Proteine, insbesondere Enzyme, finden in zahireichen Bereichen des täglichen Lebens eine weite Anwendung und sind somit von großem wirtschaftlichen Interesse.

Die Herstellung von Proteinen kann entweder chemisch oder mikrobiell erfolgen. Die erreichbaren Produktausbeuten bei der chemischen Synthese sind jedoch wenig zufriedenstellend. Darüber hinaus sind die Verfahren zur chemischen Herstellung von Proteinen in der Regel extrem zeit-und kostenintensiv und durch den nicht unerheblichen Einsatz an Hiffsstoffen vielfach stark umweltbelastend.

Wesentlich ökonomischer ist daher die Herstellung von Proteinen mit biologischen Systemen, insbesondere Mikroorganismen, da diese in der Regel einfach zu handhaben sind und die gewünschten Zielprodukte in einstufigen Prozessen gewonnen werden können. Beispiele hierzu sind zahlreich in der Fachliteratur beschrieben.

Allerdings ist die Expression von eukaryotischen Proteinen in Prokaryonten aufgrund einer erhöhten Faltungsproblematik und fehlender Glykosylierung der exprimierten Proteine limitiert.

Demgegenüber stellen Hefen oder hefeartig wachsende Organismen ein vielfach beschriebenes System der Wahl zur Herstellung eukaryotischer Proteine dar. Beispielhaft sei hierzu Sudbery, P. E., 1996, in Current Opinion in Biotechnology, p. 517-524 zitiert. Ferner sind Verfahren zur

Herstellung von Exoenzymen in filaments wachsenden Piizen, wie beispielsweise Trichoderma oder Aspergillus beschrieben (Archer, D. B. et al., 1995, in Chapman & Hall, The Growing Fungus, p. 137-162).

Durch die Produktion von Vitaminen, insbesondere Vitamin B2 (Riboflavin) gewinnt der Pilz Ashbya gossypii zunehmend wirtschaftliches Interesse.

Entsprechende Verfahren zur Herstellung und Überexpression von Riboflavin mit Ashbya gossypii sind in DE 195 25 281 und DE 195 45 468 offenbart.

Eine Herstellung von Proteinen, insbesondere Cellulase mit Ashbya gossypii ist bislang nicht beschrieben.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die biotechnische Herstellung von Proteinen mit einem Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya.

Hierbei ist erfindungsgemäß sowohl die Herstellung zelleigener als auch zellfremder Proteine möglich.

Erfindungsgemäß zeichnet sich der eingesetzte Mikroorganismus dadurch aus, daß er eine derartige Genstruktur aufweist, daß er eine Proteinsyntheseleistung (Nettoproduktivität) aufweist, die gegenüber derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC 10895 verändert, insbesondere erhöht ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus der Proteine synthetisiert, die der Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC 10895 nicht produziert. Vorzugsweise synthetisiert der erfindungsgemäße Mikroorganismus Cellulase.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Mikroorganismus um einen Pilz der Spezies Ashbya gossypii.

Bei der Expression zellfremder Proteine kommt erfindungsgemäß ein Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii mit der EMBL Accession-No.

Z12157 zum Einsatz. Bevorzugt wird ein Cellulase-Gen mit einer für die in SEQ ID No 1 von Nukleotid 2912 bis Nukleotid 4190 angegebenen für eine Aminosäuresequenz kodierenden Nukleotidsequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz eingesetzt.

Hierbei sind dem Cellulase-Gen erfindungsgemäß reguiatorische Gensequenzen zugeordnet und mit diesem operativ verknüpft. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Erfindungsgemäß ist dem Cellulase-Gen ein Promotor vorgeschaltet, der eine Expression in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya ermöglicht.

Ais Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Ashbya steuern kann. Bevorzugt ist der Promotor der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii. Besonders bevorzugt ist der Promotor der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii mit der in SEQ ID No 1 von Nukleotid 2549 bis Nukleotid 2908 angegebenen DNA- Sequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden Nukleotidsequenz.

Hierbei sind auch funktionelle Varianten des Promotors denkbar, deren Funktion, verglichen mit der Ausgangssequenz, abgeschwächt oder verstärkt ist.

Außerdem ist dem Cellulase-Gen erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz nachgeschaltet, die eine Termination der Transkription in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya ermöglicht. Als Transkriptions-Terminator ist grundsätzlich jeder Terminator geeignet, der die Transkription von Fremdgenen in Ashbya steuern kann. Bevorzugt ist der Transkriptions-Terminator der Glyzerinaldehydphosphat- Dehydrogenase aus Ashbya gossypii. Besonders bevorzugt ist der Transkriptions-Terminator der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii mit der in SEQ ID No 1 von Nukleotid 4191 bis Nukleotid 4840 angegebenen DNA-Sequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden Nukleotidsequenz. Hierbei sind auch funktionelle Varianten des Transkriptions-Terminators denkbar, deren Funktion, verglichen mit der Ausgangssequenz, abgeschwächt oder verstärkt ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Genstruktur enthaltend ein Cellulase-Gen der zuvor beschriebenen Art sowie diesem Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen, die eine Expression in einem Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya ermöglichen. Hierbei enthält die Genstruktur erfindungsgemäß aus der Nukleotidsequenz der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii einen Promotor mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 2549 bis 2908 und einen Transkriptions-Terminator mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 4191 bis 4840 oder im wesentlichen gleich wirkenden Nukleotidsequenzen. Ferner enthält die erfindungsgemäße Genstruktur der zuvor beschriebenen Art an beiden Enden, also flankierend, Nukleotidsequenzen aus dem Genom von Ashbya gossypii. Bevorzugt handelt es sich dabei um Sequenzen des Gens Leu2 kodierend für die 3- Isopropyl-Matat-Dehydrogenase mit einer Nukleotidsequenz von Nukleotid 9 bis 435 und des Gens SPL1, einem an der Reifung der tRNA beteiligten Faktor, mit einer Nukleotidsequenz von Nukleotid 4841 bis 5153. Das Gen SPL1 ist im Leu2-Genlocus von Ashbya gossypii organisiert. Eine

schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Genstruktur ist in Fig. 1 dargestellt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektor enthaltend ein Cellulase- Gen und/oder einen Promotor und/oder einen Transkriptions-Terminator der zuvor beschriebenen Art oder eine Genstruktur der zuvor beschriebenen Art sowie zusätzliche Regulationssignale beispielsweise zur Replikation des Vektors in der Wirtszelle oder zur Integration in dessen Genom.

Desweiteren ist ein transformierter Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya zur Herstellung von Cellulase Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Dabei enthält der transformierte Mikroorganismus in replikativer Form eine Gen-Struktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteine produzierenden Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya, der so verändert wird, daß er eine Proteinsyntheseleistung (Nettoproduktivität) aufweist, die gegenüber derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC10895 verändert ist. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus Gegenstand der Erfindung, der Proteine produziert, die der Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC10895 nicht produziert. Dabei ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß durch die Einfügung des Cellulase-Gens das Enzym erzeugt wird.

Erfindungsgemäß kann die Veränderung des Organismus durch ein Verfahren erzielt werden, bei dem ein Austausch des Promotors vorgenommen wird und/oder eine Erhöhung der Genkopienzahl erfolgt.

Die Veränderung des Mikroorganismus erfolgt dabei erfindungsgemäß

mittels gentechnischer Methoden. Bevorzugt ist hier die als Transformation bezeichnete Übertragung von Fremd-DNA in den Wirtsorganismus.

Die vorliegende Erfindung schließt außerdem die Verwendung einer wie zuvor beschriebenen Gen-Struktur oder eines Vektors zur Herstellung eines solchen Mikroorganismus ein.

Ferner betriffl die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen bei dem ein Mikroorganismus der Gattung Ashbya mit den zuvor genannten Eigenschaften eingesetzt wird. Dieser Mikroorganismus wird dabei erfindungsgemäß zur Herstellung von Proteinen, bevorzugt Cellulase verwendet. Ebenso sind die nach einem solchen Verfahren hergestellten Proteine Gegenstand der Erfindung. Die Proteine finden dabei insbesondere in Bereichen der Papierindustrie, Medizin, Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie, Waschmittelindustrie oder als Katalysatoren Verwendung.

! m folgenden wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind : 1. Herstellung des Genkonstrukts und Übertragung in Ashbya qossypii Zur Herstellung der Genstruktur ist es zunächst erforderlich die verschiedenen DNA-Komponenten aus denen sie zusammengesetzt ist, herzustellen und zu isolieren. Dies erfolgt nach gängigen Methoden der Molekularbiologie, insbesondere mit Hilfe der PCR-Technik wie in Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0- 87969-309-6) und PCR Protocolls, Guide to Methods and Applications, 1990 Acad. Press Inc. beschrieben. Dazu wird die jeweilige DNA einem Restriktionsverdau unterzogen. Anschließend werden die erhaltenen DNA-Fragmente mittels einer Gel-Elektrophorese nach Größen aufgetrennt und die gewünschten Fragmente isoliert.

Zur Isolierung der flankierenden Sequenzen aus dem Genom von Ashbya gossypii wird DNA, die für das Leu2-Gen kodiert einem Restriktionsverdau mit Pmel und Sall unterworfen. Das gewünschte 5'-flankierende Fragment entspricht der in SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz von Nukleotid 9 bis 435 und ist somit 426 bp lang. Die 3'-flankierende Sequenz wird durch einen Pmel und Xhol-Verdau erhalten und umfaßt eine 312 bp lange Nukleotidsequenz entsprechend Nukleotid 4841 bis 5153 der in SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz.

Die in der Genstruktur enthaltende Promotor und Terminatorsequenz wird aus der DNA-Sequenz der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAP-DH) aus Ashbya gossypii isoliert. Die Promotorsequenz wird durch einen Sall/Ndel-Verdau erhalten und resultiert in einem 359 bp langen Fragment von Nukleotid 2549 bis 2908 der in SEQ ID No 1 dargestellten Sequenz. Die Terminatorsequenz resultiert aus einem Restriktionsansatz mit Bglll und Sall. Sie umfaßt 649 bp entsprechend Nukleotid 4191 bis 4840 der in SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz.

Das verwendete Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii (celA) umfaßt eine Sequenz von Nukleotid 2912 (entsprechend A des ATG-Codons) bis Nukieotid 4190 (entsprechend der nicht translatierten 3'-Region) und resultiert aus einem Restriktionsansatz mit BamHI und Ndel.

Als Selektionsmarker dient eine Nukleotidsequenz, die für eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin kodiert. Diese Sequenz umfaßt in SEQ ID No 1 die Nukleotide 442 bis 2542 und geht auf eine DNA- Sequenz aus dem E. coli-Transposon 903, erhalten durch einen Sall- Restriktionsverdau, zurück.

Die einzelnen Fragmente werden nach gängigen Methoden durch Ligation operativ verknüpft und zwar in folgender Reihenfolge : 5'-flankierede Sequenz aus Leu2-Kanamycin-Resistenz (G418)-Promotor (GAP-DH) -CeIA-Terminator (GAP-DH)-3'-flankierende Sequenz aus SPL1.

Die Übertragung des Genkonstrukts in den Pilz Ashbya gossypii erfolgt durch Transformation nach der Methode von Wright und Philippsen, 1991, Gene, 109 : 99-105.

2. Selektion eines rekombinanten und Cellulase-produzierenden Ashbya gossvpii-Stammes Durch Ausplattierung des Transformationsansatzes auf Medium, welches als Antibiotikum 300 ug/ml Kanamycin G418 enthält werden die erfolgreich mit dem Genkonstrukt transformierten Wirtszellen selektioniert.

Vermittelt durch die flankierenden Sequenzen des Leu2-Locus am 5'-und 3'-Ende der Genstruktur kann diese via homologer Rekombination in das Genom von Ashhya gossypii integrieren. Dadurch wird der Leu2-Locus der Wirtszelle zerstört, so daß die resultierenden rekombinanten Zellen eine Leucin-Auxotrophie aufweisen, die als Selektionsmarker genutzt wird.

Femer werden die Leucin-auxothrophen Zellen, die folglich nur auf

Medium mit Leucin als Supplement wachsen, auf ihre Fähigkeit zur Cellulase-Produktion untersucht. Dazu werden die Zellen auf dem Medium MA2 (Forster, C., et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 : 9442-9448) kultiviert, das allerdings nur 0, 1% Hefeextrakt und zusätzlich 0, 75% Carboxy- Methyl-Cellulose (low viscosity, Sigma) enthält. Die Zellen werden zum Wachstum 2 Tage bei 28 °C inkubiert. Anschließend werden die Kulturplatten wie bei Teather, R. M. and Wood, P. J., 1982, Appl. Environ.

Microbiol., 43 : 777-780 beschrieben mit Kongo-Rot angefärbt. Ais Beweis der erfolgreichen Integration und Expression des Cellulase-Gens im Genom von Ashbya gossypii zeigen die rekombinanten Zellen einen deutlichen Lysehof (Fig. 2).

Beschreibung der Figuren : Fig. 1 : Schematische Darstellung des Genkonstrukts zur Integration in das Genom von Ashbya gossypii via homologer Rekombination AgLeu2 : Leu2-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für die 3-Isopropyl- Malat-Dehydrogenase G418 : Kanamycin-Resistenz-Gen GPDp Promotor der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus A. gossypii celA Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii GPDt Terminator der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus A. gossypii AgSPL1 SPL1-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für einen an der Reifung der tRNA beteiligten Faktor, organisiert im Leu2- Locus von A. gossypii Fig. 2 : Wachstum der rekombinanten und Cellulase exprimierenden Ashbya gossypi-Stämme Cel-1 und Cel-2 sowie des Wildtyps ATCC 10895 auf einer Agarplatte enthaltend Carboxy- Methyl-Cellulose. Durch Anfärbung mit Kongo-Rot wird die Lyse der Carboxy-Methyl-Cellulose als Lysehof sichtbar.

SEQ ID No 1 : Nukleotidsequenz der erfindungsgemäß. en Gen- Struktur, enthaltend von Nukleotid 1 bis 8 : Pme Nukleotid 9 bis 435 : Leu2-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für die 3-lsopropyl-Malat-Dehydrogenase Nukleotid 436 bis 441 : Sal I-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 442 bis 2542 : Kanamycin-Resistenz-Gen Nukleotid 2543 bis 2548 : Sal I-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 2549 bis 2908 : Promotor der Glyzerinaldehydphosphat- Dehydrogenase aus Ashbya gossypii Nukleotid 2909 bis 2914 : Nde I-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 2912 bis 4190 : Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii Nukleotid 4191 bis 4840 : Transkriptions-Terminator der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii Nukleotid 4841 bis 5153 : SPL1-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für einen an der Reifung der tRNA beteiligten Faktor, organisiert im Leu2-Genlocus von Ashbya gossypii Nukleotid 5154 bis 5161 : Pme I-Restriktionsschnittstelle