Die vorliegende Erfindung betrifft ein Smart-Drug-Delivery-System und ein pharmazeutisches Kit für duale nuklearmedizinisch-cytotoxische Theranostik.

Das Smart-Drug-Delivery-System umfasst

- eine erste Verbindung mit der Struktur

CT-Ll-Chel-Sl-TV ; oder

Chel mit C = CH oder N oder

- eine zweite Verbindung mit der Struktur Chel— S— TV und eine dritte Verbindung mit der Struktur CT— L— TV ; wobei in der ersten, zweiten und dritten Verbindung

Chel ein Rest eines Chelators für die Komplexierung eines Radioisotops; CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung; TV ein biologischer Targetingvektor; LI und L jeweils ein Linker; Sl, S2 und S jeweils ein Spacer ist.

Das pharmazeutische Kit besteht aus

- einem ersten Behälter mit einer ersten Verbindung oder einer, die erste Verbindung enthaltenden ersten Trägersubstanz; oder

- einem zweiten Behälter mit einer zweiten Verbindung oder einer, die zweite Verbindung enthaltenden zweiten Trägersubstanz; und einem dritten Behälter mit einer dritten Verbindung oder einer, die dritte Verbindung enthaltenden dritten Trägersubstanz; wobei die erste Verbindung die Struktur

CT-Ll-Chel-Sl-TV ; oder CT LI Cp S! - TV S2 Chel mit Cp = CH oder N die zweite Verbindung die Struktur Chel— S— TV ; und die dritte Verbindung die Struktur CT— L— TV aufweist; worin

Chel ein Rest eines Chelators für die Komplexierung eines Radioisotops; CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung; TV ein biologischer Targetingvektor; LI und L jeweils ein Linker; Sl, S2 und S jeweils ein Spacer ist.

In der Chemotherapie werden seit Jahrzehnten cytotoxische Pharmazeutika, wie beispielsweise Doxorubicin eingesetzt. Bei der herkömmlichen systemischen Chemotherapie wird das cytotoxische Pharmazeutikum intravenös, oral oder peritoneal in relativ hoher Dosis verabreicht. Neben Krebszellen schädigen cytotoxische Pharmazeutika auch gesundes Gewebe, insbesondere Zellen mit hoher Teilungsrate und verursachen starke, zum Teil lebensbedrohliche Nebenwirkungen, die häufig einen Abbruch der Behandlung erzwingen.

Um Nebenwirkungen abzumildern, werden seit einigen Jahren niedrig dosierte, zielgerichtete cytotoxische Pharmazeutika mit hoher Bindungsaffinität zu Tumorzellen eingesetzt. Die Tumoraffinität wird vermittelt durch mit dem cytotoxischen Wirkstoff konjugierte Targetingvektoren. Bei den Targetingvektoren handelt es sich in der Regel um Agonisten (Substrate) oder Antagonisten (Inhibitoren) von membranständigen Proteinen, die auf der Hülle von Tumorzellen stark überexprimiert sind im Vergleich zu gesunden Körperzellen. Targetingvektoren umfassen einfache organische Verbindungen, Oligopeptide mit natürlichen oder derivatisierten Aminosäuren sowie Aptamere.

Im Weiteren werden in der klinischen Behandlung seit etwa 15 Jahren in zunehmendem Umfang bildgebende nuklearmedizinische Diagnoseverfahren, wie Positronen-Emissions- Tomographie (PET) und Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (single photon emission computed tomography, SPECT) eingesetzt. Jüngst gewinnen auch theranostische Verfahren an Bedeutung.

Die bildgebende nuklearmedizinische Diagnose und Behandlung (Theranostik) von Krebs erkrankungen unterstützt und ergänzt die Chemotherapie.

In der nuklearmedizinischen Diagnostik und Theranostik werden Tumorzellen mit einem radioaktiven Isotop, wie beispielsweise ⁶⁸ Ga oder ¹⁷⁷ Lu markiert bzw. bestrahlt. Hierbei werden Markierungsvorläufer eingesetzt, die das jeweilige Radioisotop kovalent ( ¹⁸ F) oder koordinativ ( ⁶⁸ Ga, ^99m Tc, ¹⁷⁷ Lu) binden. Die Markierungsvorläufer umfassen im Fall von metallischen Radioisotopen als wesentliche chemische Komponente einen Chelator für die effektive und stabile Komplexierung des Radioisotops sowie als funktionelle Komponente einen biologischen Targetingvektor, der an Zielstrukturen im Tumorgewebe, insbesondere membranständige Proteine bindet.

Targetingvektoren mit hoher Affinität zu Krebszellen eignen sich gleichermaßen für die zielgerichtete Chemotherapie wie für die nuklearmedizinische Diagnostik und Theranostik. Dementsprechend arbeitet die Forschung in diesen Disziplinen komplementär.

Nach intravenöser Injektion in den Blutkreislauf reichert sich ein mit einem Radioisotop komplexierter nuklearmedizinischer Markierungsvorläufer auf bzw. in Tumorzellen an. Um die Strahlendosis bei diagnostischen Untersuchungen in gesundem Gewebe zu minimieren, wird eine geringe Menge eines Radioisotops mit kurzer Halbwertszeit von wenigen Stunden bis Tagen verwendet.

Durch den Chelator werden die Konfiguration und chemischen Eigenschaften des Targetingvektors modifiziert und in der Regel dessen Affinität zu Tumorzellen stark beeinflusst. Dementsprechend wird die Kopplung zwischen dem Chelator und dem mindestens einen Targetingvektor in aufwendigen Trial-and-Error Versuchen bzw. sogenannten biochemischen Screenings maßgeschneidert. Hierbei wird eine große Zahl von, den Chelator und einen Targetingvektor umfassenden Markierungsvorläufern synthetisiert und insbesondere die Affinität zu Tumorzellen quantifiziert. Der Chelator und die chemische Kupplung mit dem Targetingvektor sind maßgebend für die biologische und nuklearmedizinische Potenz des jeweiligen Markierungsvorläufers.

Zusätzlich zu einer hohen Affinität muss der Markierungsvorläufer weitere Anforderungen erfüllen, wie

- schnelle und effektive Komplexierung oder kovalente Bindung des jeweiligen Radioisotops;

- hohe Selektivität für Tumorzellen relativ zu gesundem Gewebe;

- in vivo Stabilität, d. h. biochemische Beständigkeit in Blutserum unter physiologischen Bedingungen.

Prostatakrebs

Für Männer in den Industrieländern ist Prostatakrebs die häufigste Krebsart und die dritthäufigste tödliche Krebserkrankung. Das Tumorwachstum schreitet bei dieser Erkrankung nur langsam voran und bei einer Diagnose im frühen Stadium liegt die 5-Jahre Überlebensrate bei nahezu 100%. Wird die Krankheit erst entdeckt, wenn der Tumor metastasiert hat, sinkt die Überlebensrate dramatisch. Ein zu frühes und zu aggressives Vorgehen gegen den Tumor kann wiederum die Lebensqualität des Patienten unnötig beeinträchtigen. So kann z. B. die operative Entfernung der Prostata zu Inkontinenz und Impotenz führen. Eine sichere Diagnose und Informationen über das Stadium der Krankheit sind essentiell für eine erfolgreiche Behandlung mit hoher Lebensqualität des Patienten. Ein weitverbreitetes Diagnosemittel neben dem Abtasten der Prostata durch einen Arzt ist die Bestimmung von Tumormarkern im Blut des Patienten. Der prominenteste Marker für ein Prostatakarzinom ist die Konzentration des prostataspezifischen Antigens (PSA) im Blut. Allerdings ist die Aussagekraft der PSA-Konzentration umstritten, da Patienten mit leicht erhöhten Werten oft kein Prostatakarzinom haben, jedoch 15% der Patienten mit Prostatakarzinom keine erhöhte PSA-Konzentration im Blut zeigen. Eine weitere Zielstruktur für die Diagnose von Prostatatumoren ist das prostataspezifische Membranantigen (PSMA). Im Gegensatz zu PSA kann PSMA im Blut nicht nachgewiesen werden. Es ist ein membrangebundenes Glykoprotein mit enzymatischer Aktivität. Seine Aufgabe ist die Abspaltung von C-terminalem Glutamat von N-Acetyl-Aspartyl-Glutamat (NAAG) und Folsäure-(poly)-y-Glutamat. PSMA tritt in normalem Gewebe kaum auf, wird aber von Prostatakarzinomzellen stark überexprimiert, wobei die Expression mit dem Stadium der Tumorerkrankung eng korreliert. Auch Lymphknoten- und Knochenmetastasen von Prostatakarzinomen zeigen zu 40% eine Expression von PSMA.

Eine Strategie des molekularen Targetings von PSMA besteht darin, mit Antikörpern an die Proteinstruktur des PSMA zu binden. Eine weitere Herangehensweise ist die enzymatische Aktivität von PSMA, die gut verstanden ist, zu nutzen. In der enzymatischen Bindungstasche von PSMA befinden sich zwei Zn ²⁺ -lonen, die Glutamat binden. Vor dem Zentrum mit den beiden Zn ²⁺ -lonen befindet sich eine aromatische Bindungstasche. Das Protein ist in der Lage sich aufzuweiten und an die Bindungspartner anzupassen (induced fit), so dass es neben NAAG auch Folsäure binden kann, wobei die Pteroinsäuregruppe in der aromatischen Bindungstasche andockt. Die Nutzung der enzymatischen Affinität von PSMA ermöglicht die Aufnahme des Substrates in die Zelle (Endozytose) unabhängig von einer enzymatischen Spaltung des Substrates.

Daher eignen sich insbesondere PSMA-Inhibitoren gut als Targetingvektoren für bildgebende diagnostische und theranostische Radiopharmazeutika bzw. Radiotracer. Die radioaktiv markierten Inhibitoren binden an das aktive Zentrum des Enzyms, werden dort jedoch nicht umgesetzt. Die Bindung zwischen dem Inhibitor und dem radioaktiven Label wird also nicht gelöst. Begünstigt durch Endozytose wird der Inhibitor mit dem radioaktiven Label in die Zelle aufgenommen und in den Tumorzellen angereichert.

Inhibitoren mit hoher Affinität zu PSMA (Schema 1) enthalten in der Regel ein Glutamat- Motiv und eine enzymatisch nicht spaltbare Struktur. Ein hoch effektiver PSMA-Inhibitor ist 2-Phosphonomethyl-Glutarsäure bzw. 2-Phosphonomethyl-Pentandisäure (2-PMPA), in der das Glutamat-Motiv an eine durch PSMA nicht spaltbare Phosphonatgruppe gebunden ist. Eine weitere Gruppe von PSMA-Inhibitoren, die in den klinisch relevanten Radiopharmaka PSMA-11 (Schema 2) und PSMA-617 (Schema 3) genutzt wird, bilden Harnstoff-basierte Inhibitoren. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, zusätzlich zu der Bindungstasche für das Glutamat-Motiv die aromatische Bindungstasche von PSMA zu adressieren. Beispielsweise ist in dem hoch wirksamen Radiopharmakon PSMA-11 das Bindungsmotiv L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) über Hexyl (Hexyl-Linker) an einen aromatischen HBED-Chelator (N,N'-Bis(2-hydroxy-5- (ethylen-beta-carboxy)benzyl)ethylendiamin N,N'-diacetat) gebunden.

Wird L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) hingegen an den nicht-aromatischen Chelator DOTA (l,4,7,10-Tetraazacyclododecan-l,4,7,10-tetraacetat) gebunden, so ist eine verminderte Affinität und Anreicherung in Tumorgewebe zu konstatieren. Um dennoch den DOTA- Chelator für ein PSMA-affines Radiopharmakon mit therapeutischen Radioisotopen, wie ¹⁷⁷ Lu oder ²²⁵ Ac nutzen zu können, muss der Linker angepasst werden. Mittels gezielter Substitution von Hexyl durch verschiedene aromatische Strukturen wurde das hoch wirksame Radiopharmakon PSMA-617, der derzeitige Goldstandard, gefunden.

Schema 2: Markierungsvorläufer PSMA-11

Schema 3: Markierungsvorläufer PSMA-617

Tumorstroma

Viele Tumore umfassen maligne Epithelzellen und sind von mehreren nicht-kanzerogenen Zellpopulationen umgeben, einschließlich aktivierten Fibroblasten, Endothelzellen, Perizyten, Immunregulationszellen und Zytokinen in der extrazellulären Matrix. Diese sogenannten Stromazellen, die den Tumor umgeben, spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, dem Wachstum und der Metastasierung von Karzinomen. Ein großer Teil der Stromazellen sind aktivierte Fibroblasten, die als krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) bezeichnet werden. Im Laufe der Tumorprogression verändern CAFs ihre Morphologie und biologische Funktion. Diese Veränderungen werden durch interzelluläre Kommunikation zwischen Krebszellen und CAFs induziert. Hierbei bilden CAFs eine Mikroumgebung, die das Wachstum der Krebszellen begünstigt. Es hat sich gezeigt, dass allein auf Krebszellen zielende Therapien unzulänglich sind. Effektive Therapien müssen die Tumor- Mikroumgebung, d. h. CAFs einbeziehen. Bei mehr als 90 % aller menschlichen Karzinome wird von CAFs das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein (FAP) überexprimiert. Daher repräsentiert FAP einen erfolgversprechenen Angriffspunkt für die nuklearmedizinische Diagnostik und Theranostik. Als affine biologische Targetingvektoren für FAP- Markierungsvorläufer eignen sich - analog zu PSMA - insbesondere FAP-Inhibitoren (FAPI oder FAPi). FAP weist bimodale, durch dasselbe aktive Zentrum katalysierte Aktivität von Dipeptidylpeptidasen (DPP) und Prolyloligopeptidasen (PREP) auf. Dementsprechend kommen zwei Arten von Inhibitoren in Betracht, welche die DPP- und/oder die PREP- Aktivität von FAP hemmen. Bekannte Inhibitoren für die PREP-Aktivität von FAP weisen eine niedrige Selektivität für FAP auf. Bei Krebsarten, bei denen sowohl FAP als auch PREP überexprimiert wird, können jedoch auch PREP-Inhibitoren trotz ihrer geringen FAP- Selektivität als Targetingvektoren geeignet sein. Schema 4 zeigt einen DOTA-konjugierten FAP-Markierungsvorläufer, bei dem der Chelator an die pharmakophore Einheit ((S)-N-(2-(2-Cyano-4,4-difluoropyrolidin-l-yl)-2-oxoethyl)-6 - (4-aminobutyloxy)-quinolin-4-carboxamid über die 4-aminobutoxy-Funktionalität an das Quinolin gekoppelt ist.

Schema 4: DOTA-konjugierter FAP-Markierungsvorläufer

Knochenmetastasen

Knochenmetastasen exprimieren Farnesyl-Pyrophosphat-Synthase (FPPS), ein Enzym im HMG-CoA-Reduktase-(Mevalonat)-Weg. Durch die Hemmung von FPPS wird die Produktion von Farnesyl, einem wichtigen Molekül für das Docking von Signalproteinen an der Zellmembran unterdrückt. Als Folge wird die Apoptose von kanzerogenen Knochenzellen induziert. FPPS wird durch Bisphosphonate, wie Alendronat, Pamidronat und Zoledronat inhibiert. Beispielweise wird der Tracer BPAMD mit dem Targetingvektor Pamidronat regelmäßig bei der Behandlung von Knochenmetastasen eingesetzt.

Als besonders effektiver Tracer für die Theranostik von Knochenmetastasen hat sich Zoledronat (ZOL), ein Hydroxy-Bisphosphonat mit einer heteroaromatischen N-Einheit erwiesen. Mit den Chelatoren NODAGA- und DOTA-konjugiertes Zoledronat (Schema 5) sind die derzeit potentesten Radio-Theranostika für Knochenmetastasen.

Schema 5: Tracer DOTA-Zoledronat (links) und NODAGA-Zoledronat (rechts)

Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Markierungsvorläufern für Diagnose und Theranostik von Krebserkrankungen mit radioaktiven Isotopen bekannt.

WO 2015055318 Al offenbart Radiotracer für die Diagnose und Theranostik von Prostata oder epithelialen Karzinomen, wie unter anderem, die in Schema 3 gezeigte Verbindung PSMA-617. Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, pharmazeutische Verbindungen und pharmazeutische Kits für duale nuklearmedizinisch-cytotoxische Theranostik bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Smart-Drug-Delivery-System, umfassend

- eine erste Verbindung mit der Struktur

CT-Ll-Chel-Sl-TV ; oder

Chel mit C = CH oder N oder

- eine zweite Verbindung mit der Struktur Chel— S— TV und eine dritte Verbindung mit der Struktur CT— L— TV ; wobei in der ersten, zweiten und dritten Verbindung

Chel ein Rest eines Chelators für die Komplexierung eines Radioisotops; CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung; TV ein biologischer Targetingvektor; LI und L jeweils ein Linker; Sl, S2 und S jeweils ein Spacer ist.

Im Weiteren schafft die Erfindung ein pharmazeutisches Kit für duale nuklearmedizinisch- cytotoxische Theranostik, bestehend aus

- einem ersten Behälter mit einer ersten Verbindung oder einer, die erste Verbindung enthaltenden ersten Trägersubstanz; oder

- einem zweiten Behälter mit einer zweiten Verbindung oder einer, die zweite Verbindung enthaltenden zweiten Trägersubstanz, und einem dritten Behälter mit einer dritten Verbindung oder einer, die dritte Verbindung enthaltenden dritten Trägersubstanz; wobei die erste Verbindung die Struktur

CT-Ll-Chel-Sl-TV ; oder CT LI Cp Si - TV S2 Chel mit Cp = CH oder N die zweite Verbindung die Struktur Chel— S— TV ; und die dritte Verbindung die Struktur CT— L— TV aufweist; worin

Chel ein Rest eines Chelators für die Komplexierung eines Radioisotops; CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung; TV ein biologischer Targetingvektor; LI und L jeweils ein Linker; Sl, S2 und S jeweils ein Spacer ist.

Im Weiteren betrifft die Erfindung eine Verbindung für duale nuklearmedizinisch- cytotoxische Theranostik mit der Struktur

CT-Ll-Chel-Sl-TV ; worin

Chel ein Rest eines Chelators für die Komplexierung eines Radioisotops; CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung; TV ein biologischer Targetingvektor; LI ein Linker; und S1 ein Spacer ist.

Im Weiteren betrifft die Erfindung eine Verbindung für duale nuklearmedizinisch- cytotoxische Theranostik mit der Struktur

CT — _L1 Cp Sl -TV

S2

Chel mit Cp = CH oder N worin

Chel ein Rest eines Chelators für die Komplexierung eines Radioisotops; CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung; TV ein biologischer Targetingvektor; LI ein Linker; S1 und S2 jeweils ein Spacer ist. Zweckmäßige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Smart-Drug-Delivery-Systems, des pharmazeutischen Kits und der Verbindungen

_CT - Li - Qp - si -TV S2

CT-Ll-Chel-Sl-TV und CheJ mit Cp = CH oder N sind dadurch gekennzeichnet, dass

- TV ein Targetingvektor ist, der gewählt ist aus einer der Strukturen [1] bis [18] mit wobei die Strukturen [1] bis [8] und [18] Aminosäuresequenzen bezeichnen;

L und LI unabhängig voneinander eine Struktur aufweisen, die gewählt ist aus

H[Ml]m-Clv-[M2]n2-l ;

H[M3] _n3 — QS— [M4]n4— Clv— [M5]nsH ;

!-[M6]n6-QS-[M7]n7-Clv-[M8]n8-QS-[M9]n9-i ; worin Ml, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8 und M9 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH2)- , -(CH2CH2O)- , -CH ₂ -CH(COOH)-NH- und -(CH ₂ ) _m NH- mit m = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; und nl, n2, nB, n4, n5, n6, n7, n8 und n9 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};

- QS ein Quadratsäurerest ist;

- Clv eine spaltbare Gruppe ist;

- S gleich L ist (S = L); und/oder

- S, S1 und S2 unabhängig voneinander eine Struktur aufweisen, die gewählt ist aus

\ — [01] _pi — | ; und

\ — [02] _p2 -QS-[0S]p3 — \ ; worin 01, 02 und OS unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH ₂ )- , -(CH ₂ CH ₂ 0)- , -CH ₂ -CH(COOH)-NH- und -(CH ₂ ) _q NH- mit q = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; und pl, p2 und p3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};

- CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung, gewählt aus Adozelesin, Alrestatin, Anastrozole, Anthramycin, Bicalutamide, Bizelesin, Bortezomib, Busulfan,

Camptothecin, Capecitabine, Carboplatin, Carzelesin, CC-1065, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cytarabine (ara-C), Dacarbazine (DTIC), Dactinomycin, Daunorubicin, Dexamethasone, Disulfiram, Docetaxel, Doxorubicin, Duocarmycin A, Duocarmycin Bl, Duocarmycin B2, Duocarmycin CI, Duocarmycin C2, Duocarmycin D, Duocarmycin SA, Erismodegib, Etoposide (VP-16), Fludarabine, Fluorouracil (5-FU), Flutamide,

Fulvestrant, Gemcitabine, Goserelin, Idarubicin, Ifosfamide, L-Asparaginase, Leuprolide, Lomustine (CCNU), Mechlorethamine (Stickstoff-Lost), Megestrolacetat, Melphalan (BCNU), Menadione, Mertansine, Metformin, Methotrexate, Milataxel, Mitoxantrone, Monomethylauristatin E (MMAE), Motesanib, Mytansinoid, Napabucasin, NSC668394, NSC95397, Paclitaxel, Prednisone, Pyrrolobenzodiazepin, Pyrvinium Pamoate, Resveratol, Rucaparib, S2, S5, Salinomycin, Saridegib, Shikonin, Tamoxifen, Temozolomid, Tesetaxel, Tetrazol, Tretinoin, Verteporfin, Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine, Vismodegib, a-Chaconine, a-Solamargine, a-Solanine, a-Tomatine ist;

- CT ein Rest einer cytotoxischen Verbindung ist, gewählt aus den Wirkstoffgruppen:

- Antimetabolite, wie Capecitabine, Cytarabine, Fludarabine, Fluorouracil (5-FU), Gemcitabine, Methotrexate;

- Alkylierende Zytostatika, wie Adozelesin, Bizelesin, Busulfan, Carzelesin, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Ifosfamide, Lomustine (CCNU), Dacarbazine (DTIC), Cisplatin, Carboplatin, Mechlorethamine, Melphalan(BCNU), Temozolomid; - Topoisomerase-Hemmer, wie Etoposide (VP-16);

- Mitosehemmstoffe, wie Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine, Docetaxel, Paclitaxel, Tesetaxel, Mertansine, Milataxel, Monomethylauristatin E (MMAE), Mytansinoid, Napabucasin, Saridegib;

- Antibiotika, wie Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Duocarmycin A, Duocarmycin Bl, Duocarmycin B2, Duocarmycin CI, Duocarmycin C2, Duocarmycin D, Duocarmycin SA, Idarubicin Anthramycin, Salinomycin, Mitoxantrone;

- Enzyminhibitoren, wie Alrestatin, Anastrozole, Camptothecin, L-Asparaginase, Motesanib;

- Antiandrogene und Antiöstrogene, wie Bicalutamide, Flutamide, Fulvestrant, Tamoxifen, Megestrolacetat;

- PARP-Inhibitoren, wie Rucaparib, Olaparib, Niraparib, Veliparib, Iniparib;

- Proteasom-Inhibitoren, wie Bortezomib;

- Sonstige, wie Dexamethasone, Disulfiram, Erismodegib, Goserelin, Leuprolide, Menadione, Metformin, NSC668394, NSC95397, Prednisone, Pyrrolobenzodiazepine, Pyrvinium Pamoate, Resveratol, S2, S5, Shikonin, Tetrazol, Tretinoin, Verteporfin, Vismodegib, a-Chaconine, a-Solamargine, a-Solanine, a-Tomatine.

- die spaltbare Gruppe Clv gewählt ist aus der Gruppe, umfassend

-S-S-

R = Me oder Ph

- der Chelator Chel gewählt ist aus der Gruppe, umfassend hUpypa, EDTA

(Ethylendiamintetraacetat), EDTMP (Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure)), DTPA (Diethylentriaminpentaacetat) und dessen Derivate, DOTA (Dodeca-1, 4,7,10- tetraamin-tetraacetat), DOTAGA (2-(l, 4,7, 10-Tetraazacyclododecan-4, 7,10)- pentandisäure) und anderen DOTA-Derivaten, TRITA (Trideca-l,4,7,10-tetraamin- tetraacetat), TETA (Tetradeca-l,4,8,ll-tetraamin-tetraacetat) und dessen Derivate, NOTA (Nona-l,4,7-triamin-triacetat) und dessen Derivate wie beispielsweise NOTAGA (l,4,7-triazacyclononan,l-glutarsäure,4,7-acetat), TRAP (Triazacyclononan- phosphinsäure), NOPO (l,4,7-triazacyclononan-l,4- bis[methylen(hydroxymethyl)phosphinsäure]-7-[methylen(2-car boxyethyl) phosphinsäure]), PEPA (Pentadeca-l,4,7,10,13-pentaaminpentaacetat), HEHA (Hexadeca-l,4,7,10,13,16-hexaamin-hexaacetat) und dessen Derivate, HBED (Hydroxybenzyl-ethylen-diamin) und dessen Derivate, DEDPA und dessen Derivate, wie H2DEDPA (l,2-[[6-(carboxylat-)pyridin-2-yl]methylamin]ethan), DFO (Deferoxamin) und dessen Derivate, Trishydroxypyridinon (THP) und dessen Derivate wie YM103, TEAP (Tetraazycyclodecan-phosphinsäure) und dessen Derivate, AAZTA (6-Amino-6- methylperhydro-l,4-diazepin-N,N,N',N'-tetraacetat) und Derivate wie DATA ((6- Pentansäure)-6-(amino)methyl-l,4-diazepin triacetat); SarAr (l-N-(4-aminobenzyl)- 3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo[6.6.6]-eicosan-l,8-diamin) und Salze davon, (NFh SAR (l,8-diamino-3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo[6.6.6]icosane) und Salze und Derivate davon, Aminothiole und deren Derivate; und/oder

- die erste, zweite und dritte Trägersubstanz unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Wasser, 0,45% wässrige NaCI-Lösung, 0,9% wässrige NaCI- Lösung, Ringerlösung (Ringer Lactat), 5% wässrige Dextroselösung und wässrige Alkohollösungen.

Das erfindungsgemäße Smart-Drug-Delivery-System und pharmazeutische Kit ermöglichen eine neue Form der zielgerichteten dualen Krebsbehandlung mit einer diagnostischen und therapeutischen Modalität (siehe Fig. 2 und Tabelle 1). Dabei wird bzw. werden dasselbe Wirksstoffkonjugat oder zwei biologisch und pharmakokinetisch analoge Wirkstoffkonjugate in niedriger und erhöhter Dosis verwendet.

Die Struktur erfindungsgemäßer Verbindungen bzw. Wirkstoffkonjugate ist schematisch in den Figuren la bis ld dargestellt, wobei CT eine cytotoxische Gruppe; L, LI jeweils eine spaltbare Linkergruppe; Chel einen Chelator für die Markierung mit einem Radioisotop; S eine spaltbare Linker- oder Spacergruppe; Sl, S2 jeweils eine Spacergruppe und TV einen biologischen Targetingvektor bezeichnet.

Die durch die Erfindung bereitgestellten diagnostischen und therapeutischen Modalitäten sind in Fig. 2 anhand von fünf membranständigen Rezeptoren (i) bis (v) veranschaulicht, wobei die Bezeichnungen CT, L, LI, Chel, S, Sl, S2 und TV die gleiche Bedeutung haben, wie vorstehend im Zusammenhang mit Fig. la bis ld erläutert. Den in Fig. 2 dargestellten Rezeptoren (i)-(v) sind in Tabelle 1 die diagnostischen und therapeutischen Modalitäten (A), (Bl), (B2) und (C), (Dl), (D2) jeweils in Verbindung mit einer qualitativen Dosisangabe zugeordnet.

Tabelle 1: Diagnostische und therapeutische Modalitäten gemäß Fig. 1

Bei den in Tabelle 1 aufgeführten Modalitäten (A), (Bl), (B2) wird dasselbe Wirkstoff konjugat mit Radioisotop (A, B2) und ohne Radioisotop (Bl) eingesetzt. Dabei ist eine Krebszelle nach Endocytose und Spaltung des Linkers LI bei der Modalität (Bl) lediglich dem cytotoxischen Wirkstoff CT und bei der Modalität (B2) dem cytotoxischen Wirkstoff CT und simultan der von dem Radioisotop emittierten Strahlung ausgesetzt.

Bei der Modalität (D2) werden zwei analoge Wirkstoffkonjugate mit Radioisotop (iv) und ohne Radioisotop (v) benutzt.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Targetingvektoren TV weisen eine hohe Bindungsaffinität zu einem membranständigen Rezeptor auf. Bei den in der vorliegenden Erfindung adressierten Rezeptoren handelt es sich um Proteine, wie beispielsweise prostata spezifisches Membranantigen (PSMA), Fibroblasten-Aktivierungs-Protein (FAP) oder Farnesyl-Pyrophosphat-Synthase (FPPS), die bei verschiedenen Krebserkrankungen auf der Hülle von Tumorzellen überexprimiert sind.

Die Spacer S, Sl, S2 binden den Chelator Chel an den Targetingvektor TV und fungieren zugleich als Abstandshalter und chemischer Modulator, der eine durch den Chelator Chel ggf. verursachte Beeinträchtigung der Bindungsaffinität des Targetingvektors TV, beispielsweise aufgrund sterischer Hinderung, kompensiert.

In analoger Weise verbinden die Linker L und LI, sowie ggf. ein zu L identischer Spacer S den Chelator Chel mit dem cytotoxischen Wirkstoff CT bzw. mit dem Targetingvektor TV und modulieren die pharmakokinetischen Eigenschaften. Zahlreiche cytotoxische Wirkstoffe sind hydrophob und im Blutserum schlecht löslich. Eine stark ausgeprägte Lipophilie eines cytotoxischen Wirkstoffs CT kann unter anderem mithilfe eines Polyethylenglykol (PEG) enthaltenden Linkers L, LI wirkungsvoll kompensiert werden. Dieser Ansatz ist im Stand der Technik unter dem Begriff "PEGylierung" bekannt.

Im Weiteren enthalten die Linker L und LI eine Gruppe Clv, die nach Aufnahme in eine Tumorzelle (Endocytose) durch, in späten Endosomen oder in Lysosomen enthaltene Enzyme oder Moleküle, wie beispielsweise Glutathion (y-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin, abgekürzt GSH) gespalten wird und den cytotoxischen Wirkstoff CT freisetzt.

Die Linker L, LI sind maßgeblich für die pharmakokinetischen Eigenschaften und verkörpern einen zentralen Ansatzpunkt für die Erfindung, die auf einem identischen bzw. zwei biologisch analogen Wirkstoffkonjugaten für die duale nuklearmedizinische und cytotoxische Behandlung beruht und eine direkte Translation von der Diagnose in die Therapie ermöglicht.

Im Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein pharmazeutisches Kit für zielgerichtete, simultan nuklearmedizinisch-cytotoxische Krebsbehandlung gemäß den oben erläuterten Modalitäten (B2) und (D2). Zunächst wird anhand eines für molekulare Bildgebung mittels PET oder SPECT geeignetes Radioisotop ermittelt, ob der Targetingvektor des Smart-Drug- Delivery-Systems an ein molekulares Target bindet, das von dem Tumorgewebe des Patienten in ausreichender Quantität exprimiert wird. Beispielsweise wird ein Smart-Drug- Delivery-System mit einem PSMA-Inhibitor als Targetingvektor bei Patienten mit Prostatakarzinom eingesetzt und muss eine ausreichend hohe und selektive Anreicherung am Primärtumor, in Metastasen des Lymphsystems, der Viszera oder Knochen zeigen.

Hierbei dient das Smart-Drug-Delivery-System (SDDS) als prä-therapeutisches Diagnostikum und indiziert die Eignung der Therapie für den jeweiligen Patienten. Da es sich um das gleiche SDDS handelt, sind identische pharmakokinetische und pharmakodynamische Eigenschaften gewährleistet. Die Ansprechquote des Patienten kann dabei mit hoher Sicherheit prognostiziert werden. Bekannte SDDS enthalten lediglich ein Zytostatikum, das an einen Targetingvektor gekoppelt ist. Daher wird bei der Verwendung bekannter SDDS vor dem Therapiebeginn die Eignung für den Patienten nicht ermittelt. Allenfalls wird die Targetexpression des Patienten mittels eines von dem SDDS verschiedenen PET-Radiotracer bestimmt. Das mittels eines separaten PET-Tracers gemessene PET-Signal ist jedoch nicht repräsentativ für die Bindung und Pharmakokinetik des SDDS. Letztere ist jedoch ausschlag gebend für die Wirksamkeit und die Durchdringung systemischer Barrieren sowie die Dosisbemessung. Dies gilt in besonderem Maße für metastasierende Prostatakarzinome, bei denen 11,8 % der betroffenen Patienten eine Mutation in DNA-Reparaturgenen aufweisen (cf. C. C. Pritchard, J. Mateo, M. F. Walsh, N. De Sarkar, W. Abida, H. Beltran, A. Garofalo, R. Gulati, S. Carreira, R. Eeles, O. Elemento, M. A. Rubin et al.; Inherited DNA-Repair Gene Mutations in Men with Metastatic Prostate Cancer, N Engl J Med 2016; 375:443-453; doi:

10.1056/NEJMoa 1603144; C. Kratochwil, F. L. Giesel, C.-P. Heussei, D. Kazdal, V. Endris, C. Nientiedt, F. Bruchertseifer, M. Kippenberger, H. Rathke, J. Leichsenring, M. Hohenfellner, A. Morgenstern, U. Haberkorn, S. Duensing, and A. Stenzinger; Patients Resistant Against PSMA-Targeting a-Radiation Therapy Offen Harbor Mutations in DNA Damage-Repair- Associated Genes; doi: 10.2967/jnumed.119.234559). Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen wird prä-therapeutisch festgestellt, ob die Therapie für den Patienten geeignet ist, sowohl in Bezug auf die Targetexpression wie auch das pharmakokinetische Profil. In Verbindung mit radiosensitivierenden PARPi, wie insbesondere dem vorstehend beschriebenen Rucaparib ergibt sich ein effektiver therapeutischer Ansatz. Zur Verwendung von Rucaparib in Kombination mit Radiotherapie liegen zahlreiche Studien vor.

Die Therapie kann je nach Indikation ohne oder mit radioaktiver Markierung des Smart-Drug- Delivery-Systems, d.h. rein cytotoxisch oder nuklearmedizinisch-cytotoxisch erfolgen. Im letztgenannten Fall werden aufgrund der lokalisiert hohen Strahlungsdosis reaktive Radikale (reactive oxygen species: ROS) gebildet und für die Resistenz (multidrug resistance: MDR) von Krebszellen maßgebliche ABC-Transporterkanäle (ATP binding cassette: ABC), wie beispielsweise P-gp oder Ptchl inaktiviert und die Ausschleusung (Exocytose) der cytotoxischen Verbindung CT aus der Krebszelle gehemmt.

Cytotoxische Verbindung CT (Zytostatika)

Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von cytotoxischen Wirkstoffen für die Krebs behandlung bekannt.

Beispielsweise hemmen Rucaparib sowie einige seiner Derivate das Enzym PARP (Poly-ADP- Ribose Polymerase), das an der Reparatur von Einzelstrangbrüchen (ESB) der DNA beteiligt ist. Die Wirkung von PARP-Inhibitoren beruht auf synthetisch induzierter Letalität. In einer gesunden Zelle mit intakter DNA-Reparatur führt PARP-Hemmung nicht zum Zelltod, weil aus ESB erfolgte Doppelstrangbrüche (DSB) der DNA durch homologe Rekombination (HR) repariert werden. In HR-defizienten Zellen führt die PARP-Hemmung hingegen zum Zelltod, da DSB in der Zelle akkumulieren und Apoptose-Moleküle rekrutieren. Die beiden Gene BRCA1 und BRCA2 (breast cancer gene) sind maßgeblich an der HR beteiligt. Eine Mutation in diesen Genen führt zu einer Störung der DNA-Reparatur und erhöht das Risiko für Tumorbildung.

Bei 20-25 % der Patienten mit mCRPC (metastasiertem kastrationsresistentem Prostata karzinom) sind HR-Gene, darunter BRCA1/2 mutiert. Diese Patienten profitieren von einer Behandlung mit PARP-Inhibitoren, die eine hohe Tumorspezifizität aufweisen. Auch kann BRCA-Deffizienz pharmazeutisch induziert werden. Der Wirkstoff Enzalutamid, ein Inhibitor des Androgenrezeptor-Signalweges kann eine Down-Regulierung der BRCA-Gene bewirken. Nach Verabreichung von Enzalutamid können auch Patienten ohne BRCA-Mutation von der selektiven Tumortoxizität von Rucaparib profitieren. Das Patientenkollektiv für PARP- Therapie kann somit erweitert werden.

Docetaxel und Paclitaxel gehören zur Gruppe der Taxane. Taxane hemmen die Depolymerisierung von Mikrotubuli und hemmen die Mitose (Zellteilung).

Temozolomid ist ein galenisch adaptierter Wirkstoff (Prodrug), der nach Metabolisierung und spontaner hydrolytischer Abspaltung Methylhydrazin (CH3(NH)NH2) freisetzt, welches DNA-Basen methyliert und Apoptose induziert. Monomethyl-Auristatin E (MMAE) ist ein antineoplastischer Wirkstoff, der den Zellzyklus durch Hemmung derTubulinpolymerisierung unterbricht und somit zur Apoptose führt.

In Tabelle 2 sind erfindungsgemäß verwendete Zytostatika wiedergegeben.

Tabelle 2: Erfindungsgemäß verwendete cytotoxische Wirkstoffe (CT)

*Peptid mit Aminosäuren-Sequenz

Chelator Chel für die Markierung mit einem Radioisotop

Der Chelator Chel ist vorgesehen für die Markierung des erfindungsgemäßen Wirkstoff ko njugats mit einem Radioisotop gewählt aus der Gruppe, umfassend ⁴⁴ Sc, ⁴⁷ Sc, 5Sm, ¹⁵⁹ Gd, ¹⁴⁹ Tb, Ac und ²³² Th. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Chelatoren für die Komplexierung der vorstehenden Radioisotope bekannt. In Schema 6 sind Beispiele erfindungsgemäß verwendeter Chelatoren wiedergegeben.

Stabilisierte Derivate von DTPA

(NH ₂ ) ₂ SAR

Schema 6: Erfindungsgemäß verwendete Chelatoren Für die nuklearmedizinische Diagnose (Modalität (A), (C)) und die simultan nuklear- medizinisch-cytotoxische Theranostik (Modalität (B2), (D2)) werden insbesondere die Radioisotope ⁶⁸ Ga bzw. ¹⁷⁷ Lu verwendet. Der für die Komplexierung von ⁶⁸ Ga wie auch ¹⁷⁷ Lu gut geeignete Chelator DOTA ist erfindungsgemäß bevorzugt. Für die Komplexierung von ¹⁷⁷ Lu wird vorzugsweise der Chelator H ₂ pypa verwendet. Die Synthese von FUpypa ist in Schema 7 gezeigt.

(i) DCC, tert-butyl alcohol, DCM, RT, 12 h, 50%; (ii) NaBH ₄ , dry MeOH, RT, 3-4 h, 72%;

(iii) Se0 ₂ , 1,4-Dioxan, 100 °C, 12 h, 56%; (iv) 1. trock. MeOH, RT, 1 h; 2. NaBH ₃ CN, trock. MeOH, 3 h, 70%; (v) NaBH ₄ , trock. MeOH, RT, 12 h, 92%; (vi) PBr3, trock. CHCb/ACN, 60 °C, 18 h, 70%; (vii) K ₂ C0 ₃ , trock. ACN, 60 °C, 24 h, 70%; (viii) TFA/DCM, RT, 12 h, 70%.

Schema 7: Synthese des ¹⁷⁷ Lu-Chelators H ₄ pypa

Amidkupplung

In der Erfindung werden funktionelle Gruppen, wie der Chelator Chel, die cytotoxische Verbindung CT, der Targetingvektor TV, die Linker L, LI und die Spacer S, Sl, S2 vorzugsweise mittels einer Amidkupplungsreaktion konjugiert. In der medizinischen Chemie ist die das Rückgrat von Proteinen bildende Amidkupplung die am häufigsten eingesetzte Reaktion. Ein generisches Beispiel einer Amidkupplung ist in Schema 8 gezeigt.

Schema 8: Amidkupplung

Aufgrund eines praktisch unbegrenzten Satzes leicht verfügbarer Carbonsäure- und Aminderivate eröffnen Amidkupplungsstrategien einen einfachen Weg für die Synthese neuer Verbindungen. Dem Fachmann sind zahlreiche Reagenzien und Protokolle für Amidkupplungen bekannt. Die gebräuchlichste Amidkupplungsstrategie beruht auf der Kondensation einer Carbonsäure mit einem Amin. Die Carbonsäure wird hierfür in der Regel aktiviert. Vor der Aktivierung werden verbleibende funktionelle Gruppen geschützt. Die Reaktion erfolgt in zwei Schritten entweder in einem Reaktionsmedium (single pot) unter direkter Umsetzung der aktivierten Carbonsäure oder in zwei Schritten unter Isolierung einer aktivierten "gefangenen" Carbonsäure und Umsetzung mit einem Amin.

Hierbei reagiert das Carboxylat mit einem Kupplungsreagenz unter Bildung eines reaktiven Zwischenprodukts, das isoliert oder direkt mit einem Amin umgesetzt werden kann. Für die Carbonsäureaktivierung stehen zahlreiche Reagenzien zur Verfügung, wie Säurehalogenide (Chlorid, Fluorid), Azide, Anhydride oder Carbodiimide. Zusätzlich können als reaktive Zwischenprodukte Ester wie Pentafluorphenyl- oder Hydroxysuccin-Imidoester gebildet werden. Aus Acylchloriden oder Aziden abgeleitete Zwischenprodukte sind hochreaktiv. Harsche Reaktionsbedingungen und hohe Reaktivität stehen jedoch häufig einer Anwendung für empfindliche Substrate oder Aminosäuren entgegen. Demgegenüber erschließen Amidkupplungsstrategien, die Carbodiimide wie DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) oder DIC (Diisopropylcarbodiimid) nutzen, ein breites Anwendungsspektrum. Häufig, insbesondere bei der Festphasensynthese werden Additive verwendet, um die Reaktionseffizienz zu verbessern. Aminiumsalze sind hocheffiziente Peptidkupplungsreagenzien mit kurzen Reaktionszeiten und minimaler Racemisierung. Mit einigen Additiven, wie beispielsweise HOBt kann die Racemisierung sogar vollständig vermieden werden. Aminiumreagenzien werden äquimolar zur Carbonsäure eingesetzt, um eine überschießende Reaktion mit dem freien Amin des Peptids zu verhindern. Phosphoniumsalze reagieren mit Carboxylat, was in der Regel zwei Äquivalente einer Base, wie beispielsweise DIEA erfordert. Ein wesentlicher Vorteil von Phosphoniumsalzen gegenüber Iminiumreagenzien besteht darin, dass Phosphonium nicht mit der freien Aminogruppe der Aminkomponente reagiert. Dies ermöglicht Kupplungen in äquimolarem Verhältnis von Säure und Amin und hilft, die intramolekularer Zyklisierung linearer Peptide sowie überschüssigen Einsatz teurer Amin komponenten zu vermeiden.

Eine umfangreiche Zusammenstellung von Reaktionsstrategien und Reagenzien für Amidkupplungen findet sich in den Übersichtsartikeln: - Analysis ofPast and Present Synthetic Methodologies on Medicinal Chemistry: Where Have All the New Reactions Gone?· D. G. Brown, J. Boström; J. Med. Chem. 2016, 59, 4443-4458;

- Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup; A. El-Faham, F. Albericio; Chem.

Rev. 2011, 111, 6557-6602;

- Rethinking amide bond synthesis; V. R. Pattabiraman, J. W. Bode; Nature, Vol. 480 (2011) 22/29;

- Amide bond formation: beyond the myth of coupling reagents; E. Valeur, M. Bradley; Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 606-631.

Zahlreiche der erfindungsgemäß verwendeten Chelatoren, wie insbesondere DOTA, weisen eine oder mehrere Carboxy- oder Amidgruppen auf. Dementsprechend können diese Chelatoren mithilfe einer der im Stand der Technik bekannten Amidkupplungsstrategien auf einfache Weise mit den Linkern L, LI und/oder Spacern S, Sl, S2 konjugiert werden.

Die in den Linkern L, LI enthaltene spaltbare Gruppe Clv gewährleistet die tumorspezifische Freisetzung des cytotoxischen Wirkstoffs CT und ist im systemischen Kreislauf, d.h. im Blutplasma stabil. Nach Aufnahme (Endocytose) in eine Krebszelle wird die spaltbare Gruppe Clv gespalten und der cytotoxische Wirkstoff CT freigesetzt.

Nachfolgend sind einige Beispiele für spaltbaren Gruppen Clv wiedergegeben.

In Schema 9 ist eine spaltbare Gruppe bzw. ein Linker des Typs p-Aminobenzoesäure-Valin- Citrullin dargestellt, der durch intrazelluläre Proteasen, insbesondere der Cathepsin-Familie, gespalten wird. Cathepsin-Proteasen sind in Prostatatumorzellen überexprimiert.

Schema 9: p-Aminobenzoesäure-Valin-Citrullin-Linker/Gruppe

Schema 10 zeigt eine spaltbare Gruppe bzw. einen Linker des Typs p-Aminobenzoesäure- Glutamat-Valin-Citrullin, der ebenfalls durch Cathepsine gespalten wird und sich durch erhöhte Stabilität in Maus-Serum auszeichnet, was für präklinische Studien einen erheblichen Vorteil bedeutet.

Schema 10: p-Aminobenzoesäure-Glutamat-Valin-Citrullin-Linker/Gruppe

Schema 11 zeigt eine spaltbare Hydrazon-Gruppe/Linker, die in saurem Millieu (pH < 6,2) - wie in Tumorgewebe vorhanden - hydrolysiert.

Zytostatikum

Schema 11: Hydrazon-Gruppe/Linker

Die in Schema 12 gezeigten Disulfid-Gruppen/Linker werden durch lysosomales Glutathion (GSH: g-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin) im Rahmen einer Disulfidaustauschreaktion gespalten.

Schema 12: Disulfid-Gruppen/Linker

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Begriffe verwendet, deren Bedeutung nachfolgend erläutert ist.

Theranostik: Diagnostik und Therapie von Krebserkrankungen unter Verwendung nuklearmedizinischer Pharmazeutika.

Tracer: Synthetisch hergestellte, radioaktiv markierte Substanz, die in sehr geringer

Stoffmenge eingesetzt und im Organismus umgesetzt wird, ohne den Metabolismus zu beeinflussen.

Markierungsvorläufer (Precursor): Chemische Verbindung, die einen Chelator oder eine funkioneile Gruppe für die Markierung mit einem Radioisotop enthält. Pharmazeutisches Kit: Ein- oder mehrteilige pharmazeutische Darreichungsform, die ggf. einen oder mehrere Behälter umfasst mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die ggf. in einer oder mehreren Trägersubstanzen enthalten, gelöst, suspendiert oder emulgiert sind.

Behälter: Vial, Durchstechflasche, Injektionsfläschen oder Ampulle aus Glas, Metall oder

Kunststoff für klinische Anwendungen.

Trägersubstanz: Flüssiger oder fester Stoff, der als galenischer Träger für einen pharmazeutischen Wirkstoff dient und in der Regel keine pharmazeutische Aktivität aufweist.

Smart-Drug-Delivery-System (SDDS): Chemische Verbindung, die einen cytotoxischen Wirkstoff, einen spaltbaren Linker zur Freisetzung des cytotoxischen Wirkstoffes und einen Targetingvektor für die Anreicherung in Tumorgewebe sowie ggf. einen weiteren Linker oder Spacer und einen Chelator für die Markierung mit einem Radioisotop umfasst.

Rest eines Chelators: Chelator als Teil einer chemischen Verbindung, insbesondere als Teil einer SDDS-Verbindung.

Target: Biologische Zielstruktur, insbesondere (membrangebundener) Rezeptor, Protein,

Enzym oder Antikörper im lebenden Organismus, an die ein Targetingvektor bindet.

Targetingvektor: Chemische Gruppe bzw. Rest, der als Ligand, Agonist, Antagonist oder

Inhibitor für ein Target fungiert und eine hohe Bindungsaffinität zu diesem Target aufweist.

Radiopharmakon: Radioaktiv markierte chemische Verbindung bzw. mit einem

Radioisotop komplexierter Markierungvorläufer für nuklearmedizinische Diagnostik oder Theranostik.

Linker: Struktureinheit, Gruppe oder Rest, der eine biologisch spaltbare Untergruppe bzw. Untereinheit umfasst und über den ein Targetingvektor, ein cytotoxischer Wirkstoff oder ein Chelator an eine weitere Struktureinheit gebunden ist.

Spaltbare Gruppe: Struktureinheit, Gruppe oder Rest, der durch im Zytoplasma, in Endosomen oder Lysosomen enthaltene Enzyme oder Moleküle gespalten wird.

Spacer: Struktureinheit, die als Abstandshalter zwischen einem Targetingvektor und einem Chelator fungiert und einer sterischen Hinderung des Targetingvektors durch den Chelator entgegenwirkt. In bestimmten zweckmäßigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Spacer eine spaltbare Gruppe und ist als Linker ausgebildet.

Wirkstoffkonjugat: Verbindung, die einen cytotoxischen Wirkstoff, einen Targetingvektor und einen spaltbaren Linker umfasst. Duales Wirkstoffkonjugat: Verbindung, die einen cytotoxischen Wirkstoff, einen Targetingvektor, einen Chelator, einen Linker und einen Spacer umfasst.

Beispiele

Beispiel 1: Duale Wirkstoffkonjugate

Schemata IS bis 22 zeigen Beispiele erfindungsgemäßer dualer Wirkstoffkonjugate gemäß Fig. la, die einen Targetingvektor, einen Chelator für die Markierung mit einem Radioisotop und einen cytotoxischen Wirkstoff umfassen.

Quadratsäure

Schema 13: Temozolomid.ValCit.QS.DOTAGA.QS.K.EuE (Zytostatikum: Temozolomid; Spaltbarer Linker: ValCit; Chelator: DOTAGA; Targetvektor: EuE.)

Schema 14: Rucaparib.ValCit.QS.DOTAGA.QS.K.EuE

Schema 15: Rucaparib.GluValCit.QS.DOTAGA.617.KuE

Schema 16: Docetaxel.Disulfid.QS.DOTAGA.617.KuE

Schema 17: Temozolomid.Hydrazon.QS.DOTAGA.QS.KuE

Schema 19: Rucaparib.ValCit.QS.DOTAGA.QS.FAPi

Schema 21: Docetaxel.GluValCit.QS.DOTAGA.QS. Pamidronat

Schema 22: Temozolomid.Disulfid.QS.DOTAGA.Zoledronat

Beispiel 2: Duale Wirkstoffkonjugate nach Fig lb

Schemata 23, 24, 25 und 26 zeigen Beispiele erfindungsgemäßer dualer Wirkstoffkonjugate nach Fig.lb, die einen Targetingvektor, einen Chelator für die Markierung mit einem Radioisotop, einen spaltbaren Linker und einen cytotoxischen Wirkstoff umfassen.

Schema 23: Docetaxel.ValCit.QS.Lys.(AAZTA).(617.KuE)

Schema 25: Rucaparib.ValCit.Lys.(DOTAGA). (SA. Pamidronat)

Schema 26: MMAE.VC.QS.DOTAGA 617.KuE

Beispiel 3: Wirkstoffkoniungate nach Fig. Id

Schemata 27, 28, 29 und 30 zeigen Beispiele erfindungsgemäßer Wirkstoffkonjugate nach Fig.ld, die einen Targetingvektor, einen spaltbaren Linker und einen cytotoxischen Wirkstoff umfassen.

Schema 28: Temozolomid.Disulfid.QS.Zoledronat

Schema 30: MMAE.ValCit.QS.617.KuE Beispiel 4: Synthesestrategie für PSMA-Markierungsvorläufer

Bei der Synthese der erfindungsgemäßen Wirkstoffkonjugate werden vorzugsweise Quadratsäure-Diester eingesetzt. Dadurch ist eine Vielzahl, zum Teil sehr komplexer Wirkstoff ko njugate mittels einfacher Reaktionen darstellbar. Quadratsäure-Diester zeichnen sich durch ihre selektive Reaktivität mit Aminen aus, so dass bei der Kupplung von Chelatoren, Linkern, Spacern und Targetingvektoren keine Schutzgruppen benötigt werden. Zudem ist die Kupplungsreaktion über den pH-Wert steuerbar.

Zunächst wird ein Targetingvektor für PSMA synthetisiert (siehe Schema Sla) und nach Aufreinigung in wässrigem Medium bei pH = 7 mit Quadratsäurediester umgesetzt zu einem Precursor für die Kupplung mit einem Chelator (siehe Schema 32). Alternativ lässt sich die Kupplung auch in einem organischem Medium mit Triethylamin als Base durchführen.

Schema 31a: Synthese QS-KuE Precursor

Als Targetvektor für PSMA wird z.B. der PSMA-Inhibitor L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) mittels eines bekannten Verfahrens synthetisiert (cf. Schema 31b). Hierbei wird an eine Festphase, insbesondere ein Polymerharz gebundenes und mit tert-Butyloxycarbonyl (tert- Butyl) geschütztes Lysin mit zweifach tert-Butyl-geschützter Glutaminsäure umgesetzt. Nach Aktivierung der geschützten Glutaminsäure durch Triphosgen und der Kopplung an das festphasengebundene Lysin wird L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) mittels TFA abgespalten und zugleich vollständig entschützt. Das Produkt kann anschließend mittels semipräparativer HPLC von freiem Lysin mit einer Ausbeute von 71 % getrennt werden.

Schema 31b: Festphasensynthese des PSMA-Inhibitors KuE; (a) DIPEA, Triphosgen, DCM 0 °C, 4h; (b) H-Lys(tBoc)-2CT-Polystyrol Festphase, DCM, RT, 16h; (c) TFA, RT, 71%.

Der PSMA-Inhibitor KuE (1) kann dann mittels Quadratsäurediethylester als Kupplungsreagenz an einen Markierungsvorläufer gekoppelt werden (cf. Schema 32). Die Kopplung von KuE (1) an Quadratsäurediester erfolgt in 0,5 M Phosphatpuffer bei einem pH- Wert von pH 7. Nach Zugabe beider Edukte muss der pH-Wert mit Natronlauge (1 M) nachjustiert werden, da die Pufferkapazität des Phosphatpuffers nicht ausreichend ist. Bei pH 7 erfolgt die einfache Amidierung der Säure bei Raumtemperatur mit kurzer Reaktionszeit. KuE-QS (2) wird nach HPLC -Aufreinigung mit einer Gesamtausbeute von 16 % erhalten.

Schema 32: Kupplung von KuE an Quadratsäure; (d) 0,5 M Phosphat puffer pH 7, RT, 16h, 23%.

Der so erhaltene KuE-Quadratsäuremonoester ist lagerbar und kann als Baustein (building block) für weitere Synthesen verwendet werden. Beispiel 5: Festphasen-basierte Synthese der KuE-Einheit und des PSMA-617 Linkers

Die Konjugation des Glutamat-Harnstoff-Lysin-Bindungsmotivs KuE mit einer aromatischen Linkereinheit erfolgte nach einer von Benesova et al. (Linker Modification Strategies To Control the Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Targeting and Pharmacokinetic Properties of DOTA-Conjugated PSMA Inhibitors; J Med Chem, 2016, 59, 1761-1775) beschriebenen Festphasen-Peptid-Synthese. Die von Benesova et al. angegebene Synthese wurde geringfügig abgewandelt (cf. Schema 33).

Schema 33.1: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;

(a) Triphosgen, DIPEA, DCM;

Schema 33.2: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker; (b) 50% Piperidin in DMF; (c) Verbindung (I) in DCM;

Schema 33.3: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;

(d) Tetrakis(triphenyl)palladium und Morpholin in DCM;

(e) Fmoc-3-(2-naphthyl)-L-alanin, HBTU und DIPEA in DMF;

Schema 33.4: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;

(f) 50% Piperidin in DMF, Fmoc-4-Amc-OH, HBTU und DIPEA in DMF;

(g) 50% Piperidin in DMF.

Beispiel 6: Synthese des kopplungsfähigen DOTAGA-Chelator und seine Kopplung an die

PSMA-617-Targetvektor-Linker-Einheit

Die Synthese erfolgt ausgehend vom kommerziell erhältlichen D02A(tBu)-GABz, welches am sekundären Amin mit einer Boc-geschützten Aminogruppe funktionalisiert wird (cf. Schema 34). Dies ermöglicht die spätere Einführung der Zytostatikum-Linker-Einheit.

Schema 34: Synthese des kupplungsfähigen DOTAGA-Chelators.

Die Benzylschutzgruppe der Glutarsäure-Seitenkette des DOTAGA(COOtBu)3(NHBoc)-GABz 4 wird reduktiv entfernt, um die Kupplung an den PSMA-Targetvektor über einen Linker zu ermöglichen.

Daraufhin wird das Linker-PSMA-Konjugat mittels Amidkupplung an den Chelator 6 gekuppelt.

Schema 35: Kupplung des Chelators 6 an die Linker PSMA-617.KuE-Einheit.

Die Kupplung des Chelators 6 an den KuE-gebundenen Linker ist in Schema 35 beschrieben. Das durch die Amidkupplung erhaltene geschützte PSMA617-Derivat 7 wird mit Hilfe von Trifluoressigsäure (TFA) entschützt und von der Festphase gelöst. Die Gesamtausbeute der zweistufigen Synthese betrug nach HPLC -Aufreinigung 6 %.

Beispiel 7: Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung MMAE.ValCit.QS.617.KuE

MMAE.ValCit.QS.617.KuE

Schema 36: Synthese von MMAE.ValCit.QS.617.KuE

Für die Synthese der Verbindung MMAE.ValCit.QS.617.KuE wird von kommerziell erhältlichem MMAE.ValCit ausgegangen und bei einem pH von 7 in Phosphatpuffer (0,5 M) und DMSO-Zusatz an Quadratsäurediethylester gekoppelt (cf. Schema 36). Anschließend erfolgt die Festphasen-basierte Kopplung der MMAE.ValCit. QS-Einheit and die 617. KuE- Linker-Targetvektor-Einheit in Ethanol mit Zusatz von 2 % Triethylamin. Nach HPLC- Aufreinigung betrug die Ausbeute der Synthese 43 %. Beispiel 8: Radiomarkierung

Für die Radiomarkierung der PSMA-Markierungsvorläufer wurde ⁶⁸ Ga mit 0,05 M HCl von einem ITG Ge/Ga-Generator eluiert und mittels wässriger Ethanol-Elution über eine Kationentauschersäule aufbereitet. Die Radiomarkierung erfolgt je nach Chelator bei pH- Werten zwischen 3,5 und 5,5 und Temperaturen zwischen 25°C und 95°C. Der Reaktions verlauf wurde mittels HPLC und IPTC aufgezeichnet, um die kinetischen Parameter der Reaktion zu ermitteln.

Beispiel 9: Quadratsäure als Komplexierungshelfer

Für die klinische Anwendung ist es sehr wichtig, dass die Komplexierung bei niedriger Temperatur effizient erfolgt. Quadratsäuren komplexieren freie Metalle und können somit das Chelatorzentrum vor unspezifischer Koordination schützen. Dieser Effekt konnte bei der Radiomarkierung von TRAP.QS bei unterschiedlichen Temperaturen beobachtet werden. TRAP komplexiert bei Raumtemperatur quantitativ. Demgegenüber wurde unter gleichen Bedingungen bei TRAP.QS ein RCY-Wert von lediglich 50% gemessen. Wird die Temperatur erhöht, so steigt die Markierungsausbeute von TRAP.QS auf quantitative Werte an. Hieran zeigt sich der Einfluss, den die Quadratsäure auf die Komplexierung hat. Dieser in Schema 37 illustrierte Effekt ermöglicht die stabile Komplexierung von Metallen mit hoher Koordinationszahl, wie beispielsweise Zirkonium mithilfe des Chelators AAZTA.QS.

Schema 37: Koordination mittels AAZTA.QS

In zweckmäßigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Kits enthalten die erste, zweite und/oder dritte Verbindung einen oder mehrere Quadratsäurereste QS. Durch die Verwendung von Quadratsäure-Diester können Kupplungsreaktionen erheblich vereinfacht werden. Beispiel 10a: Quadratsäure als Affinitätspromoter

Zudem haben die Erfinder überraschend gefunden, dass der Einbau von Quadratsäuregruppen QS die pharmakologischen Eigenschaften verbessert und die Bindungsaffinität von PSMA-spezifischen Targetingvektoren erhöht. Die Erfinder vermuten, dass die Bindungsaffinität durch ionische Wechselwirkung der Quadratsäuregruppe QS mit ARG463 erhöht wird. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Dockingstudien durchgeführt. Fig. 3 und 4 zeigen die aufgrund der Dockingstudien favorisierten Anordnungen. ARG463 befindet sich im sogenannten Arginin-Patch von PSMA. Ein weiterer putativer Wirkmechanismus beruht auf H-Brücken zu Trp541, welche die Affinität zur Arene- Bindungstasche von PSMA erhöhen.

Die Quadratsäuregruppe interagiert mit Arg463 in der Arginin-reichen Region (dunkler Bereich) sowie mit Trp541 in der Arene-Bindungstasche. Die gestrichelten hellen Linien stellen die Distanz in Ä dar. Die in der aktiven Bindungstasche befindlichen Zink-Ionen sind als Kugeln dargestellt. Die Strukturdaten basieren auf der mittels Röntgenbeugung bestimmten Struktur von PSMA im Komplex mit PSMA 1007 (PDB 505T).

Fig. 5 zeigt den putativen Bindungsmodus von AAZTA.QS.KuE in der Bindungstasche von PSMA. Der AAZTA-Chelator ragt aus der PSMA Tasche heraus. Der QS-Linker interagiert mit dem hydrophoben Teil der Bindungstasche. Das Bindungsmotif befindet sich im pharmakophoren Teil derTasche und wird von den beiden Zinkionen komplexiert. In Fig. 6 ist der putative Bindungsmodus von DATA.QS.EuE dargestellt. Das EuE-Bindungsmotif bedingt eine Verlängerung des Linkers und eine damit einhergehende räumliche Verschiebung des QS-Linkers, welche die elektrostatische Wechselwirkung mit den Aminosäuren der Bindungstasche beeinträchtigt. Nachfolgende in v/tro-Assays bestätigten die Ergebnisse der Dockinganalysen.

Beispiel 10b: Quadratsäure als Modulator der Ausscheidung

Schema 38 zeigt ein Beispiel eines Wirkstoffkonjugats bzw. Markierungsvorläufer mit einem Targetingvektor für PSMA und einer mit dem Targetingvektor konjugierten Quadratsäuregruppe.

Schema 38: PSMA.QS.DOTA Markierungsvorläufer

Die Konjugation von Quadratsäure (QS) an PSMA-Tracer mindert die Anreicherung in den Nieren und die damit verbundene Überlagerung bzw. Störung des PET-Signals der benachbarten Prostata, was bei der bildgebenden Diagnose von Prostatakarzinomen mittels PET die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit maßgeblich verbessert. Fig. 7a und 7b zeigen mRET-Aufnahmen (60 min p.i.) von [ ⁶⁸ Ga]Ga.DOTA.QS.PSMA (A), [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-ll (B) und [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-617 (C) sowie ein Diagramm mit SUV-Werten (Standard Uptake Value: SUV) für Tumorgewebe, Nieren und Leber.

Schema 39 zeigt ein weiteres QS-Derivat, das in vivo an Tumor-tragenden Tieren getestet wurde.

Schema 39: DATA.QS.KuE

DATA.QS.KuE wurde mit ⁶⁸ Ga markiert und in vivo an LNCaP-Tumor-tragenden Balb/c Mäusen getestet. Fig. 8 zeigt die Anreicherung von [ ⁶⁸ Ga]-DATA.QS.KuE in den Organen (Biodistribution). Die Selektivität der Bindung wurde mittels kompetitiver Koinjektion des PSMA-Inhibitors PMPA bestimmt. Zum Vergleich ist in Fig. 9 die Biodistribution von [ ⁶⁸ Gaj- PSMA-11 wiedergegeben.

Fig. 10a und 10b zeigen die Maximum-Intensitätsprojektionen aus mRET-Studien mit [ ⁶⁸ Gaj- PSMA-11 und respektive [ ⁶⁸ Ga]-DATA.QS.KuE in LNCaP Tumor-tragenden Balb/c Mäusen.

In Fig. 11a und 11b sind Zeit-Aktivitätskurven von [ ⁶⁸ Ga]-PSMA-ll und respektive [ ⁶⁸ Ga] - DATA.QS.KuE dargestellt. Bei annähernd gleicher Tumoranreicherung zeigt DATA.QS.KuE im Vergleich zu PSMA-11 eine erheblich geringere Nierenexposition bzw. -dosis. Bei der Therapie mit stark ionisierenden Radionukliden, wie bespielsweise ¹⁷⁷ Lu anstelle von ⁶⁸ Ga ermöglicht DATA. QS.KuE eine maßgebliche Reduzierung der Nephrotoxizität.

Beispiel 11a: Evaluation der in vitro PSMA-Bindungsaffinität ausgewählter Verbindungen und

Verbindungsbestandteile

Mittels eines zellbasierten Assays wurde die Affinität der Targetvektor-Linker-Einheiten QS.KuE, QS.K.EuE und KuE mit lipophilem Linker - analog zu PSMA-617 - sowie die Affinität der Teilstrukturen NH ₂ .DOTAGA.6i7.KuE und NH ₂ -DOTAGA. QS.KuE bestimmt. Zusätzlich wurde die PSMA-Affinität der erfindungsgemäß bevorzugten Struktur MMAE.ValCit.QS.617.KuE (siehe SchemaBO) bestimmt.

Für den Assay wurden LNCaP-Zellen in Multiwell-Platten (Merck Millipore Multiscreen™) pipettiert. Die zu analysierenden Verbindungen wurden in steigenden Konzentrationen jeweils mit einer definierten Menge bzw. Konzentration der Referenzverbindung ⁶⁸ Ga[Ga]PSMA-10 mit bekanntem K _d -Wert versetzt und 45 min lang in den Wells mit den LNCaP-Zellen inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurde die zellgebundene Aktivität bestimmt. Anhand der erhaltenen Inhibitionskurven wurden die in Tabelle 1 wiedergegebenen ICso-Werte und K,-Werte berechnet.

Tabelle 3: PSMA-Bindungsaffinitäten

Um die unspezifische Bindung zu bestimmen, wurden alle Verbindungen zudem mit einem Überschuss des PSMA-Inhibitors 2-PMPA (2-(Phosphonomethyl)-pentansäure) versetzt und dem gleichen LNCaP-Assay - wie vorstehend beschrieben - unterzogen.

Sowohl die TV-Linker-Einheiten, als auch die Chelator-TV-Linker-Einheiten weisen eine ähnliche Affinität gegenüber PSMA auf, wie die Referenzverbindung PSMA-617. Demnach führt der Einsatz von QS als Linkereinheit zu einer vergleichbaren Affinität, wie der Einsatz des peptidischen PSMA-617-Linkers. Sowohl die Kopplung an den Chelator DOTAGA, als auch dessen Markierung mit den Radionukliden Gallium-68 und Lutetium-177 führen zu keiner Affinitätsabnahme.

Die Verwendung der Bindungseinheit EuE statt KuE führt zu einer erheblichen Verschlechterung in der PSMA-Affinität. Die Ergebnisse bestätigen die Befunde der Dockingstudien über die ungünstige Orientierung des EuE-Derivats in der PSMA- Bindungstasche.

Die Kopplung des sterisch Anspruchsvollen Zytostatikums MMAE and den ValCit-Linker und die TV-Linker-Einheit QS.617. KuE führt zu einer deutlichen Erniedrigung der Affinität.

Beispiel 7b: Bestimmung der cytotoxischen Wirkung der dimeren Verbindung

MMAE.ValCit.QS.617.KuE in vitro

In einem CellTiter Blue Assay wurden LNCaP-Zellen für 72 Stunden mit der zu untersuchenden Substanz inkubiert und anschließend der ICso-Wert der Verbindung bestimmt. Tabelle 4 zeigt die ICso-Werte der erfindungsgemäß bevorzugten Verbindung MMAE.ValCit.QS.617.KuE (SchemaBO) im Vergleich zum reinen Wirkstoff MMAE.

Tabelle 4: cytotoxische Wirkung in vitro

Die erfindungsgemäße Verbindung MMAE. ValCitQS.617. KuE zeigt zwar in vitro eine etwas geringere Zell-Zytotoxizität, als der reine Wirkstoff MMAE, liegt aber dennoch im unteren nanomolaren Bereich.