DOMAINE TECHNIQUE

L'invention concerne un nouvel activateur pharmacologique et/ou génétique pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, en particulier pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), ainsi que la sarcopénie. L'invention concerne également un nouveau vecteur adénoviral pour son utilisation à titre de médicament.

TECH NIQU E ANTERIEU RE

La dystrophie musculaire est une atteinte neuromusculaire héréditaire de nature progressive, résultant de la mutation d'un ou de plusieurs gènes destinés à assurer les fonctions et structures musculaires.

La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus répandue des myopathies de l'enfant. Elle est due à des anomalies d'une protéine indispensable aux muscles, la dystrophine. Elle se caractérise par un déclin de la régénération musculaire contribuant à la perte de masse musculaire.

Chez les patients atteints de myopathie de Duchenne, en l'absence de dystrophine, les fibres qui constituent les muscles squelettiques, les muscles lisses et le muscle cardiaque s'abîment à chaque contraction et finissent par se détruire.

La dystrophie musculaire de Duchenne est due à une anomalie génétique récessive dans le gène DMD, sur le chromosome X, entraînant l'absence de dystrophine.

La dystrophine est une grande protéine qui assure le lien entre le cytosquelette contractile et la matrice extracellulaire, par l'intermédiaire d'un complexe protéique appelé complexe membranaire de la dystrophine, et joue un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité des fibres musculaires lors de la contraction.

La dystrophine est une protéine constituée de 3685 acides aminés pour un poids moléculaire de 427 kDa. Elle est encodée par le gène DMD qui permet la synthèse de 7 isoformes principales, de tailles différentes, grâce à la présence de 7 promoteurs tissus-spécifiques.

Trois de ces promoteurs (appelés promoteurs M, B et P indiquant une expression dans les tissus « Muscle (Muscle) », « Cerveau (Brain) » et « Neurones de Purkinje du cortex cérébelleux (Purkinje cerebellar neurons) ») sont situés en amont du premier exon et permettent la synthèse des dystrophines de pleine longueur fonctionnellement équivalentes.

Les quatre autres promoteurs sont intra-géniques et permettent la synthèse d'isoformes de taille réduite.

La dystrophine fait partie de la famille des protéines filamenteuses de type « spectrine » qui sont présentes dans les tissus musculaires squelettique et cardiaque, le cerveau, la rétine, les cellules gliales et de Purkinje et en quantité très réduite dans les lymphocytes. La dystrophine est composée de quatre grands domaines qui interagissent avec plusieurs partenaires de la cellule musculaire et jouent un rôle essentiel durant le cycle de contraction- relaxation musculaire : le domaine N-terminal ou domaine de liaison à l'actine (Actin Binding Domain ou ABD1 ), comprenant les premiers 246 acides aminés ; le domaine central (ou rod domain) allant de l'acide aminé 247 au 3045. Il est constitué de 24 répétitions homologues à la spectrine (ou spectrine like, RI à R24) et de 4 charnières riches en proline (ou hinges, HI à H4) divisant le domaine central en 3 sous-domaines ; le domaine riche en cystéine (cysteine rich repeats ou CR) allant de l'acide aminé 3080 à 3360 ; et le domaine C-terminal formé des 325 derniers résidus.

De nombreux essais cliniques sont en cours pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne en thérapie génique ou pharmacologique.

Les thérapies géniques visent à obtenir une production de dystrophine fonctionnelle dans le muscle.

Un premier essai clinique a démarré récemment en France. Il évalue un produit de thérapie génique associant une version raccourcie du gène DMD et un vecteur viral adéno-associé AAV.

Les thérapies pharmacologiques agissent sur certaines manifestations de la maladie pour ralentir son évolution. Plusieurs médicaments sont à l'étude pour améliorer et/ou protéger la fonction musculaire et/ou cardiaque, lutter contre l'inflammation et les effets de l'absence de dystrophine sur les cellules musculaires : le tamoxifène, le nébivolol, le givinostat, le riméporide, etc.

Le document brevet WO2018155913 concerne une composition comprenant des composés chimiques choisis parmi les inhibiteurs de la pan-histone désacétylase, les inhibiteurs de l'ALK5 (inhibiteur de la kinase 5 semblable au récepteur de l'activine A) et les activateurs de signalisation de l'AMPc permettant d'induire la différenciation de cellules somatiques, de cellules souches mésenchymateuses ou de cellules souches adultes (à l'exception des cellules souches musculaires) en cellules de muscle squelettique pour le traitement de maladies du muscle squelettique. Il met en œuvre un procédé dans lequel des cellules sont cultivées dans un milieu de culture contenant la composition induisant la différenciation en cellules de muscle squelettique. Les cellules de muscle squelettique ainsi obtenues ne présentent aucun risque d'oncogenèse après implantation du fait de la différenciation à partir de cellules somatiques, et présentent l'avantage d'être génétiquement stables en raison de l'utilisation d'un mélange de composés de faible poids moléculaire seuls, sans introduction de génétique.

PROBLEME TECHNIQU E

Considérant ce qui précède, un problème que se propose de résoudre la présente invention consiste à développer une nouvelle thérapie pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire et traiter notamment la dystrophie musculaire de Duchenne.

Or, à ce jour, aucune thérapie connue ne vise à cibler la sénescence cellulaire des cellules souches musculaires pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne. La sénescence des cellules souches musculaires est un des effets causés par la dystrophie musculaire de Duchenne (Sugihara, Hidetoshi et al. “Cellular senescence-mediated exacerbation of Duchenne muscular dystrophy." Scientific reports vol. 10,1 16385. 12 Oct. 2020, doi:10.1038/s41598-020-73315-6). Ceci contribue à la forte réduction de la régénération musculaire et provoque ainsi l'aggravation de la pathologie.

SOLUTION TECHNIQUE

La solution à ce problème posé a pour premier objet un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.

De manière surprenante, cibler la signalisation du TSHR de manière pharmacologique et/ou génétique permet de préserver les capacités de prolifération et de différenciation des cellules souches musculaires en bloquant la sénescence. L'activation de la signalisation TSHR dans les cellules souches musculaires augmente les propriétés de régénération des muscles atteints notamment de la dystrophie musculaire de Duchenne et préserve la structure et la fonction musculaires, en empêchant la fonte musculaire rapide qui se produit avec la progression de la pathologie.

Elle a également pour objet une combinaison d'un activateur pharmacologique et d'un activateur génétique pour leurs utilisations selon l'invention.

L'invention a également pour objet un vecteur adénoviral caractérisé en ce qu'il comprend une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2pour son utilisation à titre de médicament.

AVANTAGES APPORTES

Le Demandeur a notamment pu développer un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans les cellules souches musculaires permettant d'augmenter la régénération musculaire en prévenant la perte de masse musculaire et la substitution par des tissus adipeux et fibreux. Cette approche permettra de maintenir la fonctionnalité des muscles et de ralentir la progression de la dystrophie musculaire de Duchenne.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, illustrés au regard des dessins annexés dans lesquels :

[fig. 1] illustre la génération des rats R-DMDdel52 telle que détaillée dans l'exemple 1 dans laquelle : IA) est une observation de la Dystrophine et de la |3-Dystroglycane (en gris) par immunofluorescence au niveau du tibia antérieur des rats WT et des rats R-DMDdel52 à l'âge de 3 semaines et de 12 mois. (Barre d'échelle = à 20|_im).

1 B) est une analyse du taux d'expression de la Dystrophine au niveau du tibia antérieur d'un rat WT et de deux rats R-DMDdel52 (DMD #1, DMD#2) à l'âge de 16 semaines par Western Blot. La (3-Tubuline est utilisé comme gène de ménage.

I C) représente une courbe de survie des rats WT et des rats DMD par l'estimateur de Kaplan Meier.

I D) détaille la coloration du tissu musculaire du tibia antérieur, à l'Hématoxyline et l' Eosine (panel du dessus) et au rouge Sirius (panel du dessous), provenant de rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 12 mois. (Barre d'échelle = 20 m).

1 E) représente la quantification de dépôt de tissu fibreux grâce au pourcentage de surface teinté au rouge Sirius au niveau du tibia antérieur chez des rats WT et R-DMDdel52 de l'âge de 12mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.

1 F) correspond au pourcentage de myofibrilles à noyau central au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.

1 G) correspond au pourcentage de distribution des tailles des fibres musculaires de la section transversal au niveau du tibia antérieur chez des rats WT et R-DMDdel52 de l'âge de 12mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test ANOVA. Les p values sont calculés par le Sidak's post test.

1 H) détaille la coloration des muscles extra -oculaires, à l' Hématoxyline et l' Eosine (panel du dessus, en blanc) et au rouge Sirius (panel du dessous, en noir), provenant de rats WT et R- DMDdel52 à l'âge de 12 mois. (Barre d'échelle = 20 m).

11) représente la quantification de dépôt de tissu fibreux grâce au pourcentage de surface teinté au rouge Sirius au niveau des muscles extra-oculaires chez des rats WT et R-DMDdel52 de l'âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.

1 J) correspond au pourcentage de myofibrilles à noyau central au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.

1 K) correspond au pourcentage de distribution de la section transversal au niveau des muscles extra-oculaires chez des rats WT et R-DMDdel52 de l’âge de 12 mois. Moyenne ± écart- type (n=3), test ANOVA. Les p values sont calculés par le Sidak's post test.

[fig. 2] illustre la régénération continue musculaire des muscles extra-oculaires progressive dans le modèle DMD du rat telle que détaillée dans l'exemple 2 dans laquelle :

2A) est une observation de la chaîne légère de myosine embryonnaire (eMHC - embryonic myosin heavy chain, amas gris dans le panel du dessous à gauche) et de la laminine (sous forme de réseau) au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-D Ddel52 âgés de 3 semaines,

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP 6 mois et 12 mois, par immunofluorescence, le noyau est marqué grâce au colorant bleu Hoechst. (Barre d'échelle = 20 pm) .

2B) correspond aux quantifications du nombre d'eMHC par mm2 au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3) , test de Mann-Whitney.

2C) est une observation de la chaîne légère d'eMHC (amas gris) et de la laminine (sous forme de réseau condensé) au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois, par immunofluorescence, le noyau est marqué grâce au colorant bleu Hoechst. (Barre d'échelle = 20 pm).

2D) correspond aux quantifications du nombre d'eMHC par mm2 au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart- type (n=3), test de Mann-Whitney.

2E) correspond à une coloration représentative par co-immunofluorescence au niveau du tibia antérieur, utilisant des anticorps Ki67 (en triangle blanc), Pax7 (encadré 0), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst (les ronds dans les cellules) . Les encadrés jaunes indiquent une coexpression de Pax7 et Ki67 et les rectangles gris indiquent PAX7+/KI67- des cellules souches musculaires. (Barre d'échelle = 10 pm) .

2F) représente la quantification de E montrant le nombre de cellules musculaires (PAX7+) par fibre au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.

2G) représente la quantification du pourcentage de CSM (Cellules souches musculaires) quiescentes (Pax7+/Ki67-) et de CSM prolifératives (Pax7+/Ki67+) sur les TA isolés des rats WT et R- DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann- Whitney.

[fig. 3] illustre le potentiel myogénique des CSM des rats R-DMDdel52 du TA in vitro dans laquelle :

3A-B) correspondent à une coloration représentative par co-immunofluorescence de Ki67 (rond), MyoD (carré) et des noyaux (Hoechst, étoile) de myoblastes isolés à partir du tibia antérieur (A) et des muscles extra-oculaires (B) des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD. Barre d'échelle 20 pm.

3C) correspond aux quantifications des myoblastes MyoD+/KI67+ et MyoD+/KI67- à partir du tibia antérieur et des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.

3D-E) représentent le marquage par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20 sous formes de filaments) et des noyaux (Hoechst,) des myotubes différentiés au niveau du tibia antérieur (D) et des muscles extra-oculaires (E) des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Barre d'échelle 20 pm. 3F) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés du et des MEO (Muscles Extra-Oculaires) à l'âge de 3 semaines. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

3G) représente le nombre de noyaux par myotube par champ (mm2) pour les myotubes WT et R-DMDdel52 isolés de TA et MEO à l'âge de 3 semaines. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

H-l) correspondent à une coloration par co-immunofluorescence de KI67, MyoD et noyaux (Hoechst) de myoblastes isolés du TA (H) et des MEO (I) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD, tandis que les étoiles mettent en évidence les myoblastes MyoD+/KI67-, Barre d'échelle de 20 m.

3J) représente les quantifications des myoblastes MyoD+/KI67+ et MyoD+/Ki67- provenant du TA et des MEO WT et R-DMDdel52 à 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann- Whitney.

3K-L) correspondent à une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, vert) et des noyaux (Hoechst, bleu) des myotubes différenciés du TA (K) et des MEO (L) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Barre d'échelle de 20 m.

3M) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés du TA et des MEO des rats âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

3N) représente le nombre de noyaux par myotube par champ (mm2) pour les myotubes WT et R-DMDdel52 isolés du TA et MEO des rats âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

30) correspond à une coloration par co-immunofluorescence de l'Edll, de Pax7/MyoD et des noyaux (Hoechst) de myoblastes triés par FACS provenant de muscles de membres isolés de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs comarqués par KI67 et MyoD, tandis que les étoiles mettent en évidence les myoblastes MyoD-positifs négatifs pour ki67. Barre d'échelle de 20 m.

3P) correspond au pourcentage de type cellulaire (Pax7+/MyoD+ et Pax7+/MyoD-) pour évaluer la pureté des cellules après le tri FACS.

3Q) correspond à la quantification des myoblastes prolifératifs (EdU+) (Pax7:MyoD+) à partir de cellules triées par FACS et isolées des muscles des membres de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

3R) est une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de large bande (WT) et un trait épais (DMD)) et des noyaux (Hoechst, en rond) sur des myotubes différenciés à partir de myoblastes triés par FACS de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Barre d'échelle 50 m.

3S) correspond à la quantification de l'indice de fusion par champ pour l'expérience réalisée en (R) .

[fig. 4] illustre l'expression des marqueurs de sénescence au niveau des cellules satellites du muscle Tibialis anterior (TA) R-DMDdel52 telle que détaillée dans l'exemple 4, dans laquelle :. 4A) correspond à un graphique tracé par l'algorithme t-SNE sur le regroupement des populations de cellules résidant dans les muscles, révélé par l'analyse scRNA-seq sur le TA de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois.

4B) correspond à un graphique t-SNE divisé entre WT et R-DMDdel52.

4C) correspond à un graphique t-SNE montrant l'expression de Cdkn la et Cdkn2a au niveau des cellules souches musculaires (CSM) des échantillons WT et R-DMDdel52.

4D) représente des diagrammes de violon montrant la distribution de l'expression génique de Pax7 et Myf5 comme gènes spécifiques de CSM et de Cdkn 1 a et Cdkn2a comme marqueurs de sénescence.

4E-F-G) correspondent à une coloration du TA par co-immunofluorescence, en utilisant des anticorps contre Pax7 , Cdkn2a (aussi appelé pl 6 ; étoile, E) ou Cdknl a (aussi appelé p21 ; étoile, F) ou yH2AX (étoile, G), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst pour les noyaux. Les triangles mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10pm.

4H) correspond à la quantification de E montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdkn2a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA des rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

41) correspond à la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdknl a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA chez les rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

4J) correspond à la quantification de G montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant yH2AX à l'âge de 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA des rats WT et R- DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

[fig. 5] illustre l'expression des marqueurs de sénescence au niveau des CSM de patients humains atteints de DMD telle que détaillée à l'exemple 5, dans laquelle :

5A) représente une immunofluorescence pour la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC, gros cercle gris rempli) et la laminine (sous forme de réseau) sur des biopsies humaines témoins et DMD à l'âge de 1 -2, 3-4, 5-6, 7-8 ans. Barre d'échelle 20pm.

5B) correspond à la quantification du nombre de myofibres eMHC+ par mm ² par rapport à A. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=20), test de Mann-Whitney.

5C) est une coloration par co-immunofluorescence de biopsies musculaires de DMD et de contrôle, en utilisant des anticorps contre Pax7, Cdkn2a (rouge) et Hoechst. Les triangles jaunes mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10 m.

5D) représente la quantification de C montrant le pourcentage de CSM Pax7 co-exprimant Cdkn2a dans les biopsies musculaires DMD et contrôle. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=20), test de Mann-Whitney.

5E) représente un test de corrélation de Pearson montrant la corrélation entre les CSM DMD exprimant Cdkn2a et l'âge (Contrôle n=12 ; DMD n=20) . 5F) est une coloration représentative par co-immunofluorescence de biopsies musculaires de DMD et de contrôle, en utilisant des anticorps contre Pax7, yH2AX (étoile) et Hoechst. Les triangles mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle lOpm.

5G) représente la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant yH2AX dans les biopsies musculaires DMD et contrôle. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=l 5), test de Mann-Whitney.

5H) représente un test de corrélation de Pearson entre les CSM DMD exprimant yH2AX et l'âge (Contrôle n=12 ; DMD n= 15) .

[fig. 6] illustre l'expression d'une signature spécifique des CSM au niveau des MEC distincte de celle au niveau du TA telle que détaillée à l'exemple 6, dans laquelle :

6A) est un graphique tracé par l'algorithme t-SNE du regroupement des populations de cellules résidant dans les muscles, révélé par scRNA-seq au niveau du TA (panneaux de gauche) et des MEO (panneaux de droite) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois, montrant l'expression de Pax7, Pitx2, Cdkn la, Cdkn2a et Tshr. Les carrés indiquent le groupe de CSM.

6B-C) représentent des diagrammes de Violon montrant la distribution de l'expression génique de Fax/, Cdkn la, Cdkn2a en B et Myf5, Pitx2 et Tshr en C à partir de l'analyse scRNAseq effectuée au niveau du TA et des MEO de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois.

6D) est une analyse qPCR des myoblastes dérivés des MEO et des membres en tant que pli d'expression relatif aux myoblastes dérivés des MEO pour Cdknl a, Cdkn2a et Tshr. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

6E-G) correspondent à une coloration par co-immunofluorescence des MEO, en utilisant des anticorps contre Pax7, Cdkn2a (E) ou Cdknl a (F) ou yH2AX (, G), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst. Les triangles mettent en évidence les CSM (PAX7+) . Barre d'échelle l Opm.

6H) correspond à la quantification de E montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdkn2a à l’âge de 3 semaines, 6 mois et 12 mois des rats au niveau du TA WT et R- DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

61) correspond à la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdknl a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois chez les TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

6J) correspond à la quantification de G montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant yH2AX à 3 semaines, 6 mois et 12 mois chez les TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart- type (n = 3), test de Mann-Whitney.

[fig. 7] illustre la régulation de la sénescence au niveaux des myoblastes isolés des MEO chez les rats R-DMDdel2, dans laquelle :

7A) correspond à une immunofluorescence pour TSHR (étoiles) et Pax7/MyoD sur des myoblastes des rats âgés de 3 mois isolés des MEO (à gauche) et des muscles des membres (à droite) . Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst. Barre d'échelle de 20 m. 7B) est une coloration par co-immunofluorescence de l'Edll (panels du milieu), de Pax7/MyoD (panels à gauche) et des noyaux (Hoechst, panels de droite) des myoblastes dérivés de l'OME traités par véhicule (DMSO) ou ML224. Barre d'échelle de 20 m.

7C) correspond aux quantifications des myoblastes prolifératifs (EdU+) (Pax7/MyoD+) provenant de myoblastes dérivés des MEO traités avec le véhicule (DMSO) ou l'inhibiteur du TSHR ML224. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

7D) est une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de bande) et des noyaux (Hoechst) de myotubes différenciés issus de cellules MEO traitées avec véhicule (DMSO) ou ML224. Barre d'échelle de 20pm.

7E) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés des MEO, traités avec le véhicule (DMSO) ou ML224. Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann- Whitney.

7F) correspond à une analyse qPCR sur les myoblastes dérivés des MEO traités avec véhicule ou ML224, évaluant l'expression génétique de Cdknla et Cdkn2a. Moyennes ± écart- type (n = 4-5), test de Mann-Whitney.

7G) représente une coloration représentative par co-immunofluorescence de Pax7/MyoD (panels de gauche), de l'EdU (panels du milieu) et des noyaux (Hoechst, panels de droite) sur des myoblastes isolés de muscles de membres WT et R-DMDdel52 traités par véhicule (DMSO) ou par l’activateur de l'adénylate cyclase Forskoline. Barre d'échelle de 20 m.

7H) correspond aux quantifications des myoblastes Pax7:MyoD+/EdU+ et Pax7:MyoD+/EdU- provenant de myoblastes WT et R-DMDdel52 isolés à partir de muscles des membres après traitement par la Forskoline ou par le véhicule (DMSO). Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.

71-J) correspondent à l’analyse qPCR sur des myoblastes dérivés de membres traités par véhicule ou par Forskoline provenant de rats WT et R-DMDdel52, évaluant l'expression génétique de Cdknla (I) et Cdkn2a (J) . Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.

7K) représente une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de bandes) et des noyaux (Hoechst, ronds) de myotubes différenciés provenant de cellules de membres WT et R-DMDdel52 traitées par véhicule (DMSO) ou par Forskoline. Barre d'échelle de 20 m.

7L) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur des myotubes différenciés provenant de muscles de membres WT et R-DMDdel52, traités avec le véhicule (DMSO) ou la Forskoline. Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.

8A) correspond au Schéma du lentivirus TSHR Tomato

8B) montre l'expression de Tomato dans des myoblastes WT et DMD transduits avec un lentivirus contrôle (Tomato) ou avec le lentivirus TSHR Tomato.

8C) représente une analyse par qPCR des niveaux de transcription du gène TSHR.

8D) correspond au pourcentage de myoblastes MyoD-positifs exprimant le marqueur de sénescence pl 6. DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION

L'invention concerne un activateur de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, préférentiellement chez l' Homme et l'animal, encore plus préférentiellement chez l' Homme.

Préférentiellement, l'invention concerne un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, préférentiellement chez l' Homme et l'animal, encore plus préférentiellement chez l' Homme.

De manière surprenante, le Demandeur a ainsi pu identifier de nouveaux activateurs pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR), pris seul ou en combinaison, pour leur utilisation spécifiquement au niveau des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour bloquer leur sénescence.

Le TSHR appartient à la famille des récepteurs glycoprotéiques de la rhodopsine qui, lorsqu'il est activé, stimule l'adénylate cyclase, activant la voie de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc)/protéine kinase A (PKA) (Morshed et al., “Characterization of thyrotropin receptor antibody-induced signaling cascades." Endocrinology vol. 150,1 (2009) : 51 -29 : Rowe et al., "Tezacaftor-lvacaftor in Residual-Function Heterozygotes with Cystic Fibrosis." The New England journal of medicine vol. 377,21 (2017) : 2024-2035) .

La sénescence des cellules souches musculaires est un des effets causés par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ceci contribue à la forte réduction de la régénération musculaire et provoque ainsi l'aggravation de la pathologie.

Préférentiellement, préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence des cellules souches musculaires (cellules satellites) permet de prévenir et/ou traiter les myopathies, plus préférentiellement la DMD.

Selon un autre mode de réalisation, les activateurs pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) utilisés selon l'invention permettent de prévenir et/ou traiter la sarcopénie.

Par sarcopénie, on entend un syndrome gériatrique se caractérisant dans un premier temps par une diminution des capacités musculaires due à l'âge et qui en s'aggravant sera à l’origine d'une détérioration de la force musculaire et des performances physiques. La sarcopénie observée chez la personne âgée est imputable au processus de vieillissement mais peut être accélérée par des facteurs pathologiques et comportementaux tels que la dénutrition et la sédentarité. Dès 30 ans, on observe une dégénérescence musculaire de 3 à 8 % par décennie. Le tissu musculaire est remplacé par la masse grasse et cette perte s'accélère à partir de 50 ans. En effet, la masse musculaire décline approximativement de 1 à 2 % par an passé l'âge de 50 ans tandis que la force décline en moyenne de 1 ,5 % par an entre 50 et 60 ans (-15 %), puis au rythme de 3 % par an, soit une perte de 30 % par décennie après 60 ans. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'activateur de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) utilisé selon l'invention est un activateur choisi parmi un agoniste du récepteur TSHR ou un activateur de l'adénylate cyclase, pris seul ou en combinaison.

Par agoniste du récepteur TSHR utilisé selon l'invention, on entend un composé capable d’activer directement par fixation au niveau du récepteur TSHR ou indirectement par l’intermédiaire d’autre(s) composé(s) le récepteur TSHR.

A titre d'exemple d'agoniste du récepteur TSHR, on peut citer le TSH humain recombinant (rhTSH) Thyrogen®, un anticorps stimulant le TSHR (comme M22), NCGC00161870 connu comme C2 et constitué par les énantiomères El et E2, NCGC00379308, et MSql .

L'activateur pharmacologique utilisé selon l'invention est préférentiellement un activateur de l'adénylate cyclase choisi parmi NKH 477 (6-[3-(dimethylamino) propionyl] forskolin) , cw008, DMAPD (6-[3-(dimethylamino)propionyl]-14,15-dihydro-forskolin), PACAP-27, PACAP-38, Glucagone, Isoproterenol, Octopamine, PACAP 27 Amine, Prostaglandine D2/E1/E2/I2, Vasopressina, Forskoline et ses analogues comme 6-Acetyl-7-deacetyl-Forskoline, 7-Deacetyl-7-O- 4hemisuccinyl-Forskoline, 7-Deacetyl-7-(O-N- methylpiperazino)-y-butryl-Dihydrochlonde- Forskoline, 7-deacetyl-forskoline (D3533), 6-[3-(dimethylamino)propionyl]forskoline, 6-[N-(2- isothiocyanatoethyl)aminocarbonyl]forskoline, 5,6-dehydroxy-7-deacetyl-7-nicotinoylforskoline, 6- acetyl-7-deacetyl-forskoline, 7-deacetyl-7-O-hemisuccinyl-forskoline, 1 ,9-dideoxy-forskolin (D3658), préférentiellement la Forskoline.

Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'activateur de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) utilisé selon l’invention est un activateur génétique.

Préférentiellement, l'activateur génétique utilisé selon l'invention consiste en un vecteur choisi parmi un liposome comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, un vecteur adénoviral comprenant la séquence protéique de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, et un vecteur adénoviral comprenant une séquence CRISPR-Cas9 fusionnée avec un domaine transactivateur préférentiellement choisi parmi VP16, VP64, p65, NCO1A1, FOXO1A pour activer l'expression du TSHR.

Par nucléotide, on entend tout polyribonucléotide ou polydésoxyribonucléotide, qui peut être un ARN ou un ADN non modifié ou un ARN ou un ADN modifié. Les polynucléotides comprennent, sans limitation, de l'ADN simple et double brin, de l'ADN qui est un mélange de régions simple et double brin ou de régions simple et triple brin, de l'ARN simple et double brin, et de l'ARN qui est un mélange de régions simple et double brin, des molécules hybrides comprenant de l'ADN et de l'ARN qui peuvent être simple brin ou, plus typiquement, double brin, ou des régions triple brin, ou un mélange de régions simple et double brin. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « polynucléotide(s) » comprend également les ADN ou ARN décrits ci-dessus qui contiennent une ou plusieurs bases modifiées. Ainsi, les ADN ou ARN dont les squelettes sont modifiés pour des raisons de stabilité ou pour d'autres raisons sont des « polynucléotides » au sens où ce terme est entendu ici. De plus, les ADN ou ARN comprenant des bases inhabituelles, telles que l'inosine, ou des bases modifiées, telles que des bases tritylées, pour ne citer que deux exemples, sont des polynucléotides au sens où ce terme est utilisé ici. On comprendra qu'une grande variété de modifications ont été apportées à l'ADN et à l'ARN, qui servent à de nombreuses fins utiles connues des personnes compétentes dans ce domaine. Le terme « polynucléotide(s) » tel qu'il est utilisé ici englobe de telles formes de polynucléotides modifiées chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement, ainsi que les formes chimiques d'ADN et d'ARN caractéristiques des virus et des cellules, y compris, par exemple, les cellules simples et complexes. Le terme « polynucléotide(s) » englobe également les polynucléotides courts souvent appelés oligonucléotides.

Par séquence protéique, on entend tout peptide ou protéine comprenant deux ou plusieurs acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques ou des liaisons peptidiques modifiées. Le terme « polypeptide(s) » désigne à la fois des chaînes courtes, communément appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et des chaînes plus longues généralement appelées protéines. Les polypeptides peuvent contenir des acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par le gène. Les « polypeptides » comprennent ceux qui sont modifiés par des processus naturels, tels que la transformation et d'autres modifications post-traductionnelles, mais aussi par des techniques de modification chimique. De telles modifications sont bien décrites dans la littérature scientifique et sont bien connues des personnes compétentes dans ce domaine. Il sera apprécié que le même type de modification peut être présent au même degré ou à des degrés différents sur plusieurs sites dans un polypeptide donné. De même, un polypeptide donné peut contenir de nombreux types de modification. La modification peut se produire n'importe où dans un polypeptide, y compris le squelette peptidique, les chaînes latérales d'acides aminés et les extrémités aminées ou carboxyliques. Les modifications comprennent, par exemple, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un fragment d'hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé de nucléotide, fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé de lipide, fixation covalente du phosphotidylinositol, réticulation, cyclisation, formation de liaison disulfure, déméthylation, formation de liaisons transversales covalentes, formation de cystéine, formation de pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, formation d'ancrage GPI, hydroxylation, iodation, méthylation, myristoylation, oxydation, traitement protéolytique, phosphorylation, prénylation, racémisation, glycosylation, la fixation aux lipides, la sulfatation, la gamma- carboxylation des résidus d'acide glutamique, l'hydroxylation et l'ADP-ribosylation, la sélénoylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés aux protéines par l'intermédiaire de l'ARN de transfert, comme l'arginylation, et l'ubiquitination. Les polypeptides peuvent être ramifiés ou cycliques, avec ou sans ramification. Les polypeptides cycliques, ramifiés et non ramifiés peuvent résulter de processus naturels post-traductionnels et peuvent également être fabriqués par des méthodes entièrement synthétiques.

Préférentiellement, la séquence d'acide protéique de TSH R est identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , par exemple à 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, plus préférentiellement identique à au moins 95% à la séquence SEQ ID NO :1 , par exemple 96%, 97%, 98%, 99%, encore plus préférentiellement est identique à la séquence SEQ ID NO :1.

Préférentiellement, la séquence d'acide nucléique de TSH R est identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, par exemple à 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, plus préférentiellement identique à au moins 95% à la séquence SEQ ID NO :2, par exemple 96%, 97%, 98%, 99%, encore plus préférentiellement est identique à la séquence SEQ ID NO :2.

Par identité, on entend une relation entre deux ou plusieurs séquences polypeptidiques ou deux ou plusieurs séquences polynucléotidiques, telle que déterminée par la comparaison des séquences. Dans l'art, « identité » signifie également le degré de parenté de séquence entre les séquences polypeptidiques ou polynucléotidiques, selon le cas, tel que déterminé par la correspondance entre les chaînes de ces séquences. L'« identité » et la « similarité » peuvent être facilement calculées par des méthodes connues, y compris, mais sans s'y limiter, celles décrites dans les références suivantes (Computational Molecular Biology, Lesk A.M., ed„ Oxford University Press, New York, 1988 ; Biocomputing : Informatics and genome Projects, Smith D.W., ed„ Academic Press, New York. 1993 ; Computer Analysis of sequence Data, Part I, Griffin A.M., et Griffin H.G., eds., Humana Press. New jersey, 30 1994 ; sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G„ Academic Press, 1987 ; et sequence Analysis Primer, Gribskov M. et Devereux J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 ; et Carillo H., et Lipman D„ SIAM J. Applied Math., 48:1073 ( 1998)) . Les méthodes de détermination de l'identité sont conçues pour donner la plus grande correspondance entre les séquences testées. En outre, les méthodes de détermination de l'identité sont codifiées dans des programmes informatiques accessibles au public. Les méthodes de programmes informatiques permettant de déterminer l'identité entre deux séquences comprennent, sans s'y limiter, le progiciel GCG (Devereux J. et al., Nucleic Acids Research 12(1 ) : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul S. F. et al., J. Molec. Biol. 215 : 403-410 (1990)) . Le programme BLAST X est 12 publiquement disponible auprès du NCBI et d'autres sources (BLAST Manual, Altschul S. et al., NCBI NLM NUH Bethesda, MD 20894 ; Altschul S. et al., J. Mol Biol. 215 : 403-410 (1990)).

Par variant, on entend un polynucléotide ou un polypeptide qui diffère d'un polynucléotide ou d'un polypeptide de référence, respectivement, mais qui conserve des propriétés essentielles. Un variant typique d'un polynucléotide diffère par sa séquence nucléotidique d'un autre polynucléotide de référence. Les modifications de la séquence nucléotidique du variant peuvent ou non modifier la séquence d'acides aminés d'un polypeptide codé par le polynucléotide de référence. Les changements de nucléotides peuvent entraîner des substitutions, des ajouts, des suppressions, des fusions et/ou des troncations d'acides aminés dans le polypeptide codé par la séquence de référence, comme discuté ci-dessous. Une variante typique d'un polypeptide diffère en séquence d'acides aminés d'un autre polypeptide de référence.

En général, les différences sont limitées de sorte que les séquences du polypeptide de référence et du variant sont globalement très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Un polypeptide variant et un polypeptide de référence peuvent différer dans la séquence d'acides aminés par une ou plusieurs substitutions, additions, et/ou délétions dans n'importe quelle combinaison. Un résidu d'acide aminé substitué ou inséré peut être ou ne pas être un résidu codé par le code génétique.

La présente invention comprend également des variantes de chacun des polypeptides de l'invention, c'est-à-dire des polypeptides qui varient des références par des substitutions conservatrices d'acides aminés, par lesquelles un résidu est remplacé par un autre ayant des caractéristiques similaires. Les substitutions d'acides aminés conservatrices typiques sont parmi Ala, Val, Leu et Ile ; parmi Ser et Thr ; parmi les résidus acides, Asp et Glu ; parmi Asn et Gin ; et parmi les résidus basiques Lys et Arg ; ou les résidus aromatiques Phe et Tyr. Ces mutations conservatrices comprennent les mutations qui échangent un acide aminé contre un autre dans l'un des groupes suivants :

1 . Petits résidus aliphatiques, non polaires ou légèrement polaires : Ala, Ser, Thr, Pro et Gly ;

2. Résidus polaires, chargés négativement et leurs amides : Asp, Asn, Glu et Gin ;

3. Résidus polaires, chargés positivement : His, Arg et Lys ;

4. De grands résidus aliphatiques, non polaires : Met, Leu, Ile, Val et Cys ; et

5. Résidus aromatiques : Phe, Tyr et Trp.

Ces variations conservatrices peuvent en outre inclure les éléments suivants :

Préférentiellement, les variantes dans lesquelles plusieurs, par exemple 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 acide aminé sont substitués, supprimés ou ajoutés dans n'importe quelle combinaison. Un variant d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être d'origine naturelle, comme un variant allélique, ou il peut s'agir d'un variant qui n'est pas connu pour être d'origine naturelle. Les variants non naturels de polynucléotides et de polypeptides peuvent être obtenus par des techniques de mutagenèse, par synthèse directe et par d'autres méthodes de recombinaison connues de l'homme de l'art.

Comme mentionné ci-dessus, en plus de la teneur en GC et/ou du nombre d'ARF, l'optimisation de la séquence peut également comprendre une diminution du nombre d'îlots CpG dans la séquence et/ou une diminution du nombre de sites donneurs et accepteurs d'épissage.

Bien entendu, comme cela est bien connu de l'homme du métier, l'optimisation de la séquence est un équilibre entre tous ces paramètres, ce qui signifie qu'une séquence peut être considérée comme optimisée si au moins un des paramètres ci-dessus est amélioré alors qu'un ou plusieurs des autres paramètres ne le sont pas, tant que la séquence optimisée conduit à une amélioration du transgène, telle qu'une amélioration de l'expression et/ou une diminution de la réponse immunitaire au transgène in vivo.

Préférentiellement, le transgène d'intérêt code pour un TSHR humain, et la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine TSHR humaine comprend une séquence optimisée identique à la séquence SEQ ID NO : 2.

Par liposome, on entend une vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux. On en obtient à partir d'une grande variété de lipides amphiphiles, dont les plus souvent des phospholipides. Lorsque de tels composés sont mis en présence d'un excès de solution aqueuse, ils s'organisent de manière à minimiser les interactions entre leurs chaînes hydrocarbonées et l'eau.

L'activateur génétique préférentiellement utilisé selon l'invention est un vecteur adénoviral, plus préférentiellement un virus adéno-associé (AAV), encore plus préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.

Un autre objet de l'invention concerne une combinaison d' un activateur pharmacologique de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) et d' un activateur génétique de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, préférentiellement pour prévenir et/ou traiter les myopathies, plus préférentiellement la DMD ou encore pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, dans la combinaison utilisée selon l'invention, l'activateur pharmacologique est la Forskoline et l'activateur génétique est un virus adéno-associé (AAV) comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, plus préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.

Un autre objet de l'invention concerne un vecteur adénoviral comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2 pour son utilisation à titre de médicament.

Le vecteur adénoviral préférentiellement utilisé selon l'invention est un virus adéno-associé (AAV), préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.

Le vecteur adénoviral est préférentiellement utilisé selon l'invention pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, plus préférentiellement pour prévenir et/ou traiter les myopathies, encore plus préférentiellement la DMD.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le vecteur adénoviral est préférentiellement utilisé selon l'invention pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.

Exemples :

L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism, version 6.0. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type.

Exemple 1 : Génération des rats R-DMDdel52 :

Le modèle de rat R-DMDdel52 est généré par la délétion de 188 pb (paires de bases) et la génération d'un codon stop prématuré au niveau de l'exon 52 du gène de la Dystrophine (DMD) pour produire une perte de fonction de l'allèle responsable de la production de dystrophine.

La séquence de l'exon 52 du rat (ENSRNQE00000518152) et les séquences introniques autour ont été sélectionnées afin d'identifier les séquences d'ARN guides (sgRNAs) par l’algorithme BWA pour l'édition génomique par la méthode CRISPR.

Après une validation in vitro, deux sgRNAs 3' et 5’ ont été sélectionnés et microinjéctés dans les ovocytes des rats Sprague Dawley.

Les animaux F0 ont été dépistés par génotypage par PCR de jonction. Le génotypage est réalisé sur de l'ADN extrait de biopsies de la queue ou de l'oreille.

Le mélange PCR a été préparé avec le tampon Dream Taq 10X (ThermoFisher Scientific, Cat#B65), 0.25mM de dNTP (lOmM), 0.3 M de l'amorce sens ((5'- CTAACGCATTTAAAATATGCTGTCA-3'), 0.3 M de l'amorce anti-sens (5'- GTTGGCTTAGCTCAACAACCAAGAT-3', lOOpM), 0.03U/|jl DreamTaq et environ 150ng d'ADN. La PCR a été réalisée à l'aide du Thermal Cycler 2720 avec le programme thermique suivant : dénaturation initiale à 95°C pendant 5 minutes, 40 cycles de dénaturation à 95°C pendant 10 secondes, hybridation des amorces à 60°C pendant 30 secondes et élongation à 72°C pendant 45 secodes, et l'élongation finale à 72°C pendant 5 minutes.

La délétion de l'exon 52 a été détectée sur un gel d'agarose à 2%.

Les rats ont été hébergés dans une installation exempte d'agents pathogènes avec des cycles de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité, conformément à la directive européenne 2010/63/UE.

Seuls des rats mâles ont été utilisés pour les expériences car la mutation est portée sur le chromosome X.

Les animaux ont été manipulés conformément aux directives nationales et européennes, et les protocoles ont été approuvés par le comité d'éthique du ministère français (APAFIS#25606- 20200531 1746599) .

L'expression de la dystrophine a ensuite été évaluée par immunofluorescence (figure 1 A) et western blot [figure 1 B) au niveau du muscle des rats WT et R-DMDdel52.

Le western blot a été réalisé par cryosections de muscles congelés qui ont été homogénéisées à l'aide d'un homogénéisateur dounce dans un tampon de lyse contenant 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCI, 0,5% NP40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéase Halt (Pierce) .

Les échantillons ont ensuite été centrifugés pendant 5 minutes à 1500g et dénaturés à température ambiante pendant 30 minutes avec du tampon Laemmli. La concentration en protéines a été déterminée par le test de Bradford (Pierce). Les protéines ont été séparées par électrophorèse (Nu-PAGE 4-12% gel Bis-Tris ; Life Technologies) puis transférées sur des membranes de nitrocellulose (GE Healthcare) et marquées avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires couplés à la peroxydase de raifort. L'anticorps primaire utilisé est la Dystrophin (DYS2, Leica) et l'alpha-tubulin (Sigma, T5168) . Les signaux ont été visualisés avec le substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico (Pierce) . Les images ont été acquises avec Chemidoc MP (Biorad).

Cela a permis de déterminer que la dystrophine n'est pas exprimée chez les rats R- DMDdel52 comparé aux rats WT. (Figi A-B) .

Une courbe de survie a été établie afin de comparer la probabilité de survie entre les rats WT et R-DMDdel52 en fonction du nombre de jour. Cela a permis de montrer que les rats R- DMDdel52 meurent au bout de 14 mois de vie, contrairement aux rats WT.

De plus, les rats R-DMDdel52 présentent une masse corporelle nettement inférieure à celle des témoins WT à partir de l'âge de 3 mois, avec une forte diminution de l'indice de masse corporelle et de la longueur du corps à l'âge de 12 mois (Tableau 1 ) . En accord avec la perte progressive de la masse musculaire, une réduction du poids du Tibialis anterior (TA) et du soleus a été observée chez les rats R-DMDdel52 âgés de 12 mois comparés aux rats WT.

Un examen histologique a été réalisé par hématoxyline et éosine (H&E) et coloration au rouge Sirius au niveau du tibia antérieur chez les rats R-DMDdel52 en comparaison avec les rats WT. (Figl D-G)

Pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, les muscles du TA sont isolés chez des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois. Après isolement, les muscles sont immédiatement congelés dans de l'isopentane refroidi dans l'azote liquide et sectionnés à 7 m.

Les lames sont plongées dans l'hématoxyline de Mayer (Sigma-Aldrich) pendant 3 minutes et après rinçage dans de l'eau désionisée, elles sont plongées dans une solution de carbonate de lithium pendant 3 secondes, puis incubées dans de l'éosine pendant 30 secondes. Après un lavage à l'eau distillée, les lames sont plongées dans de l'éthanol à 50 % et 70 %, puis équilibrées dans de l'éthanol à 95 % et 100 %.

Les lames ont été montées avec Eurokit après avoir été trempées dans du xylène.

Pour la coloration au rouge Sirius, des lames sont décongelées pendant 20 minutes à température ambiante (RT) et plongées dans de l'EtOH à 90% pendant 2 minutes avant de commencer la coloration, en incubant les échantillons pendant 25 minutes dans une solution de rouge picro-sirius (Sigma-Aldrich). Les lames sont ensuite lavées abondamment à l'eau et déshydratées dans de l'éthanol à 100%.

Après la clarification au xylène, les lames ont été montées en Eurokit.

Cela a permis de mettre en évidence que les muscles des rats R-DMDdel52 présentent des signes de pathologie DMD sévère avec présence de fibrose endomysiale, une morphologie des fibres altérée et l'envahissement de cellules inflammatoires. (Figl D, panneaux supérieurs) .

En effet, un dépôt fibrotique sévère est confirmé par la coloration au rouge Sirius. (Figl D, panneaux inférieurs). L'étendue de la fibrose est quantifiée en mesurant le pourcentage de la zone occupée par le tissu conjonctif, montrant des différences statistiquement significatives entre les rats WT et R-DMDdel52 au niveau du tibia antérieur (fig. 1 E). En effet les rats R-DMDdel52 présentent environ 2.5 fois plus de fibrose que les rats WT.

La présence de noyaux centraux est également évaluée, en tant que marqueur pathologique d'un muscle subissant un événement de dégénération/régénération. Le muscle R- DMDdel52 présentait un nombre considérable de fibres à noyau central par rapport aux contrôles. (Fig.l F)

Enfin, la présence de fibres atrophiques est confirmée, avec une surface de section transversale des fibres musculaires réduite, qui contribuent à la fonte musculaire (Shin, Jonghyun ét al. "Wasting mechanisms in muscular dystrophy." The international journal of biochemistry & cell biology vol. 45,10 (2013): 2266-79. doi:10.1016/j.biocel.2013.05.001 ) . (Figl G)

Les muscles extra-oculaires (MEO) ont également été analysés, car ils sont sélectivement épargnés dans la dystrophie musculaire de Duchenne (Kaminski, H J et al. “Extraocular muscles are spared in advanced Duchenne dystrophy." Annals of neurology vol. 32,4 (1992) : 586-8. doi:10.1002/ana.4103204181992). Les MEO sont des muscles striés complexes qui présentent des propriétés biochimiques, mécaniques et physiologiques distinctes par rapport à leurs homologues des membres (Bondi, A Y, and D J Chiarandini. "Morphologie and electrophysiologic identification of multiply innervated fibers in rat extraocular muscles." Investigative ophthalmology & visual science vol. 24,4 ( 1983) : 516-9., Jacoby et al., 1990, Kono et al., 2005, Fraterman et al., 2007) . Les colorations à l'hématoxyline/éosine et au rouge Sirius ont confirmé la préservation des MEO isolées d'animaux R-DMDdel52 âgés de 12 mois (Fig. H-K), sans signe d'inflammation ou de fibrose significative par rapport aux témoins (Fig. 1 H-l) .

Il est intéressant de noter que les MEO R-DMDdel52 présentaient un nombre élevé de myofibres à noyau central par rapport aux muscles WT (Fig. I J), mais dans une moindre mesure par rapport aux TA (Fig. 1 F). En outre, l'analyse de la taille des fibres n'a pas montré de variation significative entre les MEO des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois (Fig. 1 K) .

Ces résultats montrent que les R-DMDdel52 présentent une dystrophie musculaire progressive et sévère caractérisée par des caractéristiques bien décrites de la physiopathologie de la DMD, y compris le fait que les muscles extra-oculaires ne sont spécifiquement pas atteints par la maladie.

Tableau 1 :

Exemple 2 : Les muscles extra-oculaires ne présentent pas de défauts de régénération musculaire progressive dans le modèle DMD du rat

Les lésions du tissu musculaire entraînent la nécrose des fibres musculaires qui déclenchent la régénération musculaire en activant le pool de cellules satellites musculaires quiescentes situées à proximité des fibres musculaires.

Le déroulement temporel de la régénération musculaire dans le tibia antérieur des rats R- DMDdel52 a été évalué, en utilisant l'immunofluorescence pour la chaîne lourde de myosine embryonnaire (eMHC), un marqueur spécifique des myofibres en développement et en régénération sur des coupes histologiques de muscles squelettiques.

Une immunohistochimie est ainsi réalisée sur cryosections : Les muscles frais congelés ont été sectionnés avec le cryostat Leica CM3050S (Leica Biosystems) à 7 pim d'épaisseur sur des lames Super Frost Plus (Thermo scientific, 10149870) et conservés à -80°C. Les lames ont été décongelées pendant environ 20 minutes à température ambiante, réhydratées pendant 5 minutes dans du PBS 1 X et ensuite fixées avec du PFA à 4% dans du PBS 1 X pendant 10 minutes à 4°C. Après des lavages dans du PBS I X, les lames ont été placées dans une solution froide d'acétone et de méthanol (1 :1 ) pendant 6 minutes à -20°C, puis incubées avec de la BSA à 10% pendant 1 heure de blocage. Les anticorps primaires ont été ajoutés à 1% de BSA et incubés pendant la nuit (O/N) à 4°C.

Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : Pax7 (Santa Cruz Biotechnology, sc-81648), ki67 (Abeam, sp6 abl 6667), Cdkn2a (Abeam Anti-CDKN2A/pl 6INK4a, Abl 08349), Cdknl a (Thermofisher, bs-10129R) et yH2AX (Abeam, abl 1 174) . Après des lavages répétés, les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires de type Alexa fluor pendant 45minutes à température ambiante. La coloration de la laminine a été réalisée après l'incubation des anticorps secondaires, pendant I h à 37°C en utilisant un anticorps conjugué (NB300-144AF647) .

Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261 ). La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800. Les immunomarquages de la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC), de la dystrophine et du |3-dystroglycane ont été réalisés sans fixation et avec une perméabilisation dans du Triton à 0,5 % dans du PBS I X pendant 5 minutes. L'eMHC (sc-53091 ), la dystrophine (Leica, DYS2-CE), le |3-dystroglycane (Leica, B-DG-CE) et la laminine (Sigma-Aldrich, L9393) ont été incubés à l'air libre.

L'incubation des anticorps secondaires et la coloration des noyaux ont été effectuées comme décrit ci-dessus. La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800.

Un grand nombre de myofibres positives à l'eMHC dans les TA des rats R-DMDdel52 âgés de 3 semaines est observé, alors qu'elles étaient complètement absentes dans les muscles WT (Fig. 2A) .

Une forte diminution du nombre de fibres en régénération a été observé au fil du temps (Fig. 2A-B), indiquant une réduction progressive de la régénération musculaire au cours de la progression de la dystrophie musculaire.

En revanche, bien qu'il soit légèrement augmenté chez les rats R-DMDdel52 par rapport aux rats WT, le processus de régénération est stable et limité au cours de la progression pathologique dans les muscles extra-oculaires.

Ces données suggèrent que les MEO présentent des performances de régénération accrues par rapport aux autres muscles.

La capacité de régénération des muscles squelettiques étant liée aux cellules satellites, nous avons décidé d'évaluer le nombre et le statut myogénique des CSM in vivo.

Un co-immunomarquage est réalisé pour Pax7 et Ki67, un marqueur de prolifération et d'activation, sur des coupes histologiques de muscles squelettiques isolées du TA et MEO de rats WT et R-DMDdel52.

Comme le montrent les figures 2E et 2H, aucune différence n'est observée dans le nombre de CSM par fibre entre les muscles TA ou MEO WT et R-DMDdel52 (quantifiés dans les figures 2F et 21), ce qui indique que les CSM ne sont pas perdues au cours de la progression pathologique de la DMD.

Le statut du cycle cellulaire des CSM est ensuite évalué chez les rats WT et R-DMDdel52. On peut dire que dans le muscle TA des rats WT et R-DMDdel52, les CSM ne se divisent qu'à des stades précoces (3 semaines), tout en restant arrêtées dans leur cycle cellulaire à des stades ultérieurs de la pathologie, y compris dans le contexte pathologique de la DMD.

En revanche, une grande partie des CSM analysées sur des coupes histologiques de MEC exprimaient le marqueur de prolifération, Ki67, à la fois dans les échantillons WT et R-DMDdel52 et à tous les stades examinés, y compris chez les rats WT et dystrophiques âgés de 12 mois (Fig.2H-J) .

Ce qui suggère que les CSM des MEO sont très actives dans un contexte WT et conservent leur capacité de régénération chez les animaux R-DMDdel52.

Exemple 3 : Les CSM R-DMDdel52 TA présentent un potentiel myoqénique altéré in vitro :

Pour approfondir les propriétés des CSM WT et R-DMDdel52, les cellules satellites des muscles du Tibialis Anterior et des muscles extra-oculaires ont été isolées et évalué leur capacité proliférative en culture.

Pour cela, les cellules ont été fixées avec du PFA à 4% pendant 10 minutes à 4°C et perméabilisées avec du Triton à 0,5% dans du PBS I X pendant 6 minutes. Après blocage avec 10% de BSA pendant 30minutes à température ambiante, les cellules ont été incubées O/N à 4°C avec les anticorps primaires suivants : Pax7 (Santa Cruz Biotechnology, sc-81648), MyoD (Dako, clone 5.8A, M3512), ki67 (Abeam, sp6 abl 6667), chaîne lourde des myosines sarcomériques (MF20, DSHB, AB_2147781 ) .

Des différences significatives n'ont pas été observées dans les propriétés prolifératives des CSM isolées à partir du TA ou des MEO des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines (Fig.3A-C) .

En outre, les cultures de myoblastes dérivés de CSM WT et R-DMDdel52 isolés à partir de contrôles des muscles TA et MEO n'ont pas présenté de différences significatives dans la différenciation myogénique (Fig.3D-G).

On peut constater que les CSM dérivées du TA de rats R-DMDdel52 âgés de 6 mois présentent une diminution du pourcentage de myoblastes MyoD-positifs co-exprimant Ki67 par rapport aux cellules témoins WT (Fig. 31-J) .

Cependant, il n'y a pas de différence de prolifération significative dans les myoblastes isolés à partir de MEO R-DMDdel52 de 6 mois par rapport aux MEO WT, ce qui suggère que les CSM des muscles extra-oculaires R-DMDdel52 conservent leur capacité de prolifération ex vivo (Fig.3l- J).

Ensuite, la différenciation myogénique a été évaluée sur des cellules cultivées isolées à partir de muscles TA des rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 6 mois.

Alors que la différenciation des cultures de cellules myogéniques isolées à partir des MEO de R-DMDdel52 âgés de 6 mois était pratiquement indifférenciable de celle des témoins, un fort déficit de différenciation est observé dans les cultures de cellules R-DMDdel52 isolées à partir des TA des mêmes rats. (Fig.3 K-L) La quantification a montré une réduction importante de l'indice de fusion ainsi que du nombre de noyaux par myotube par mm ² dans les cellules cultivées de R-DMDdel52 TA par rapport aux contrôles WT. (Fig. 3M-N)

À l'inverse, aucun défaut de différenciation significatif n'a été constaté dans les myoblastes isolés des MEO de rats dystrophiques et de rats WT âgés de 6 mois. (Fig. 3M-N)

Afin d'évaluer si les défauts de prolifération et de différenciation observés lors de la culture de cellules isolées à partir de muscles R-DMDdel52 TA sont cellulaires-autonomes, les CSM sont purifiées à partir de muscles de membres par tri FACS avec CD45, CD31 , Terl 19 comme marqueurs d'exclusion et a7-integrin comme marqueur de surface à sélection positive (Fig.S2A), permettant la culture de myoblastes purs dérivés de CSM (Figure 3 O-P) .

Le tri FACS est fait par la méthode suivante : Après dissociation des cellules, les cellules isolées du membre postérieur ont été incubées avec CD45-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 552848), Terl 19-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 557853), CD31 -PE-Cy7 (BD Pharmingen, 561410), a7-intégrine-FITC (CliniSciences, Cl 79570-100) pendant 45minutes à 4°C. Après des lavages avec du HBSS supplémenté en DNase (Sigma-Aldrich, DN25), les cellules sont incubées avec le colorant vital 7- AAD (BD Pharmingen, 559925) et triées avec le dispositif BD FacsAria. La population de CSM a été identifiée comme CD45:Terl 19:CD31-négative et a7-intégrine-positive.

Une diminution du potentiel prolifératif est observée dans les cellules R-DMDdel52 triées, comme le montre le nombre inférieur de myoblastes (Pax7±:MyoD±) marqués à I'EdU (Fig. 3Q) dans les cellules cultivées provenant de muscles de membres dystrophiques.

Les cellules satellites musculaires triées R-DMDdel52 présentent également de fortes déficiences dans la différenciation myogénique avec la formation de petits myotubes avec moins de noyaux par rapport aux cellules WT (Fig. 3R-S) .

Dans l'ensemble, ces données démontrent que la prolifération et la différenciation sont altérées dans les CSM isolées des muscles des membres R-DMDdel52, alors que les CSM des MEO dystrophiques conservent leur potentiel.

Exemple 4 : Les cellules satellites du muscle Tibialis anterior R-DMDdel52 expriment des marqueurs de sénescence

Afin d'étudier les changements moléculaires et cellulaires survenant dans les muscles de rats dystrophiques, une scRNA-seq est réalisée à partir de muscles TA de rats R-DMDdel52 et WT âgés de 12 mois.

En effet, les cellules des muscles du TA et extra-oculaires sont extraites chez des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois et immédiatement digérés avec 3U/ml de Dispose II (Roche, 4942078001 ) et 0,5u/ml de Collagenase A (Roche, 10103586001 ) pendant 20minutes dans du HBSS à 37°C avec une légère agitation.

La suspension cellulaire est passée à travers des filtres à cellules et centrifugée à 600g/minutes pendant 5 minutes, à 4°C. Le surnageant a été éliminé et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du sérum bovin fœtal à 20 % (Cat#S1810-500 Dominique Dutscher) dans du DMEM (Cat#41966-029 Gibco) complété par 25ng/ml de bFGF (RP4037, Sigma- Aldrich) avec de la pénicilline/streptomycine à 100 mg/mL. (354234, Life Sciences) recouvertes de matrigel (Sarstedt, #94.6140.802). Les cellules ont crû pendant 48 heures pour évaluer la prolifération. Après 48h de prolifération, les cellules ont été cultivées pendant 5 jours dans du sérum bovin fœtal à 5% pour induire la différenciation.

Après dissociation, les cellules ont été filtrées dans des crépines cellulaires de 100 et 70 m et triées par FACS après incubation dans du DAPI (D9542, Sigma-Aldrich) pour obtenir une suspension cellulaire propre éliminant les cellules mortes et les débris.

Le snRNA-seq est réalisé en utilisant le kit Chromium Next GEM Single Cell 3'Gene Expression V3 ( 10X Genomics) en suivant le protocole de fabrication. Le séquençage a été effectué sur le système NexSeq 550 d'Illumina avec le High Output Kit v2.5 (75 cycles, Illumina 20024906).

Les cellules ont été filtrées en fonction des lectures par échantillon, de la teneur en ARN mitochondrial et ribosomal et des doublets prédits pour obtenir une moyenne de 6247 cellules par échantillon (tableau 2) . L'identité des cellules a été évaluée sur la base de l'expression de marqueurs bien établis et les données ont été visualisées par intégration de voisinage stochastique distribué en T (Jamieson, Andrew R et al. "Exploring nonlinear feature space dimension reduction and data representation in breast Cadx with Laplacian eigenmaps and t-SNE." Medical physics vol. 37,1 (2010): 339-51. doi:10.1 1 18/1.3267037) (t-SNE ; Fig. 4A) . Un total de 9 groupes majeurs de cellules résidant dans les muscles est identifié. (Fig.S2A).

Les cellules WT et R-DMDdel52 sont marquées sur la carte t-SNE, mettant en évidence les changements liés à la maladie au niveau transcriptomique (Fig. 4B). Ces changements étaient évidents pour les CSM qui présentaient des signatures d'expression génique distinctes entre les échantillons WT et R-DMDdel52 (Fig. 4C) .

L'identification des gènes différentiellement exprimés dans le groupe des CSM est ainsi étudiée.

L'induction spécifique de deux marqueurs d'arrêt de croissance et de sénescence dans les CSM R-DMDdel52 par rapport aux témoins est identifiée : les inhibiteurs de la kinase dépendante de la cycline Cdkn l a (p21 ) et Cdkn2a (pl 6lnk4a,Cdkn2a ) (Hernandez-Segura, Alejandra et al. "Hallmarks of Cellular Senescence." Trends in cell biology vol. 28,6 (2018): 436-453. doi:10.1016/j.tcb.2018.02.001 ) (Fig. 4C-D) .

L'expression de Cdknl a et Cdkn2a est observée dans les CSM au niveau protéique par co- immunomarquage avec Pax7 sur des sections musculaires isolées des rats R-DMDdel52 et WT âgés de 6 mois.

La présence de la forme phosphorylée de l'histone H2A gamma X (yH2AX), un marqueur des dommages à l'ADN induits dans les cellules sénescentes (Wang, Zhong et al. “RNA-Seq: a revolutionary tool for transcrip tomics." Nature reviews. Genetics vol. 10,1 (2009) : 57-63. doi:10.1038/nrg2484; Bernadotte, Alexandra et al. “Markers of cellular senescence. Telomere shortening as a marker of cellular senescence." Aging vol. 8,1 (2016) : 3-1 1 . doi:10.18632/aging.100871 ; Dungan, Cory M et al. “In vivo analysis of yH2AX+ cells in skeletal muscle from aged and obese humans." FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology vol. 34,5 (2020) : 7018-7035. doi:10.1096/fj.2020001 1 1 RR) dans les CSM de rats dystrophiques par rapport aux WT (Fig. 4F-H) est également observée.

De manière frappante, la signature de sénescence des CSM in vivo (Cdkn2a, Cdknl a, yH2AX) était associée à la progression de la maladie chez les R-DMDdel52 (Fig. 4H-J) .

Ces données suggèrent que les CSM du TA R-DMDdel52 acquièrent progressivement une signature de sénescence au cours de l'évolution de la maladie, ce qui est cohérent avec la réduction progressive du potentiel régénérateur et les phénotypes observés dans les cultures ex vivo de CSM.

Tableau 2 :

Exemple 5 : Les CSM de patients humains atteints de DMP expriment des marqueurs de sénescence

Afin d'évaluer si la sénescence des cellules souches musculaires chez les rats dystrophiques reproduit la pathologie humaine de la DMD, le potentiel de régénération et la présence d'une signature de sénescence des CSM sur des biopsies deltoïdes humaines provenant de patients atteints de DMD et de patients témoins sont évalués.

Les biopsies musculaires DMD, divisées par classes d'âge (1 -2, 3-4, 5-6, 7-8 ans), et les biopsies de contrôle sont colorées pour la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC) afin de marquer les myofibres en régénération (Fig. 5A) .

La quantification des myofibres positives à l'eMHC a montré une réduction progressive des capacités de régénération des muscles DMD, avec des différences marquées entre les échantillons de stade précoce ( 1 -2 ans) et ceux de 7-8 ans (Fig. 5B).

Des co-immunomarquages de Pax7 avec Cdkn2a et yH2AX sont réalisés sur des coupes histologiques provenant de biopsies DMD et de biopsies témoins afin d'évaluer le statut de sénescence des cellules satellites musculaires humaines.

Les coupes musculaires de patients atteints de DMD présentaient un nombre substantiel de CSM Pax7-positives qui co-exprimaient Cdkn2a (Fig.5C-E) et yH2AX (Fig.5F-H) par rapport aux biopsies de contrôle qui exprimaient à peine Cdkn2a et présentaient de faibles niveaux de yH2AX (Fig.5C-H).

De plus, le nombre de CSM DMD exprimant Cdkn2a augmente avec l'âge (r=0.84, corrélation de Pearson, Fig.7E), sans révélation d' une forte corrélation positive entre les CSM DMD exprimant yH2AX et la progression de la maladie (r=-0.34, corrélation de Pearson, Fig.7H).

Pour conclure, les CSM humaines DMD expriment une signature sénescente précoce et progressive, associée à un déclin graduel du potentiel de régénération musculaire.

Exemple 6 : Les CSM de rat expriment une signature spécifique aux MEOs distincte de celle des TA Les MEO sont prélevés sur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois et les cellules sont isolées et analysées par scRNAseq avec la plateforme lOx Genomics afin d'identifier les caractéristiques spécifiques des MEO associées à un potentiel régénératif efficace dans la DMD.

Le même protocole que pour les échantillons TA est utilisé pour caractériser les échantillons MEO, identifiant une moyenne de 2505 cellules.

Le profil transcriptomique des CSM du TA et des MEO provenant d'animaux WT et R- DMDdel52 est comparé et l'expression spécifique du gène Pitx2 est détecté (Evano, Brendan et al. "Dynamics of Asymmetric and Symmetric Divisions of Muscle Stem Cells In Vivo and on Artificial Niches." Cell reports vol. 30,10 (2020) : 3195-3206. e7. doi:10.1016/j.celrep.2020.01 .097; Noden, Drew M, and Philippa Francis-West. "The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles." Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists vol. 235,5 (2006) : 1 194-218. doi:10.1002/dvdy .20697) dans les CSM des MEO WT et R-DMDdel52, confirmant l'identité spécifique de ces cellules (Fig. 6A-C) .

Comme prévu, les CSM isolées des MEO ne présentaient pas de signature de sénescence, Cdknl a et Cdkn2a étant exprimées de manière sélective uniquement dans les CSM du TA de R- DMDdel52 (Fig. 6B).

L'absence de transcrits Cdknl a et Cdkn2a est également validé ainsi que l'expression spécifique de TSHR sur les cellules satellites musculaires fraîchement isolées des MEO par qRT-PCR (Fig. 6D) : L'ARN est extrait à l'aide du kit d'isolation d'ARN total RNAqueous-Micro (Invitrogen) et rétrotranscrit à l'aide de la transcriptase inverse Superscript™ III (Invitrogen, 18080093) selon les instructions du fabricant.

La qPCR est réalisée à l'aide du système PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems) et des outils de détection SYBR Green (Applied Biosystems) .

Les résultats sont rapportés en tant qu'expression génique relative (2-DDCT) en utilisant les cellules traitées par le véhicule ou les myoblastes dérivés de l'extra-oculaire comme référence. L'expression génique est normalisée sur les niveaux d'expression de la |3-actine.

Des co-immunomarquages pour Pax7 et les marqueurs de sénescence sont également réalisés :Cdkn2a , Cdknl a et yH2AX (Hernandez-Segura et al. 2018 ; Wang et al, 2009 ; Bernadotte et al, 2016 ; Dungan et al, 2020) (Fig.6E-G), montrant l'absence de leur expression dans les cellules satellites Pax7-positives des MEO.

En effet, les quantifications du pourcentage de Pax7±/ Cdkn2a ±/ Cdknl a ±/ yH2AX± dans les MEOs à 3 semaines, 6 et 12 mois démontrent qu'il n'y a pas de différences entre les échantillons WT et R-DMDdel52.

Ces données confirment que les CSM des MEOs sont protégées de la sénescence et conservent leur potentiel myogénique chez les rats dystrophiques.

Exemple 7 : La signalisation TSHR régule la sénescence dans les myoblastes isolés des MEO des rats R-DMDdel52.

Le TSHR, le récepteur de l'hormone stimulant la thyroïde, est spécifiquement exprimé dans les CSM des MEO (Fig.6A-C). L'expression protéique spécifique du TSHR dans les CSM des MEO est validé par immunofluorescence du TSHR sur des cellules myogéniques fraîchement isolées des muscles extra-oculaires et des membres.

Pour la coloration du TSHR, les cellules ont été perméabilisées pendant 5 minutes avec 0, 1 % de Triton dans du PBS I X, puis incubées O/N avec l'anticorps TSHR (CliniSciences, BS-0003R) . Le jour suivant, les cellules ont été lavées dans du PBS I X et incubées avec des anticorps secondaires de type Alexa fluor pendant 45 minutes à température ambiante. Enfin, les noyaux ont été contre- colorés avec du Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261 ). La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800.

Comme le montre la figure 7A, le TSHR est fortement exprimé dans les myoblastes dérivés des MEO au niveau de la membrane cellulaire, tandis que les myoblastes isolés des muscles des membres expriment un niveau faible ou indétectable de TSHR.

Pour évaluer l'importance fonctionnelle de l'expression du TSHR dans les CSM des MEO, les myoblastes ont été isolés des MEO WT et traités avec un antagoniste sélectif du récepteur de la TSH, le ML224 (Neumann et al., 2014) .

Pour cela, les myoblastes dérivés de CSM ont été traités avec 10|JM de ML224 (HY12381 -S, CliniSciences) pendant 2 jours (prolifération) ou 7 jours (différenciation) ou 20 M de Forskoline (F3917, Sigma-Amdrich) (expérience suivante) uniquement pendant 48h. Les cellules témoins ont été traitées avec du DMSO (D8418, Sigma Aldrich) comme véhicule pour le ML224 et la Forskoline.

La prolifération a été mesurée après 24 h de culture en ajoutant au milieu de culture une impulsion de 10 mM de 5-éthynyl-20-désoxyuridine (EdU) pendant 24 h (EdU Click-IT PLUS Kit C10640, Life Technologies) .

L'inhibition de la signalisation du TSHR a compromis la prolifération des myoblastes avec une diminution significative des cellules Pax7±/MyoD±/EdU± par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (Fig. 7B-C).

Cette expérience est menée dans des conditions sans sérum afin d'éviter toute stimulation de TSHR par la présence de TSH dans le sérum, ce qui explique la plus faible capacité proliférative des myoblastes des MEO traités avec le véhicule, par rapport aux données présentées précédemment (Fig.3l) .

En outre, les myoblastes des MEO traités par le ML224 ont présenté des défauts de différenciation et ont compromis la formation de myotubes associée à une réduction significative de l'indice de fusion par rapport aux cellules témoins traitées uniquement par le véhicule (Fig. 7D- E).

De plus, les cellules satellites des MEO en culture traitées par l'inhibiteur du TSHR ont induit l'expression de Cdknl a (p21 ) et de Cdkn2a (pl 6) (Fig.7F), suggérant l'acquisition d'une signature de sénescence. Il est frappant de constater que les myoblastes des MEO traités par le ML224 ont présenté un phénotype remarquablement similaire à celui des myoblastes de membres R- DMDdel52 en culture, rappelant les cellules sénescentes (Moustogiannis, Athanasios et al. "The Effects of Muscle Cell Aging on Myogenesis." International journal of molecular sciences vol. 22,7 3721. 2 Apr. 2021 , doi:10.3390/ijms22073721 ) . Ces données démontrent que la signalisation TSH R est nécessaire pour empêcher l'entrée en sénescence et maintenir le potentiel myogénique des CSM dérivées de l'OME dystrophique.

Ensuite, l'hypothèse que la signalisation TSHR pouvait également protéger les myoblastes dérivés des CSM DMD de l'entrée en sénescence a été émise.

Pour valider cette hypothèse, des CSM WT et R-DMDdel52 isolées des muscles des membres ont été traitées avec de la Forskoline, un activateur bien connu de l'adénylate cyclase [Alasbahi & Melzing, 2012) et de la signalisation TSHR.

Il est frappant de constater que les myoblastes R-DMDdel52 traités à la forskoline ont présenté une prolifération restaurée par rapport aux cellules R-DMDdel52 témoins, atteignant la capacité proliférative des cellules WT (Fig.7G-H) .

Il est important de noter que les myoblastes R-DMDdel52 exposés à la forskoline ont aboli l'expression aberrante de Cdknl a (p21 ) et Cdkn2a (pl 6), tandis que les myoblastes R-DMDdel52 traités avec le véhicule ont maintenu l'expression de ces marqueurs de sénescence (Fig. 51-J) .

Enfin, les myoblastes des membres R-DMDdel52 traités par forskoline ont présenté un potentiel de différenciation amélioré par rapport aux cellules R-DMDdel52 témoins, formant des myotubes significativement plus grands avec un indice de fusion plus élevé (Fig. 7K-L) .

Ces données suggèrent que l'activation de la signalisation AMP/PKA peut corriger les défauts de prolifération et de différenciation observés dans les myoblastes R-DMDdel52.

Exemple 8 : Matériel et méthodes

Culture cellulaire

Les muscles des membres postérieurs de rats adultes ont été disséqués et digérés avec 3U/ml de Dispose II (Roche, 4942078001 ) et 0,5u/ml de Collagénase A (Roche, 10103586001 ) pendant 1 h dans du HBSS à 37°C avec une légère agitation. La suspension cellulaire a été passée à travers des filtres cellulaires et centrifugée à 600g/min pendant 5 minutes, à 4°C. Le surnageant a été jeté et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du sérum bovin fœtal à 20 % (Cat#S 1810-500 Dominique Dutscher) dans du DMEM (Cat#41966-029 Gibco) complété par 25ng/ml de bFGF (RP4037, Sigma- Aldrich) avec de la pénicilline/streptomycine à 100 mg/mL, et placé sur des lames à 8 chambres recouvertes de Matrigel (354234, Life Sciences) (Sarstedt, #94.6140.802). Les cellules ont été transduites 24h après la mise en place et analysées 72 heures après la transduction.

Immunofluorescence des cellules cultivées

Les cellules ont été fixées avec du PFA à 4% pendant 10 minutes à 4°C et perméabilisées avec du Triton à 0,5% dans du PBS 1 X pendant 6 minutes. Après blocage avec 10% de BSA pendant 30min à RT, les cellules ont été incubées O/N à 4°C avec les anticorps primaires suivants : MyoD (Dako, clone 5.8A, M3512), et pl 6 (Abeam Anti-CDKN2A/pl 6INK4a, Ab 108349). Le jour suivant, les cellules ont été lavées dans du PBS I X et incubées avec des anticorps secondaires de type Alexa fluor pendant 45min à température ambiante. Enfin, les noyaux ont été contre-colorés avec du Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261 ) . La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800. La fluorescence des tomates a été évaluée avec le microscope EVOS M5000. Le vecteur lentiviral utilisé pour surexprimer TSHR dans notre étude, pLV[Exp]-Tom-CMV>rTshr[NM_012888.2], a été construit et conditionné par VectorBuilder.

Isolation de l'ARN et RT-qPCR

L'ARN a été extrait à l'aide du kit d'isolation d'ARN total RNAqueous-Micro (Invitrogen) et rétrotranscrit à l'aide de la transcriptase inverse Superscript™ III (Invitrogen, 18080093) selon les instructions du fabricant. La qPCR a été réalisée à l'aide du système PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems) et des outils de détection SYBR Green (Applied Biosystems) . Les résultats sont rapportés en tant qu'expression génique relative (2-DDCT) en utilisant les cellules traitées par le véhicule ou les myoblastes dérivés de l'extra-oculaire comme référence. L'expression génique du transcrit du rat a été normalisée sur les niveaux d'expression de la (Sactine. Les séquences des amorces sont les suivantes : Tshr de rat (Pour CTTTGTCCTGTTCGTCCTGC, Rev AGTGAAGGGACTAGCATTGTC) ; |3actine (Pour : TGTCACCAACTGGGACGATA, Rev : GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA) .

Résultats

Afin de comprendre si la surexpression du TSHR pourrait avoir un impact sur l'entrée en sénescence des myoblastes DMD, un vecteur lentiviral portant la séquence codante du TSHR et le gène rapporteur Tomato sous le contrôle du promoteur CMV (TSHR Tomato, Fig.8A) ont été générés. Des myoblastes de type sauvage (WT) et des myoblastes DMD ont été isolés à partir de rats âgés de 6 mois et mis en culture. La transduction avec la séquence codante TSHR Tomato ou avec un lentivirus de contrôle portant uniquement le gène Tomato a été réalisée 24 heures après la mise en culture. Les cellules ont été analysées 72 heures après la transduction et l'efficacité de la transduction des myoblastes WT et DMD avec TSHR Tomato ou un lentivirus contrôle (Fig. 8B) a été vérifiée.

La surexpression de TSHR a été validée par qPCR, montrant une plus grande expression du transgène dans les cellules transduites avec TSHR Tomato par rapport aux cellules de contrôle (Fig.SC) . De manière intéressante, les cellules DMD surexprimant TSH R ont une plus faible expression du marqueur de sénescence p! 6 (Fig.SD) démontrant ainsi que TSHR prévient l'entrée en sénescence des myoblastes DMD.

En d'autres termes, une surexpression du récepteur TSHR permettrait de prévenir et traiter la DMD.