一种种子特异型表达载体及其构建方法与应用 技术领域 本发明涉及一种种子特异型表达载体及其构建 方法与应用， 特别是涉及一种种子特异型 表达载体及其构建方法和利用该载体在油葵中 制备阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的方法。 背景技术 心血管疾病是全球范围导致人类死亡最主要的 原因， 预计到 2015年， 约有 2000万人死 于心血管疾病。 诸多的心血管疾病 （如心肌梗塞和中风） 为动脉粥样硬化的主要合并症。 动 脉粥样硬化的发病机制目前尚不完全清楚，血 脂代谢异常是造成该疾病的主要危险因素之一 ， 其中高水平的低密度脂蛋白 (low density lipoproteins, LDL)和低水平的高密度脂蛋白 (high density lipoproteins, HDL)是两个最重要的危险因素。 传统的治疗策略是降低血浆中总胆固醇 (total cholesterol, TC) 和低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoproteins cholesterol, LDL-C)的含 量， 他汀类是目前首选的降脂药物， 但该类药物不能清除已沉积在动脉壁上的斑块 ， 也不能 达到根本治疗动脉粥样硬化症的目的。 各国学者越来越多地把目光转向另一个危险因 素一低 水平的高密度脂蛋白， 流行病学研究表明： 血浆中高密度脂蛋白的水平与冠心病的发病率 成 负相关， 认为高密度脂蛋白能起到防止动脉粥样硬化形 成的作用。 通过提升高密度脂蛋白的 水平来治疗动脉粥样硬化症一这是世界医药行 业正在浮现的一种新的针对急性冠状动脉粥样 硬化疾病治疗的新方法， 被称为高密度脂蛋白靶向治疗。 阿朴脂蛋白 A-I (apolipoprateinA-I, apoA-I) 是高密度脂蛋白主要的蛋白成分。 阿朴脂蛋白 A-I在肝脏和小肠内合成， 其原始翻 译产物是含有 267个氨基酸残基的前原蛋白形式 (prepraapo A-I)。前原蛋白被信号肽酶加工切 除 18肽前片段转变成原阿朴脂蛋白形式（proapo A-I), 原阿朴脂蛋白分泌出胞外后， 在细胞 外特异性转化酶作用下切除 6肽原片段 (Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln), 转变成血浆成熟阿朴脂 蛋白 A-I。 阿朴脂蛋白 A-I的作用机理主要是促进胆固醇的外溢、 抗氧化和抗血小板聚合等。

阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体（apolipoprotein A-IM, apoA-IM)是阿朴脂蛋白 A-I的自然突 变体 (Argl73--Cys)， 与阿朴脂蛋白 A-I相比， 173位精氨酸的丢失导致其 ct螺旋含量降低， 加 大了与脂质结合的能力。 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体易形成二聚体 (A-IM/A-IM), 此二聚体激 发胆固醇逆向转运的效率要比阿朴脂蛋白 A-I高， 从而更高效地加速胆固醇的排出； 同时阿 朴脂蛋白 A-I米兰突变体比阿朴脂蛋白 A-I能更好地削弱低密度脂蛋白的氧化。 目前， 阿朴 脂蛋白 A-I米兰突变体是世界上唯一被证实的能够清除 已经沉积在动脉壁上血栓的药用蛋白， 具有十分广阔的应用前景。

最近 《美国医学会杂志》 报道： 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体对动脉粥样病变改变的速度 和幅度前所未有， 并且几乎没有副作用， 应用前景十分广阔， 已成为世界医药研发领域工作 的重点和竞争的焦点。 全球最大的医药公司辉瑞 （Pfizer) 预测： 任何能够逆转冠状动脉斑 块的药物都有可能取得 10亿美元的销售业绩，所以阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的开发必然可 以带来巨大的经济效益和社会效益， 同时也会增强我国在心血管疾病和动脉粥样硬 化疾病药 物开发领域的世界影响力。

此外， 基于小样本临床结果显示： 阿朴脂蛋白 A-I的临床需要量是每个疗程 5-6g， 阿朴 脂蛋白 A-I的高治疗剂量以及动脉粥样硬化的高患病率 均预示了一个强大的市场需求， 这也 为阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的开发提供了一个契机。 目前， 美国爱普隆（Esperion) 公司生 产实验试剂用途的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 但其采用的是生物合成的方法， 生产的成本 高， 产量小， 不适合规模化生产。 细菌系统内蛋白质的重组体表达一般具有吸引 力， 但是此 方法产率低， 并且大肠杆菌内毒素与阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体易形成强的复合体， 蛋白纯 化方法昂贵且安全性较差。 因此， 开发高产、 高效生产阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的方法势 在必行。 植物生物反应器 （plant bioreactor) 也被称为分子药田 （Molecular medicine farming) 是 指利用植物生物系统大规模生产具有重要应用 和商业价值的外源蛋白质， 特别是用于医疗和 诊断的药用蛋白。 1989年哺乳动物抗体在转基因植物中首次获得� �功表达， 其重链和轻链在 转基因烟草中表达并正确组装， 首次证实了植物作为生物反应器的可行性。 此后， 转基因植 物研究逐渐兴起。 许多其它的药用蛋白陆续在各种不同的植物中 实现了表达， 如： 水蛭素、 干扰素、 人血清蛋白、 功能抗体， 已用于植物生物反应器研究的植物有： 烟草、 拟南芥、 大 豆、 小麦、 水稻、 玉米、 油菜、 马铃薯和番茄等。

目前， 加拿大针对代谢及心血管疾病研制蛋白质药物 组合的生物科技公司 SemBioSys Genetics公司在中国申请了转基因红花和拟南芥� ��产阿朴脂蛋白 A-I和阿朴脂蛋白 A-I米兰突 变体方法的专利 （CN1906296A), 把嵌合核酸构建体导入拟南芥或红花中， 结籽后在种子中 表达阿朴脂蛋白 A-I及阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体。 拟南芥是一年生或两年生草本植物， 其 基因组是目前已知植物基因组中最小的， 并且因为其基因高度纯合， 用理化因素处理突变率 很高， 容易获得各种代谢功能的缺陷型， 成为了遗传学研究的好材料， 被科学家誉为"植物中 的果蝇"。 但是， 拟南芥目前广泛被用于实验途径， 并未有大规模的普遍种植形成。 红花属一 年生草本植物， 种子可以搾油， 是一种重要的油料作物， 分布在温带， 我国多产于西北， 尤 以新疆、 西藏为多， 其次是华北和东北地区。 但红花亩产量比较低 （120-150 kg) , 瘦果含油 率不是很高 （34〜55 % )， 导致最终产物蛋白的量少， 成本较高。

因此， 现有技术仍然需要一种方法稳定、 产率高、 成本低、 步骤简单的制备阿朴脂蛋白 A-I和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的方法。 发明内容

本发明的申请人通过长期研究， 付出大量的创造性劳动， 通过构建一种特异型的表达载 体， 并选择油葵作为生物反应器， 稳定、 高效地生产出阿朴脂蛋白 A-I和阿朴脂蛋白 A-I米 兰突变体， 从而完成了本发明。

本发明涉及以重组 DNA技术生产阿朴脂蛋白 A-I或阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的方法， 特别涉及以油葵作为宿主生产阿朴脂蛋白 A-I或阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的方法。 具体的 说， 本发明涉及利用花生油体蛋白与阿朴脂蛋白 A-I或阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的融合蛋 白基因在油葵油体中表达从而可以大量生产制 备治疗动脉粥样硬化极其所造成的心血管疾病 的重要药物阿朴脂蛋白 A-I和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 优选制备阿朴脂蛋白 A-I米兰突 变体。

首先， 本发明提供了一种种子特异型表达载体， 含有阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体与花生 油体蛋白融合基因或含有阿朴脂蛋白 A-I与花生油体蛋白融合基因，优选含有阿朴脂 蛋白 A-I 米兰突变体与花生油体蛋白融合基因， 其中， 该载体的启动子为油菜油体蛋白基因启动子。 以上载体用以在油葵中制备阿朴脂蛋白 A-I或阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 优选阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体。

另外， 本发明还提供了一种构建上述高效种子特异型 表达载体的方法， 包括如下步骤：

1 ) 分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体 蛋白基因；

2 ) 按照植物偏爱的密码子设计合成阿朴脂蛋白 A-I 米兰突变体基因或阿朴脂蛋白 A-I 基因；

3) 构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油 体蛋白与阿朴脂蛋白 A-I 米兰突变体 或阿朴脂蛋白 A-I基因融合表达的植物表达载体。

具体步骤包括：

1 ) 分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体 蛋白基因 采用 PCR方法自油菜 (Brassica campestris 基因组 DNA中扩增 20kD油体蛋白基因的启动子， 并将该启动子克隆 到 pUC 19 (购自 MBI公司）上得到重组质粒 pUCN， 以花生基因组 DNA为模板 PCR方法扩增终 止密码子缺失的花生油体蛋白基因。 其中， 油菜品种可以是目前现有技术中已经公开或使 用 的油菜品种， 例如， 可以是青油 14品种、 互丰 101、 耐寒高油王、 早油 100天和秦油 2号等， 优选青油 14品种。以上油菜油体蛋白启动子可以克隆到 pUC19的适合位点之间，优选克隆到 pUC19的 H^dl l BBamHI位点之间。所述的花生品种可以是目前现 有技术中已经公开或使用 的花生品种， 例如， 可以是冀花 4号、 冀油 7号、 白沙、 鲁花 11、 海花和丰花 1号等， 优选 冀花 4号。

2) 按照植物偏爱的密码子设计合成阿朴脂蛋白 A-I或阿朴脂蛋白 A-咪兰突变体基因 按 照油葵密码子使用频率优化阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I基因， 优选优化的基 因为阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因。 频率小于 10%的密码子一律认为是稀有密码子被排除， 其余的各密码子按油葵密码子使用频率优化， 优化前基因的分子量为 451.4， 优化前后序列的 一致性为大于 60%， 优选大于 65%， 最优选为 72%， 优化后基因的分子量优选为 451.3。 油 葵密码子吏用频率可参考 http：〃 www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4232

3 ) 构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油 体蛋白与阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因或 阿朴脂蛋白 A-I基因融合表达的植物表达载体 利用重叠 PCR技术将花生油体蛋白基因和阿 朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白 A-I基因构建成融合基因， 优选将花生油体蛋白基 因和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因构建成融合基因 O/ _e /¾p -/ _M ， 将该融合基因连入 pUCN得 到重组质粒 pUCNOA, 优选连入的位点为 pUCN的 BomHI和 Sacl酶切位点之间， 双酶切重组质 粒 pUCNOA, 优选 H dl l l和 Sacl双酶切重组质粒 pUCNOA, 回收 2202bp的外源片段， 并将 该外源片段连入植物表达载体 PBI 121 (植物转基因工程中常用的植物双元表达载体� � 的 H dl l l和 Sacl位点之间获得 pBINOA, 即油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋 白与阿 朴脂蛋白 A-I米兰突变体融合基因的植物表达载体或油菜 油体蛋白基因启动子驱动的花生油 体蛋白与阿朴脂蛋白 A-I融合基因的植物表达载体。 最后， 本发明还提供了利用以上种子特异型植物表达 载体制备阿朴脂蛋白 A-I米兰突变 体或阿朴脂蛋白 A-I的方法， 包括如下步骤：

1 ) 将上述构建表达载体导入受体植物外植体内；

2) 将上述受体植物材料培养为完整的植株， 得到种子；

3 ) 从上述种子中分离纯化得到阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I。

其中，所述的受体植物优选为油葵，优选分离 纯化得到的是阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体。 具体步骤包括：

1 ) 将携带阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白 A-I基因的种子特异型植物表 达载体导入油葵恢复系外植体。 将种子特异型植物表达载体导入油葵恢复系的 方法可以是本 领域常规的导入方法， 包括但不限于基因枪法、花粉管通道法、 子房注射法和农杆菌介导法， 优选的是农杆菌介导法。 农杆菌介导法中， 将携带阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因或阿朴脂 蛋白 A-I基因的种子特异型植物表达载体导入农杆菌 ， 由农杆菌介导转化油葵恢复系外植体。 所述外植体包括无菌苗茎尖、 子叶、 子叶节、 去掉一片子叶的实生株四种形式， 其中优选去 掉一片子叶的实生株；

2) 转基因后获得的再生植株经抗性筛选得到抗性 苗， 待抗性苗生根后移栽入温室进行 培养， 直至成熟收获种子。 其中， 抗性苗生根后移栽入温室进行蛭石和营养土混 合物培养， 在幼苗期进行 PCR检测和 Southern blotting检测，收获籽粒后进行油体蛋白和阿朴� ��蛋白 A-I 米兰突变体融合蛋白的 Western blotting检测；

3 ) 将含阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I的种子在缓冲液中研磨， 离心将 油体和种子的其他成分分离， 洗涤油体， 通过酶切反应将阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴 脂蛋白 A-I自油体表面释放， 经 HPLC纯化获得阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 并对其进行鉴 定。

在本发明的载体和方法中， 选择了油菜油体蛋白基因启动子。 经实验研究表明， 该启动 子可大大提高阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因的表达效率。 优选地， 在油体蛋白基因起始密 码子周围还可以设计 Kozak序列表达控制元件， 可以更加进一步提高基因表达效率。

在本发明的载体和方法中，还选择了油体蛋白 和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I的融合表达。 目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白的形式 与油体蛋白共同在油体中特异 表达， 利用油体亲脂疏水的特性， 将转基因植物种子粉碎， 液体抽提， 离心处理， 回收上层油 相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开， 可去除 90%以上的种子蛋白。优选地，在油体蛋白 和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I之间设计了凝血酶识别位点， 用以从油体上释 放阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 简化了表达产物的纯化工艺， 提高了纯化效率。 其中， 优选的 油体蛋白为花生油体蛋白。 花生油体蛋白和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I的融 合表达， 表达效率高， 效果好。

在本发明公开的载体和方法中， 为了提高阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白 A-I基因的表达效率， 根据阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因序列或阿朴脂蛋白 A-I基因序列和油 葵偏爱的密码子、 GC含量对阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因或阿朴脂蛋白 A-I基因的密码子进 行了优化和全基因的人工合成。

在本发明公开的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体或阿朴脂蛋白 A-I的生产方法中， 优选的植 物生物反应器为油葵。 油葵作为我国一种重要的油料作物， 在我国具有悠久的种植历史， 具 有其它作物不可替代的优势。 油葵产量高， 作为耐旱作物， 可以在盐碱地、 干旱地区甚至沙 漠等恶劣环境下种植， 因此适于大面积推广种植， 不仅不会与粮食 "争地" ， 而且还有利于 提高我国山岭薄地、 干旱贫瘠之地的利用率， 缓解国家耕地紧张的压力。 因此， 选择油葵作 为生物反应器， 大规模地生产阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体是适合我国国情的生产药用蛋白 的 方式。 最有优势的是， 采用油葵作为生物反应器， 与目前已作为阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体 或阿朴脂蛋白 A-I生产反应器的红花相比， 具有显著的生产效率提高， 产率增加的效果。 采用此发明方法生产人阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体具有以下优点：

1、 植物表达的外源蛋白， 类似于哺乳动物表达的蛋白， 能进行正确的折叠， 这对于必须 具有体内活性的药用蛋白的生产尤为重要。

2、采用植物生物反应器生产的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体更安全， 因为避免了大肠杆菌 中的内毒素和动物病原菌的的污染。

3、利用转基因植物的油体表达系统表达阿朴� �蛋白 A-I米兰突变体， 大大简化了纯化工 艺， 降低了成本， 有利于将来的产业化。 较之已经被 SemBioSys Genetics公司采用的拟南芥 以及红花具有很大的优势。

4、采用本发明的种子特异型植物表达载体� �制备方法， 大大提高了阿朴脂蛋白 A-I米兰 突变体或阿朴脂蛋白 A-I的表达量， 能达到种子总蛋白含量的 1.5%。

5、 采用农杆菌介导法转化植物， 不仅可以降低成本、 提高转化效率， 还提高了转基因植 株的遗传稳定性。 本发明是利用转基因技术开发高效表达的植物 生物反应器， 所生产阿朴脂蛋白 A-I米兰 突变体或阿朴脂蛋白 A-I是治疗心血管疾病和动脉粥样硬化疾病的特 效药物。 术语及解释： 除有特殊说明， 在本发明中出现术语均具有本领域通常的含义 ， 其中的縮写代表的内容 如下：

LDL ： low density lipoproteins, 低密度脂蛋白

HDL: high density lipoproteins, 高密度脂蛋白

TC: total cholesterol, 血浆中总胆固醇

LDL-C ： low density lipoproteins cholesterol, 低密度脂蛋白胆固醇

apoA-I: apolipoproteinA-I 阿朴月旨蛋白 A-I

apoA-IM: apolipoprotein A-I Milano 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体

A-IM/A-IM: 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体二聚体 pUC 19: 常用的大肠杆菌克隆载体， 购自 MBI公司

PBI121 : 植物转基因工程中常用的植物表达载体

pUCN: 携带油菜油体蛋白基因启动子 （NOP ) 的 pUC19载体， 插入位点为 H dlll和 BamHI

Oleosin/apoA-IM: 花生油体蛋白和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的融合基因

pUCNOA: 携带油菜油体蛋白基因启动子 （NOP)、 花生油体蛋白和阿朴脂蛋白 A-I米 兰突变体融合基因的 pUC 19载体， 插入位点为 ndm和 ^cl

pBINOA: 携带油菜油体蛋白基因启动子 （NOP)、 花生油体蛋白和阿朴脂蛋白 A-I米兰 突变体融合基因的 PBI121载体， 插入位点为 H dlll和 ^cl

附图说明

图 1 种子特异型植物表达载体 pBINOA结构示意图；

图 2 种子特异型植物表达载体 pBINOA构建流程示意图； 图 3 pUCN载体的酶切鉴定及 PCR检测；

图 4 Oleosin/apoA-IM融合基因的构建；

图 5 pUCNOA载体的酶切鉴定； 图 6 种子特异型植物表达载体 pBINOA的酶切鉴定；

图 7 转基因油葵《7 Π基因的 PCR检测； 图 8 转基因油葵的阿朴脂蛋白 Α-Ι米兰突变体基因的 PCR检测；

图 9 转基因油葵 PCR-Southem杂交结果；

图 10 转基因油葵籽粒油体中油体蛋白 -阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体融合蛋白的 Western 检测；

图 11

具体实施方式

以下具体实施方式仅是对于本发明进行进一步 说明， 并不用于限定本发明的范围。 在了 解本发明的内容后， 本领域技术人员在不背离本发明精神的前提下 对本发明进行改变， 这些 技术方案均落在本发明的保护范围之内。

除有特殊说明外， 下列实施例中所述的方法均为本领域的常规方 法。 实施例 1 : 种子特异型植物表达载体

本发明中首先采用 PCR方法扩增了油菜油体蛋白基因启动子 （NOP ) , 将该启动子插入 pUC 19的 H dm和 Bamffl酶切位点之间得到 pUCN。 同时依据阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因 序列和油葵偏爱的密码子设计并人工合成了阿 朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因，并将该合成的基 因插入花生油体蛋白基因 01 的 3 '末端， 获得花生油体蛋白和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体 融合基因， 同时在花生油体蛋白基因和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因之间添加了凝血酶酶切 位点。进而将该融合基因插入 pUCN的 BamH MflcI酶切位点之间得到 ρΙ^ΝΟΑ， «(1Π Β5^Ι 双酶切 pUCNOA, 琼脂糖凝胶回收 2202bp的外源片段， 并将该外源片段插入植物双元表达载 体 pBI121的 H^ffl MflcI酶切位点之间， 获得本发明提供的植物表达载体 pBINOA, pBINOA 的表达盒为以油菜油体蛋白基因启动子 （NOP ) 驱动的 O/e/¾p -/ _M 融合基因， pBINOA结构 如图 1所示， 1 : 油菜油体蛋白基因启动子， 2: 花生油体蛋白基因， 3 : 凝血酶酶切位点， 4: 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因。 将 pBINOA进行测序获得表达盒的序列如 SEQ ID NO: 15所 示， 长度为 2202bp。

实施例 2: 种子特异型植物表达载体 pBINOA的构建

植物表达载体 pBINOA构建流程如图 2 所示， 具体步骤如下：

油菜油体蛋白基因启动子的克隆， 油菜是重要的油料作物， 含油量高 （42〜45% ) ， 而 且油菜油体中 20kD油体蛋白的量为 24kD油体蛋白量的 10倍。根据油菜油体蛋白基因启动子 核苷酸序列 （Genbank No. AF134411 ) 设计正向引物 pBINOA-1 ： CCC AAG CTT TTC AAC

GTG GTC GGA TCA TGA CG ( SEQ ID ΝΟ: 1 ) 和反向引物 pBINOA-2: CGC-GGA TCC GAA

TTG AGA GAG ATC GAA GAG ( SEQ ID NO:2 ) ， 用于 PCR扩增油菜 20kD油体蛋白基因的 启动子， 在引物上分别引入了 >«1111和 0«^1酶切位点（下划线表示酶切位点）。 以油菜

(Brassica rampeWr^)青油 14品种基因组 DNA为模板， BINOA- 1 禾口 pBINOA-2为引物， PCR 的条件为： 94°C lmin、 63-73 °C lmin、 68 °C lmin, 30个循环后， 68 °C 延伸 10min， 扩增油 菜油体蛋白基因启动子。 琼脂糖凝胶电泳并回收扩增产物， 进而用 H dm和 fiiimHI双酶切回 收所得产物， 并将其与 H dm和 mffl双酶切的 pUC19连接， 将连接产物与 20(^L DH5 α感 受态细胞 （购自天根生化科技 (北京)有限公司） 混匀， 冰浴 30min， 42°C热激 1.5min， 冰浴

3min, 加入 80(^L LB培养基 37°C培养 45 min， 涂布含 5(^g /mL氨苄青霉素的 LB平板， 37°C 培养过夜。 PCR方法筛选转化子， pBINOA- 1禾 BpBINOA-2为引物， PCR的条件为： 94°C lmin、

60-73 °C lmin、 72 °C lmin, 30个循环后， 72 °C 延伸 10min， 将 PCR产物进行琼脂糖电泳检测 筛选结果，将阳性转化子命名为 pUCN，将阳性转化子进行液体震荡培养，碱裂� �法提取质粒， 将质粒进行 H mffll单酶切鉴定和 H dm、 BomHI双酶切鉴定， 琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果 如图 3所示， M: DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, LI : Hindm 酶切 pUCN质 粒的产物为 3565bp的片段， L2: H dm和 Bflmffl双酶切 pUCN 质粒的产物为 2662bp的载体片 段和 903bp的启动子， L3: PCR检测 pUCN质粒得到 903bp的启动子。将 pUCN质粒进行测序， 测序步骤如下： （1 ) 以 pUCN为模板， pUC19通用测序引物进行 PCR反应， 得到 PCR产物；

(2) 纯化 PCR产物， 以去除酶、 荧光染料、 引物和其他离子； （3 ) 纯化后的 PCR产物经变 性和冰浴处理后上 3730测序仪 （ABI公司） 进行测序； （4) 仪器自动分析并打印出彩色测 序图谱和 DNA序列。 pUCN中外源片段长度为 903bp， 序列如 SEQ ID NO:3所示， 分子量为 556.7kDa。 酶切结果和测序结果表明： 已将油菜油体蛋白基因启动子成功克隆到 pUC19上。

阿朴脂蛋白 A-I 米兰突变体基因的人工合成， 依据阿朴脂蛋白 A-I基因序列 （SEQ ID NO:4， NM000039 ) ， 氨基酸序列如 SEQ ID NO:5 所示， 同时参照油葵密码子使用频率

(http：〃 www.kazusa.or .jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4232)和油葵基因 组中的 GC含 量重新设计并合成了阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因， 同时第 517为的碱基 C突变为碱基 T， 并在基因的 5 ' 端添加了凝血酶酶切位点， 核苷酸序列如 SEQ ID NO:6所示 CTGGTCCCAA GGGGTAGC, 氨基酸序列为 SEQ ID NO:7所示 L V P R G S, 人工合成后的阿朴脂 蛋白 A-I米兰突变体基因 750bp， 分子量为 462.4kDa， 序列如 SEQ ID NO:8所示。 该基因编 码的蛋白由 249个氨基酸残基组成， 分子量为 28.585kDa。

O/e/¾p -/ _M 融合蛋白基因的扩增，依据花生油体蛋白 基因序列（Genbank No. AF325917) 和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因序列 SEQ ID NO:8 设计了两对特异性引物 pBINOA-3/pBINOA-4禾口 pBINOA-5/pBINOA-6 (序列分别如 SEQ ID NO:9， SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO: 11， SEQ ID NO: 12 ) pBINOA-3禾口 pBINOA-6中分别弓 |入 BflmH ^acI酶切位点

(带下划线的碱基为酶切位点）， 且 pBINOA-3引物中在油体蛋白基因起始密码子周围� ��计了 Kozak序列（序列中加粗部分， 功能是提高转录和表达效率）； pBINOA-4和 pBINOA-5互为反 向互补序列。

pBINOA-3: CGC-GGA TCC AGC AAA GCC GCC ACC ATG GCT ACT GCT ACT GAT CG pBINOA-4: GCT ACC CCT TGG GAC CAG TGA TGA TGA CCT CTT AAC pBINOA-6: C GAG CTC TTA TTG TGT GTT AAG TTT CTT TG

以 pBINOA-3/ pBINOA-4为引物， 花生 （品种冀花 4号） 基因组 DNA为模板扩增终止密 码子缺失的花生油体蛋白基因， PCR的条件为： 94°C lmin、 50-55 °C lmin、 68 °C lmin, 30个 循环后， 68°C 延伸 lOmin; 以 pBINOA-5/ pBINOA-6为引物， 优化后的阿朴脂蛋白 A-I米兰突 变体基因为模板扩增阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因， PCR的条件为： 94°C lmin、 63-73 °C lmin、 68 °C lmin, 30个循环后， 68°C 延伸 lOmin; 琼脂糖凝胶电泳并回收两种 PCR扩增产 物， 将两种产物摩尔比 1： 1混合作为模板， 以 pBINOA-3/ pBINOA-6为引物进行重叠 PCR,

PCR的条件为： 94°C lmin、 50-55 °C lmin、 68 °C 2min, 30个循环后， 68°C 延伸 lOmin, 琼 脂糖凝胶电泳并回收扩增产物获得 O/e/¾p -/ _M 融合基因。 O/e/¾p -/ _M 融合基因的构建如图 4 所示， M: DNA Molecular Weight Marker DL2000, LI : pBINOA-3/ pBINOA-4为引物， 花生（品 种冀花 4号）基因组 DNA为模板扩增终止密码子缺失的花生油体蛋白 基因 528bp的片段， L2: 以 pBINOA-5/ pBINOA-6为引物， 优化后的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因为模板扩增阿朴脂 蛋白 A-I米兰突变体基因 750bp (含编码凝血酶酶切位点的核苷酸序列）， L3 : 以 pBINOA-3/pBINOA-6为引物进行重叠 PCR， 获得的 O/e/<¾wA-/ _M 融合基因。将 O/e/<¾wA-/ _M 融合 基因进行测序， 测序结果显示 O/e ¾p -/ _M 合基因序列如 SEQ ID N0: 13所示， 长 1278bp， 分子量 787.9kDa。 预测的氨基酸残基序列如 SEQ ID NO: 14所示， 由 425个氨基酸残基组成， 分子量 46.994kDa。 ο/«^'«-ίφ -/ _Μ 融合基因的构建结果和测序结果表明： 我们已得到 o/eo«>z-flp(¾4- i融合基因。

中间载体 pUCNOA的构建， 将 O/e ¾p -/ _M 融合基因进行 BflmH MflcI双酶切后与同样双 酶切的 pUCN连接， 将连接产物与 20(^L DH5 a感受态细胞（购自天根生化科技 (北京)有限公 司）混匀，冰浴 30min， 42°C热激 1.5min，冰浴 3min，加入 800μΙ^ LB培养基 37°C培养 45 min, 涂布含 100μ _§ /mL氨苄霉素的 LB平板， 37 °C培养过夜。 PCR方法筛选转化子， pBINOA-3和 pBINOA-6为引物， PCR的条件为： 94 °C lmin、 60-73 °C lmin、 72 °C 1.5min, 30个循环后，

72°C 延伸 lOmin, 将 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测筛选结果， 将阳性转化子命名为 pUCNOA, 将阳性转化子进行液体震荡培养， 碱裂解法提取质粒， 将质粒进行 H dm单酶切鉴 定、 H din和 Bflmffl双酶切鉴定以及 ^mH ^flcI双酶切鉴定， 琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果 如图 5所示， M: DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, LI : H mffll单酶切 pUCNOA质 粒的产物为 4849bp的片段， L2: H^dll ^flcl双酶切 pUCNOA质粒的产物为 2647bp的载体 片段和 2202bp的外源片段 （包含油菜油体蛋白基因启动子和 ο/^^ί-βρ -/Μ融合基因） L3 :

^^^！^和 ^双酶切 pUCNOA 质粒的产物为 3571bp的载体片段和 1278bp的外源片段

(o/ei^'«-fl/wA-/M融合基因）。将 pUCNOA质粒进行测序，测序结果 SEQ ID NO: 15，全长 2202bp， 分子量为 1357.5kDa， 包括油菜油体蛋白基因启动子和 ₀ /«^'«- ^4- 融合基因。酶切结果（如 图 5所示）和测序结果 （如序列表中） SEQ ID NO: 15表明： 已获得了油菜油体蛋白基因启动 子驱动的花生油体蛋白与阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体融合基因的表达盒，并已将该表 达盒成功 克隆到载体 pUC19上。

种子特异型植物表达载体 pBINOA的构建， 碱裂解法提取 pUCNOA质粒 DNA， 用 H^dlll 和 ^1 双酶切， 琼脂糖凝胶电泳回收 2202bp的外源片段， 双酶切的 PBI121连接， 将连接产物与 20(^L DH5 α感受态细胞 （购自天根生化科技 (北京)有限公司） 混匀， 冰浴 30min， 42°C热激 1.5min， 冰浴 3min， 加入 800μ LB培养基 37°C培养 45 min， 涂布含 10(^g/mL卡那霉素的 LB平板， 37°C培养过夜。 PCR方法筛选转化子， pBINOA-1 和 pBINOA-6为引物， PCR的条件为： 94°C lmin、 60-73 °C lmin 72°C2min, 30个循环后， 72°C 延伸 lOmin, 将 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测筛选结果， 将阳性转化子命名为 pBINOA, 将阳性转化子进行液体震荡培养， 碱裂解法提取质粒， 将质粒进行 H^din单酶切鉴定以及 H mffl MflcI双酶切鉴定， 琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果如图 6 所示， M: DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, LI : HmdIII 酶切 pBINOA质粒的产物为 14205bp的片段， L2: H mffl ^flcI双酶切 pBINOA质粒的产物为 12003bp的载体片段和 2202bp的外源片段（包含油 菜油体蛋白基因启动子和 o/eo^i- -/ _M 融合基因）。将 pBINOA质粒进行测序，测序结果 SEQ ID NO:15, 载体的全长核苷酸序列如 SEQ ID NO:16所示。 整个表达盒长 2202bp， 分子量为 1357.5kDa, 包括油菜油体蛋白基因启动子和 ο/«^'«-ίφ -/ _Μ 融合基因。 油菜油体蛋白基因启 动子是种子特异型的强启动子，在转基因植物 的种子中驱动阿朴脂蛋白 Α-Ι米兰突变体以融合 蛋白的形式与花生油体蛋白共同在油体中特异 表达，花生油体蛋白携带阿朴脂蛋白 Α-Ι米兰突 变体锚定在油体表面。 利用油体亲脂疏水的特性， 将转基因植物种子粉碎， 液体抽提， 离心处 理， 回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组 分分开， 可去除 90%以上的种子蛋白。并在 花生油体蛋白和阿朴脂蛋白 Α-Ι米兰突变体之间设计了凝血酶识别位点，� ��以从油体上释放阿 朴脂蛋白 Α-Ι米兰突变体。

实施例 3: 利用该载体制备阿朴脂蛋白 Α-Ι米兰突变体

3.1 上述构建的种子特异型表达载体导入受体植物 外植体内；

3.1.1 农杆菌感受态细胞的制备

( 1 ) 挑取根癌农杆菌 LBA4404 单菌落于 3mL 的 YEB 液体培养基 （含链霉素 Sm 125 g/mL) 中， 28°C振荡培养过夜；

(2) 取过夜培养菌液 50(^L接种于 50mL YEBCSm 125 g/mL)液体培养基中， 28°C振荡 培养至 OD ₆ QQ为 0.5;

(3 ) 5,000rpm, 离心 5min;

(4) 力 B 10mL 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞， 5，000rpm， 离心 5min;

(5 ) lmL预冷的 20mM CaCl ₂ 悬浮细胞， 冰浴， 24h内使用， 或分装成每管 200μΙ^， 液 氮中速冻 1 min， 置 -70°C保存备用。

3.1.2 种子特异型植物表达载体向农杆菌感受态细胞 的转化

取 20(^L感受态细胞，加入 l g构建好的质粒 DNA，液氮中速冻 1 min， 37°C水浴 5 min, 然后加入 lmLYEB培养基， 28°C慢速振荡培养 4h; 1,000 rpm离心 30sec， 弃上清， 加入 O.lmLYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有 lOO g/mL Kan禾卩 125 g/mL Sm的 YEB平板上， 28°C培养约 48h。

阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于 YEB液体培养液 (含有 lOO g/mL Kan和 125 g/mL Sm) 中， 28°C振荡培养过夜； 碱裂解法小量提取质粒 DNA， 以质粒 DNA为模板， pBINOA-1和 pBINOA-6为引物，进行 PCR扩增鉴定， PCR的条件为： 94 °C lmin、 60-73 °C lmin、 72 °C 2min, 30个循环后， 72°C 延伸 lOmin, 将 PCR产物进行琼脂糖电泳检测筛选结果获得阳性 转化子。 用于转化油葵的农杆菌菌液的准备

从平板上挑取农杆菌单菌落， 接种到 5mL YEB液体培养基中 （含有 10(^g/mL Kan和 125 g/mL Sm) , 振荡培养过夜， 取 ImL菌液接种到 100-200mL YEB液体培养基 （含有 lOO g/mL Kan禾卩 125 g/mLSm)中， 剧烈振荡培养至 OD ₆₀₀ 为 0.4〜0.8， 3500rpm离心 lOmin, 菌体用 MS (不含植物生长调节剂和抗生素）液体培养基� �悬， 使 0D _6QQ 为 0.6左右， 以进行侵 染。

3.1.3 农杆菌介导的油葵外植体的遗传转化 将发芽 3〜4d的油葵种子实生幼苗的茎尖、 子叶、 子叶节和去掉一片子叶的实生株四种 形式的外植体， 在上述农杆菌菌液中浸泡 6〜8min， 转至 MS固体培养基上共培养 3d (25 °C 黑暗）。 其中优选的方式是去掉一片子叶的实生株。

3.2将上述受体植物材料培养为完整的植株， 得到种子并进行目的基因和蛋白的检测；

3.2.1受体植物材料培养为完整的植株， 得到种子

将上述转化过的外植体转到含头孢霉素 300mg/L的 MS培养基上继续进行培养， 约 7d 后， 转至 MS抗性筛选培养基上 （含头孢霉素 300mg/L和卡那霉素 70mg/L的） 选择培养， 每 15〜20d更换培养基，筛选三次后获得抗性芽，� �� 2〜3厘米抗性芽转至生根培养基 MS2 (MS + IBAO. l mg/L+Kan 70 mg/L+cef 300 mg/L),待抗性苗生根后移栽入温室进行蛭石和营 养土混 合物培养， 直至成熟收获种子。

3.2.2 目的基因和蛋白的检测

在幼苗期对阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因进行 PCR检测， 收获籽粒后对花生油体蛋白 和阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体融合蛋白进行 Western blotting检测。 转基因油葵幼苗的 PCR检测和 PCR-Southem blotting检测

采用 SDS 法提取抗性油葵幼苗幼嫩真叶的基因组 DNA作为模板， 以 npmF/npmR和 pBINOA-5/ pBINOA-6两对引物进行 PCR扩增检测，引物序列分别为： nptUF: ATGAAC TGC AGGACGAGG (SEQIDNO:17) npt!IR: GCG ATA CCG TAA AGC ACG (SEQ ID NO:18) wpllF/wpnR和 pBINOA-5/ pBINOA-6的 PCR扩增的条件均为为： 94°C lmin、 60 °C lmin、 72 °C lmin, 30个循环后， 72°C 延伸 lOmin, 分别扩增出预期为 567bp的片段 （部分 基因）和 750bp的 ίψ -/ _Μ 基因片段， 结果如图 7和图 8所示。 图 7中， M: DNA Molecular Weight Marker DL2000, LI- L4: nF/«pnR为引物， 以自卡那抗性的油葵所提基因组 DNA为模板扩增出 567bp的片段，即为阳性植株， L5:非抗性油葵做对照。图 8中， M: DNA Molecular Weight Marker DL2000, LI- L4: pBINOA-5/ pBINOA-6为引物， 以自卡那抗性的油葵所提基因组 DNA为模板 扩增出 750bp的片段， 即为阳性植株， L5: 非抗性油葵对照。

PCR-Southem blotting检测

1) 采用 SDS 法提取 和 -/ _M 均为阳性的转基因油葵幼苗真叶的基因组 DNA， 以 pBINOA-1/ pBINOA-6为引物对基因组 DNA进行 PCR扩增。 PCR反应条件为 94°C lmin、 60°C lmin、 72 °C 2.5min, 30个循环后， 72°C 延伸 10min。

2)将 DNA从凝胶转移至尼龙膜， 电泳完毕， 进行变性、 中和后， 进行半干转膜， 将膜晾干， 真空 80°C干烤 1.2hrs。

3) DNA探针标记

回收 pBINOA质粒的 BamH I +Sac I双酶切片， 取 3 μ g DNA用于标记

4) 杂交

63°C预杂交膜 30mins， 63°C杂交过夜， 用充足的 2XSSC, 0.1%SDS洗膜 2次； 用预热 到 65°C的 0.5XSSC, 0.1%SDS 63 °C条件下洗膜 2次。

5) 检测

杂交和洗过的膜用冲洗缓冲液冲洗，简单淋 洗一次；在 lOOmL封闭液中浸泡 30min;在 20mL 抗体溶液中浸泡 30min; 用 lOOmL冲洗缓冲液冲洗 2次， 各 15min; 在 20mL检测缓冲液中平 衡 2-5min; 将膜的 DNA面向上放到杂交袋中， 加入 lmL CSPD; 37°C温浴湿润的膜 10min， 以使化学荧光充分反应； 在 X光片上室温曝光。 结果如图 9所示， M: DNA Molecular Weight Marker ADNA/EcoT 141, LI- L4: 以 PCR检测阳性植株基因组为模板以 pBINOA-1/ pBINOA-6 为引物扩增产物的 Southern blotting结果， 2.2kb处显示杂交信号， 与预期结果一致， 表明 ^ί^'«- -/ _Μ 合基因已经整合到油葵基因组中， L5: 非转基因油葵对照。

转基因油葵籽粒中花生油体蛋白和阿朴脂蛋 白 Α-Ι米兰突变体融合蛋白的 Western 1)1 ₀ 110^检 将转基因油葵籽粒于 5V研磨缓冲液 （50mM Tris-HCl H 7.5, 0.4 M sucrose, 0.5M NaCl) 中研磨， 离心 10 X g 30min， 分为三部分， 取油相， 重新悬浮于等体积的研磨缓冲液中， 混匀， 轻轻加入 5V预冷的 50mM Tris-HCl pH 7.5缓冲液， 离心 10 X g 30min， 取油相。 将上述过程重 复 2次，用以进一步去除剩余的水溶性成分和不� �性成分，得到纯净的油体（油体的成分包括: 中性脂类 磷脂、 油体蛋白） 。 在油体中加入 2V乙醚， 离心， 中性脂类留在了上层乙醚相中， 磷脂在下层的水相中， 取中间的蛋白层， 以 0.1M的蔗糖缓冲液重悬， 加入氯仿甲醇 （2 : 1 ) 混合物， 抽提两次， 取中间蛋白层， 乙醚抽提一次， 溶于无菌水中。 进行 SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳， 经转膜后用山羊抗兔阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的多克隆抗体进行 Western blotting分 析， 结果如图 10 所示， M: 蛋白分子量标准， L1和 L2: 为自转基因油葵的种子中提取的油体 蛋白，有阿朴脂蛋白 A-咪兰突变体的表达，表达产物大小约为 48kDa，与预期的大小一致（花 生油体蛋白 18.4 kDa +凝血酶酶切位点 0.6 kDa +阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体 28.9 kDa)。表达量 占种子总蛋白的 1.1%， 超过了重组药物蛋白在植物中表达的最低商业 化要求（1%) ， 因此利 用植物油体表达系统 来实现阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的产业化， 具有可行性和广阔的应用 前景。

3.3 从上述种子中分离纯化获得阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体。

第一步： 将油体与种子中的其它成分分开

将种仁于 5V研磨缓冲液（50mMTris-HCl pH 7.5， 0.4M蔗糖， 0.5 M NaCl)中研磨， 离心 ( 10xg) 30min, 分为三部分： 最底部是不可溶沉淀 （籽壳、 纤维质材料、 不溶糖、 蛋白质和 其它不溶性污物）， 中间是水相， 内含可溶的细胞成分 （储藏蛋白）， 最上层是油体和与之结 合的油体蛋白。

第二步： 洗涤油体

取第一步所得油相， 重新悬浮于等体积的研磨缓冲液中， 混匀， 加入 5V 预冷的 50m MTris-HCl pH 7.5缓冲液， 离心 （10xg) 30min, 取油相。 将上述过程重复 2次， 用以进一步 去除剩余的水溶性成分和不溶性成分， 洗涤过的油体重悬于等体积预冷的 50mM Tris-HCl pH 7.5中， 这样所得的油体是基本纯净的油体制品， 仅存的蛋白质是油体蛋白。

第三步： 酶切反应释放阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体蛋白

用凝血酶酶切缓冲液 （20m M Tris-HCl pH8.4、 150m M NaCl、 2.5m M CaCl ₂ ) 洗涤油体 两次， 加入适量的凝血酶， 37°C过夜， 离心， 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体蛋白存在于水相中。

第四步： HPLC纯化阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体蛋白

上反相色谱柱 〔4(5μ， 0.24*25cm)， 紫外波长 214nm， 缓冲液 A(10%乙腈 0.1%三氟乙 酸) 2mL/min平衡柱子， 将上一步所得水相上样， 对柱子施以 0-60%缓冲液 B (95%乙腈 0.1% 三氟乙酸） 线性梯度洗脱， 得到纯的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体蛋白， 纯度达 99.5%以上。 实施例 4: 油葵作为生物反应器和和红花作为生物反应器 制备阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体的比 取相同质量 （280mg) 的转阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体基因的油葵种子和红花种子， 依 据实施例 3分离纯化获得阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体蛋白， 上样量为所得总量的十分之一， 进行 Western blotting检测， 结果如图 11所示， M: 蛋白分子量标准， L1 : 自转基因红花纯化 的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 大小为 28.9kDa，与预期大小一致， 定量为 50ng， L2: 自转 基因油葵纯化的阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 大小为 28.9kDa，与预期大小一致， 定量为 80ng。 由此推算 1kg转基因油葵种子可获得 2.85g 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体， 同等条件下 1kg转 基因红花种子可获得 1.78g 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体。 而且油葵的亩产量约 250kg.红花的 亩产量约 200公斤， 无论是从种子阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体产率还是单位面积种植作物的 阿朴脂蛋白 A-I米兰突变体产量来看， 油葵都要优先于红花。