(GNRH) COMO IMMUNÓGENO.

Campo técnico:

La presente invención se relaciona con el campo de Ia inmunología, Ia endocrinología, Ia oncología y Ia reproducción, y en particular se basa en Ia generación simultánea de una respuesta inmune potente contra toda Ia molécula GnRH y especialmente contra los extremos amino y carboxilo de esta hormona. Para ello se aprovecha Ia mejor exposición al sistema inmune de Ia hormona GnRH en su forma nativa y/o sus miméticos, incluyendo las variantes basadas en D aminoácidos, cuando estas son unidas a una molécula portadora, en un caso por el carboxilo terminal y en el otro por el amino terminal, para formar 2 inmunomoléculas diferentes que denominaremos en Io adelante variante carboxilo terminal y variante amino terminal, respectivamente. Técnica Anterior:

La Hormona Liberadora de Gonodatropinas (GnRH - Gonodatropin-Releasing Hormone), también conocida como Hormona Liberadora de Ia Hormona Luteinizante (LHRH - Luteinizing Hormone Releasing Hormone), es un decapéptido hipotalámico, que actúa sobre Ia hipófisis anterior, causando Ia liberación de FSH (follicle- stimulating hormone) y LH (luteinising hormone) hacia Ia sangre, las cuales a su vez estimulan Ia síntesis de esteroides testiculares y con ello el desarrollo de las gónadas masculinas en los animales jóvenes y en los varones adolescentes. En el sexo femenino esta hormona estimula el desarrollo de los ovarios, los folículos, y Ia síntesis de los esteroides ováricos y Ia ovulación.

Es bien conocido el papel que juega Ia LHRH en Ia regulación de Ia fertilidad. Así, un número importante de enfermedades se encuentran relacionadas con las gonadotropinas y las hormonas esteroides gonadales, particularmente los estrógenos y Ia testosterona. Tales enfermedades incluyen el cáncer de mama, útero y otros tipos de cáncer ginecológicos, endometriosis, fibrosis uterina, cáncer de próstata e hiperplasia prostática benigna, entre otras.

La castración o gonadectomía quirúrgica o química constituye uno de los métodos más efectivos en Ia intervención terapéutica de las neoplasias dependientes de hormonas (Huggins C, Hodges CV. Studies on prostatic cáncer. I. The effect of castration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate. Cáncer Researh 1941 ; 1 :293-7). En Ia producción pecuaria, Ia castración se utiliza para evitar el mal olor y sabor de las carnes provenientes de animales adultos machos de interés económico. Proc. Soc. Exp. Biol. Med 175:259-281 , 1984. Meloen RH et al. Efficient ¡mmunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide. Vaccine 1994;12:741-747. Crowley WF, Vale WW, Rivier J, MacArthur JW: LHRH in hypogonadotropic hypogonadism. In ZatuchniGI, Shelton JD, Sciarra JJ (eds): "LHRH Peptides as Female and Male Contraceptives". Philadelphia: Harper & Row Publishers, 1981 , pp 321-333).

Los análogos de GnRH se encuentran dentro de las drogas más usadas en el tratamiento del cáncer de próstata, ovario y mama, los cuales ejercen su acción a través de Ia deprivación androgénica o estrogénica y/o el efecto directo sobre las células cancerosas. (Schally, Comaru-Schally AM, Redding TW: Anti-tumour effects of analogues of hypothalamic hormones in endocrine-dependent cancers). El mecanismo directo a través del cual estos análogos y antagonistas de GnRH ejercen su acción se ha relacionado con Ia "desinsitización" y Ia desregulación de los receptores de GnRH cuando éstos son administrados de forma crónica. Muchos de estos análogos y antagonistas potentes han sido reportados por difererentes autores (Waxman JH, Wass JAH, Hendry WF, Whitfield HN, Besser GM, Malpas JS, Oliver RTD: Treatment with gonadotropin releasmg hormone analogue in advanced prostate cáncer. Br. Med. J. 286:1309-1312, 1983. Alien JM, O'Shea JP, Mashiter K, Williams G, Bloom SR: Advanced carcinoma of the prostate: Treatment with a gonadotropin releasing hormone agonist. Br. Med. J. 286:1607-1609, 1983). (Couillard S. Labrie C. Belanger A. Candas B. Pouliot F. Labrie F. "Effect of dehydroepiandrosterone and the antiandrogen EM-800 on growth of human ZR-75-1 breast cáncer xenografts". J. Nat. Cáncer Inst., May 20, 772-778, 1998; KoIIe S. et al.: "Expression of growth hormone receptor in human prostatic carcinoma and hyperplasia". Int. J. Oncol., vol. 14, No. 5, p 91 1 -916, 1999). Una variante alternativa en el uso de análogos de GnRH/LHRH es Ia inmunización activa con Ia hormona nativa o con sus péptido-miméticos, los cuales pueden servir como vacunas cuando éstos son unidos a moléculas más inmunogénicas tales como el toxoide tetánico, diftérico o sus epítopes, Ia KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) o BSA (Albúmina sérica de bovinos), entre otros. (Gual C, Garza- Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti- luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fértil Steril 1997;67:404-7). En Ia literatura existen diferentes reportes de vacunación usando Ia GnRH/LHRH como antígeno propio, ej. en US 5,897,863, o US 6,132,720. Sin embargo, uno de los problemas que ha estado presente desde los inicios de esta práctica, es su insuficiente capacidad en Ia producción de una potente respuesta inmune que induzca niveles efectivos de anticuerpos anti-GnRH, debido fundamentalmente a su pequeña talla y Ia naturaleza autóloga en todos los mamíferos de este decapéptido. Es por ello que desde los primeros intentos siempre se han aprovechado Ia experiencia existente con moléculas similares y el uso de portadores que aumentan Ia "visibilidad" de estos péptidos ante el sistema inmune.

Experimentos realizados con candidatos vacunales basados en Ia hormona GnRH o sus miméticos unidos a moléculas portadoras del tipo del TT, han sido ensayadas en cerdos, roedores y primates, donde han demostrado atrofia en testículos, y próstata en machos y de ovarios en hembras. (Talwar GP, Raina K, Gupta J. C, Ray R, Wadhwa S, AIi MM. A recombinant luteinising-hormone-releasing hormone immunogen bioeffective in causing prostatic atrophy. Vaccine 2004; 22:3713-372. Millar RP, King JA, Davidson JS, Milton RC. Gonadotrophin-releasing hormone- diversity of functions and clinical applications. S Afr Med J 1987;72:748-755). Otra de las desventajas que con frecuencia se mencionan con el empleo de inmunógenos a base de GnRH/LHRH como vacunas contra Ia fertilidad en animales de interés económico y mascotas, es Ia gran variabilidad en los resultados que se observa entre los individuos de un grupo inmunizado, aún cuando se utilizan grandes dosis. A esto se añade Ia problemática del uso de adyuvantes muy reactogénicos como el adyuvante completo de Freund. (Hoskinson et al, Austr. J. Biotech; 4, 166-170 (1990); Bonneau et al., J. Anim. Sci. 72, 14-20 (1994); U.S. Pat. No. 4,608,251 ; Int. patent appl. WO 88205109; Caraty et al., C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Serie III, No. 16, 673-676 (1986); Falvo et al.; J. Anim. Sci. 63, 986-994 (1986).

De forma similar en Ia patente WO 98/2711 1 "Preparado vacunal para Ia inmunocastración reversible de mamíferos" de R. Bringas y cois., se obtuvieron resultados positivos en Ia inmunocastración de cerdos prepubers utilizando Ia hormona GnRH mutada, unida en el proceso de síntesis al TT y emulsionada en ACF, sin embargo, Ia utilización extensiva de este preparado vacunal, no mostró una homogeneidad semejante a Ia observada en los animales pubers.

Los primeros ensayos clínicos en pacientes con cáncer de próstata avanzado y en mujeres postmenopáusicas para investigar Ia inhibición de las gonadotropinas se realizaron por primera vez en Ia década de los años 90 del siglo pasado, los cuales fueron publicados por Talwar GP y cois. (Talwar GP. Vaccines for control of fertility and hormone-dependent cancers. Immunology and CeII Biology 1997;75:184-189. Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti-luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fértil Steril 1997;67:404-7). Además de Io mencionado anteriormente, los candidatos que han usado Ia LHRH conjugada químicamente al TT (toxoide tetánico) y al DT (toxoide diftérico) como portadores, producen frecuentemente inmunosupresión anti-hapténica. (Schutze M-P, Leclerc C, Jolivet M, Audibert F, Chedid L. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. J immunoi 1985;135:2319-22. Gaur A ₁ Arunan K, Singh OM ₁ Talwar GP. By pass by an altérnate carrier of acquired unresponsiveness to hCG upon repeated immunization with tetanus conjugated vaccine. Int Immunology 1990;2(2):151 -5. Sad S, Gupta HM ₁ Talwar GP, Raghupathy R. Carrier induced suppression of the antibody response to self hapten. Immunlogy 1991 ;74:223-7), además de las pérdidas propias reportadas en el proceso de conjugación. (Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti- luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fértil Steril 1997;67:404-7). Recientemente, un grupo de investigadores en Estados Unidos ha utilizado múltiples epítopes T cooperadores proveniente de antígenos de microorganismos que producen frecuentemente enfermedades infecciosas en los infantes y los han unido a Ia GnRH por su extremo amino terminal en el propio proceso de síntesis química en aras de encontrar una respuesta mucho más potente y universal (Finstad CL, Wang CY, Kowalsky J ₁ Zhang M ₁ Li M ₁ Li X ₁ Xia W ₁ Bosland M ₁ Murthy k.k, Walfield A, Koff W. C, Zamb TJ. Synthetic luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) vaccine for effective androgen deprivation and its application to prostate cáncer immunotherapy. Vaccine 2004;22:1300-1313). No obstante Ia buena respuesta inmunológica encontrada gracias al uso de 4 epítopes T cooperadores en un mismo inmunógeno, fue necesario el uso de inmunizaciones repetidas utilizando para ello adyuvantes oleosos. La formulación reportada constituye además un proceso de difícil reproducción, de alto costo y difícil de llevar a cabo en Ia práctica en un proceso industrial a gran escala. En este particular, se explota solo Ia potenciación de Ia respuesta inmunológica a costa de Ia diversidad de las moléculas portadoras y no Ia potencialidad que tendría una mezcla donde se expongan el amino y el carboxilo libres de Ia GnRH ó sus miméticos.

Finalmente, es importante señalar que a pesar de que en Ia literatura se alude a Ia capacidad ¡nmunogénica de los diferentes inmunoconjugados de GnRH o sus miméticos y de los resultados variables obtenidos por diferentes autores, utilizando inmunomoléculas de GnRH conjugadas por sus extremos amino y carboxilo terminal, incluyendo Ia utilización de aminoácidos adicionales para facilitar Ia conjugación; el uso de disímiles moléculas portadoras unidas a uno de sus extremos, Ia construcción por vía convencional de síntesis de péptidos o de recombinación del ADN de moléculas complejas en forma de "tándem" y MABS, no se ha reportado sin embargo, el efecto sinérgico que tiene sobre Ia respuesta inmune, los niveles de hormonas sexuales y del efecto sobre los órganos dianas (próstata, testículos, mama, ovarios), cuando se utiliza una formulación de 2 variantes de GnRH acopladas a Ia molécula portadora, una a través del amino y otra por el carboxilo terminal cuando son utilizadas en una misma preparación farmacéutica.

El proceso de construcción de las moléculas propuestas contempla Ia unión química por síntesis, Ia conjugación o el clonaje en forma de proteína de fusión de Ia GnRH o sus miméticos con moléculas portadoras. Las moléculas portadoras pueden ser proteínas completas, o sus fragmentos o epítopes, dígase Toxoide Tetánico (TT), proteína P64K de Neisseria Meningitides, antígeno de superficie de Ia hepatitis B, o antígeno de Ia envoltura del virus de Ia hepatitis, etc. La preparación farmacéutica reportada aquí, administrada en una misma formulación, genera una respuesta inmunológica sinérgica dirigida contra los extremos amino y carboxilo libres de Ia GnRH. Como resultado, se obtiene una rápida y significativa ablación de las hormonas sexuales masculinas y femeninas, según el caso (andrógenos y estrógenos respectivamente), Io cual se traduce en una vigorosa inmunocastración. Esta formulación tendría una aplicación directa en Ia inmunocastración de animales de interés económico y animales macotas, en el control de Ia fertilidad en humanos, así como en el tratamiento de tumores hormonosensibles; de próstata, mama, ovario, endometrio, testículos, hipófisis, glándulas salivales y otros tipos de tumores, Io cual se expresa como reducción del volumen de los órganos dianas, de Ia masa tumoral y en el aumento de Ia sobrevida de los individuos.

Divulgación de Ia Invención.

La presente invención se basa en Ia combinación en un mismo esquema de inmunización de 2 variantes de Ia hormona GnRH/LHRH natural y/o sus miméticos, incluyendo las variantes retro-inversas, sintetizadas a base de D aminoácidos, donde las variantes de GnRH se generan a través de Ia síntesis química, Ia conjugación o el uso de quimeras de ADN de Ia GnRH unidas indistintamente por los extremos carboxilo y amino terminales a una molécula portadora del tipo del TT, o sus epítopes, con el objetivo de lograr una más potente y rápida respuesta inmunológica contra Ia GnRH endógena. En el caso que nos ocupa, las variantes carboxilo y amino terminales (referidas al sitio de unión de Ia GnRH a Ia molécula portadora) pueden ser administradas al unísono en una misma preparación o separadas, de forma secuencial o alterna en un mismo esquema de inmunización. La novedad de esta invención radica en el efecto sinérgico que produce sobre el sistema inmune, Ia inmunización activa con las 2 variantes de GnRH mencionadas anteriormente y que referimos como: carboxilo terminal (variante en Ia cual el portador es unido al carboxilo terminal de Ia GnRH o sus miméticos ) y amino terminal (variante en Ia cual el portador es unido al extremo amino terminal de Ia GnRH o sus miméticos), una vez que son administradas como parte de una misma formulación, produciendo una rápida y potente ablación de las hormonas sexuales masculinas y femeninas (andrógenos y estrógenos respectivamente), Io cual se traduce en una vigorosa acción inmunocastradora y de ahí su efectividad en Ia inmunocastración de animales de interés económico y animales mascotas, en el control de Ia fertilidad en humanos, así como en el tratamiento de tumores hormonosensibles; próstata, mama, ovario, endometrio, testículos, hipófisis, glándulas salivales y otros tipos de tumores, Io cual se expresa como reducción del volumen de los órganos diana, de Ia masa tumoral y en el aumento de Ia sobrevida de los individuos. La combinación descrita, no solo representa Ia sumatoria de Ia acción de los dos tipos de variantes (carboxilo terminal y amino terminal) sino que supone además, un sinergismo en su acción sobre el sistema inmunológico que se traduce en un efecto similar sobre los órganos dianas, una vez que ambas variantes son administradas en las combinaciones descritas anteriormente.

La presente invención tiene como ventaja sobre las similares descritas anteriormente, una acción más rápida y potente sobre los órganos dianas (testículos, próstata, ovarios..etc) y/o sobre los tumores dependientes de las hormonas sexuales (próstata, mama, ovarios, endometrio, glándulas salivales, testículos, etc); gracias al sinergismo logrado con Ia mezcla de las variantes carboxilo y amino terminal.

La combinación de las variantes propuestas, exhiben una estrecha relación entre los títulos de anticuerpos anti-GnRH generados, Ia reducción de los niveles de las hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos) hasta niveles de castración, y de éstos a su vez, con el efecto producido sobre los órganos dianas. Estos resultados, además de los claros efectos que presupone con el uso de adyuvantes oleosos del tipo del Montanide, permite como ventaja adicional, el uso de adyuvantes mucho menos potentes, como las sales de aluminio y otros adyuvantes no considerados "potentes", pero más inocuos, en el proceso de preparación de vacunas. Estos aspectos ofrecen una ventaja considerable a Ia mezcla de las variantes amino y carboxilo terminales de GnRH sobre cualquiera de los inmunógenos basados en Ia hormona GnRH reportados hasta el momento.

Descripción Detallada de Ia Invención. En estudios realizados en ratas adultas sanas, Ia generación de respuesta inmune usando las variantes peptídicas de Ia GnRH carboxilo y amino-terminal en una misma formulación o preparado vacunal, ha permitido obtener resultados superiores a los comparados con los esquemas de inmunización donde se usa sólo una variante (carboxilo o amino-terminal), de forma independiente. Los resultados descritos demuestran un sinergismo, tanto en Ia inmunocastración como en el tratamiento de enfermedades proliferativas benignas (ej. endometriosis), o malignas (cáncer de próstata, mama, endometrio, ovario, testículos, glándulas submaxilares) y otras sensibles a Ia depleción hormonal. En Ia presente invención, a diferencia de las técnicas practicadas anteriormente, Ia molécula de GnRH en su forma natural o sus miméticos, especialmente Ia variante denominada GnRHmI , puede ser unida directamente en el proceso de síntesis peptídica a una molécula portadora, o conjugada químicamente o clonada en forma de proteína de fusión a moléculas de reconocido poder inmunogénico, para formar dos variantes diferentes; carboxilo terminal y amino terminal. Estas variantes pueden utilizar como portadores, algunas de las proteínas más frecuentemente reportadas con este fin o sus epítopes, dígase Toxoide Tetánico, Toxoide Diftérico, proteína P64K de Neisseria meningitides, Antígeno de superficie de Ia hepatitis B, antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitos B, etc., de modo que esta mezcla provoque una rápida y potente respuesta inmunológica, cuyo sinergismo, conduce a Ia ablación de Ia GnRH y de las hormonas involucradas en Ia cascada GnRH/LH- FSH/Testosterona/Estrógenos. Las variantes, carboxilo terminal y amino terminal pueden ser usadas en una misma formulación en diferentes proporciones, donde Ia relación entre Ia variante carboxilo terminal respecto a Ia amino terminal varía desde 10:90 hasta 80:20 (peso/peso). De esta forma, Ia molécula GnRH que tiene unido el portador por su extremo carboxilo terminal, constituye en todos los casos al menos el 10% de Ia cantidad total de Ia mezcla, y a su vez Ia variante amino terminal representa el 20% de Ia mezcla total como mínimo.

Los mejores resultados en Ia combinación de las variantes carboxilo y amino- terminal, se obtienen cuando estas son mezcladas en una proporción del 50% (peso/peso) de cada una de las variantes. De forma similar, las moléculas de GnRH, carboxilo y amino terminal, pueden estar unidas a un mismo portador indistintamente en un caso por el amino y en el otro por su carboxilo terminal o por Io contrario, una variante, dígase Ia carboxilo terminal, puede estar unida a una molécula portadora y Ia otra, dígase amino terminal, puede estar unida a otra. Así, Ia mezcla inmunogénica puede estar constituida por ejemplo, por Ia GnRH o sus miméticos unidos en un caso a un portador como el TT o uno de sus epítopes y en el otro a Ia proteína p64K de Ia bacteria Neisseria meningitides o el antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitis B o sus epítopes u otra molécula portadora de comprobada inmunogenicidad.

Este tipo de combinación permite que al ser mezcladas las variantes carboxilo y amino terminal de GnRH con adyuvantes oleosos del tipo del Montanide, o adyuvantes hidrosolubles del tipo de Ia alúmina, QS 21 u otros, se obtenga una respuesta inmunológica más rápida y potente contra Ia GnRH que Ia observada utilizando otras variables de inmunógeno.

La potencialidad de Ia formulación descrita puede ser aumentada de forma 5 ostensible, si se adicionan además al preparado, inmunoestimulantes como los proteoliposomas de muy pequeño tamaño (VSSP, del inglés Very Small size Proteoliposoms), obtenidos de Ia mezcla de las lipoproteínas de Ia pared de Ia Neisseria meningitides con el gangliósido N-Acetil o N glicolil GM3, o de forma similar cuando esta es mezclada con adyuvantes hidrosolubles como cocleatos y

I O arginatos.

Esta invención, puede ser usada para Ia inmunización de un amplio rango de vertebrados y especialmente es de particular interés su uso como inmunógeno en mamíferos para Ia esterilización de animales mascotas, tales como perros, gatos, etc, o para el control de Ia fertilidad de especies salvajes como roedores, ardillas y

15 otros. La combinación propuesta asegura un mayor porciento de homogeneidad en Ia inmunocastración, como por ej. cerdos, chivos, etc. para evitar el desagradable olor que se produce en las carnes y grasa de estos animales. También permite producir esterilización controlada o Ia disminución de Ia agresividad de animales de importancia económica en los rebaños, como es el caso de toros, búfalos, equinos y 0 otros mamíferos. En Ia medicina humana, el uso de esta invención tiene aplicación directa en el tratamiento del cáncer de próstata y de mama, así como en el cáncer de útero, ovario, de testículo, de glándula submaxilar, en patologías hipofisarias, y en otros tipos de neoplasias hormonosensibles. Obtención de una preparación inmunogénica del tipo carboxilo terminal como 5 uno de los componentes de Ia combinación.

Uno de los componentes de Ia vacuna, Ia variante carboxilo-terminal puede estar constituida en uno de los casos por Ia molécula GnRH natural o uno de sus miméticos, dígase Ia molécula GnRHmI de secuencia QHWSYPLRPG unida al epítope T cooperador del toxoide tetánico 830-844, QYIKANSKFIGITEL, al péptido 0 P48-P64K de Ia Neisseria meningitides de secuencia IPGVAYTSPEVAWVG, o a Ia molécula completa P64K u otros portadores como el toxoide diftérico, el antígeno de superficie de Ia hepatitis B, el antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitis B, antígenos del circunsporozoito, etc o su uso como proteína de fusión obtenida a través de un sistema de expresión por construcciones genéticas. La síntesis química de los péptidos QHWSYPLRPGGGQYIKANSKFIGITEL y QHWSYPLRPGGGIPGVAYTSPEVAWVG y su emulsificación con un adyuvante oleoso del tipo del Montanide, ha demostrado tener un potente efecto de ablación sobre Ia testosterona, en solo 2 inmunizaciones en animales prepubers y de 3 a 4 inmunizaciones cuando este es administrado a animales adultos. Los títulos de anticuerpos específicos contra Ia hormona GnRH natural usando ambas variantes como inmunógeno, suelen ser de alrededor de 1/1000-1/2000 para Ia mayoría de los individuos después de Ia 4ta inmunización. El porciento de seroconversión suele estar en alrededor del 90%. Amino terminal, el segundo componente de Ia combinación.

De forma similar, Ia construcción de una molécula de GnRH natural o alguno de sus miméticos, como el caso de Ia GnRHmI descrita anteriormente unida por su extremo amino terminal al epítope 830-844 toxoide tetánico para formar Ia molécula (QYIKANSKFIGITELGGQHWSYPLRPG) O Ia unión de esta por su amino-terminal al péptido P48 de Ia proteína P64K de Ia bacteria Neisseria Meningitides (IPGVAYTSPEVAWVGGGGQHWSYPLRP), U otra molécula portadora del tipo de las mencionadas anteriormente, constituye un principio activo con un potencial mucho mayor de inmunogenicidad contra Ia hormona GnRH endógena, que el producido por Ia variante carboxilo terminal descrita anteriormente. Testimonio de ¹ ello, es que los individuos inmunizados con Ia variante TT-GnRHmI seroconvierten ' contra Ia hormona GnRH natural después de solo una inmunización, alcanzando títulos que oscilan entre 1 :6000 y 1 :12 000 después de Ia 3ra o 4ta inmunización y a su vez, Ia inmunización con Ia variante amino-terminal (P48-P64K-GnRHm1 ) genera una respuesta de anticuerpos significativa en el 90% de los animales después de solo una inmunización y títulos de anticuerpos anti GnRH entre 1 :5000 y 1 :12000 después de 4 administraciones. Estos títulos pueden considerarse como muy significativos, si se tiene en cuenta el pequeño tamaño de Ia molécula GnRH y además, que Ia misma constituye una molécula autóloga e idéntica en todos los mamíferos. Esta variante Amino terminal, no suele producir sin embargo, un efecto significativamente superior a Ia vahante carboxilo-terminal, cuando se analiza su efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos en machos u ovarios en hembras).

Descripción de las Figuras Figura 1. Representación esquemática de Ia secuencia aminoacídica de Ia GnRH natural, Ia variante GnRHmI -TT, TT-GnRHmI , GnRHmI -P48-P64K y P48-P64K- GnRHmL Figura. 2. Media de Ia seroconversión anti GnRH natural de los animales inmunizados con las diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora TT.

Figura 3. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH en ratas Copenhagen sanas inmunizadas con diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora TT .

Figura. 4. Evaluación del tamaño de los Testículos al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1 - Placebo, 2- GnRHmI-TT, 3- TT- GnRHmI , 4- Combinación 2+3 (50/50), 5- Combinación 2+3(70/30), 6- Esquema alterno Figura. 5. Evaluación del tamaño de Ia próstata al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1. Placebo, 2. GnRHmI -TT, 3. TT-GnRHmI , Combinación 2+3 (50/50), 5-Combinación 2+3(70/30), 6. Esquema alterno. Figura 6. Aspecto macroscópico de los testículos y Ia próstata de todos los animales que fueron evaluados en el ensayo (n =10). Los grupos representados de izquierda a derecha son: 1 ero - Placebo, 2do - GnRHmI -TT (C-T), 3ro - TT- GnRHmI (A-T), 4to - Combinación [C-T] + [A-T] (50/50), 5to - Combinación [C-T] + [A-T] (70/30) y 6to - Esquema alterno (AIt.).

Figura 7. Media de Ia seroconversión anti GnRH natural de los animales inmunizados con las diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora P48-P64K. Figura 8. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH en ratas Copenhagen sanas inmunizadas con diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora TP48-P64K.

Figura. 9. Evaluación del tamaño de los Testículos al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1 - Placebo, 2- GnRHm1-P48-P64K, 3- P48-P64K-GnRHm1 , A- Combinación 2+3 (50/50), 5- Combinación 2+3(70/30), 6- Esquema alterno

Figura. 10. Evaluación del tamaño de Ia próstata al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1- Placebo, 2- GnRHm1-P48-P64K, 3- P48-P64K- GnRHmI ₁ 4- Combinación 2+3 (50/50), 5- Combinación 2+3(70/30), 6- Esquema alterno. Figura 11. Evaluación del crecimiento tumoral de Ia línea Dunning R3327-H implantada en ratas Copenhagen previo a Ia inmunización de los animales.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:

5 Experimentos de inmunogenicidad y efecto sobre órganos diana con el péptido GnRHmI en las variantes carboxilo y amino terminal con diferentes moléculas portadoras.

Ejemplo 1. Inmunogenicidad de las variantes carboxilo y amino-terminal I O de GnRHmI utilizando el TT como molécula portadora.

La secuencia de los péptidos GnRH y TT sintetizados y usados en los ensayos biológicos, carboxilo y amino terminal, se encuentran descritos en Ia Fig.i a y 1 b.

1.1. Grupos Experimentales

1 - Placebo

15 2-Carboxilo terminal (GnRHmI -TT) 750 μg de péptido total. 3- Amino terminal (TT-GnRHmI ) 750 μg de péptido total

4-Combinación 50/50 (peso/peso) en una misma emulsión del carboxilo terminal - (GnRHmI -TT) + el amino terminal (TT-GnRHmI ). Se usaron 375 μg de cada uno a sumar 750 μg totales 0 5- Combinación 70/30 (peso/peso) en una misma emulsión de las variantes carboxilo (GnRHmI -TT) y amino terminal (TT-GnRHmI ). Se utilizaron: (525 μg del GnRHmI-TT y 225 μg del TT-GnRHmI ) para un total de 750 μg. 6- Inmunización alterna con 2 y 3, es decir se inmunizó con 750 μg de Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -TT) a los tiempos 0, 30 y 60 días y luego con 750 μg 5 de amino terminal (TT-GnRHmI ) en los tiempos 15 y 45 días.

En total se realizaron 5 inmunizaciones subcutáneas para cada variante, usando el adyuvante Montanide

1.2. Desarrollo experimental

1.2.1. Preparación de los inmunógenos, inmunización de los animales y 0 chequeo de los resultados:

1.2.2. Adyuvación: El péptido carboxilo terminal GnRHmI -TT y/o el péptido amino terminal TT-GnRHmI fueron pesados de acuerdo a Ia dosis propuesta y resuspendidos individualmente en agua para inyección. Posteriormente se realizó una mezcla 50% (v/v) de los péptidos resuspendidos con igual volumen de adyuvante oleoso. La mezcla fue finalmente agitada en un mezclador mecánico durante 20 minutos hasta que se formó una emulsión de color blanco lechosa, lista para ser administrada.

5 1.2.3. Inmunización: La emulsión fue cargada en jeringuillas desechables de 1 mL e inyectada por vía subcutánea en Ia región dorsal de ratas Copenhagen de 9-12 semanas de edad, usando un esquema quincenal.

1.2.4.Titulación de anticuerpos Anti-GnRH: Los anticuerpos circulantes anti GnRH obtenidos por Ia vacunación fueron determinados usando un sistema ELISA,

I O del inglés (Enzyme-linked-immunoassay). Para ello, fueron recubiertas placas de poliestireno de 96 pozos con el péptido nativo GnRH a una concentración de 5 μg/ml en 100 mM Na ₂ CÜ ₃ (pH 9.6) e incubado toda Ia noche a 4 °C. Después de varios lavados con PBS 1 x (pH 7.4), las placas fueron saturadas durante una hora con 2 % BSA in PBS. El suero de los animales se diluyó (rango: 1/60 hasta 1/2000) en PBS ^•

15 conteniendo 1 % BSA, Tween 20 (0.01 %, peso/vol) e incubadas por 3h a 37 ⁰ C. Las placas fueron lavadas varias veces con PBS y puestas a reaccionar con anticuerpos , anti -IgG de rata conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma Biochemical, USA). Después de otra operación de lavado, las placas se hicieron reaccionar con ^• una mezcla que contenía Ortophenilen-diamine (OPD) y el sustrato peróxido de ; 0 hidrógeno en buffer citrato. Los títulos de anticuerpos fueron calculados como Ia máxima dilución a Ia cual Ia absorbancia de las muestras fueron 2 veces superiores al valor de corte del ensayo.

1.2.5. Determinación de niveles de Testosterona: Los niveles de Testosterona fueron determinados utilizando el kit TESTO CT2 (CisBio, International, France). 5 Para este proceder, se tomaron 25 μl de suero de cada muestra y se dispensaron directamente en tubos pre-recubiertos. Las muestras fueron incubadas por duplicado. Finalmente los tubos fueron lavados con agua destilada y leídos en un contador gamma. Los resultados fueron expresados en nmol/L.

1.2.6. Sacrificio de los animales y análisis estadístico: Los animales fueron 0 anestesiados y luego sacrificados, de acuerdo a las normas de buenas prácticas de laboratorio, un mes posterior a Ia quinta inmunización (100 días). Para Ia evaluación de las diferencias estadísticas del tamaño de los testículos y Ia próstata se utilizó el Test de Duncan del Stat -Graphic. De forma similar los niveles de Testosterona fueron analizados utilizando este mismo paquete estadístico (SAS Institute Inc ,

SAS/STAT™ User ^' s Guidθ, Reléase 6.03 Edition. Cary, NC: SAS Institute Inc., 1988. 1028 pp). 5 1.3. Resultados experimentales

1.3.1. Análisis de Ia Seroconversiόn:

La molécula GnRH, como se ha explicado, al compartir el 100% de homología en todos los mamíferos y en un elevado nivel en los vertebrados superiores, y ser de muy pequeño tamaño (solo diez aminoácidos), confiere a este péptido muy poco

I O poder inmunogénico y en contraste una alta capacidad tolerogénica, debido a su naturaleza endógena.

En el ejemplo que describimos, el grupo inmunizado con Ia variante amino terminal con el péptido (TT-GnRHmI ), tuvo un 100% de seroconversiόn después de Ia primera inmunización, mientras que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo

15 terminal representado por el péptido (GnRHmI-TT), mostró entre un 80-90% de seroconversión, solo después de Ia 3ra inmunización. La combinación (50/50) de las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas, tuvieron un 100% de seroconversión después de Ia segunda inmunización y finalmente, Ia combinación de las variantes carboxilo y amino terminal en Ia proporción (70/30), y el esquema 0 de inmunización alterno, desarrollaron un 100% de seroconversión, después de Ia tercera inmunización (Fig.2).

1.3.2. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH:

La figura 3 relaciona los títulos de anticuerpos anti GnRH de los sueros de cada uno de los grupos experimentales. En este gráfico se observa que el 5 grupo TT-GnRHmI fue el que mostró mayor velocidad en Ia aparición de los títulos anti GnRH, los cuales oscilaron entre 1/6000 y 1/12 000, entre los 75 y 100 días de comenzado el experimento. De las variantes combinadas, Ia vahante (50/50) y (70/30), mostraron similares títulos de anticuerpos anti GnRH. Sin embargo, Ia variante (50/50), fue Ia que mostró mayor velocidad 0 de aparición de los títulos. El esquema de inmunización alterno con las variantes GnRHmI -TT y TT-GnRHmI , aunque mostró similar velocidad en Ia aparición en los títulos que Ia variante (70/30), no logró mantener sin embargo, títulos a niveles tan altos como Ia primera. En el grupo inmunizado con Ia variante GnRHmI-TT, los títulos aparecieron más tarde que el resto de los grupos experimentales (después de Ia tercera inmunización) y no alcanzaron niveles superiores a 1/1 OQO en los mejores casos.

1.3.3. Correlación de Ia respuesta humoral despertada contra diferentes zonas 5 de Ia hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana.

Se realizó un análisis de correlación entre los títulos de anticuerpo y el efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos). Como puede observarse en Ia fig 3, mientras Ia inmunización con Ia variante amino terminal TT-GnRHmI mostró una alta inmunogenicidad, Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -TT), mostró una

I O seroconversión mucho más lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra Ia GnRH. Estos ^' diferentes resultados en Ia seroconversión, no resultaron sin embargo ' en diferencias evidentes sobre los órganos diana al momento del sacrificio. Así, títulos tan altos como 1 :12000 del grupo inmunizado con Ia variante- amino terminal (TT-GnRHmI ), produjo efectos similares sobre los

15 órganos diana (próstata y testículos) que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI-TT) (Fig. 4 y 5).

Sin embargo, las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, logran por una parte una respuesta inmunológica significativamente superior a Ia obtenida con el péptido 0 carboxilo terminal individual, y aunque inferior a los títulos obtenidos con el uso de Ia variante aminotermínal, el efecto biológico resulta significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de inmunización de forma alterna. (Fig 4, 5, 6). 5

Ejemplo 2. Inmunogenicidad de las variantes carboxilo y amino-terminal de GnRHmI utilizando el péptido P48-P64K como molécula portadora. 2.1. Grupos Experimentales 1 - Placebo

30 2-Carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) 750 ug de péptido total. 3- Amino terminal (P48-P64K-GnRHm1 ) 750ug de péptido total 4-Comb¡nación 50/50 (w/w) en una misma emulsión del carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) + el amino terminal (P48-P64K-GnRHm1 ). Se usaron 375ug de cada uno a sumar 750 ug totales

5- Combinación 70/30 (p/p) en una misma emulsión de las variantes carboxilo (GnRHm1-P48-P64K) y amino terminal (P48-P _. 64K-GnRHm1 ). Se utilizaron: • (525ug del GnRHmI -P48-P64K y 225ug del P48-P64K-GnRHm1 ) para un total de

750 ug.

6- Inmunización alterna con 2 y 3, es decir se inmunizó con 750ug de Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) a los tiempos 0, 30 y 60 días y luego con 750ug de amino terminal (P48-P64K-GnRHm1 ) en los tiempos 15 y 45 días.

Se realizaron 5 inmunizaciones subcutáneas totales para cada variante usando el adyuvante Montanide .

2.2. Desarrollo experimental

La preparación de los inmunógenos, inmunización de los animales, chequeo de los resultados, y procesamiento estadístico, se realizó de forma similar a Io descrito desde 1.2.1 hasta 1.3.3.

2.3. Resultados experimentales

2.3.1. Análisis de Ia Seroconversión:

En este experimento, el grupo inmunizado con Ia variante amino terminal con el péptido (P48-P64K-GnRHm1 ), tuvo un 100% de serocoriversión después de Ia primera inmunización, mientras que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo terminal representado por el péptido (GnRHmI -P48-P64K), mostró entre un 70- 80% de seroconversión, solo después de Ia 3ra inmunización. Sin embargo, Ia combinación (50/50) de las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas, tuvieron un 100% de seroconversión después de Ia segunda inmunización. La combinación de las variantes carboxilo y amino terminal en Ia proporción (70/30), y el esquema de inmunización alterno, desarrollaron un 100% de seroconversión, después de Ia tercera inmunización (Fig. 7).

2.3.2. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH: La figura 8 relaciona los títulos de anticuerpos anti GnRH de los sueros de cada uno de los grupos experimentales. En este gráfico se observa que el grupo P48-P64K-GnRHm1 fue el que mostró mayor velocidad en Ia aparición de los títulos anti GnRH, los cuales oscilaron entre 1 /5000 y 1/8 000, al final del experimento. De las variantes combinadas, Ia variante (50/50) y (70/30), mostraron similares títulos de anticuerpos anti GnRH. Sin embargo, Ia variante (50/50), fue Ia que mostró mayor velocidad de aparición de los títulos. Por su parte, el esquema de inmunización alterno con las variantes GnRHm1-P48-P64K y P48-P64K-GnRHm1 , mostraron niveles de 5 inmunogenicidad similares a los despertados cuando se utilizó Ia variante (70/30), aunque no se logró mantener los títulos a niveles tan altos como Ia primera. En el grupo inmunizado con Ia variante GnRHm1-P48-P64K, los títulos aparecieron más tarde que el resto de los grupos experimentales, y no alcanzaron niveles superiores a 1/1000 en los mejores casos.

I O 2.3.3. Correlación de Ia respuesta humoral despertada contra diferentes zonas de Ia hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana.

Como puede observarse en las fig. 7 y 8, mientras Ia inmunización con Ia vanante amino terminal P48-P64K-GnRHm1 mostró una alta inmunogenicidad, Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K), mostró una seroconversión mucho más

15 lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra Ia GnRH. Estas diferencias en Ia seroconversión, no resultaron sin embargo, en diferencias evidentes sobre los órganos diana al momento del sacrificio. Así, títulos tan altos como 1 :8000 del grupo inmunizado con Ia variante amino terminal (P48-P64K- GnRHmI ), produjo efectos similares sobre los órganos diana (testículos y próstata) 0 que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) (Fig. 9 y 10).

Por su parte, las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, logran una respuesta inmunológica significativamente superior a Ia obtenida con el péptido carboxilo 5 terminal individual, y aunque inferior a los títulos obtenidos con el uso de Ia variante aminoterminal, el efecto biológico resulta significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de inmunización de forma alterna (Fig. 8, 9 y 10). 0 Ejemplo 3. Correlación de Ia respuesta humoral despertada contra diferentes zonas de Ia hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana. La combinación de estos efectos. Una vez analizados los títulos de anticuerpos, se realizó un análisis de correlación entre estos y el efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos). Como puede observarse en las figuras 3 y 8, en los grupos experimentales 2 y 3, correspondiente a las variantes carboxilo terminal y amino terminal, se observó un comportamiento 5 totalmente diferente respecto a su capacidad inmunogénica, es decir, mientras el amino terminal, representado por los péptidos TT-GnRHmI y P48-P64K-GnRHm1 , mostraron una alta velocidad de producción de anticuerpos contra Ia GnRH en los modelos utilizados y elevados títulos contra esta hormona, Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI-TT y GnRHm1-P48-P64K), mostraron una seroconversión

I O mucho más lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra Ia GnRH. Estos diferentes resultados en Ia seroconversión y en Ia titulación de los sueros, arrojaron sin embargo similares resultados en su acción sobre los órganos diana cuando los animales fueron evaluados al sacrificio. Así, se pudo observar que títulos de anticuerpos tan altos como 1 :12000 en los grupos inmunizados con las

15 variantes amino terminal, produjeron efectos similares sobre los órganos diana (testículos y próstata ) que los grupos inmunizados con las variantes carboxilo terminal (Fig. 4, 5 y 9,10). Sin embargo, si las variantes carboxilo y amino terminal se mezclan en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, se logra por una parte, una respuesta inmunológica significativamente superior a Ja 0 obtenida con el péptido carboxilo terminal individual, Ia cual aunque no llega a alcanzar valores de titulación tan elevados como con el uso de Ia variante aminoterminal, produce sin embargo, un efecto biológico significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de 5 inmunización de forma alterna (Fig 4, 5, 9 y 10).

Los resultados descritos aquí, hablan a favor de que Ia presencia del grupo carboxilo libre en Ia GnRH estimula de forma muy potente Ia respuesta inmunológica contra esta hormona, cuando esta es unida a una molécula portadora por su extremo amino-terminal y probablemente a otra zona alejada del carboxilo. Lo 0 contrario sucede con Ia variante carboxilo terminal, Ia cual al unirse con Ia molécula portadora por su extremo carboxilo, parece estar comprometiendo Ia exposición al sistema inmunológico de esta zona y solo exponiendo su extremo amino, el cual no presenta Ia alta capacidad inmunoestimulante que el primero, pero que sin embargo, es capaz de generar una respuesta que aunque es 10 veces menor, es simílarmente neutralizante de Ia hormona, cuando esta es administrada en iguales dosis que Ia variante aminoterminal.

Estos hallazgos permiten afirmar que para Ia GnRH, similar a Io que ocurre con otras proteínas y péptidos, se cumple que las zonas más inmunogénicas, no son necesariamente las más inmuno-neutralizantes.

Estos resultados permiten concluir que el uso simultáneo en un mismo esquema de inmunización de una mezcla de 2 variantes de GnRH o sus miméticos unidos a una molécula portadora en un caso por su amino y en el otro por su carboxilo terminal, producen un sinergismo en Ia respuesta inmunológica de anticuerpos contra Ia GnRH del individuo, Io cual resulta superior a Ia simple sumatoria de los efectos esperados en cada caso.

Los resultados de Ia inmunización con Ia mezcla de los péptidos y su uso como inmunógenos se hizo más marcado en las vahantes de combinación (50/50) y (70/30), en ese orden donde se observa un franco efecto sinérgico en Ia reducción del tamaño de los testículos y Ia próstata. También aunque en menor proporción, se observa un efecto combinado con el uso del esquema de inmunización secuencial o alterno, los cuales se vieron materializados fundamentalmente en el potente efecto atrofiante sobre los testículos y Ia próstata. En Ia realización de los cálculos, el Efecto del tratamiento (ETratamiento) se consideró como Ia unidad menos Ia relación de Ia media del peso de los órganos (próstata y testículos) en los animales tratados (PTratamiento) y Ia media del peso de los órganos diana en los animales placebos (PPIacebo). ETratamiento = 1 - (PTratamiento/ PPIacebo) (1 ) Como se puede apreciar en las Tablas No. 1 a y 1 b, para Ia combinación carboxilo + amino terminal (50/50), el efecto experimental sobre Ia próstata y los testículos, resultó superior al efecto teórico o esperado, quedando demostrado el efecto sinérgico de esta combinación en Ia reducción del tamaño de estos órganos utilizando cualquiera de las moléculas portadoras descritas en Ia figura 1. Para el caso de Ia combinación de las 2 variantes peptídicas en Ia relación (70/30), se obtuvieron resultados muy similares a los observados con Ia combinación carboxilo + amino terminal (50/50). En el esquema alterno, aunque como se ha mostrado resultaron ser significativamente superiores a las variantes individuales de inmunización, referidos a su efecto biológico sobre los órganos blanco descritos (próstata y testículos), solo se observó el resultado de Ia sumatoria de dichos efectos.

El resultado global del efecto sinérgico que tuvo Ia inmunización combinada comparada con las variantes individuales de cada uno de los péptidos cuando estos fueron utilizados por separado en Ia inmunización de animales adultos sanos, se presentan en Ia Tabla 1 a y b.

Tabla 1. Resumen de los valores teóricos y experimentales utilizando las variantes carboxilo y amino-terminal de Ia GnRHmI con 2 moléculas transportadoras diferentes. A) Efecto obtenido con las moléculas GnRHmI-TT y TT-GnRHmL B)

Efecto generado con Ia utilización de Ia variante GnRHmI -P48-P64K y P48-P64K-

GnRHmL

Λ)

B)

Ejemplo 4. Experimentos de terapia usando las variantes GnRHmI-TT y TT- GnRHmI individuales y sus combinaciones (GnRHmI-TT +TT-GnRHmI ) en ratas adultas Copenhagen implantadas con Ia linea celular Dunning R3327-H.

4.1. Animales, modelo tumoral: Fragmentos de tumor de (2 x 2 x 2 mm) del modelo tumoral murino Dunning R3327-H, fueron transplantados subcutáneamente (s.c). en Ia zona distal de Ia extremidad posterior derecha de ratas Copenhagen adultas con un peso de entre 150 y 200 g. (CENPALAB, Cuba). Esta es una línea tumoral altamente diferenciada, hormono-dependiente, con un tiempo de replicación, (VDT) del inglés, (volume doublimng time) de 17 días. Para Ia determinación de Ia tasa de crecimiento tumoral, los tumores fueron medidos rutinariamente una vez por semana. El volumen tumoral fue calculado usando Ia fórmula 4/3 π r ³ donde r, es Ia media del radio. Los animales fueron mantenidos con dieta comercial y agua fresca at libitum.

4.2. Diseño experimental:

El experimento contó con los siguientes grupos:

1. Animales placebos (inmunizados con PBS en Montanide ISA 51 ).

2. Animales castrados quirúrgicamente.

3. Animales inmunizados con el péptido GnRHmI -I 4. Animales inmunizados con una mezcla (50/50) de los péptidos GnRHmI -TT + TT-GnRHmL

5. Animales inmunizados con el péptido GnRHmI -P48-P64K

6. Animales inmunizados con una mezcla (50/50) de los péptidos GnRHmI -P48- 5 P64K + P48-P64K-GnRHm1.

4.3. Tratamiento de los animales: El tratamiento de los animales se realizó utilizando un modelo terapéutico, en el cual se inocularon fragmentos de Ia línea tumoral Dunning R3327-H, tal y como se describe en el acápite 3.1.1. La intervención terapéutica (inmunizaciones), se comenzaron cuando los tumores

I O alcanzaron un diámetro de aproximadamente 10 mm. Las inmunizaciones se realizaron con un intervalo quincenal.

Las dosis utilizadas en el experimento para los grupos del 3 al 6, fueron las mismas que las descritas en el acápite 1.1.

4.4. Resultados experimentales:

15 Evaluación de Ia velocidad de crecimiento tumoral de las ratas Copenhagen implantadas con Ia línea tumoral Dunning R3327-H.

Como puede apreciarse en Ia figura 11 , mientras en el grupo placebo se observó un crecimiento abrupto del tumor, en los grupos castrados e inmunizados con se observa una marcada inhibición del crecimiento tumoral. No obstante Ia mayor 0 inhibición del crecimiento tumoral se observó en los animales castrados y en los grupos de animales inmunizados con las variantes combinadas GnRHmI -TT+TT- GnRHmI (50/50) y GnRHmI -P48-P64K + P48-P64K-GnRHm1 (50/50). La inhibición para estas 3 variantes experimentales fue muy similar y resultó significativa en comparación con el placebo y los restantes tratamientos 5