens teilweise als planparallele Platte ausgebildeten Probenträger angeordnet. Handelt es sich beispielsweise um ein Probengefäß mit seitlichen Wänden, welches mit Flüssigkeit gefüllt werden kann, so kann die planparallele Platte auch durch einen Deckel des Probengefäßes gebildet werden. Die Objektebene liegt schräg zu dieser planparallelen Platte, was bedeutet, dass das Licht - bezogen auf die optische Achse des Mikroskopobjektivs, welche senkrecht zur Objektebene steht - schräg durch diese planparallele Platte hindurchtritt. Das vorangehend beschriebene optische Übertrag ungssystem ist dann Teil des Mikroskops, welches außerdem mindestens ein Mikroskopobjektiv als Teil eines mikroskopischen Abbildungs- und / oder Beleuchtungssystems umfasst. Je nach Zweck ist das Mikroskopobjektiv für eine Abbildung aus der Zwischenbildebene im zweiten Medium in eine Bildebene, die beispielsweise durch den Flächendetektor einer Kamera gebildet werden kann, als Detektionsobjektiv ausgelegt, oder als Beleuchtungsobjektiv, wenn beispielsweise Beleuchtungslicht in Form eines Lichtblatts in die Zwischenbildebene und von dort durch das Übertragungssystem in die Objektebene abgebildet wird. Die optische Achse des mindestens einen Mikroskopobjektivs steht senkrecht auf der Zwischenbildebene, auf welche das mindestens eine Mikroskopobjektiv fokussiert ist. Der Probenbereich, aus welchem abgebildet werden soll, befindet sich dabei innerhalb der Brennweite der probennächsten Linse des optischen Übertragungssystems, und das Zwischenbild ist ein virtuelles Bild, wobei sich die Zwischenbildebene und die Objektebene auf derselben Seite des optischen Übertragungssystems befinden.

Dabei ist es zweckmäßig, wenn die numerische Apertur NA _M des mindestens einen Mikroskopobjektivs nicht größer als die numerische Apertur NA ₀ des optischen Übertragungssystems ist, da dann in einem maximalen Winkeibereich um die Normale der planparallelen Platte bzw. der optischen Achse des optischen Übertragungssystems eine korrigierte Abbildung erfolgen kann. Die numerische Apertur N _M des Mikroskopobjektivs kann dabei auch unsymmetrisch sein um beispielsweise einer zur optischen Achse des Übertragungssystems gekippten Stellung Rechnung zu tragen: In meridionaler Richtung, d.h. in der Richtung der Verkippung, kann die numerische Apertur kleiner als in sagittaler Richtung, d.h. senkrecht zur Richtung der Verkippung. gewählt werden um einerseits einen möglichst hohen Verkippungswinkel realisieren zu können und andererseits einen möglichst hohen Öffnungswinkel zu verwirklichen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist dabei der Bereich zwischen der probennächsten Linse des optischen Übertragungssystems und der planparallelen Platte von einem dritten Medium ausgefüllt, welches als Immersionsmedium für das optische Übertragungssystem dient. Dieses dritte Medium weist bevorzugt ähnliche oder identische optische Brechungseigenschaften wie das erste Medium auf, beide Medien können auch identisch sein, beispielsweise Wasser. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die Brechzahl des dritten Mediums nicht kleiner als die des ersten Mediums ist um das Auftreten von Totalreflexion zu vermeiden, was den zugänglichen Winkelbereich stark einschränken würde. Die Verwendung eines Immersionsmediums ermöglicht eine noch kompaktere Gestaltung des optischen Übertragungssystems und größere Öffnungswinkel bzw. höhere numerische Aperturen, wobei es vorteilhaft ist, ein drittes Medium zu verwenden, dessen Brechungsindex auch ähnlich dem des Materials der planparallelen Platte ist um den verwendbaren Winkelbereich zu maximieren. Grundsätzlich ist aber auch hier die Wahl des dritten Mediums prinzipiell frei, auch Luft oder ein anderes Gas kann das dritte Medium bilden. Bei der Verwendung von Luft als drittem Medium ist der Offnungswinkei in der Regel kleiner, da aufgrund der geringeren Brechzahl von Luft gegenüber der von üblichen immersionsmedien ansonsten bei größeren Einfallswinkeln, d.h. bei größeren Öffnungswinkeln, Totalreflexion auftritt.

Die Verwendung von Wasser als drittes Medium erfordert, dass das optische Übertragungssystem mit dem Probenträger im Bereich der planparallelen Platte so dicht verbunden ist, dass kein Wasser aus dem Bereich zwischen Probenträger und der Frontlinse des virtuellen Relays austreten kann. Die Anbringung des virtuellen Relays im Mikroskop kann dadurch technisch aufwendig werden. Vorteilhaft verwendet man daher als drittes Medium ein festes oder amorphes Medium, beispielsweise ein amorphes Fluoropolymer, wie es von der Firma BELLEX Int. Corp. unter dem Produktnamen CYTOP ^® angeboten wird. Aufgrund seiner Konsistenz muss dieses Material nicht gesondert in einem Gefäß aufbewahrt werden, was für die Ankopplung des optischen Übertragungssystems einen großen Vorteil darstellt. Auch Glycerin und Glycerinverbindungen lassen sich als erstes - und drittes - Medium einsetzen. Mit diesen und anderen, ebenfalls geeigneten sogenannten C/ear/ng-FIüssigkeiten lassen sich zu untersuchende Proben teilweise transparent machen, was bei der Analyse von Vorteil ist.

In einer besonders zweckmäßigen Ausgestaltung umfasst das Mikroskop eine Halterung zur Aufnahme des optischen Übertragungssystems und zu seiner Fixierung relativ zu einem Stativ, zu einem Probentisch und / oder dem Probenträger. Das Mikroskopobjektiv weist dann zweckmäßig zur Fokussierung bevorzugt Mittel zur innenfokussierung auf und / oder ist entlang seiner optischen Achse relativ zum optischen Übertragungssystem verschiebbar.

Das optische Übertragungssystem wird also in einer fest vorgegebenen Position im Mikroskop angeordnet, so dass sein Abstand zum Probenträger immer gleich ist. Die Halterung ist dabei so konzipiert, dass das virtuelle Relay leicht ausgewechselt werden kann, da ein jedes virtuelle Relay speziell an das Material der planparallelen Platte angepasst ist, aber auch an das verwendete erste, zweite und insbesondere das dritte Medium. Als Material für die planparallele Platte kommen beispielsweise Glas oder Plastik in Frage, übliche Dicken liegen zwischen 0,17 mm und 0,5 mm. Da das optische Übertragungssystem sehr kompakt gebaut werden kann und mit maximal zwei Linsen auskommen kann, ist es auch möglich, die Halterung nach Art einer Revolvertrommel zu konzipieren, mit Aufnahmen für mehrere optische Übertragungssysteme, die dann je nach verwendetem Probenträger und / oder verwendeten Medien in den Strahlengang eingebracht werden können.

Wird als zweites Medium Luft verwendet, so ist das Mikroskopobjektiv vorzugsweise als Trockenobjektiv ausgestaltete, hier können dann bereits vorhandene Standardobjektive weiterverwendet werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der Winkel, den die optische Achse des mindestens einen Mikroskopobjektivs mit der optischen Achse des optischen Übertragungssystems einschließt, frei einstellbar. Dies ermöglicht es dann auch, mehrere Objektive gleichzeitig zu verwenden, z.B. für die Beobachtung aus zwei Richtungen gleichzeitig und der Beleuchtung der Probe aus einer dritten Richtung, die beispielsweise zwischen diesen beiden Detektionsrichtungen liegen kann. Um eine Beobachtung der Probe aus verschiedenen Richtungen zu erleichtern, wenn jedoch nur ein Objektiv zur Beobachtung zur Verfügung steht, ist es vorteilhaft, Mittel vorzusehen, die es ermöglichen, dass das mindestens eine Mikroskopobjektiv in Bezug auf das optische Übertragungssystem relativ um dessen optischer Achse rotierbar ist, wenn die optische Achse des mindestens einen Mikroskopobjektivs mit der optischen Achse des optischen Übertragungssystems einen von Null verschiedenen Winkel einschließt. Da das virtuelle Relay rotationssymmetrisch aufgebaut ist, kann die Probe aus beliebigen Richtungen und Winkeln betrachtet werden, wobei immer die sphärischen Aberrationen, die durch den schrägen Lichtdurchtritt entstehen, korrigiert sind. Die Rotation des Mikroskopobjektivs relativ um die optische Achse des Übertragungssystems kann dabei so erfolgen, dass das Mikroskopobjektiv um die optische Achse des virtuellen Relays rotierbar ist, beispielsweise durch entsprechende Umlaufvorrichtungen am Mikroskopkörper, die bevorzugt ansteuerbar sind und automatisch bewegt werden können. Dabei kann optional auch der eingestellte Winkel des Mikroskopobjektivs zur optischen Achse variiert werden. Alternativ ist auch eine Drehung der Probe denkbar, jedoch gestaltet sich diese meistens aufwendiger, da sie hier auch mit einer lateralen Bewegung gekoppelt wäre.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Mikroskop als Lichtblatt-Mikroskop ausgestaltet. Es umfasst dann ein erstes als Beleuchtungsobjektiv ausgestaltetes Mikroskopobjektiv zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblau und ein zweites, als Detektionsobjektiv ausgestaltetes Mikroskopobjektiv zur Detektion von Licht, welches aus dem Bereich der Probe abgestrahlt wird. Die optischen Achsen des Beleuchtungsobjektivs und des Detektionsobjektivs schließen dabei einen von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt 90° ein. Die Verwendung des optischen Übertragungssystems bietet insbesondere bei der Lichtblattmikroskopie große Vorteile, da der Aufbau des Mikroskops durch diese Anordnung noch kompakter gestaltet werden kann und die vorteilhafte Anordnung der Objektive in einem Winkel von jeweils 45° zur Normalen der planparallelen Platte beibehalten werden kann. Auch andere Winkel sind selbstverständlich möglich und insbesondere bei verschiedenen numerischen Aperturen der Objektive vorteilhaft - dann kann das Objektiv mit der kleineren numerischen Apertur in einem größeren Winkel zur Normalen der planparallelen Platte angeordnet werden. Der von den optischen Hauptachsen beider Objektive eingeschlossene Winkel sollte dabei etwa 90° betragen. Zweckmäßig liegen dabei die optische Achse des Beieuchiungsobjektivs, des optischen Übertragungssystems und des Detektionsobjektivs in einer Ebene, dies ist aber nicht zwingend, eine Beobachtung ist auch mit anderen Winkeln möglich. Um hier Aufnahmen aus verschiedenen Richtungen zu erhalten, die zu einem Gesamtbild zusammengesetzt werden können, sind dann vorzugsweise beide Objektive gleichzeitig um die optische Achse des virtuellen Relays rotierbar, wobei beide Objektive zueinander relativ jedoch in ihrer Position fixiert sind.

Alternativ kann auch die optische Achse des Detektionsobjektivs relativ zur optischen Achse des optischen Übertragungssystems fixiert sein, wobei nur das Beleuchtungsobjektiv in Bezug auf die optische Achse des Detektionsobjektivs relativ um dieses rotierbar ist. Diese Alternative kann beispielsweise dann sinnvoll sein, wenn die optische Achse des Detektionsobjektivs mit der optischen Achse des optischen Übertragungssystems zusammenfällt.

Für die Erzeugung von sogenannten /Wu/f/ ^' -V/ew-Aufnahmen, bei der die Probe wechselnd aus verschiedenen Richtungen beleuchtet und in verschiednen Richtungen detektiert wird, ist es vorteilhaft, wenn die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs mit der optischen Achse des optischen Übertragungssystems eine erste Ebene aufspannt und die optische Achse des Detektionsobjektivs mit der optischen Achse des Übertragungssystems eine zweite Ebene aufspannt, welche die erste Ebene unter einem vorgegebenen Winkel schneidet. Der Winkel kann beispielsweise 120° betragen, so dass ohne weiteres ein drittes Mikroskopobjektiv hinzugenommen werden kann, welches dann zu den beiden benachbarten Objektiven ebenfalls im Winkei von 120° angeordnet ist, so dass die drei Mikroskopobjektive ein Dreibein bilden. Die optischen Achsen der drei Mikroskopobjektive stehen dann bevorzugt paarweise senkrecht zueinander, und das Mikroskop ist mit einer Ansteuerung versehen, die es ermöglicht jedes der drei Mikroskopobjektive entweder als Beleuchtungs- oder als Detektionsobjektiv zu betreiben, was durch geringfügige konstruktive Änderungen erreicht werden kann, insbesondere wenn ein quasi-statisches Lichtblatt verwendet wird, wofür keine im Strahlengang angeordnete Zylinderiinsen etc. verwendet werden müssen. Im Wechsel werden dann jeweils ein Objektiv als Beleuchtungsobjektiv und die beiden anderen Mikroskopobjektive als Detektionsobjektive betrieben. Die Ansteuerung lässt sich selbstverständlich auch für ein System mit nur zwei Mikroskopobjektiven verwenden. Vorteilhaft sind dabei alle Objektive, zwischen denen gewechselt wird, gleichartig ausgestaltet um jeweils vergleichbare Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen zu erhalten.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung umfasst das Mikroskop einen Objektivrevolver, an welchem das Beleuchtungs- und das Detektionsobjektiv angeordnet - beispielsweise eingeschraubt - sind und an welchem ein weiteres Mikroskopobjektiv angeordnet ist, wobei in einer ersten Stellung des Objektivrevolvers, bei welcher Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv in den Strahlengang eingeschwenkt sind, das Mikroskop als Lichtbiatt-Mikroskop betreibbar ist, und in einer zweiten Stellung, bei der nur das weitere Mikroskopobjektiv in den Strahlengang eingeschwenkt ist, in einer weiteren Betriebsari betreibbar ist. Auf diese Weise wird eine Kombination verschiedener Betriebsarten und Beobachtungsarten ermöglicht.

Beispielsweise kann die optische Achse des weiteren Mäkroskopobjektivs mit der optischen Achse des optischen Übertragungssystems zusammenfallen, wenn das weitere Mikroskopobjektiv in den Strahlengang eingeschwenkt ist. Wenn das weitere Mikroskopobjektiv dann beispielsweise als Weitfeld-Objektiv ausgestaltete ist mit einer geringen Vergrößerung - vorzugsweise um den Faktor 10x - im Bereich bis zu 20 ausgestaltet ist, kann dieses weitere Mikroskopobjektiv verwendet werden, um beispielsweise ein Übersichtsbild eines größeren Bereichs zur Orientierung und Festlegung des zu analysierenden Probenbereichs aufzunehmen. Alternativ kann das weitere Mikroskopobjektiv auch als Objektiv mit einem hohen Öffnungswinkel von mehr als 60° und einer entsprechend hohen numerischen Apertur ausgestaltet sein, beispielsweise 1 ,2 für das Immersionsmedium Wasser. Mit einem solchen Objektiv kann dann ein Bild in einem Laser-Scanning-Modus aufgenommen werden. Auch andere Objektive für die Verwendung mit dem Verfahren der SD- (Spinning Disk), der TIRF- ( Totai Internal Reflection Fluorescence) oder der SIM-Mäkroskopie (Structured Illumination Microscopy) sind an dieser Stelle einsetzbar. Das weitere Mikroskopobjektiv kann auch einen von Null verschiedenen Winkel mit der optischen Achse des virtuellen Relays einschließen. Da die Korrektur der Aberrationen des schiefen Durchgangs ausschließlich im virtuellen Relay stattfindet, müssen dementsprechend keine weiteren Korrekiurmechanismen in den Objektiv vorgesehen werden. Dies führt zu erheblichen Kosteneinsparungen.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:

Fig.1 den grundlegenden Aufbau eines optischen Übertragungssystems

Fig.2 die Abbildungsverhältnisse bei einem solchen Übertragungssystem,

Fig.3 ein Übertragungssystem im Zusammenspie! mit einem Mikroskopobjektiv,

Fig.4 ein Übertragungssystem in einem Lichtblattmikroskop, und

Fig.5 ein Ausführungsbeispiel für ein optisches Übertragungssystem.

In Fig.1 ist zunächst der grundlegende Aufbau eines optischen Übertragungssystems gezeigt. Das optische Übertragungssystem umfasst mindestens eine Linse, im gezeigten Beispiel werden zwei Linsen, eine als Frontlinse ausgestaltete erste Linse 1 und eine zweite Linse 2 verwendet. Das optische Übertragungssystem bildet einen ausgewählten Bereich 3 einer Probe 4, welche in einem ersten Medium 5 in einer Objektebene auf oder in einem mindestens teilweise als planparallele Platte 6 ausgebildeten Probenträger angeordnet ist, aus der Objektebene in ein Zwischenbild in einer Zwischenbildebene in einem zweiten Medium 7 ab. Bei der Abbildung befindet sich die planparallele Platte 6 zwischen dem optischen Übertragungssystem und dem Bereich 3 der Probe 4. Objektebene und Zwischenbildebene schließen mit einer optischen Achse 8 des Übertragungssystems einen Winkel zwischen Null und 90° ein. Dabei ist das optische Übertragungssystem relativ zum Bereich 3 der Probe 4 so positioniert, dass sich dieser Bereich 3 der Probe 4 innerhalb der Brennweite der probennächsten Linse 1 des optischen Übertragungssystems befindet. Bei dem Zwischenbild handelt es sich um ein virtuelles Bild, wobei sich die Zwischenbildebene und die Objektebene auf derselben Seite des optischen Übertragungssystems befinden. Die Linsen 1 und 2 sind beide rotationssymmetrisch, mindestens eine der beiden Linsen 1 und 2 ist mit einer asphärisch geformten Fläche versehen. Als erstes Medium 5 kann beispielsweise Wasser, als zweites Medium Luft verwendet werden. Vorteilhaft für eine hohe numerische Apertur, aber nicht zwingend, füllt das erste Medium 5 auch den Bereich zwischen der planparallelen Platte 6 und der Frontiinse 1 des optischen Ü b ertrag ungs Systems auf, alternativ kann auch ein drittes Medium verwendet werden.

Das Abbildungsverhalten des optischen Übertragungssystems, welches schlagwortartig auch als virtuelles Relay bezeichnet wird, ist in Fig.2 näher dargestellt. Hier ist der Bereich 3 der Probe 4 vergrößert dargestellt. In diesem Bereich ist eine Objektebene 9 definiert. Die Objektebene 9 schließt mit der optischen Achse 8 des optischen Übertragungssystems einen von 90° verschiedenen Winkel ein. Die zur Objektebene 9 senkrecht gezeigte Richtung entspricht dann beispielsweise der Richtung, aus der ein Beobachtungsobjektiv, ein Mikroskopobjektiv auf die Probe gerichtet ist. Diese Objektebene 9 wird dann auf eine Zwischenbildebene 10 abgebildet, die sich ebenfalls in dem Bereich befindet, wo die Probe 4 angeordnet ist, es handelt sich bei dem entstehenden Zwischenbild also um ein virtuelles Bild. Das Zwischenbild ist gegenüber dem originalen Objekt vergrößert, hier durch den vergrößert dargestellten Volumenbildbereich 11 gekennzeichnet. Die Vergrößerung des optischen Übertragungssystems ist dabei so eingestellt, dass sie dem Verhältnis der Brechzahl des ersten Mediums zu der des zweiten Mediums, multipliziert mit einem Faktor ξ, welcher frei wählbar ist, entspricht. Ist ξ ungleich 1 , so wird das Bild entweder lateral oder in der Tiefe verzerrt, also im Volumen nicht maßstabsgetreu abgebildet, im vorliegenden Fall ist jedoch ξ gleich 1 , so dass die Abbildung objekttreu erfolgt, d.h. der Bereich 3 der Probe wird maßstabsgetreu vergrößert in den Volumenbereich 1 1 abgebildet, und zwar über den ganzen Volumenbereich 1 1. Die Vergrößerung beträgt hier M = 1 ,33, wenn das erste Medium Wasser und das zweite Medium Luft ist. Ist ξ ungleich 1 , so wird nur die Objektebene maßstabsgetreu in die Zwischenbildebene abgebildet, da dann entweder die sogenannte Sinusbedingung oder die sogenannte Hersche!bedingung nicht mehr erfüllt sind. Die numerische Apertur des optischen Übertragungssysiems sollte so groß wie möglich gewählt werden, sie kann beispielsweise bei Verwendung des Immersionsmediums Wasser als drittem Medium zwischen pianparalleler Platte 6 und Frontlinse des Übertragungssystems 1 ,32 betragen, entsprechend einem Öffnungswinkel von etwa 83°. Der Öffnungswinkel sollte bevorzugt mindestens 75° betragen.

Bei einer objekttreuen Abbildung kann ein Mikroskopobjektiv ohne weitere Korrekturen auf jede Zwischenbildebene 10 fokussiert werden, die in dem objekttreu abgebildeten Voiumenbereich 1 1 liegt.

Dies äst beispielhaft in Fig.3 dargestellt. Hier ist auf der der planparallelen Platte 6 abgewandten Seite des optischen Übertragungssystems ein Mikroskopobjektiv 12 mit seinen ersten beiden Linsen angedeutet. Die Fokussierung des Mikroskopobjektivs auf seine Objektebene erfolgt hier mit einer Verschiebung des Objektivs entlang seiner optischen Achse, hier etwa in einem Bereich von 67 pm in beiden Richtungen von einer Ruheposition aus. Durch diese Bewegung lässt sich die Objektebene des Mikroskopobjektivs 12, die der Zwischenbildebene 10 entspricht, die bei einer objekttreuen Abbildung überall im Volumenbildbereich 11 angeordnet sein kann, um etwa 50 pm in beiden Richtungen.

Da das virtuelle Relay in das zweite Medium 7 abbildet, entsteht das virtuelle Zwsschenbüd ebenfalls in diesem Medium, also beispielsweise in Luft. Unter diesen Umständen können auf Mikroskopseite weiterhin schon vorhandene Trockenobjektive verwendet werden. Das optische Übertragungssystem wird vorzugsweise in einer nicht gezeigten Halterung zur Aufnahme desselben gehalten, so dass es relativ zu einem Stativ des Mikroskops, einem Probentisch und/ oder der Probenträger mit der planparalleien Platte 6 fixiert ist. Das Mikroskopobjektiv wird zur Fokussierung entweder entlang seiner optischen Achse relativ zum optischen Übertragungssystem verschoben oder auch über Mittel zur Innenfokussierung. Der Winkel, den die optische Achse des mindestens einen Mikroskopobjektivs 2 mit der optischen Achse 8 des optischen Übertragungssystems einschließt, ist bevorzugt frei wählbar, d.h. dass das Objektiv des Mikroskops relativ zur Probe in einem großen Winkelbereich einstellbar ist, wobei diese Einstellung sowohl am Mikroskop selber als auch an der Halterung der Probe und an der Probe selbst vorgenommen werden kann. Auch kann die optische Achse des mindestens einen Mikroskopobjektivs 12 mit der optischen Achse 8 des optischen Übertragungssystems einen von Null verschiedenen Winkel einschließen und in Bezug auf das optische Übertragungssystem und dessen optische Achse 8 rotierbar sein.

Insbesondere kann ein Mikroskop, welches das vorangehend beschriebene optische Übertragungssystem verwendet auch als Lichtblatt-Mikroskop ausgestaltet sein. Dies ist beispielhaft in Fig.4 dargestellt. Ein erstes Mikroskopobjektiv ist als Beleuchtungsobjektiv 13 ausgestaltet, das Beleuchtungsobjektiv 13 beleuchtet die Probe 4 mit einem Lichtbiatt. Ein zweites Mikroskopobjektiv ist als Detektionsobjektiv 14 ausgestaltet, es detektiert Licht, weiches aus dem Bereich 3 der Probe 4 abgestrahlt wird. Die optischen Achsen des Beleuchtungsobjektivs und des Detektionsobjektivs schließen einen Winkel von 90° ein, der Winkel der optischen Achse 15 des Detektionsobjektivs 14 zur optischen Achse 8 des optischen Übertragungssystems beträgt hier 32° und der Winkel der optischen Achse 16 des Beleuchtungsobjektivs 13 entsprechend 58°. Bei dem Übertragungssystem handeit es sich bei dem in Fig.3 gezeigte und in Fig. 5 noch genauer dargestellte System, das virtuelle Bild in Luft als zweitem Medium 7 wirkt gegenüber dem Objekt um einen Faktor von 1 ,33 vergrößert. Als drittes Medium wird wie als erstes Medium Wasser bzw. eine physiologische Kochsalzlösung verwendet, auch Glycerin oder andere C/ear ng-Flüssigkeiten können vorzugsweise eingesetzt werden. Die numerische Apertur des optischen Übertragungssystems beträgt 1 ,32, diejenige des Detektionsobjektivs 14 liegt bei 1. Das Beleuchtungsobjektiv 13 hat eine noch kleinere Apertur, beispielsweise im Bereich von 0,3±0,2. Beleuchtungsobjektiv 13 und Detektionsobjektiv 14 sind hier für spezielle Zwecke im Rahmen der Lichtblattmikroskopie ausgelegt, es sind jedoch auch andere Konfigurationen denkbar, bei denen beide Objektive gleich mit einer mittleren Apertur ausgestattet sind, so dass sie wechselweise für sogenannte Multt-View- Aufnahmen verwendet werden können, bei denen die Objektive abwechselnd als Beleuchtungsund Detektionsobjektiv verwendet werden.

Das in Fig.5 gezeigte optische Übertragungssystem weist die in Tabelle 1 aufgeführten Daten auf:

Tabelle 1 : Daten für das virtuelle Relay aus Fig. 5

Als Material für die planparallele Platte 6 - Fläche Nr. 2 - wurde dabei Kronglas mit der Bezeichnung NK5 mit einer Dicke von 0, 1 7 mm verwendet. Die Angaben von Radius und Dicke bzw. Abstand erfolgt in mm. Mit „W23" wird eine physiologische Kochsalzlösung (NaCI) bezeichnet. Der Abstand zwischen Probe und der äußersten Linsenfläche 7 des optischen Übertragungssystems beträgt hier 7,54 mm. Die Brechzahl betrifft die Wellenlänge A _e = 546,07 nm, die Brechzahl η betrifft die Wellenlänge A _c < = 643,84 nm, die Brechzahl η _Ρ · betrifft die Wellenlänge λ _Ρ = 479,99 nm und die Brechzahl n _g betrifft die Wellenlänge λ _β = 435,83 nm. „1" in Tabelle 1 bezeichnet den Ort der Probe, d.h. die Objektebene; diese ist vom Deckglas in 0,5 mm Entfernung angeordnet. Der Bereich zwischen der planparallelen Platte 6 und der ersten, probennächsten Fläche 4 der Frontlinse 1 ist mit dem dritten Medium aufgefüllt, hier ebenfalls mit der Kochsalzlösung W23. Drittes Medium und erstes Medium 5 sind in diesem Beispiel also identisch, das dritte Medium wirkt als Immersionsmedium für das virtuelle Relay. Im Scheitelpunkt beträgt der Abstand der Frontfläche Nr. 4 vom Probenträger somit 2,02 mm. Die Dicke der Frontlinse 1 aus Kronglas beträgt 1 ,50 mm, usw. Auch die zweite Linse ist aus Kronglas gefertigt. Zwischen beiden Linsen befindet sich als zweites Medium 7 Luft.

Der äußeren Fläche 5 der Frontlinse 1 ist außerdem eine asphärische Form aufgeprägt. Die asphärisch geformte Fläche, hier eine rotationssymmetrische Kegelschnittasphäre, wird dabei durch die Beziehung beschrieben. K ist die konische Konstante, / und N sind natürliche Zahlen. c _2l bezeichnet die Koeffizienten eines Polynoms in h. Für p gilt die Beziehung p = 1/R, und R bezeichnet den Radius einer gedachten Kegelschnittfläche am Scheitelpunkt dieser Fläche, d.h. den Abstand des Scheitelpunkts zum nächstgeiegenen Brennpunkt. Dabei liegen sowohl der Scheitelpunkt als auch die Brennpunkte der Kegelschnittfläche auf der optischen Achse, h bezeichnet den Abstand zur optischen Achse, an der der Wert der Funktion f(h) bestimmt wird, bei f handelt es sich um den Abstand der Linsenoberfläche von einer lotrecht auf der optischen Achse im Scheitelpunkt der Kegeischnittfläche stehenden Ebene beim Abstand h von der optischen Achse. Die Koeffizienten c _2h die konische Konstante K und der Radius R werden iterativ bestimmt. Im vorliegenden Beispiel beträgt der Wert der konischen Konstante K = -0, 1806 und der Scheitelradius liegt bei R = -5,8050 mm. Wenn man eine übliche Linsenhöhe von ca. 30 mm ansetzt, ergeben sich die folgenden Koeffizienten des Polynoms in h bis / = 3: c ₂ = 1 ,3909- 10 ^"4 , c ₄ = 3,2862- 1 Q ^'7 und c ₆ = -1 ,5531 ^■ 10 ^"9 .

Die numerische Apertur NA _M des Mikroskopobjektivs sollte dabei nicht größer als die numerische Apertur NA ₀ des optischen Übertragungssystems sein, so dass mit dem Mikroskopobjektiv 12 der Voiumenbildbereich 11 unter ailen möglichen Winkeln betrachtet werden kann. Bei dem in Fig. 5 gezeigten Beispiel ist der Strahlenverlauf bis zu einem Öffnungswinkel von 82° korrigiert, wie durch die äußersten Strahlen angedeutet wird, ein Adapter würde dann nur in dem Bereich ansetzen, wo das optische Übertragungssystem nicht korrigiert.

Mit dem vorangehend beschriebenen optischen Übertragungssystem ist es gelungen, ein kompaktes Bauelement zur Korrektur sphärischer Aberrationen beim schiefen Lichtdurchtriit zu korrigieren, ohne das dazu vorhandene Objektive durch andere ersetzt werden müssten. Das virtuelle Relay kann somit bestehende Mikroskope, insbesondere solche, die die Lichtblattmikroskopie ausgelegt sind, jedoch sphärische Aberrationen nicht oder nicht ausreichend korrigieren, ergänzen.

Bezugszeichenliste

1 Linse

2 Linse

3 Bereich

4 Probe

5 erstes Medium

6 planparaiiele Platte

7 zweites Medium

8 optische Achse

9 Objektebene

10 Zwischenbildebene

11 Volumenbildebene

12 Mikroskopobjektiv

13 Beleuchtungsobjektiv

14 Detektionsobjektiv

15 optische Achse

16 optische Achse