AMOSTRA PARA USO EM ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO, SISTEMA, KIT, MÉTODO E USO DA MESMA".

Campo da Invenção

[001] O presente pedido de patente refere-se à uma plataforma de amostra individual, sustentável e personalizável para uso em um sistema de espectroscopia de infravermelho, podendo ser usada com amostras biológicas para diagnóstico de doenças ou em técnicas forenses, detecção de compostos orgânicos e inorgânicos com aplicações industriais, na agropecuária e em áreas de toxicologia.

[002] Ainda o presente pedido de patente se refere a um sistema de plataformas de amostra que compreende mais de uma da referida plataforma de amostra individual e ainda pode compreender uma estrutura de suporte para as plataformas de amostra .

[003] O presente pedido de patente também trata de um método que reduz o tempo de preparo e aumenta a capacidade analítica de amostras em um sistema de espectroscopia de infravermelho, assim como o uso da referida plataforma de amostra, ou sistema compreendendo as referidas plataformas de amostra, em um sistema de espectroscopia de infravermelho, mais particularmente espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR).

[004] O objetivo do presente pedido de patente é fornecer uma plataforma de amostra individual sustentável para uso em um sistema de espectroscopia de infravermelho, particularmente FTIR, mais particularmente ATR-FTIR que possibilite a secagem rápida para formação de biofilme e permita a identificação e armazenamento de amostras diretamente na referida plataforma, sem que apresente ruido relevante ou que interfira no espectro criado, e, que reduza o tempo de preparo das amostras e aumente a escala de análise das mesmas.

[005] Em uma outra modalidade o presente pedido fornece um método para uso da referida plataforma de amostra, ou do sistema de plataformas de amostra, em um sistema de espectroscopia de infravermelho. Mais particularmente um método que compreende uma etapa de secagem rápida da amostra para formação de um biofilme, que ainda pode compreender uma etapa de identificação da amostra e armazenamento da mesma diretamente na referida plataforma, sem que apresente ruido relevante ou que interferia no espectro criado, e, que reduza o tempo de preparo das amostras e aumente a escala na análise das mesmas.

[006] Em outra modalidade a presente invenção fornece o uso da referida plataforma de amostra, ou sistema de plataformas de amostra, em um sistema de espectroscopia de infravermelho. Mais particularmente o uso da referida plataforma de amostra com fluidos biológicos para diagnóstico de doenças usando espectros de infravermelho.

Fundamentos da Invenção

[007] A espectroscopia no infravermelho baseia-se na absorção de energia que encontra-se na região do infravermelho do espectro eletromagnético. Ela é largamente usada tanto na indústria quanto na academia por se tratar de uma técnica rápida, reprodutível e confiável, possibilitando controle de qualidade, análises dinâmicas e diagnóstico de doenças.

[008] A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) é uma plataforma analítica que avalia a interação da radiação eletromagnética no espectro infravermelho com a matéria, no intuito de obter informações moleculares de determinado material ou amostra biológica (BARTH, A., 2007). Desta forma, a absorção de um espectro específico de cada amostra, proporciona modos vibracionais únicos de cada estrutura molecular avaliada, considerando que cada grupo químico funcional apresenta uma assinatura específica no espectro (BUNACIU, A. A., et ai., 2017).

[009] A configuração do aparelho para aquisição dos espectros FTIR pode ser feita de diferentes maneiras, dentre estas as mais utilizadas são a de transmissão, transflexão e reflexão total atenuada (ATR). As análises espectrais por reflexão, em geral, são mais utilizadas em relação às de transmissão, uma vez que os espectros obtidos por essa aquisição devem ser corrigidos computacionalmente devido a ocorrência de interferências físicas (CHAN, K. L., et al., 2013). Ao contrário da transmissão e transflexão, medidas no ATR não requerem substratos especiais e nenhuma preparação da amostra, necessitando apenas que a amostra esteja em contato direto com o elemento de reflexão interna, tornando o processo de análise mais rápido e simples, sendo mais indicado para processos de diagnósticos de doenças (Tatulian, 2003; DORLING, K. M., et al. 2013).

[010] A região do infravermelho médio absorvida pela espectroscopia FTIR, encontra-se na faixa de 400-4000 cnr ¹ , compreendendo os modos vibracionais associados a importantes componentes bioquímicos. Isto indica que em uma mesma análise, diversos grupos funcionais de proteínas, carboidratos, lipídeos e ácidos nucleicos são analisados de forma integrada, e cada um deles pode ser utilizado como um biomarcador único, por meio de uma análise integrada com base em um painel de biomarcadores ou por inteligência artificial encontrando padrões específicos para diversas doenças .

[011] Nosso grupo e outros já demonstraram a capacidade de utilização do ATR-FTIR como plataforma para diagnóstico de doenças sistémicas baseados em análises de fluidos biológicos com saliva, urina e sangue.A saliva foi utilizada para discriminar doença renal crónica (RODRIGUES, R. P., et al., 2019) e câncer de mama (FERREIRA, I. C. C., et al., 2020) em humanos e diabetes (CAIXETA, D. C., et al., 2020) em modelos animais. A urina foi utilizada como fluido diagnóstico de cisteinúria (OLIVER, K. V., et al., 2016) e câncer de endométrio (PARASKEVAIDl, M., et al., 2018) em humanos. O sangue foi utilizado para diagnóstico de malária (ROYS, S., et al., 2017), doença renal (KHANMOHAMMADI, M. et al., 2015); câncer de mama (SITNIKOVA, V. E., et al. 2020); câncer de cérebro (BUTLER, H. J., et al. 2019) em humanos e para linfomas e melanomas (GHIMIRE, H., et al., 2017) em modelos animais. Tecidos humanos foram utilizados para discriminar câncer de ovário (THEOPHILOU, G., et al., 2016) [012] A patente US 7255835 demonstrou um sistema com um elemento de reflexão interna (IRE) com uma face de reflexão localizada no IRE e na amostra, seguida de uma onda evanescente direcionada do exterior do IRE para o interior do mesmo, de modo a provocar a incidência de radiação infravermelha na amostra. O sistema é associado a uma ponta funcionalizada compreendendo uma sonda imobilizada na superfície que preenche o volume exposto à onda evanescente, o que é detectado por um detector.

[013] Nos últimos anos foram descritos dois métodos de diagnóstico de câncer de cérebro por análises sanguíneas de ATR-FTIR. No primeiro deles, o pedido de patente WO 2014/076480, demonstrou a capacidade de um método de diagnóstico inserindo a amostra diretamente no cristal de

ATR do sistema de espectrometria FTIR por meio de um teste que não promove danos moleculares na amostra. A desvantagem deste método é o tempo de secagem e limpeza da amostra no cristal ATR, devido ao tempo necessário para formação de um biofilme antes da obtenção do espectro da amostra. O tempo necessário para secagem da amostra depende do volume especifico para cada biofluido, dificultando assim seu uso em larga escala. O segundo sistema relacionado a patente WO 2018/178669 é um sistema de larga escala que substituiu o IRE do espectrofotômetro, para a secagem da amostra diretamente sobre o IRE inserido no dispositivo desenvolvido. Este dispositivo é inserido em um aparato automatizado que permite a movimentação das amostras após a interação da fonte de luz infravermelha. As análises demonstraram que o padrão de espectro por este sistema é equivalente ao IRE de diamante considerado como padrão-ouro. Adicionalmente, é demonstrado um protocolo de secagem com temperatura entre 25°C e 35°C.

[014] Outro documento do estado da técnica demonstra o potencial uso do alumínio como substrato em análises de sangue para o diagnóstico de câncer endometrial, com isso a parte refletora de uma folha de alumínio encobre uma lâmina de vidro em uma preparação que leva de 30 a 45 segundos.

Para realização deste procedimento de forma manual é fundamental que a folha de alumínio fique perfeitamente em contato com vidro (PARASKEVAIDl, M., et al., 2018), pois eventuais rugosidades ou dobramentos na folha de alumínio poderão alterar o perfil do espectro da amostra e consequentemente seu resultado. Devido a fina espessura da folha de alumínio, a sua reutilização parece ser inadequada após procedimento de lavagem, limpeza e/ou assepsia.

[015] Apesar de capacidade de aplicação do sistema de larga escala com substituição de IRE no dispositivo em processo automatizado e de reduzida instrumentação (WO 2018/178669), ainda existe uma carência de processos com baixo custo que permitam um processo de secagem rápida da amostra e inativação de microrganismos (virus, fungos, bactérias) para que a análise no IRE ocorra sem a presença desses interferentes, como exemplo, os microrganismos. A presença do aquecimento e da associação de compostos de rápida volatilidade pode ter papel central em análises de alta escala em testes diagnósticos de doenças infecto- contagiosas e de doenças sistémicas nas quais o paciente pode estar infectado com patógenos não relacionados (exemplo: HIV, virus da Hepatite A e etc). Adicionalmente, substratos que permitam a utilização de materiais recicláveis que possam ser reutilizados após limpeza e assepsia poderão ser de grande valia para aplicações de tecnologias verdes com protocolos sustentáveis. A presente invenção tem intenção de superar as limitações atuais no estado da técnica, proporcionando uma plataforma de amostra sustentável e reutilizável, permitindo a utilização em um método de secagem rápida para formação de biofilme e o armazenamento de amostras diretamente na referida plataforma para mensuração em sistemas análise fotônicos, mais particularmente sistemas de espectroscopia de infravermelho, ainda mais particularmente espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), sem que apresente ruido relevante ou que interfira no espectro criado, reduzindo o tempo de preparo e aumentando a capacidade de análise das mesmas com custo reduzido.

Breve descrição da invenção

[016] O presente pedido de patente refere-se à uma plataforma sustentável de amostra individual e personalizável para uso em um sistema de espectroscopia de infravermelho, podendo ser usada com amostras biológicas para o diagnóstico de doenças ou em técnicas forenses, bem como na detecção de compostos orgânicos e inorgânicos com aplicações industriais, na agropecuária e em áreas de toxicologia .

[017] Trata-se de um método que reduz o tempo de preparo e aumenta a capacidade analítica de amostras em um sistema de espectroscopia de infravermelho, assim como o uso da referida plataforma de amostra, ou sistema compreendendo as referidas plataformas de amostra, em um sistema de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier. [018] Mais particularmente a referida plataforma de amostra possibilita o uso de diferentes métodos de secagem rápida da amostra para formação de um biofilme, além de possibilitar o armazenamento de amostras diretamente nela para posterior mensuração em sistema de espectroscopia de infravermelho, sem que apresente ruido relevante ou que interfira no espectro criado.

[019] O presente pedido ainda se refere a um Kit para personalização e otimização das referidas plataformas de amostra para uso em sistema de espectroscopia de infravermelho .

Breve descrição das figuras

[020] A presente invenção será mais bem compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:

[021] A FIGURA 1 ilustra os princípios básicos do FTIR no contexto de uma plataforma convencional.

[022] A FIGURA 2 ilustra os princípios básicos do FTIR no contexto da criação de uma plataforma de amostra de alumínio.

[023] A FIGURA 3 ilustra exemplos de modalidades de uma plataforma de amostra individual ou um sistema de plataformas de amostra organizada em conjunto de duas ou mais plataformas de amostra individuais.

[024] A FIGURA 4 ilustra uma das modalidades da plataforma de amostra em forma de um sistema de plataformas de amostra com quatro plataformas de amostra em formato de pastilhas individuais sendo aquecida para secagem da amostra.

[025] A FIGURA 5 ilustra uma das modalidades da plataforma de amostra na forma de pastilhas de alumínio, podendo compreender ou não diferentes sistemas de identificação das amostras.

[026] A FIGURA 6 mostra um workflow de um sistema de análise FTIR usando uma modalidade da plataforma de amostra de alumínio da presente invenção.

[027] A FIGURA 7 mostra um comparativo da interferência no espectro de ATR-FTIR de uma modalidade da plataforma de amostra de alumínio, de uma plataforma de amostra de papel e de uma plataforma de amostra de plástico.

[028] A FIGURA 8 mostra a comparação do espectro de ATR- FTIR da amostra de saliva diretamente no diamante do ATR- FTIR, da amostra de saliva na plataforma de amostra de alumínio e da plataforma de amostra de alumínio sem amostra. [029] A FIGURA 9 mostra a comparação do espectro de ATR- FTIR de uma amostra de saliva na plataforma de amostra de papel e da plataforma de amostra de papel sem amostra.

[030] A FIGURA 10 mostra a comparação do espectro de ATR- FTIR de diferentes aplicações de amostra de lavabo de swab de nasofaringe na plataforma de amostra de alumínio.

[031] A FIGURA 11 mostra a comparação do espectro de ATR-

FTIR de amostra de saliva mensurada imediatamente após a coleta e após o armazenamento da amostra em baixa temperatura durante 6h, 24h, 48h e 72h.

[032] A FIGURA 12 mostra a comparação do espectro de ATR-

FTIR de amostra de saliva mensurada imediatamente após a coleta e após o armazenamento da amostra em temperatura ambiente durante 6h, 24h, 48h e 72h.

[033] A FIGURA 13 mostra a comparação do espectro de ATR-

FTIR de amostra de sobrenadante de saliva mensurada imediatamente após a coleta e após o armazenamento da amostra em baixa temperatura durante 6h, 24h, 48h e 72h [034] A FIGURA 14 mostra a comparação do espectro de ATR-

FTIR de amostra de sobrenadante de saliva mensurada imediatamente após a coleta e após o armazenamento da amostra em temperatura ambiente durante 6h, 24h, 48h e 72h.

[035] A FIGURA 15 demonstra a comparação do espectro de

ATR-FTIR de amostra de saliva diretamente no diamante do

ART-FTIR, de amostras de saliva na plataforma de amostra de alumínio aquecidas a diferentes temperaturas.

[036] A FIGURA 16 compara o espectro de ATR-FTIR de amostra de gargarejo na plataforma de amostra de alumínio aquecidas em diferentes temperaturas. [037] A FIGURA 17 mostra a comparação do espectro de ATR-

FTIR de amostra de lavado de swab nasal aplicado diretamente no diamante do ATR-FTIR, de lavado de swab nasal aplicado plataforma de amostra de alumínio aquecidas a diferentes temperaturas .

[038] A FIGURA 18 mostra a comparação do espectro de ATR- FTIR de amostras com adição de volume 1:1 de saliva e álcool 100% para sobrenadante de saliva pura, de sobrenadante de saliva com álcool 100%, de saliva total pura e saliva total com álcool 100%.

Objetivo da invenção

[039] O objetivo do presente pedido de patente é fornecer uma plataforma de amostra individual sustentável para uso em um sistema de espectroscopia de infravermelho, particularmente ATR-FTIR, que possibilite uma secagem rápida para a formação de biofilme e permita a identificação e armazenamento de amostras diretamente na referida plataforma, sem que apresente ruído relevante ou que interfira no espectro criado, e, que reduza o tempo de preparo das amostras e aumente a escala na análise das mesmas.

[040] Ainda o presente pedido de patente tem como objetivo fornecer ainda um método para uso da referida plataforma de amostra, ou do sistema de plataformas de amostra, em um sistema de espectroscopia de infravermelho, bem como o uso em si, além de um Kit para personalização e otimização das referidas plataformas de amostra.

[041]

[042] Mais particularmente um método que compreende uma etapa de secagem rápida da amostra para formação de um biofilme, que ainda pode compreender uma etapa de identificação da amostra e armazenamento da mesma diretamente na referida plataforma, sem que apresente ruido relevante ou que interfira no espectro criado, e, que reduza o tempo de preparo das amostras e aumente a escala na análise das mesmas

[043] Em outra modalidade o objetivo do presente pedido é fornecer o uso da referida plataforma de amostra, ou sistema de plataformas de amostra, em um sistema de espectroscopia de infravermelho.

[044] O presente pedido ainda se refere a um Kit para personalização e otimização das referidas plataformas de amostra para uso em sistema de espectroscopia de infravermelho .

Descrição detalhada da invenção

[045] A invenção se refere a uma plataforma de amostra individual para ser usada em um sistema de análise fotônico, particularmente FTIR, mais particularmente ATR-FTIR, mas também pode ser usada em outras técnicas analíticas, análises univariadas de modos vibracionais, análises de segunda derivada, análises multivariadas como PCA (Principal

Component Analysis) e HCA (Hierarquical Cluster Analysis) e análises de aprendizado de máquina e Inteligência Artificial .

[046] A referida plataforma pode ser usada com amostras biológicas, particularmente fluidos biológicos como saliva, gargarejo, lavado de swab de nasofaringe ou nasal, urina, sangue, dentre outros, para detecção de biomarcadores ou perfis espectrais decorrentes de várias doenças.

[047] Em uma modalidade da invenção a referida plataforma sendo de alumínio para secagem e armazenamento das amostras, em substituição aos slices de vidro, tendo em vista as propriedades vantajosas do alumínio com relação ao vidro, como por exemplo a sua boa condutividade térmica, facilidade de trabalho e custo de produção, bem como a baixa interferência de ruído no espectro formado.

[048] Em outra modalidade a referida plataforma pode ser de outro material revestido de alumínio, ou seja, ter o núcleo constituído de outro material, sendo esse outro material de boa condutividade térmica e baixo custo de produção .

[049] Além do alumínio, outros materiais que apresentem características físico-químicas similares podem ser utilizados em substituição ao mesmo ou em conjunto com o alumínio para fabricação da plataforma de amostra, como, por exemplo, aço-inox, compósitos ou ligas metálicas de alumínio. Mais particularmente, materiais que se mostrem inertes, não interferindo na leitura da amostra, ou que apresentem um nível de ruído aceitável após leitura da amostra podem ser utilizados.

[050] Em outra modalidade a referida plataforma de amostra pode ser de formas distintas e tamanhos variados, desde que seja adequada para uso em um sistema de FTIR. Mais particularmente a referida plataforma de amostra está no formato de pastilhas de alumínio ou revestidas de alumínio. [051] Em uma das modalidades da invenção, a plataforma de amostra pode ter em seu lado inferior meios para identificação de amostras. Tais meios para identificação incluem, por exemplo, números impressos na pastilha, códigos alfanuméricos, códigos de barras, códigos QR, etiquetas, dentre outros.

[052] A Figura 1 ilustra os princípios básicos no contexto de uma plataforma convencional de amostra para um sistema de espectroscopia de infravermelho FTIR. Neste caso a amostra, por exemplo um fluido biológico, composições/compostos orgânicos e/ou inorgânicos, necessita esperar o tempo necessário, dependendo do volume e composição da amostra, até que se forme uma película/biofilme, para que seja possível iniciar a análise por infravermelho. A amostra também pode ser um tecido biológico ou outro tipo de material.

[053] A Figura 2 ilustra os princípios básicos do FTIR no contexto da criação da plataforma de amostra do presente pedido de patente, que pode ser por exemplo individual ou um conjunto de plataformas individuais, e pode ser em formato de pastilha circular, ovalado, quadrado, retangular ou qualquer outro formato que seja adequado a ser usado em um sistema de espectroscopia de infravermelho, feita ou revestida de alumínio ou por material com propriedades e características físico-químicas similares ao do alumínio. A referida plataforma de amostra possibilita o preparo, secagem, identificação e armazenamento prévio de amostras para posteriormente serem analisadas em sistema FTIR. Neste caso, as plataformas podem receber amostras, por exemplo, fluidos biológicos, composições/compostos orgânicos e/ou inorgânicos, para secagem em diferentes circunstâncias com temperatura e fluxo de vento controlados, ou em temperatura ambiente, permitindo o preparo das amostras em plataformas individuais ou em um sistema que compreenda um conjunto de duas ou mais das referidas plataformas individuais. A utilização de um conjunto de plataformas de amostra individuais ou do sistema proporciona o preparo de várias amostras de interesse ao mesmo tempo, bem como a sua identificação e armazenamento em lotes. Estando, portanto, as diversas amostras prontas para análise no sistema ATR- FTIR em sequência, o que otimiza o sistema tornando-o de alta-escala, reutilizável, sustentável e proporcionando velocidade e baixo custo na análise.

[054] A Figura 3 mostra exemplos de algumas das modalidades preferenciais da presente invenção. A primeira ilustração mostra uma plataforma de amostra individual sustentável e reutilizável (modelo isolado), com sistema de identificação numeral, para facilitar o reconhecimento da amostra. Nessa modalidade as plataformas individuais podem ser configuradas para receber um sistema de identificação que seja adequado a necessidade. As referidas plataformas individuais são sustentáveis uma vez que após a análise, elas podem ser devidamente lavadas, esterilizados e secas, e estariam prontas para serem reutilizadas.

[055] Na segunda e terceira ilustrações da Figura 3 são mostrados exemplos de modalidades da plataforma de amostra em que as mesmas se encontram em um modelo individual, unitário, (com uma única plataforma de amostra) ou em um sistema de modelo múltiplo compreendendo mais de uma plataforma de amostra individual. No exemplo da Figura 3, demonstramos o sistema compreendendo duas ou três plataformas unitárias de amostra (modelo composto duplo ou modelo composto triplo). Nesses exemplos de modalidades pode-se proporcionar um único sistema, suporte, estrutura ou plataforma que compreenda múltiplas plataformas unitárias/individuais de amostra. Esse sistema compreendendo a estrutura capaz de abrigar múltiplas plataformas de amostra individuais, que permita o preparo, identificação e armazenamento de várias amostras diferentes ao mesmo tempo, ganhando assim em tempo e escala de análise. O número de plataformas individuais de amostra no referido sistema, por exemplo 4, 5, 6...10, 20 ou mais, pode variar dependendo da necessidade de custo beneficio, eficiência e velocidade. O referido sistema de plataformas de amostra múltiplo sustentável, uma vez que após a análise das amostras, todo o sistema pode ser devidamente lavado, esterilizado e seco, e estaria pronto para reutilização.

[056] A Figura 4 mostra uma ilustração das plataformas de amostra múltipla, compreendendo plataformas individuais no formato de pastilhas, mais particularmente pastilhas de alumínio, sendo submetidas a um método de secagem em uma chapa quente com temperatura variando de entre 37°C a 80°C, podendo, ou não, serem colocadas sobre um material condutor de calor para formação rápida de biofilme.

[057] A Figura 5 mostra exemplos de algumas das modalidades preferenciais da presente invenção em que a plataforma de amostra pode ainda possuir diferentes sistemas de identificação na face posterior a que receberá a amostra, como por exemplo: sequências numéricas, código de barras ou

QR code. [058] A Figura 6 mostra um workflow de um sistema de análise de dados que compreende o preparo da amostra usando a plataforma de amostra da presente invenção e posterior obtenção dos espectros.

[059] A Figura 7 demostra a diferença de espectro entre plataformas de amostra produzidas com diferentes materiais. Sendo a plataforma de amostra do presente pedido de patente no formato de pastilhas de alumínio (preto), plataformas de papel (vermelho) e plataformas de plástico (em azul). Percebe-se de forma evidente a presença de modos vibracionais em 3000-2750 cm-1, 1500-1250 cm-1 e 700-750 cm-1 para a plataforma de plástico e diversas regiões de modos vibracionais para a plataforma de papel (3700-2500 cm-1 e 1750-750 cm-1), o que pode modificar o sinal de análise de diversos componentes biológicos. Por outro lado, o espectro de infravermelho produzido pela plataforma de alumínio praticamente não apresenta variações no espectro, o que indica uma excelente matriz de suporte e secagem para análise de amostras biológicas de forma sustentável.

[060] A Figura 8 demonstra que a assinatura espectral de uma amostra biológica de saliva inserida diretamente no cristal de ATR-FTIR (preto) é equivalente a assinatura espectral de saliva inserida na plataforma de amostra de alumínio (azul). Em conjunto esses dados comprovam a possibilidade de utilização da plataforma de amostra do presente pedido de patente para medidas de ATR-FTIR sem comprometer a qualidade da amostra analisada. O perfil espectral da plataforma de amostra na configuração de pastilhas de alumínio (vermelho) demonstra que o sinal espectral do alumínio não se sobrepõe ao espectro de saliva. [061] A Figura 9 mostra a comparação do espectro de infravermelho entre uma amostra biológica, mais particularmente saliva, inserida em uma plataforma de papel e apenas a plataforma de papel sem amostra. Considerando que em diversos modos vibracionais o componente do papel (preto) se sobrepõe ao perfil com saliva na plataforma de papel (vermelho), a Figura 9 demonstra que o papel não é uma matriz boa para ser usada como uma plataforma para amostras biológicas para análise do perfil espectral. Sua utilização pode ocorrer em análises de amostras focadas na região de amida I e amida II na região espectral entre 1750-1500 cm- 1.

[062] A Figura 10 demonstra a comparação do espectro de FTIR de lavado de swab de nasofaringe com uma aplicação da amostra na plataforma em forma de pastilha de alumínio da presente invenção, ou com duas, três ou quatro aplicações intercaladas com secagem de 5 min em chapa quente 80°C.

[063] A Figura 10 demonstra o potencial das plataformas de pastilhas de alumínio do presente invento para procedimentos em que é necessário um conjunto maior de pipetagens para concentração da amostra de lavado de swab de nasofaringe. Percebe-se que é possível fazer uma sequência diversas pipetagens com secagem intermitente e ocorre uma preservação do sinal espectral para uma aplicação (preto), duas aplicações (vermelho), três aplicações (azul) ou quatro aplicações (verde) intercaladas com períodos de secagem de 5 min em chapa quente 80°C.

[064] A Figura 11 demonstra o espectro de ATR-FTIR para amostras de saliva total mensuradas imediatamente após a coleta (preto), após 6 horas (vermelho), 24 horas (azul), 48 horas (verde) e 72 horas (violeta) armazenadas em gelo. De forma geral percebe-se uma manutenção do espectro em infravermelho nos diferentes modos vibracionais. No entanto, percebe-se uma tendência de instabilidade no modo vibracional entre 1000-1100 cm-1, indicando necessidade de parâmetros de armazenamento similares quando este modo vibracional for foco do estudo.

[065] A Figura 12 demonstra o espectro de ATR-FTIR para amostras de saliva total mensuradas imediatamente após a coleta (preto) e após 6 horas (vermelho), 24 horas (azul), 48 horas (verde) e 72 horas (violeta) armazenadas em temperatura ambiente. De forma geral percebe-se uma manutenção do espectro em infravermelho nos diferentes modos vibracionais. No entanto, percebe-se uma tendência de instabilidade em alguns modos vibracionais, destacando: 1000-1100 cm-1, 1250-1300 cm-1, 1420-1460 cm-1 e 3100-3000 cm-1 indicando necessidade de parâmetros de armazenamento similares quando este modo vibracional for foco do estudo. Adicionalmente, percebe-se uma maior variação das amostras em comparação as amostras armazenadas em gelo.

[066] A Figura 13 demonstra a comparação do espectro entre o sobrenadante da saliva Oh e o efeito de armazenamento em gelo durante 6h, 24h, 48h e 72h. Considerando que na saliva total pode conter restos alimentares e debris celulares, a análise foi repetida com o sobrenadante salivar após centrifugação em 2600 G, 4°C durante 15 minutos. O espectro de ATR-FTIR para amostras de sobrenadante da saliva mensurado imediatamente após a coleta (preto) e após 6 horas (vermelho), 24 horas (azul), 48 horas (verde) e 72 horas (violeta) armazenadas em gelo. De forma geral percebe-se uma manutenção do espectro em infravermelho nos diferentes modos vibracionais . No entanto, percebe-se uma tendência de instabilidade no modo vibracional entre 1000-1100 cm-1, indicando necessidade de parâmetros de armazenamento similares quando este modo vibracional for foco do estudo. Os dados foram similares a manutenção de saliva total em gelo nos mesmos períodos.

[067] A Figura 14 demonstra a comparação do espectro entre o sobrenadante da saliva Oh e o efeito de armazenamento de temperatura ambiente durante 6h, 24h, 48h e 72h. Considerando que na saliva total pode conter restos alimentares e debris celulares, a análise foi repetida com o sobrenadante salivar após centrifugação em 2600 G, 4°C durante 15 minutos. O espectro de ATR-FTIR para amostras de sobrenadante da saliva mensurado imediatamente após a coleta (preto) e após 6 horas (vermelho), 24 horas (azul), 48 horas (verde) e 72 horas (violeta) armazenadas em temperatura ambiente. De forma geral percebe-se uma manutenção do espectro em infravermelho nos diferentes modos vibracionais. No entanto, percebe-se uma tendência de instabilidade em alguns modos vibracionais, destacando: 1000-1100 cm-1, 1250- 1300 cm-1, 1420-1460 cm-1 e 3100-3000 cm-1 indicando necessidade de parâmetros de armazenamento similares quando este modo vibracional for foco do estudo. Adicionalmente, percebe-se uma maior variação das amostras em comparação as mesmas amostras armazenadas em gelo.

[068] A Figura 15 demonstra a comparação do espectro entre a saliva aplicada diretamente no cristal (preto), ou inserida na plataforma de amostra no formato de pastilha de alumínio a 23°C (vermelho), inserida na plataforma de amostra no formato de pastilha de alumínio a 37°C (azul), inserida na plataforma de amostra no formato de pastilha de alumínio a 50°C (verde) ou inserida na plataforma de amostra no formato de pastilha de alumínio a 80°C (violeta).

Considerando que o processo de secagem com temperaturas aumentadas permite uma aceleração do procedimento de secagem da amostra, fato que tem uma grande aplicabilidade industrial devido a possibilidade de utilização do sistema em alta escala, foi realizada análise das amostras que foram preparadas utilizando diferentes temperaturas de secagem da amostra na plataforma de alumínio. Apesar de diferenças no perfil espectral percebe-se que a saliva inserida diretamente no cristal ATR (preto), saliva em 23°C (vermelho), saliva em 37°C (azul), saliva em 50°C (verde) e saliva em 80°C (violeta) mantém a presença de todos os modos vibracionais, o que indica que podem ser utilizadas como método de alta-escala desde que todas as amostras do estudo sejam secadas na mesma temperatura. Em caso de alteração no padrão de temperatura percebe-se uma tendência de instabilidade em alguns modos vibracionais, destacando: 900- 1200 cm-1, 1250-1200 cm-1 e 3300-2800 cm-1. O tempo de secagem foi respectivamente de 37 minutos, 47 minutos, 19 minutos, 12 minutos e 5.35 minutos, desta forma podendo o processo de secagem acelerar em até 7 vezes o preparo da amostra usando a plataforma de amostra da presente invenção, sem afetar na qualidade do espectro de infravermelho produzido.

[069] A Figura 16 demonstra a comparação do espectro entre uma amostra de gargarejo inserido na plataforma de amostra no formato de pastilha de alumínio a 23°C (preto), a 37°C (vermelho), a 50°C (azul) ou a 80°C (verde).

Considerando que o processo de secagem com temperaturas elevadas permite uma aceleração do procedimento de secagem da amostra, fato que tem uma grande aplicabilidade industrial devido a possibilidade de utilização do sistema em alta escala, foi realizada análise de outra amostra biológica em diferentes temperaturas da placa de aquecimento. Apesar de diferenças no perfil espectral percebe-se que o gargarejo de 3 mL de solução salina e água por 10 segundos, gargarejo em 23°C (preto), em 37°C (vermelho), em 50°C (azul) e saliva em 80°C (verde) mantém a presença de todos os modos vibracionais, o que indica que podem ser utilizadas como método de larga escala desde que todas as amostras do estudo sejam secadas na mesma temperatura. O tempo de secagem foi respectivamente de 48 minutos, 19 minutos, 12 minutos, e 4.4 minutos até a formação do filme, desta forma podendo o processo de secagem acelerar em até 11 vezes utilizando a plataforma de amostra da presente invenção, sem afetar na qualidade do espectro de infravermelho produzido.

[070] A Figura 17 demonstra a comparação do espectro entre lavado de swab nasal aplicado diretamente no cristal (preto), ou inserida na plataforma de amostra no formato de pastilha de alumínio a 23°C (vermelho), a 37 °C (azul), a

50 C (verde) ou a 80 C (violeta). Como mencionado previamente, devido a interferência do processo de secagem com temperaturas aumentadas para grande aplicabilidade industrial devido a possibilidade de utilização do sistema em larga escala, foi realizada uma análise das amostras em diferentes temperaturas de secagem para lavado de swab nasal. Apesar de diferenças no perfil espectral percebe-se que o lavado de swab nasal inserido diretamente no cristal ATR (preto), em 23°C (vermelho), em 37°C (azul), em 50°C (verde) e em 80°C (violeta) mantém a presença de todos os modos vibracionais, o que indica que podem ser utilizadas como método de alta-escala desde que todas as amostras do estudo sejam secadas na mesma temperatura. O tempo de secagem foi respectivamente de 204 minutos, 88 minutos, 73 minutos, 48 minutos e 20 minutos para 4 aplicações por amostra, desta forma podendo o processo de secagem da amostra acelerar em até 10 vezes o processo usando a plataforma de amostra da presente invenção, sem afetar na qualidade do espectro de infravermelho produzido.

[071] A Figura 18 demonstra a comparação do espectro entre amostras que tiveram um processo de secagem a temperatura ambiente, diretamente na plataforma de amostra em formato de pastilha de alumínio, ou com secagem associada a adição de álcool 100% na proporção 1:1 com a amostra na plataforma de amostra em formato de pastilha de alumínio. O perfil espectral infravermelho com a adição de volume 1:1 de amostras de saliva e álcool 100% para sobrenadante de saliva pura (preto), sobrenadante de saliva com álcool 100%

(vermelho), saliva total pura (azul) e saliva total com álcool 100% (verde). Percebe-se a manutenção da expressão de todos os modos vibracionais e também a ausência de mudança de perfil com o álcool 100%, o que pode ser utilizado como estratégia microbicida para amostras contaminadoas com fungos, vírus e bactérias.

[072] O aspecto central da presente invenção é proporcionar uma plataforma de amostra de baixíssimo custo, reciclável, e reutilizável para recebimento de amostras com respectiva secagem com intuito de formação de biofilme de forma rápida e permitindo armazenamento de amostras diretamente na pastilha para mensuração em plataformas fotônicas (convencionalmente FTIR), sem interferir na qualidade do espectro formado e com nível baixíssimo de ruído [073] Na plataforma de amostra aqui descrita o sistema não funciona como elemento reflexivo interno (IRE) mas permite a secagem e armazenamento do biofilme da amostra que se adere a pastilha.

[074] Para o protocolo de secagem até a formação de biofilme foram testados os seguintes protocolos: temperatura ambiente e usando uma fonte de calor para aquecer a plataforma de amostra, onde a fonte de calor pode ser por exemplo uma placa de aquecimento com temperatura entre 37°C a 80°C: (1) secagem de biofluido puro (Imΐ =~4minutos); (2) secagem de biofluido homogeneizado (1:1) em etanol para rápida evaporação e redução de viabilidade de microrganismos; (3) secagem de biofluido homogeinizado (1:1) em metanol para rápida evaporação e redução de viabilidade de microrganismos; (4) secagem de biofluido homogeneizado (1:1) em acetonitrila para rápida evaporação e redução de viabilidade de microrganismos.

[075] A plataforma de amostra individual no formato de pastilha de alumínio é utilizada em substituição aos slices de vidro pois o alumínio é um bom condutor de calor e as lâminas de vidro tem características mais similares com isolante de calor. Adicionalmente, uma vantagem do uso de uma plataforma de amostra que é uma pastilha de alumínio ou com cobertura de alumínio é uma redução de custos da produção das pastilhas e da flexibilidade de poder usá-las individualmente, com pequenos volumes de material e possibilidade de armazenamento das amostras sem utilização de suporte. A plataforma de amostra de alumínio pode ter um tamanho mínimo da dimensão do elemento reflexivo interno do próprio aparelho (geralmente 2,5 a 3 mm ² ) e podem ter tamanhos maiores até 8 mm ² . Considerando que o alumínio é um bom condutor de calor as pastilhas podem ter de 0,1 mm até 2 mm de espessura. As plataformas de amostra podem ainda compreender um sistema de identificação por números impressos diretamente na pastilha de alumínio, código de barras, código QR, etiquetas ou qualquer outro sistema.

[076] Este sistema pode ser adaptado em um equipamento de ATR-FTIR de bancada ou portátil, em que o acessório de ATR (costumeiramente de diamante) tenha tamanho inferior ao da plataforma de amostra de alumínio, sem necessidade de qualquer alteração na configuração de espelhos ou ângulo do feixe infravermelho da plataforma de ATR-FTIR.

[077] A análise por técnicas fotônicas, frequentemente o ATR-FTIR mas também podem ser expandida para outras técnicas analíticas, com as amostras sob as plataformas de alumínio da presente invenção permitem análises univariadas de modos vibracionais, análises de segunda derivada, análises multivariadas como PCA (Principal Component Analysis) e HCA (Hierarquical Cluster Analysis) e análises de aprendizado de máquina e Inteligência Artificial.

[078] O presente pedido de patente refere-se a uma plataforma de amostra individual para uso em sistema de espectroscopia no infravermelho (FTIR), ainda mais particularmente ATR-FTIR, em que a plataforma de amostra individual é fabricada com material que compreenda boa condutividade térmica e baixa interferência de ruído no espectro formado, mais particularmente feito ou revestido de alumínio, ou por material com propriedades e características físico-químicas similares ao do alumínio. O referido material poderá ser: alumínio; ligas-metálicas de alumínio; e combinação de um outro material que possua boa condutividade térmica com o alumínio, mais particularmente em que o referido material compreende o núcleo e este é revestido por alumínio.

[079] A referida plataforma de amostra compreende um formato de pastilha circular, ovalado, quadrado, retangular ou outro adequado para uso em um sistema de espectroscopia de infravermelho. A plataforma de amostra compreende ainda um tamanho mínimo equivalente ao tamanho mínimo da dimensão do elemento reflexivo interno do aparelho de espectroscopia de infravermelho, mais particularmente um tamanho que pode variar entre cerca de 2,5 mm ² até 8 mm ² , com uma espessura de pastilha que pode variar de cerca de 0,1 mm até 2 mm. [080] A referida plataforma de amostra pode compreender ainda meios para identificação da amostra a ser analisada, podendo ser impressos diretamente na plataforma ou fixado na plataforma no lado oposto ao que recebe a amostra ou nas laterais da plataforma; os meios de identificação podem abranger: números, códigos alfanuméricos, códigos de barras, códigos QR, marcações outras de identificação ou etiquetas. [081] O presente pedido de patente refere-se também a um sistema de plataformas de amostra para uso em espectroscopia de infravermelho onde o sistema pode compreender duas ou mais das referidas plataformas de amostra individuais e ainda pode compreender uma estrutura de suporte para as plataformas. A estrutura de suporte pode compreender regiões especificas para abrigar ou fixar cada uma das plataformas de amostra individuais, de modo que possa ser configurada de acordo com a necessidade; ou em que a estrutura de suporte pode compreender uma pluralidade de plataformas individuais pré-definida e já integradas a sua estrutura.

[082] O presente pedido de patente refere-se ainda a um método para reduzir o tempo e aumentar a escala de análise de amostras em um sistema de espectroscopia no infravermelho em que o método compreende as etapa de preparo das plataformas de amostra individuais, ou o sistema de plataformas de amostra, com as amostras de interesse a serem avaliadas e analisar as amostras nas plataformas no sistema de espectroscopia de infravermelho.

[083] A etapa de preparar as plataformas ou sistema com as referidas amostras compreende as seguintes etapas:

- aplicação da amostra na plataforma de amostra; e

- secagem da amostra para formação de biofilme.

[084] A etapa de aplicação da amostra pode ser repetida, mais preferencialmente de 2 a 4 vezes, cada aplicação adicional intercalada com uma etapa de secagem.

[085] A etapa de secagem da amostra pode compreender diferentes métodos ou combinação destes, como a exposição à temperatura ambiente; ou aquecimento dentro de uma faixa de temperatura controlada e/ou fluxo de ar controlado e/ou adição de substância volátil na amostra.

[086] A etapa de secagem da amostra com temperatura controlada compreende o aquecimento da plataforma de amostra através de uma fonte controlada de calor a uma temperatura que pode variar de 37°C a 80°C, sendo o tempo de secagem reduzido quanto maior for a temperatura utilizada.

[087] A adição de substância volátil compreende a adição de álcool 100% na proporção em volume de 1:1 com a amostra, preferencialmente o álcool é selecionado do grupo que engloba etanol, metanol e acetonitrila.

[088] O referido método ainda pode compreender as etapas de: identificação da amostra (por meio impresso diretamente ou fixados na plataforma do lado oposto ao que recebe a amostra); os meios de identificação podem ser através de: números, códigos alfanuméricos, códigos de barras, códigos QR, marcações outras de identificação ou etiquetas; e

- armazenamento da plataforma de amostra ou sistema de plataformas de amostra já com as amostras secas, em que o referido armazenamento ocorre em ambiente refrigerado com gelo ou de baixa temperatura.

[089] O presente pedido refere-se ainda ao uso da plataforma de amostra individual ou do sistema de plataformas de amostra, em que é em um método de análise de amostras em um sistema de espectroscopia de infravermelho.

[090] O presente pedido de patente refere-se também a um

Kit para personalização e otimização de plataformas de amostra para uso em sistema de espectroscopia de infravermelho em que compreende:

- uma pluralidade das referidas plataformas de amostra individuais; e

- ao menos uma estrutura de suporte compreendendo uma pluralidade de regiões especificas para abrigar ou fixar cada uma das plataformas de amostra individuais, de modo que possa ser configurada de acordo com a necessidade de uso. [091] A referida plataforma de amostra, sistema ou kit aqui descritos, podem ser usados com amostras biológicas para o diagnóstico de diversas doenças ou em técnicas forenses, detecção de compostos orgânicos e inorgânicos com aplicações industriais, na agropecuária e em áreas de toxicologia.

[092] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a titulo de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, evidentemente certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.

[093] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente invenção como aqui descritos, sem se distanciar do escopo da presente invenção.