Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Polypeptidvarianten zur Stimulierung der Chondrogenese, Osteogenese und Wundheilung bzw. zur Behandlung von Entzündung und Krebs. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung osteoinduktive Zu- sammensetzungen, die diese Varianten enthalten.

Zahireiche biologische Faktoren beeinflussen die Entwicklung und Regeneration von Zellen, Geweben und Organen des menschlichen und tierischen Körpers. Viele dieser Faktoren sind bis heute unbekannt, die von ihnen gesteuerten Prozesse sind noch nicht vollständig verstanden. Auch die Knochenbildung (Osteogenese) ist ein bisher unvoll- ständig verstandener Prozeß ; ihr Ablauf ist durch zahlreiche aufeinander folgende Ein- zelprozesse, wie z. B. Chemotaxis, Mitose und Differenzierung, gekennzeichnet. Che- motaxis bedeutet in diesem Zusammenhang die direkte Einwanderung von Zellen als Antwort auf einen chemischen Gradienten von Signalverbindungen, die aus der unlösli- chen demineralisierten Knochenmatrix, die hauptsächlich aus Typ I unlöslichem Colla- gen besteht, freigesetzt werden. An dieses Typ I unlösliche Collagen bindet Plasma- Fibronektin, welches seinerseits Domänen zur Bindung von Collagen, Fibrin und Hepa- rin aufweist.

An der Steuerung der Osteogenese sind prinzipiell zwei Hauptgruppen von biologisch aktiven Faktoren, die systemisch bzw. die lokal wirkenden Faktoren, beteiligt.

Zur Gruppe der systemisch wirkenden Faktoren gehören beispielsweise die beiden Hormone Parathormon (PTH) und 1,25-Dihydroxy-Vitamin D, die den endogenen Calci- um-Spiegel regulieren. Ein weiteres an der Knochenentwicklung beteiligtes Hormon ist Calcitonin, das die Knochenresorption verhindert.

Zu den die Osteogenese regulierenden systemischen Hormone gehören außerdem bei- spielsweise Östrogene, Androgene, Wachstumshormone, Insulin-like growth factor (IGF), Schilddrüsenhormone und Glucocorticoide.

Zur Gruppe der lokal wirkenden Faktoren gehören (i) Cytokine, die den Knochenabbau bewirken, wie IL-1, Tumornekrose-Faktor (TNF), IL-6, IL-11 und ODF (Osteoklastendifferenzierungsfaktor, TRANCE) ; (ii) Cytokine, die den Knochenabbau verhindern : IL-4, IL-13, IL-18, IFN (Interferon), OPG (Osteoprotegerin) und IL-1 ra (Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist) ; (iii) Kolonie-stimulierende Faktoren : M-CSF (Makrophagen-Kolonie stimulierender Fak- tor) und GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen stimulierender Faktor) ; (iv) Prostaglandine, Leukotriene und Stickstoffmonoxid ; und (v) Wachstumsfaktoren : IGF (Insulin-like growth factor ; Insulin-artiger Wachstumsfaktor), Proteine aus der DVR (Decapentaplegic-Vg-related)-Familie einschließlich der Proteine der TGF- (transforming growth factor ß ; transformierender Wachstumsfaktor 3)- Superfamilie, die die Proteine aus der Activin/lnhibin-Familie, MIS (Mullerian Inhibitory Substance ; Müllerscher Inhibitor), GDF (growth/differentiation factor ; Wachstums- /Differenzierungsfaktor), Nodal und Dorsalin umfaRt ; FGF (fibroblast growth factor ; Fi- broblastenwachstumsfaktor), PDGF (platelet-derived growth factor ; Blutplättchen- abstammender Wachstumsfaktor) und PTHrP (PTH-related protein ; Parathormon- verwandtes Protein).

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die TGF-ß Superfamilie von be- sonderem Interesse.

Die TGF-|3 Superfamilie umfaßt derzeit mehr als 20 Proteine, wobei die vermuteten Orthologen in verschiedenen Organismen nicht mitgerechnet sind. Neben den TGF-P's gehören die BMP's (bone morphogenetic proteins), die GDF's (growth differentiation factors) Inhibine/Aktivine und weitere Proteine (Kingsley, 1994) zur Superfamilie. Sie bestehen alle aus zwei Untereinheiten, die fast immer Homodimere aus zwei identi- schen Monomeren sind und kovalent durch eine Disulfidbrücke verknüpft vorliegen.

Kennzeichnendes Merkmal aller bis jetzt strukturell untersuchten Proteine der TGF-3 Superfamilie ist das"TGF-p/BMP Gerüst", das aus einem Cystinknoten, einer a-Helix und mindestens vier a-Strängen pro Monomer besteht, und das im Dimer zu einer cha- rakteristischen Anordnung der Monomeren führt (McDonald und Hendrickson, 1993).

Die Aminosäuresequenzen können dabei sehr unterschiedlich sein und weisen zum Teil weniger als 40 % identisch besetzte Positionen auf. Besonders variabel sind die"Loop"- Bereiche sowie die N-terminalen Sequenzen. Andererseits ist für alle Faktoren der TGF- 3 Superfamilie eine erstaunliche Konservierung von Funktion und Struktur in der Stam- mesgeschichte gezeigt worden. So weisen sie alle ein als"Cystinknoten"bezeichnetes Strukturelement auf, das aus 3 in allen Proteinen der TGF-p Superfamilie konservierten und gleich angeordneten Disulfidbrücken besteht. Besonders gut untersucht sind neben den TGF-i's einzelne Vertreter der BMP's, wie BMP-2 und-7, und Vertreter der GDF's, wie GDF-5, die die Entwicklung und Regenerierung von Knochen und Knorpelgewebe in Gang setzen können. So ist z. B. für BMP-2 gezeigt worden, daß dieses sowohl in he- terotopen als auch in orthotopen Implantatlagern osteoinduktive Eigenschaften aufweist.

Die Proteine der TGF-|3 Superfamilie werden in der Zelle zuerst als großes Proprotein synthetisiert, aus dem dann das reife Protein durch Proteolyse entsteht. Das Proprotein scheint nach einer ArgXXArg Erkennungssequenz gespalten zu werden, so daß eine C- terminale Sequenz von etwa 100 bis 140 Aminosäureresten, die das reife Protein dar- stellt, freigesetzt wird.

Zur Signaltransduktion binden die Faktoren der TGF- Superfamilie an die extrazellulä- ren Domänen von 2 Typen membranständiger Rezeptoren ihrer Zielzellen, z. B. indu- zierbarer Knochenmarksstammzellen. Die Typ 2 Untereinheit enthält im cytoplasmati- schen Teil eine Protein-Serinkinase, die nach Ligandenbindung in der Typ 1 Unterein- heit Serinreste phosphoryliert. Dadurch wird in der Typ 1 Untereinheit ebenfalls eine Protein-Serinkinase aktiviert, die intrazelluläre Signalproteine wie SMAD's phosphorylie- ren und aktivieren kann. Es gibt Hinweise, daß sowohl die Typ 1 als auch die Typ 2 Un- tereinheiten als Dimere existieren. Kürzlich ist die Kristallstruktur der extrazellulären Domäne des Typ 2 Untereinheit des Aktivinrezeptors (Act-RII) aufgeklärt wurden. BMP- 2, das zu den besten untersuchten Proteinen der TGF-|3 Familie gehört, bindet an die Rezeptoruntereinheiten über die strukturell hoch konservierte Domäne nach dem ersten Cystein des Cystinknotens. Die supervariable N-terminale Sequenz vor dem ersten Cy- stein des Cystinknotens interagiert im BMP-2 nicht direkt mit den Rezeptoruntereinhei- ten. Die Interaktion von Proteinen der TGF-p Superfamilie mit Typ 1 und Typ 2 Rezeptor Untereinheiten ist zum Teil promiskuitiv und die Spezifitäten überlappen. Es ist noch nicht völlig geklärt, wieweit diese gemeinsame Nutzung von Rezeptor-Untereinheiten oder die Unterschiede im Mechanismus der Rezeptoraktivierung gehen. Aus der ge- genwärtigen Literatur geht insbesondere nicht eindeutig hervor, welche Strukturelemen- te die Spezifität eines Proteins für z. B. eine osteoinduktive Aktivität ausmachen.

Außer mit den Rezeptoruntereinheiten können die Faktoren der TGF-p Superfamilie mit einer Reihe weiterer Proteine interagieren. Dadurch kann die Aktivität der Faktoren mo- duliert oder gehemmt werden. Fetuin/a2-HS Glykoprotein und ein daraus abgeleitetes Peptid (TRH1) bindet BMP-2 und TGF-p, wobei BMP-2 mit höherer Affinität gebunden wird. Die Bindung kompetiert mit der Bindung an den Rezeptor. Das Noggin-Protein aus Säugetieren bindet BMP-2 mit hoher Affinität in Konkurrenz mit dem Rezeptor. Chordin wirkt, wie in Krallenfrosch-Oozyten gezeigt worden ist, als Hemmstofffür BMP-4. Folli- statin bindet mit hoher Affinität an Aktivin und BMP-7. Für BMP-2 ist die Fähigkeit, an Heparin zu binden, nachgewiesen worden.

Das therapeutische Potential der Mitglieder der TGF-p Superfamilie ist aufgrund ihrer physiologischen Bedeutung offensichtlich. Hierbei sind insbesondere rekombinant her- gestellte Proteine von Interesse, da sie in großer Menge erhalten werden können. Dar- über hinaus sind die für sie kodierenden Nukleinsäuren potentielle Gen-Therapeutika.

Somit besteht ein generelles Interesse an Mitgliedern der TGF-p Superfamilie und Vari- anten mit veränderten biologischen Eigenschaften. Kübler et al. (1999) beschreiben ein BMP-Analogon EHBMP-2, dessen Primärstruktur von der des natürlicherweise vor- kommenden humanen BMP-2 dadurch abweicht, dal3 die mutmaßlich für die starke He- parin-Bindung von BMP-2 verantwortlichen ersten 12 Aminosäuren durch die ersten 13 Aminosäuren von humanem Interleukin-2 ersetzt sind. Das genetisch veränderte BMP-2-Analogon wurde rekombinant in E. coli exprimiert. EHBMP-2 weist eine vernach- lässigbare Affinität zu Heparin und eine höhere biologische Aktivität in verschiedenen Zelikulturen, d. h. in vitro, auf. Beim Vergleich der in vivo-Aktivität der Variante mit natür- lichem BMP-2 zeigte sich jedoch, daß in der Maus durch BMP-2-Konzentrationen ab 4 g in annähernd allen Proben eine heterotope Knocheninduktion erzeugt wurde, wo- hingegen zur Erzielung desselben Effekts eine Menge von ca. 40 lig EHBMP-2 benötigt wurde. Weiterhin wurde beobachtet, daß das resultierende Ausmaß der Knochenneu- bildung bei gleichen Proteinkonzentrationen mit dem natürlichen BMP-2 signifikant grö- ßer war als bei seinem BMP-Analogon EHBMP-2.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht somit darin, weitere Polypeptidvarianten bereitzustellen, deren in vivo Wirksamkeit derjenigen des Wildtyps entspricht oder erhöht ist. Eine weitere Aufgabe liegt in der Bereitstellung von für die Polypeptidvarianten kodierenden Nukleinsäuren und Vektoren und Wirtszellen, die die- se Nukleinsäuren enthalten. Weiterhin sollen Verfahren zum Herstellen der Polype- tidvarianten bereitgestellt werden. Schließlich sollen pharmazeutische Zusammenset- zungen, die diese Polypeptidvarianten enthalten, und deren Verwendung bereitgestellt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß getost durch eine Polypeptidvariante mit erhöhter Heparin-Bindungsfähigkeit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß (i) an die Aminosäuresequenz eines Polypeptides mit geringer Heparin- Bindungsfähigkeit wenigstens ein Oligopeptid, umfassend die Aminosäurese- quenz X1 X2 X3 X4 X5 X6, addiert ist und/oder, (ii) in die Aminosäuresequenz eines Polypeptides wenigstens ein Oligopeptid, umfassend die Aminosäuresequenz X, X2X3X4X5X6, inseriert ist und/oder (iii) wenigstens eine natürlicherweise in der Aminosäuresequenz eines Polype- tids vorkommende Oligopeptidsequenz durch ein Oligopeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz X1X2X3X4X5X6, substituiert ist, wobei X, = K, R oder H ; X2 = K, R oder H ; X3 = K, R, H oder keine Aminosäure ; X4 = kein K, R, H, sonst beliebige Aminosäure ; X5 = kein K, R, H, sonst beliebige oder keine Aminosäure ; X6 = kein K, R, H, sonst beliebige oder keine Aminosäure, bedeutet (SEQ ID No : 1) oder X, = K, R oder H ; X2 = kein K, R, H, sonst beliebige Aminosäure ; X3 = K, R oder H ; X4 = kein K, R, H, sonst beliebige Aminosäure ; X5 = kein K, R, H, sonst beliebige oder keine Aminosäure ; X6 = kein K, R, H, sonst beliebige oder keine Aminosäure (SEQ ID No : 2), bedeutet.

Im nachfolgenden werden einige Begriffe näher erläutert, um klarzustellen, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden sollen.

Der Begriff"Polypeptid", so, wie er nachfolgend in der Beschreibung verwendet wird, umfaßt aus 5 oder mehr Aminosäuren zusammengesetzte Peptide oder Proteine, die wenigstens eine biologische Aktivität aufweisen. Der Begriff umfaßt ferner biologisch aktive Fragmente der Polypeptide, Mutanten und Fusionsproteine davon.

"Polypeptidvariante mit erhöhter Heparin-Bindungsfähigkeit"bedeutet, daß die Polype- tidvariante eine Heparin-Bindungsfähigkeit aufweist, die gegenüber der Heparin-Bin- dungsfähigkeit des nicht veränderten Polypeptides erhöht ist. Die Heparin-Bindungs- fähigkeit allgemein kann beispielsweise durch Plasmonresonanz-Analyse mit Hilfe eines Heparin-beschichteten Trägers gemessen werden. Die einzelnen Versuchsbedingungen sind beispielsweise beschrieben in Ruppert et al., 1996.

Unter der in vivo Wirksamkeit wird das Ausmaß der bestimmungsgemäßen Wirkung am Zielort verstanden. Die in vivo Wirksamkeit wird bestimmt durch die biologische Aktivität des Proteins in Verbindung mit der Verfügbarkeit des Proteins am Zielort. Sie wird letzt- endlich gemessen als Wirkung am Zielort. Für die Messung der Wirkung kann auf eta- blierte Verfahren zurückgegriffen werden. Im Fall von BMP-2 Varianten hat sich die In- duktion der ektopen Knochenbildung, beschrieben in Kübler & Urist, 1991 und Kübler et al., 1999, bewährt.

Als"Wachstumsfaktor"wird ein biologisch aktives Polypeptid bezeichnet, das das Wachstum und/oder die Differenzierung von Zellen moduliert.

Insofern nachfolgend auf bestimmte Polypeptide eingegangen wird, so ist die Aminosäu- resequenz beispielsweise erhältlich aus der öffentlich zugänglichen Datenbank Entrez (z. Zt. : http ://www. ncbi. nim. nih. gov/Entrez/).

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck"Homologie"bezeichnet den Grad der Ver- wandtschaft zwischen zwei oder mehr Polypeptiden, der durch die Übereinstimmung zwischen den Aminosäuresequenzen mittels bekannter Verfahren, z. B. computerge- stützter Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J.

Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt wird. Der Prozentsatz der"Homologie"ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Be- rücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit Algorithmen eingesetzt, die den besonderen Anfor- derungen Rechung tragen.

Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht ein- geschränkt auf das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12) : 387 (1984) ; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)) ; BLASTP, BLASTIN, und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol.

Biol. 215 : 403-410) (1990)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Bio- technology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894 ; Altschul, S., et al., Mol. Bio. 215 : 403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Homologien verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden : Algorithmus : Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48 : 443-453 (1970) Vergleichsmatrix : BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS USA 89 (1992), 10915-10919 Lücken-Wert (Gap Penalty) : 12 Lückenlängen-Wert : (Gap Length Penalty) : 4 Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity) : 0 Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet.

Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default parameters) für Aminosäu- resequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie-Wert nicht verringern.

Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenzsequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100.000 (expectation value) zu erhöhen und gegebe- nenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz- Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60 % wird im Rahmen dieser Anmeldung als 60 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere Homologiegrade.

"His-Tag"bedeutet eine Sequenz von wenigstens 6 Histidin-Aminosäuren, die durch entsprechende Klonierung und Fusion mit einer exprimierbaren Sequenz zu einem Fu- sionsprotein mit wenigstens 6 His-Resten am NH2-Terminus führt, das leicht durch Komplexierung mit einer Ni2+-Säule aufgereinigt werden kann.

Unter einem"heterologen Gen"ist der kodierende Bereich eines Strukturgens zu ver- stehen, der entweder nicht unter der Kontrolle des eigenen (homologen) Promotors oder nicht in dem Organismus, aus dem er abgeleitet ist, oder weder unter der Kontrolle des eigenen Promotors noch im ursprünglichen Organismus exprimiert wird.

"Klonierung"soll alle im Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfassen, die hier zum Einsatz kommen könnten, die jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

Unter"rekombinanter Expression in einer geeigneten Wirtszelle"sollen alle im Stand der Technik bekannten Expressionsmethoden in bekannten Expressionssystemen verstan- den werden, die hier zum Einsatz kommen könnten, jedoch nicht alle im einzelnen be- schrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine erfindungsgemäße Polypeptidva- riante eine höhere Heparin-Bindungsfähigkeit gegenüber dem nicht veränderten Poly- peptid dadurch aufweist, daß wenigstens ein Oligopeptid, das eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz umfaßt, an das Polypeptid addiert und/oder in das Polypeptid inse- riert wird und/oder einige der Aminosäuren als Polypeptide ersetzt. Es konnte gezeigt werden, daß im Vergleich zum nicht veränderten Polypeptid die Menge der an Heparin gebundenen Varianten größer ist und daß außerdem die Abdissoziierung der Varianten von Heparin verringert ist. Da Heparin-ähnliche Strukturen integrale Bestandteile der Knochenstruktur sind, weisen die erfindungsgemäßen Polypeptidvarianten auch eine erhöhte Bindungsfähigkeit für Knochenstrukturen auf. Diese Eigenschaft ist besonders wichtig für regenerative Vorgänge in der Knochenstruktur, wobei in diesem Fall die be- teiligten Polypeptide an der Knochenmorphogenese (Osteogenese) mitwirken. Es konnte dabei gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Polypeptidvarianten die He- parinbindungsfähigkeit um den Faktor 30, mindestens aber den Faktor 10 steigern konnten. Die erhöhte Heparinbindungsfähigkeit wiederum führte zu einer dramatisch gesteigerten in vivo Wirksamkeit, wie z. B. durch die Figur 8 belegt.

Wie erwähnt, wird die Wirkung der an der Osteogenese beteiligten Polypeptide durch Rezeptoren vermittelt, die u. a. auf der Oberfläche von induzierbaren Knochen- marksstroma-Stammzellen vorkommen. Diese haben die Fähigkeit, nach Einwirkung eines induktiven Signals von morphogenetischen Proteinen oder demineralisierter Kno- chenmatrix, Knochenzellen auszubilden. Es wird angenommen, ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, daß die Erhöhung der Heparin-Bindungsfähigkeit von Poly- peptiden, insbesondere von osteoinduktiven Polypeptiden, zur Erhöhung der lokalen Konzentration von osteogenetischen Proteinen in unmittelbarer Nähe des Ortes der Knochenneubildung führt.

Da jedoch Heparin mit dem zellulären Rezeptor des Polypeptides um die Polypeptidva- riante konkurriert, ist zunächst davon auszugehen, daß die Erhöhung der Heparin- Bindungsfähigkeit der Polypeptidvariante zu einer Abnahme der für den Polypeptid- spezifischen Rezeptor verfügbaren Polypeptid-Menge und damit zu einer verminderten Signaltransduktion führt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die biologische Verfügbarkeit der Poly- peptidvariante bei gleichzeitiger Erhöhung der Heparin-Bindungsfähigkeit nicht beein- trächtigt ist, daß vielmehr die erhöhte Heparin-Bindungsfähigkeit mit einer Erhöhung der lokalen Konzentration von für den spezifischen Rezeptor veRügbarem Polypeptid korre- liert.

Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß die Qualität des durch die Poly- peptidvariante in vivo gebildeten Knochens gegenüber derjenigen, die durch das nicht veränderte Polypeptid gebildet wurde, erhöht ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz an den N-Terminus des reifen Polypeptids addiert und/oder durch Substitution bzw. In- sertion in den N-terminalen Bereich des Polypeptides eingefügt. Der N-terminale Be- reich bedeutet hierbei die ersten 20, vorzugsweise die ersten fünf, N-terminalen Ami- nosäuren.

Sofern das Polypeptid zur TGF-p Superfamilie gehört, sind die reifen Polypeptide, z. B. ausgehend von BMP-2, wie folgt ermittelbar : Eine Suche in der"Swiss-Prot"Datenbank (derzeit http ://expasy. hcuge. ch/cgi-bin/sprot-search-de) mit dem Suchwort"BMP-2"er- gibt unter der Nummer P12643 die Aminosäuresequenz des gesamten Proproteins von humanem BMP-2. Daraus läßt sich unter"bone morphogenetic protein 2"die Sequenz für das reife Protein auswählen. Sie entspricht den Aminosäureresten 283-396. Um die anderen Proteine der TGF-Superfamilie zu identifzieren, wird diese Sequenz 283-396 unter"BLAST2"bei EMBnet-CH (Lausanne, Schweiz) eingereicht. Dort wird sie gegen die Datenbanken Swiss-Prot + TrEMBL + TrEMBL_New mit Hilfe des Programms "blastp"abgesucht. Dabei wird die Vergleichsmatrix Blosum 62 verwendet, und es wer- den die 250 am nächsten verwandten Proteine ermittelt. Das Programm liefert die ent- sprechenden Identitäts-Nummern der Swiss-Prot Datenbank, unter denen sich die Ami- nosäuresequenzen der gesamten Proproteine aufrufen lassen. Die Sequenzabschnitte für die reifen Proteine sind jeweils angegeben. Sie ließen sich sonst auch ableiten, da die reifen Proteine gewöhnlich nach der Erkennungssequenz RXXR abgespalten wer- den (X bedeutet hier eine beliebige Aminosäure).

Alle Polypeptide der TGF-ß Superfamilie sind, wie schon erwähnt, durch ein Strukture- lement gekennzeichnet, das als"Cystinknoten"bezeichnet wird (McDonald und Hendrickson, 1993). Gehört das Polypeptid zu dieser Superfamilie, so gilt der gesamte Bereich vor dem Cystinknoten als N-terminaler Bereich, und die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz wird vorzugsweise vor dem Cystinknoten eingefügt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Oligopeptid, das die erfin- dungsgemäße Aminosäuresequenz umfaßt, ein bis viermal durch Addition, Insertion und/oder Substitution in das Polypeptid eingefügt, wobei jeweils ein oder mehrere Kopi- en des Oligopeptids an einer oder mehreren Positionen in das Polypeptid eingefügt werden können.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat das Oligopeptid die Sequenz RKRA (SEQ ID No. 3) oder die Sequenz RKRAKHKQ (SEQ ID No. 4).

Weiterhin ist bevorzugt, daß die Polypeptidvariante eine für die rekombinante Ex- pression relevante Sequenz am N-Terminus umfaßt, wobei die für die rekombinante Expression relevante Sequenz M oder MZ ist, und M Methionin und Z eine oder mehrere beliebige Aminosäuren bedeutet. MZ kann beispielsweise eine Signalse- quenz darstellen, wie sie für zahireiche prokaryontische und eukaryontische Protei- ne dem Fachmann bekannt ist. Es kann sich dabei um auf das jeweilige Expressi- onssystem zugeschnittene Signalsequenzen handeln oder aber um die"homologen" Signalsequenzen, d. h., die zu dem Protein natürlicherweise gehörenden Signalse- quenzen, sowie schließlich um eine Kombination einer beliebigen Signalsequenz mit gezielt eingefügten Proteaseschnittstellen, etc.

Ferner ist bevorzugt, daß die Polypeptidvariante ein His-Tag umfaßt. Das His-Tag am NH2-Terminus der Polypeptidvariante erleichtert die Aufreinigung des Proteins wesentlich, da diese Aufreinigung an einer Nickel-Saule durch Chelat-Bildung durchgeführt werden kann.

Das der Polypeptidvariante zugrundeliegende Polypeptid weist eine biologische Aktivität auf. Hierbei sind grundsätzlich sämtliche biologischen Aktivitäten von Inter- esse, bei denen die Wirksamkeit eines Polypeptides mit biologischer Aktivität durch das Wegdiffundieren von negativ geladenen intra-und extrazellulären Strukturen limitiert ist. Vorzugsweise sind diese negativ geladenen Strukturen Strukturen der extrazellulären Matrix, die aufgrund ihres Anteils an Proteoglykanen und Glykosa- minoglykanen, wie Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat und Dermatan- sulfat, negativ geladen sind. In einer bevorzugten Ausführungsform reguliert die biologische Aktivität die Entwicklung bzw. Differenzierung von Zellen, Geweben und Organen des menschlichen oder tierischen Körpers.

Besonders bevorzugt ist hierbei, daß das der Polypeptidvariante zugrundeliegende Polypeptid die Knochenbildung reguliert (osteogenetische Aktivität). Die osteogene- tische Aktivität kann hierbei beispielsweise durch den Wachstumsfaktor-abhängigen Einbau von 35SO4 in Proteoglykan-Strukturen von Gliedmaßenknospen aus Hühnerem- bryonen bestimmt werden. Sinnvollerweise wird dazu ein Konzentrationsbereich für das BMP-Protein gewähtt, der es ermöglicht, sowohl die maximale Zellantwort als auch die EC50 (Konzentration, bei der 50% des maximalen Einbaus erreicht werden) zu bestim- men. Die Assay-Bedingungen sind angegeben in Ruppert et al., 1996.

Alternativ kann die myoblastäre Maus-Zelilinie C2C12 verwendet werden, um die BMP- abhängige Induktion der Alkalischen Phosphatase zu bestimmen (Katagiri et al., 1994) Auch mit diesem Test können die maximale Zellantwort und die EC5o bestimmt werden.

Bevorzugt ist das Polypeptid aus der Hormone, Cytokine und Wachstumsfaktoren um- fassenden Gruppe ausgewählt. Hierbei sind besonders bevorzugt : Parathormon (PTH) ; Calcitonin ; Wachstumshormon ; Insulin-like growth factor (IGF) ; Cytokine, die den Knochenabbau bewirken, wie IL-1, Tumornekrose-Faktor (TNF), IL-6, IL-11 und ODF (Osteoklastendifferenzierungsfaktor, TRANCE) ; Cytokine, die den Kno- chenabbau verhindern : IL-4, IL-13, IL-18, IFN (Interferon), OPG (Osteoprotegerin) und IL-1 ra (Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist) ; Kolonie-stimulierende Faktoren : M-CSF (Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor) und GM-CSF (Granulozyten- Makrophagen stimulierender Faktor) ; und Wachstumsfaktoren : IGF (Insulin-like growth factor ; Insulin-artiger Wachstumsfaktor) ; Proteine aus der DVR-Familie einschließlich der Proteine aus der TGF-p (transforming growth factor ß ; transformierender Wachs- tumsfaktor p)-Superfamilie, die wiederum die Activin/Inhibin-Familie, MIS (Mullerian In- hibitory Substance ; Müllerscher Inhibitor), die GDF (growth/differentiation factor ; Wachstums-/Differenzierungsfaktor)-Familie, Nodal und Dorsalin umfaßt ; FGF (fibroblast growth factor ; Fibroblastenwachstumsfaktor) ; PDGF (platelet-derived growth factor ; Blutplättchen-abstammender Wachstumsfaktor) und PTHrP (PTH-related protein ; Parathormon-verwandtes Protein).

Besonders bevorzugt umfaßt das Polypeptid Mitglieder der TGF,-Superfamilie, Acti- vin/Inhibin-Familie, MIS, GDF-Familie, Nodal und Dorsalin, sowie Mitglieder der BMP- Familie, insbesondere BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7/OP-1 oder BMP-8/OP-2, sowie BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14 und BMP-15.

Die vorstehende Auswahl von Wachstumsfaktoren ist erfindungsgemäß von besonde- rem Interesse, da die Beteiligung dieser Faktoren an der Osteogenese bekannt ist (Reddi, 1998) ; die Verwendung der erfindungsgemäßen Varianten dieser Faktoren führt zu einer erhöhten Heparin-Bindungsfähigkeit unter Beibehaltung der osteoinduktiven Eigenschaften.

Sofern das Polypeptid der TGF-Superfamiiie angehört und somit die vorstehend erläu- terte"Cystinknoten"-Struktur aufweist, wird die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz bevorzugt vor den Cystinknoten in die Polypeptidsequenz eingefügt. Besonders bevor- zugte Positionen sind beispielsweise bei BMP-2 die Positionen zwischen den Aminosäu- reresten 2 und 3,6 und 7,10 und 11 sowie 13 und 14 des reifen Proteins. Aufgrund der Homologie zwischen den Mitgliedern der TGF-p Familie, insbesondere der konservier- ten Anordnung der Cysteine, kann der Fachmann den genannten Proteinen entspre- chende Positionen in anderen TGF-, Familienmitgliedern bestimmen.

Das Polypeptid kann ferner ein Hormon, ein Cytokin oder ein Wachstumsfaktor sein, der eine Addition, Substitution, Insertion, Inversion und/oder Deletionen aufweist, wobei das die Addition, Substitution, Insertion, Inversion und/oder Deletion aufweisende Polypeptid wenigstens 10 %, vorzugsweise wenigstens 50 % und insbesondere wenigstens 90 % der biologischen Aktivität, im Fall osteogenetischer Polypeptide der osteogenetischen Aktivität des ursprünglichen Polypeptids aufweist. Die biologische Aktivität kann hierbei allgemein mit jedem dem Fachmann bekannten Verfahren zur Messung der biologi- schen Aktivität des Polypeptides bestimmt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die durch Addition, Substitution, Insertion, Inversion oder Deletion erhaltenen Polypeptide wenigstens 50 %, vorzugswei- se 75 % und insbesondere 90 % homolog zur Aminosäuresequenz des vollständigen ursprünglichen Polypeptids. Dabei kann eine wenigstens 10% ige biologische Aktivität mit einer mindestens 50% igen, mindestens 75% igen oder mindestens 90% igen Homo- logie korrelieren. Gleiches gilt für eine wenigstens 50% ige oder wenigstens 90% ige bio- logische Aktivität.

Besonders bevorzugt sind Polypeptidvarianten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No 5 (T3) oder SEQ ID No 6 (T4). Diese Polypeptidvarianten entsprechen den in den Bei- spielen verwendeten Polypeptidvarianten, die eine erhöhte Wirksamkeit bei gleicher Konzentration und eine verbesserte Qualität des induzierten Knochens zeigen, wobei unter verbesserter Qualität insbesondere eine dichtere Knochenmatrix und damit eine erhöhte biomechanische Belastbarkeit zu verstehen sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäß hergestelite Polypeptidvariante modifiziert. Die Modifikationen umfassen hierbei die Di-, Oligo-und Polymerisierung des monomeren Ausgangsprodukts, beispielsweise durch Quervernet- zung, z. B. durch Dicyclohexylcarbodiimid oder Pegylierung oder Assoziation (self as- sembly). Die somit hergestellten Di-, Oligo-und Polymere können voneinander bei- spielsweise durch Gelfiltration abgetrennt werden. Weitere Modifikationen umfassen Seitenketten-Modifikationen, beispielsweise von £-Amino-Lysin-Resten der Polype- tidvariante, oder Amino-bzw. Carboxy-terminale Modifikationen. Schließlich umfaßt der Begriff Modifikationen posttranslationale Ereignisse, z. B. die Glykosylierung oder die partielle oder vollständige Deglykosylierung des Proteins.

Die Erfindung stellt ferner Nukleinsäuremoieküle bereit, die eine für eine erfindungsge- mäße Polypeptidvariante kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen.

Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül enthaltene Nukleinsäuresequenz kann von einer genomischen DNA, cDNA oder synthetischen DNA abgeleitet sein, wobei un- ter synthetischen DNA-Sequenzen auch solche verstanden werden, die modifizierte Internukleosid-Bindungen enthalten. Weiterhin kann es sich bei den Nukleinsäurese- quenzen um RNA-Sequenzen handeln, was z. B. für die Expression mittels rekombinan- ter RNA-Vektorsysteme erforderlich sein kann.

Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle umfassen eine für eine der Polypeptidvarianten T3 oder T4 kodierende Nukleinsäure. Beispiele solcher Nukleinsäuren sind im Sequenzpro- tokoll unter SEQ ID No. 7 (T3) und SEQ ID No. 8 (T4) angegeben. Es versteht sich von selbst, daß anstelle der in SEQ ID No. 7 oder SEQ ID No. 8 angegebenen Nukleinsäu- resequenzen solche, die auf einer Degeneration des genetischen Codes beruhen, ebenfalls verwendet werden können. Bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Nu- kleinsäuresequenzen, die im Hinblick auf die Expression in einem bestimmten Wirtsor- ganismus eine an den Codon-Gebrauch dieses Wirtsorganismus adaptierte Codon- Auswahl aufweisen. Zu den vorgenannten Sequenzen komplementäre Sequenzen sind von der Erfindung ebenfalls umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremo- lekül einen zur Expression geeigneten Promotor, wobei die Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle des Promotors steht. Die Wahl des Promotors hängt vom zur Expression verwendeten Expressionssystem ab. Generell sind induzierbare Promotoren, wie z. B. der Metallothionein-Promotor, bevorzugt, jedoch sind auch konstitutive Promotoren möglich.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Nukleinsäuremolekül we- nigstens einen Teil eines Vektors, insbesondere regulatorische Regionen, wobei der Vektor ausgewählt sein kann aus Bakteriophagen wie B-Derivaten, Adenoviren, Vacci- niaviren, Baculoviren, SV40-Virus, Retroviren, Plasmiden, wie Ti-Plasmide von Agrobacterium tumefaciens, YAC-Vektoren und BAC-Vektoren. Bevorzugte Vektoren sind pRTSpRC 109 (Weigel et al., 1989) und pRBSIIPN25x/o (Stueber, 1994).

Ferner stellt die Erfindung Wirtszellen bereit, die das Nukleinsäuremolekül enthalten und die zur Expression des Nukleinsäuremoleküls geeignet sind. Im Stand der Technik sind zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme bekannt, wobei die Wirtszelien beispielsweise ausgewählt sind aus prokaryontischen Zellen, wie E. coli oder B. subtilis, aus eukaryontischen Zellen, wie Hefezellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, COS-Zellen oder HeLa-Zellen, sowie Derivaten davon. Im Stand der Technik sind beispielsweise bestimmte CHO-Produktionslinien be- kannt, deren Glykosylierungsmuster im Vergleich zu CHO-Zellen verändert sind. Die durch die Verwendung Glykosylierung-effizienter oder Glykosylierung-verringerter Wirts- zellen erhaltenen Polypeptidvarianten verfügen möglicherweise über eine veränderte räumliche Struktur, die gegebenenfalls zu einer erhöhten biologischen Aktivität gegen- über der glykosylierten Polypeptidvariante führen kann, sofern das Polypeptid biologi- sche Aktivität aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Polypeptidvariante mit erhöhter Heparin-Bindungsfähigkeit, umfassend das Addieren wenigstens eines Oligopeptides, enthaltend eine Aminosäuresequenz, die aus : SEQ ID No : 1 und SEQ No : 2 ausgewählt ist, an die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, und/oder das Inserieren wenigstens eines Oligopeptids, das eine Aminosäuresequenz enthält, die aus : SEQ ID No : 1 und SEQ No : 2 ausgewähit ist, in die Aminosäurese- quenz des Polypeptids ; und/oder das Substituieren wenigstens einer natürlicherweise in der Aminosäuresequenz vorkommenden Oligopeptidsequenz durch ein Oligopeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die aus : SEQ ID No : 1 und SEQ No : 2 ausgewählt ist.

Das Verfahren kann durch chemische Partial-oder Total-Synthese, unter Verwendung der bekannten Merrifield-Synthese oder durch enzymatische Synthese durchgeführt werden. Weiterhin kann das Verfahren gentechnologisch, d. h. durch rekombinante Ex- pression durchgeführt werden. Die Erfindung umfaßt ferner auch die Kombination aus chemischen/enzymatischen und gentechnologischen Verfahren.

In einer bevorzugten Form umfaßt das Verfahren : a) in vitro Mutagenese einer für ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, so daß (i) an die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure wenigstens eine Nukleinsäure addiert wird, die für ein Oligopeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die aus SEQ ID No : 1 und SEQ ID No : 2 ausgewähtt ist ; und/oder (ii) in die für das Polypeptid kodie- rende Nukleinsäure wenigstens eine Nukleinsäure inseriert wird, die für ein Oligopeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID No : 1 und 2, enthält und/oder (iii) wenigstens eine natürlicherweise in der für das Polypeptid kodierenden Nukleinsäure vorkommende Nukleinsäuresequenz durch eine Nukleinsäuresequenz substituiert wird, die für ein Oligopeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die aus : SEQ ID Nu : 1 und SEQ ID No : 2 ausgewähit ist ; b) Einklonieren der mutierten Nukleinsäure in einen geeigneten Expressionsvektor ; c) Transformieren/Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem erhaltenen Ex- pressionsvektor ; d) Kultivieren der transformierten/transfizierten Wirtszelle unter zur Expression geeigne- ten Bedingungen ; e) Isolieren und gegebenenfalls Renaturieren der Expressionsprodukte.

Dem Fachmann sind zahireiche Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen be- kannt ; vgl. Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology, engl. Text, Band 62, Humana Press Totowa, New Jersey (1995). Die Expression kann sowohl konstitutiv als auch induzierbar sein, wobei Induktoren wie beispielsweise IPTG und Zn2+ dem Fachmann bekannt sind.

Die der Mutagenese zuzuführenden Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit biologischer Aktivität kodieren, sind beispielsweise durch ein Screening von cDNA- Banken, die aus Gewebe hergestellt wurden, die das Polypeptid exprimieren, oder von genomischen DNA-Banken mit einer nachweisbar markierten spezifischen Sonde er- hältlich. Die Identifizierung positiver cDNA-/genomischer DNA-Klone erfolgt gemäß Standardverfahren ; vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Die Nukleinsäuresequenz, die für das Oligopeptid kodiert, das die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz enthält, kann beispielsweise durch Kassetten- mutagenese oder durch rekombinante Polymerasekettenreaktion (PCR) in die doppel- strängige DNA eingefügt werden. Die entsprechenden Methoden sind dem Fachmann bekannt (z. B. Wang et al., 1997 ; Ruppert et al., 1996). Die erhaltene mutierte doppel- strängige DNA wird sodann in einen Expressionsvektor eingefügt.

Die verwendbaren Vektoren und Wirtszellen wurden bereits vorstehend beschrieben.

Wird die Expression in E. coli durchgeführt, so kann das Protein aus dem unlöslichen Anteil der Zellen durch Guanidiniumhydrochlorid herausgelöst werden (Ruppert et al., 1996). Sodann wird die Polypeptidvariante renaturiert und über Chromatographie ge- reinigt. Für die Reinigung von Proteinen aus der TGF-p Superfamilie ist ein pH-Wert von 8 bevorzugt, wobei bevorzugt bei hoher Salzkonzentration (1 M NaCI), in Gegenwart von schwachen Detergentien und mit Redoxmediatoren gearbeitet wird.

Alternativ kann die Polypeptidvariante aus dem Kulturmedium erhalten werden, wenn ein geeigneter Expressionsvektor verwendet wird, der zur Expression der Polypeptidva- riante mit einer geeigneten sekretorischen Signalsequenz führt.

Die Erfindung stellt weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die minde- stens eine erfindungsgemäße Polypeptidvariante und physiologisch verträgliche Zu- satzstoffe, die im Stand der Technik bekannt sind, enthalten. Bevorzugt ist hierbei, daß die Polypeptidvariante von einem biologisch aktiven Polypeptid abgeleitet ist, beispiels- weise von einem Cytokin oder einem Wachstumsfaktor. Besonders bevorzugt sind hier- bei Hormone, Cytokine und Wachstumsfaktoren, die an der Osteogenese beteiligt sind.

Die erhöhte Heparin-Bindungsfähigkeit der Polypeptidvarianten führte hierbei zu einer verringerten Diffusion der therapeutisch wirksamen Polypeptidvarianten von der Hepa- rin-Komponente der demineralisierten Knochenmatrix und somit zu einer erhöhten loka- len Konzentration therapeutisch wirksamer Stoffe.

Allgemein wurde auch eine erhöhte Bindungsfähigkeit für extrazellulare Matrix- Strukturen und Zelloberflächen beobachtet. Die therapeutisch wirksamen Polypeptidva- rianten sind somit verwendbar zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheiten, an denen die extrazellulare Matrix oder Zelloberflächen beteiligt oder benachbart sind.

Gehören die den Polypeptidvarianten zugrundeliegenden Polypeptide zur DVR-Familie, so sind sie zur Förderung des Knochenwachstums und-reparatur geeignet. Die Beteili- gung von GDF-5 an der Knorpel-Bildung ist beschrieben und für die Sehnen- Entwicklung wird sie postuliert. Somit sind von GDF-5 abgeleiteten Polypeptidvarianten zur Knorpel-und Sehnen-Reparatur geeignet. BMP-7/OP-1 unterdrückt die Produktion von GDF-5, welches möglicherweise einen Mechanismus zum Ausgleich der Knochen- und Knorpel-Bildung darstellt. Somit weisen von BMP-7 abgeleiteten Polypeptidvarian- ten regulatorische Eigenschaften in bezug auf die Knochen-und Knorpel-Bildung auf.

BMP-7 ist an der Nieren-und Augen-Entwicklung, BMP-6 an der Haut-und BMP-2 an der Herz-Entwicklung beteiligt. Somit können gemäß der vorliegenden Erfindung die von BMP abgeleiteten Polypeptidvarianten zur Regulation der Nieren-, Augen-, Haut-und Herz-Entwicklung verwendet werden.

Weiterhin wird die Angiogenese durch GDF-5 induziert. Daher sind GDF-5 von abgelei- teten Polypeptidvarianten sinnvoll zur Stimulierung der Angiogenese einsetzbar.

Gehören die Polypeptide der Polypeptidvarianten zur TGF-j3-Familie, so sind die thera- peutisch wirksamen Polypeptidvarianten zur Immunsuppression, Entzündungshem- mung, Stimulierung der Knochen-und Knorpel-Bildung geeignet. Sie sind aufgrund der verstärkten Ablagerung von Extrazellulärmatrix-Komponenten wie Collagenen, Fibro- nectin, Glykosaminoglykanen und Proteoglykanen zur Wundheilung verwendbar.

Weiterhin sind die Polypeptidvarianten auf TGF-|3-Basis zur Verhinderung der Retina- Ablösung verwendbar. Ferner sind sie vorteilhaft anwendbar bei oraler Mukositis, die als Nebenwirkung der Tumor-Chemotherapie auftritt. Aufgrund der allgemeinen Zellwachs- tumshemmung durch TGF-3's können sie zur Unterdrückung von Krebszellen wie bei- spielsweise Brustkrebszellen verwendet werden.

Die Beteiligung der Hypophysen-Hormone, Aktivine und Inhibine bei der Modulation des weiblichen Menstruationszyklus ist bekannt. Aktivin induziert und Inhibin hemmt die Synthese der Hypophysen-Hormone FSH und LH. Somit wird die Verwendung der er- findungsgemäßen Poiypeptidvarianten zur Regulation des weiblichen Menstruationszy- klus vorgeschlagen.

Inhibine unterdrücken die Entwicklung von Keimdrüsen-Tumoren. Inhibin-abgeleitete Polypeptidvarianten könnten daher bei der Prophylaxe und zur Behandlung von Keim- drüsen-Tumoren eingesetzt werden.

Aktivine sind vermutlich an der Wundheilung beteiligt. Die Erfindung umfaßt somit die Verwendung von von Aktivin abgeleiteten Polypeptidvarianten zur Herstellung von Me- dikamenten zur Wundheilung.

Aktivine sind möglicherweise bei der Entwicklung und dem Umsatz von Knorpel zu Kno- chen beteiligt. Die von Aktivin abgeleiteten Polypeptidvarianten sind somit zur Regulati- on des Knochen-bzw. Knorpel-Wachstums geeignet.

Aktivin fördert die Expansion von Blast-bildenden Untereinheiten und Kolonie-bildenden Untereinheiten während der Hämatopoese, wohingegen Inhibin diese Funktionen inhi- biert. Daher wird die Verwendung von Polypeptidvarianten, die von diesen Proteinen abgeleitet sind, zur Regulation der Hämatopoese vorgeschlagen.

Weitere besonders relevante Polypeptide, die als Grundlage für die Polypeptidvarianten dienen können, sind MIS und GDNF (Glial cell line derived neurotrophic factor), die bei- de an der Embryonal-Entwicklung beteiligt sind.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ferner eine Matrix zur Osteoin- duktion bereit, die mindestens eine Polypeptidvariante und einen Träger umfaßt. Wei- terhin wird ein in vitro-Verfahren zur Osteoinduktion, in dem die osteoinduktive Matrix verwendet wird, vorgeschlagen.

Im Stand der Technik sind osteoinduktive Matrizen vorgeschlagen worden, die Wachs- tumsfaktoren enthalten. Beispielsweise befindet sich eine von der Firma Integra Life Sciences Corp. hergestellte Collagen-Matrix, die rekombinantes humanes BMP-2 um- faßt, in der Entwicklung (Hollinger et al., 1998). Weiterhin entwickelt die Firma Sofamor- Danek Titankäfige, die rekombinantes humanes BMP-2 enthalten. Schiießlich gibt es eine Vorrichtung unter der Bezeichnung"NOVOSTM"von der Firma Creative Biomolecu- les, nun als Weiterentwicklung durch die Firma Stryker bekannt, die osteoinduktives Typ I Knochencollagen und rekombinantes OP-1 (BMP-7) enthält. Diese Vorrichtung befin- det sich in der klinischen Phase III in den Vereinigten Staaten von Amerika. Die Ver- wendungen umfassen die Behandlung von orthopädischen Traumata, maxillofaziale Reparaturen und avaskuläre Nekrosen. Weiterhin wird die Verwendung von BMP-7 zur Behandlung von Knorpelschäden, Nierenversagen, Hirn-und Rückenmarksschädigun- gen, Herzinfarkt und Osteoporose vorgeschlagen.

Typischerweise wird also ein Matrix-Material mit osteoinduktiven Wachstumsfaktoren versetzt und diese Matrix operativ eingesetzt. Die Matrix ist hierbei nicht nur der Träger des Wachstumsfaktors, sondern verleiht auch physikalische Stabilität und verhindert das Eindringen von Weichteilgewebe in den Ort des Knochendefektes. Das Hinzufügen der Wachstumsfaktoren soll hierbei das Ersetzen des Implantates durch neuen Kno- chen beschleunigen.

Ein Hauptproblem bei den bekannten Matrix-Typen besteht jedoch darin, daß die in der Matrix enthaltenen Proteine sehr rasch den Ort der Anwendung verlassen. Da die Kno- chenreparatur jedoch ein relativ langsamer Vorgang auch bei Anwesenheit von Wachstumsfaktoren ist, wirkt die kurze Verbleibzeit des hinzugefügten Proteins limitie- rend.

Da die biologische Wirkung von osteoinduktiven Wachstumsfaktoren darin besteht, die Immigration von pluripotenten mesenchymalen Zellen unter Bildung von Chondro-und Osteovorläuferzellen zu induzieren und deren Aktivität zu stimulieren, erfordert dies die Lokalisierung der Wachstumsfaktoren an der Reparaturstelle. Wachstumsfaktoren, die aus der Reparaturstelle herausdiffundieren, sind einerseits für die beabsichtigte thera- peutische Wirkung sinnlos und bergen andererseits die Gefahr einer ektopischen Kno- chenbildung.

Die erfindungsgemäßen Polypeptidvarianten zeichnen sich im Vergleich mit den be- kannten Polypeptiden durch eine erhöhte Heparin-Bindungsfähigkeit aus, die bei Ver- wendung von Heparin bzw. Heparin-ähnlichen Strukturen als Matrixmaterial oder auf die Matrix aufgebrachtes Material das rasche Wegdiffundieren der Polypeptidvarianten vom Träger verhindert. Die Polypeptidvarianten bleiben somit am Ort der Wirkung lokalisiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Träger aus Heparin, Hydroxylapatit, Hyaluronsäure, synthetischen Polymeren oder Collage. Die Trägerstoffe können re- sorbierbar oder nicht resorbierbar sein.

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zum Herstellen von pharmazeutisch verträglichen Matrizen bekannt. Beispiele pharmazeutisch verträglicher Matrizen sind in Wagner et al., 1996, und Fischgrund et al., 1997 beschrieben. Die Matrix kann in Form eines Blockes, Gels, Vlies, einer Kugel oder Granula ausgebildet sein.

Die Verteilung der Polypeptidvarianten innerhalb der Matrix kann homogen oder nicht- homogen sein, wobei eine homogene Verteilung bevorzugt ist. Die Verteilung der Poly- peptidvariante kann, abhängig von der Größe des Defektes oder der Dauer des Hei- lungsvorgangs, vorteilhaft gestaltet werden. Die Polypeptidvariante sollte hierbei in einer Konzentration von ungefähr 100 ag/cm3 bis ungefähr 2 mg/cm3, vorzugsweise 250 Fg/cm3 bis 750 4g/CM3 und besonders bevorzugt 450 4g/CM3 bis 550 pg/cm3 Träger lie- gen. In der Regel wird eine Konzentration von ungefähr 500 llg/cm3 verwendet werden.

Erfindungsgemäß kann die osteoinduktive Matrix zur Behandlung von orthopädischen Traumata, maxillofaszialen Reparaturen und avaskulären Nekrosen verwendet werden.

Weiterhin wird die Verwendung zur Prophylaxe und Therapie von Knorpelschäden, Nie- renversagen, Hirn-und Rückenmarksschädigungen, Herzinfarkt und Osteoporose vor- geschlagen.

Die erfindungsgemäße osteoinduktive Matrix weist bei Verwendung rekombinant her- gestellter Polypeptidvarianten weiterhin den Vorteil auf, daß sie frei von Kontaminatio- nen, z. B. Viren ist, die bei Wachstumsfaktoren tierischer Herkunft von Zeit zu Zeit be- obachtet werden.

Die erfindungsgemäße osteoinduktive Matrix kann in vitro verwendet werden, um in Gewebekultur die Ansiedlung von Osteoblasten und/oder Chondroblasten zu ermögli- chen. Diese so vorbereiteten osteoinduktiven Matrizen können sodann autolog oder heterolog mit chirurgischen Verfahren in Patienten eingebracht werden (Kübler et al., 1997 ; Kübler et al., 1998 ; Chen et al., 1998).

Es ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Figuren und Beispielen die Erfindung zu er- läutern, diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die eben- falls umfaßt sind.

Beschreibung der Figuren : Fig. 1 zeigt Abbildungen einiger Strukturformeln von typischen Disaccharideinheiten Heparin-ähnlicher Strukturen, wie sie unter anderem in bestimmten Glykosaminoglyka- nen auftreten.

Fig. 2 zeigt das Bild eines mit Coomassie Blau angefärbten SDS-Polyacrylamidgels nach Auftrennung der in E. coli exprimierten und gereinigten Varianten T3 und T4 sowie von BMP-2 und EHBMP-2 in oxidierter (oben) und reduzierter (unten) Form. Links ist jeweils ein Molekulargewichtsstandard (15,20,30,35,68 und 94 kD) aufgetragen. Die Gele wurden (von links nach rechts) wie folgt beladen : Spuren 1-4 : je 2 lig BMP-2, EHBMP-2, T3 (SEQ ID No : 5) und T4 (SEQ ID No : 6) ; Spuren 5-8 : je 5 g BMP-2, EHBMP-2, T3, T4.

Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung von mit dem Pharmacia BIA2000 System auf- genommenen Sensogrammen der Bindung der Varianten T3 und T4 (SEQ ID No : 5 und 6) sowie von BMP-2 an Heparin.

Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung von mit dem BIA2000 System aufgenommenen Sensogrammen der Bindung der Varianten T3 und T4 (SEQ ID No : 5 und 6) sowie von BMP-2 an die Ektodomäne des Rezeptors BMPR-IA. <BR> <BR> <BR> <P>Fig. 5 zeigt in einer graphischen Darstellung den Einbau von 35SO4 in kultivierte Zellen aus Gliedmaßenknospen von Hühnerembryonen in Abhängigkeit von der Konzentration von BMP-2, der Variante T3 und der Variante T4 (SEQ ID No. 5 und 6).

Fig. 6 zeigt in einer graphischen Darstellung die Induktion der Alkalischen Phosphatase in kultivierten C2C12 Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration von BMP-2, der Va- riante T3 und der Variante T4 (SEQ ID No. 5 und 6).

Fig. 7a und 7b zeigen histologische Ansichten von in der Maus gebildeten Ossikeln, die durch Implantation von BMP-2 induziert wurden. Die Präparate wurden mit Hematoxylin- Eosin gefärbt. Ossikel erscheinen violet, mit darin eingeschlossenen weissen oder dun- kelvioletten Arealen. Bei den dunkelvioletten Bereichen handelt es sich um Knochen- mark, bei den weissen Zellen um Fettgewebe, das natürlicherweise im Knochenmark vorkommt. Die umgebende Muskulatur ist intensiv rot gefärbt.

Fig. 8 zeigt die histologische Ansicht eines in der Maus gebildeten Ossikels, das durch Behandlung mit T3 induziert wurde. Das Präparat wurde ebenfalls mit Hematoxylin- Eosin gefärbt.

Fig. 9 zeigt eine Röntgenaufnahme eines durch T3-Implantation in der Maus gebildeten Ossikels.

Fig. 10 zeigt die histologische Ansicht eines in der Maus gebildeten Ossikels, das durch Behandlung mit T3 induziert wurde.

Methoden Messung der Heparin-Bindung Zur Messung der Heparin-Bindung wurde Heparin 6000 aminobiotinyliert (Mach et al., 1993) und an einen Streptavidin-beschichteten Biosensor CM5 (Pharmacia Biosensor AB) fixiert. Die Bindung von Polypeptiden und erfindungsgemäßen Polypeptidvarianten- mit erhöhter Heparin-Bindungsfähigkeit an den Heparin-dotierten Biosensor wurde mit Hilfe eines BIA2000 Gerätes gemessen. Die einzelnen Versuchsbedingungen sind vor- beschrieben (Ruppert et al., 1996).

Messung der Bindung an den Rezeptor BMPR-IA Zur Messung der Bindung wurde die Ektodomäne des Rezeptors BMPR-IA aminobio- tinyliert (Shen et al., 1996) und an einen Streptavidin-beschichteten Biosensor CM5 (Pharmacia Biosensor AB) fixiert. Die Bindung von Polypeptiden und den erfindungs- gemäßen Polypeptidvarianten an den Rezeptor-dotierten Biosensor wurde mit Hilfe ei- nes BIA2000 Gerätes gemessen.

Messung der biologischen Osteoinduktions-Aktivität Zur Messung der biologischen Aktivität wurde folgendes Zellkultursystem verwendet : Zellen aus den Gliedmaßenknospen von Hühnerembryonen wurden isoliert und für die Messung des BMP-abhängigen Einbaus von 35SO4 in Proteoglykane verwendet (Ruppert et al., 1996). Es wurde ein Konzentrationsbereich für das BMP-Protein ge- wäh ! t, der es ermöglichte, sowohl die maximale Zellantwort als auch die EC5o- Konzentration (Konzentration, bei der 50 % des maximalen Einbaus erreicht werden) zu bestimmen.

Die myoblastäre Maus-Zellinie C2C12 wurde verwendet, um die BMP-abhängige Induk- tion der Alkalischen Phosphatase zu bestimmen (Katagiri et al., 1994). Es konnten die maximale Zellantwort und die EC50-Konzentration bestimmt werden.

Beispiel 1 : Expression und Charakterisierung von T3 Es wurde cDNA (Ruppert et al., 1996), die für das reife humane BMP-2 (NIH-Datenbank Entrez/Swiss-Prot Nr. P12643) und zusätzlich ATGGCT (Met-Ala) am 5'Ende kodierte, einer Kassetten-Mutagenese (Wang et al., 1997) unterworfen. Zwischen die singulären Spaltstellen für Ncol und Aflll wurde folgende doppelsträngige DNA eingefügt : 5'CATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCGCTCGTAAACGTC 3'SEQ ID Nô : 9 <BR> <BR> <BR> <BR> 3'CGAGTTCGGTTTGTGTTTGTCGCCTTTGCGCGAGCATTTGCAGAATf 5 SEQ ID NO : 10 Dadurch wurde zwischen Gln an Position 8 und Arg an Position 9 eines humanen Met- Ala-BMP-2 zusätzlich die Sequenz Arg-Lys-Arg-Ala (SEQ ID No. 3) eingefügt. Die mu- tierte cDNA wurde als Ncol/BamHi-Fragment in den Expressionsvektor pRBSIIPN25x/o (Stueber et al., 1984) integriert, und die Mutation durch Sequenzierung bestätigt.

Nach Expression und Isolierung zeigte sich, daß die so hergestellte Variante T3 in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ein im Vergleich zu BMP-2 erwar- tungsgemäß höheres apparentes Molekulargewicht aufwies. T3 interagierte in Biosensor Experimenten (BIA2000) mit unveränderter Affinität (Dissoziationskonstante Kd : ca.

200 pM) mit der Ektodomäne des BMP-Rezeptors BMPR-IA (NIH-Datenbank Entrez/Swiss-Prot Nr. P36894). Die Bindung an Heparin war jedoch im Vergleich zu BMP-2 erhöht, wohingegen die Abdissoziierung verlangsamt war.

Die biologische Aktivität war in verschiedenen Testsystemen verändert. Die über einen Sulfateinbau gemessene Proteoglykansynthese in Zellen der GliedmaRenknospen von Hühnerembryonen zeigte einen höheren EC50-Wert für T3 im Vergleich zu BMP-2. Der maximal erreichbare Einbau war unverändert. Die Induktion der Alkalischen Phosphata- se-Aktivität in der C2C12-Zellinie zeigte für T3 ebenfalls einen höheren EC50-Wert als für BMP-2.

Beispiel 2 : Expression und Charakterisierung von T4 Es wurde Beispiel 1 mit der Ausnahme wiederholt, daß folgende doppelsträngige DNA in die BMP-2 cDNA integriert wurde : 5'CATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCGCTAAGCATAAGCAACGTAAGCGT C 3' <BR> <BR> <BR> <BR> 3'CGAGTTCGGTTTGTGTTTGTCGCCTI'TGCGCGATTCGTATTCGTTGCATTCGCAGAA TT 5' Die obere Sequenz wird mit SEQ ID NO : 11, die untere mit SEQ ID NO : 12 im Sequenz- protokoll angegeben.

Dadurch wurde zwischen Gln an Position 8 und Arg an Position 9 des BMP-2 zusätzlich die Sequenz Arg-Lys-Arg-Ala-Lys-His-Lys-Gln eingefügt.

Die so exprimierte und isolierte Variante T4 wies in der SDS-PAGE ein höheres appa- rentes Molekulargewicht als T3 und BMP-2 auf. T4 bindet an die Ektodomäne des BMP- Rezeptors BMPR-IA mit einer Dissoziationskonstante von etwa 340 pM. Dies entspricht der Rezeptor-Affinität von BMP-2 (Kd 320 pM). Die Bindung von T4 an Heparin war je- doch im Vergleich zu BMP-2 erhöht, und die Abdissoziierung verlangsamt. Die Freiset- zung von T4 von Heparin war überraschenderweise langsamer als die von T3.

Die biologische Aktivität von T4 ist im Vergleich zu BMP-2 verändert. T4 zeigt während der Proteoglykansynthese (Sulfateinbau) in Zellen von Gliedmaßenknospen von Hühnerembryonen einen höheren EC50-Wert als BMP-2 (und sogar höher als T3).

Ebenso wird die Aktivität der Alkalischen Phosphatase in C2C12-Zellen durch T4 bei einem höheren ECso-Wert induziert als durch BMP-2.

Beispiel 3 : Untersuchungen zur in vivo-Wirksamkeit der Polypeptidvarianten Als Methode wurde hierbei die Induktion von ektotopem Knochen im Oberschenkelmus- kel der Maus gewählt. Bei ektoper Knochenbildung entsteht Knochen de novo in einem fremden Gewebe und ohne Kontakt zum Skelettsystem. Der Vorteil dieses Testsystems liegt in seiner hohen Stringenz. Da kein Kontakt mit skelettalem Knochen existiert, spie- len regenerative Knochenheilungsprozesse keine Rolle. Somit werden falsch positive Versuchsergebnisse vermieden, die durch Verletzung des Knochens während der Ope- ration verursacht werden könnten.

Die Methode zur Induktion ektoper Knochenbildung in ICR-Mäusen ist im Detail be- schrieben in Kübler und Urist, 1991.

BMP-2 und die Variante T3 wurden in unterschiedlichen Konzentrationen mit Rinder- serumalbumin als Träger vermischt, und in den Musculus quadriceps femoris von ICR- Mäusen implantiert. Nach 3 Wochen wurde das gebildete Knochenmaterial durch Rönt- genaufnahmen und histologische Untersuchungen charakterisiert.

Die Implantation von Rinderserumalbumin ohne BMP (Kontrolle) ergab in keinem Fall nachweisbare Knochenbildung. Weder mit BMP-2 noch mit T3 wurden Anzeichen für eine Entzündung oder sonstige schädliche Nebenwirkungen beobachtet. Fig. 7 ist zu entnehmen, daß BMP-2 die Bildung von Knochenmatrix und Knochenmark induzieren konnte. Fig. 8 zeigt die entsprechende Abbildung für die Behandlung mit T3. Im Ver- gleich zum Ergebnis mit BMP-2 zeigt sich für T3, daß das Verhältnis von Knochenmatrix zu Knochenmark stark in Richtung eines hohen Anteils von Knochenmatrix verschoben ist.

Fig. 9 zeigt eine Röntgenaufnahme eines durch T3 Implantation gebildeten Ossikels. Die Größe des Ossikels unterscheidet sich nicht wesentlich von Ossikeln, die im gleichen Testsystem mit konventionellen BMPs erhalten wurden.

Fig. 10 zeigt die histologische Ansicht eines Ossikels, das durch Behandlung mit T3 in- duziert wurde. Die Färbung wurde hier mit Masson-Trichrome durchgeführt, was es er- laubt, den Differenzierungsstatus von Knochengewebe zu unterscheiden. Rote Farbe zeigt komplett ausdifferenzierten Knochen an, türkise Areale sind noch im Prozess der Ossifikation begriffen. Zum Teil können in dem türkis gefärbten Gewebe runde, weisse Zellen ausgemacht werden ; es handelt sich dabei um Restanteile von knorpelbildenden Chondrocyten, da die BMP-induzierte Knochenbildung durch endochondrale Ossifikati- on erfolgt (transiente Knorpelbildung).

Die den Figuren 7 bis 10 zugrundeliegenden Versuche werden mit jeweils 10 lig re- kombinantem humanem BMP-2 bzw. rekombinanten T3 (SEQ ID No. 5) durchgeführt. In der folgenden Tabelle wird die in vivo Wirksamkeit von BMP-2 und rekombinantem T3 verglichen. rhBMP-2 (Rg) T3 (lig) Knochenbildung 0/30 0, 40/3 0,4 3/4 1 0/9 1 4/4 4 4/4 10 10/11 10 4/4 Tabelle 1 : Vergleich der durch BMP-2 bzw. T3-induzierten Knochenbildung.

Es zeigt sich, daß T3 bei geringen Konzentrationen wirksamer ist als BMP-2 (Tabelle 1).

Bei Implantation von 1 pg BMP-2 erfolgte in keinem von neun Versuchen Knochenbil- dung, wohingegen bei der gleichen Menge T3 in vier von vier implantierten Tieren Kno- chen gebildet wurde. T3 induziert sogar bei Applikation von nur 0,4 4g noch in 3 von 4 Tieren Knochenbildung.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Polypeptidvariante mit erhöhter Heparin-Bindungs- fähigkeit in vivo die Knochenbildung induzieren kann. Es wurden in keinem Fall Entzün- dungsreaktionen oder sonstige Unverträglichkeiten beobachtet. Im Vergleich zu kon- ventionellem BMP-2 bewirkt die Anwendung von T3 die Bildung eines Ossikels mit we- sentlich höherem Anteil an Knochenmatrix. Da die Matrix dem Knochen seine mechani- sche Stabilität verleiht, wird ein in diesem Sinne dichterer Knochen eine wesentlich hö- here Festigkeit und funktionelle Belastbarkeit aufweisen. Es wird also im Vergleich zu BMP-2 die Bildung eines Knochens mit deutlich höherer Qualität induziert. Da T3 bei einer geringeren Konzentration als BMP-2 in vivo biologische Wirksamkeit zeigt, kann auch die erforderliche Menge an Wachstumsfaktor reduziert werden. Dies stellt einen wünschenswerten Vorteil der Polypeptidvariante im Vergleich zu BMP-2 dar.

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