Das weibliche Kontrazeptivum, das am häufigsten eingesetzt wird, ist die klassische Pille. Sie besteht aus einem Östrogen-und einem Gestagenanteil. Eine regelmäßige Einnahme führt zur Ovulationshemmung bei der Frau. Das Prinzip dieser Methode ist, daß es durch die Einnahme der Pille zu einer Unterdrückung der endogenen Steroidhormonproduktion im Ovar und somit zu einer Ovulationshemmung kommt. Ein Nachteil ist, daß ein natürlicher Zyklus somit bei der Frau nicht mehr vorhanden ist.

Zudem können in Zusammenhang mit der Einnahme der Pille bei Patientinnen mit Risikopotential Nebenwirkungen wie beispielsweise Brustspannungen, Gewichtszunahmen etc. auftreten.

Prinzipien für die männliche Fertilitätskontrolle sind bisher nur wenige bekannt. Eines der wenigen Prinzipien, das bisher beim Mann erprobt wurde, ist die Verabreichung von Testosteronderivaten. Dadurch kommt es zu einer Unterdrückung der Spermatogenese und somit zur männlichen Infertilität. Diese Methode der Empfängnisverhütung hat jedoch noch viele Nachteile. So dauert es bis zum Eintreten des Empfängnisschutzes ca 70 Tage. Darüber hinaus müssen die Testosteronderivate aufgrund mangelnder oraler Verfügbarkeit injiziert werden.

Durch zahlreiche Untersuchungen ist belegt, daß bei der Frau mit zunehmendem Alter die Fertilität abnimmt. Dies ist unter anderem auf eine schlechtere Qualität der Eizelle, eine erhöhte Abortrate, verstärkte Exposition mit Infektionskeimen (z. B. Chlamydien oder Gonococcen) zurückzuführen. Da sich in den Industrielandern jedoch das Alter der Erstgebährenden immer weiter nach hinten verschiebt, ist es notwendig, Möglichkeiten zur Verbesserung der Fertilitat zu finden. Dieses trifft für die Frau und auch für den Mann zu. Für Paare mit Fertilitätsstörungen stehen heute die Techniken der assistierten Reproduktion zur Verfügung (In vitro Fertilisation (IVF) ; Gamete intrafallopian transfer (GIFT), Intrauterine Insemination). Diese Methoden sind jedoch invasiv und in den meisten Fällen mit einer vorherigen Stimulation der Follikelreifung bei der Frau durch Proteohormone (Follikel-stimulierendes Hormon/FSH) verbunden. Diese kann zu unangenehmen Nebenwirkungen wie Kopfschmerzen oder Schmerzen im Abdomen, im schlimmsten Fall jedoch auch zum sogenannten ovariellen Hyperstimulationssyndrom führen.

Liegt das Problem der Infertilität auf der Seite des Mannes, so steht heute die Technik der Intracytoplasmatischen Injektion des Spermiums (ICSI) in die Eizelle zur Verfügung.

Da bei dieser Methode jedoch auch"defekte"Spermien in die Eizelle injiziert werden können, birgt sie bisher noch nicht genau bekannte Gefahren von Mißbildungen oder sonstigen Entwicklungsstörungen des Embryos.

Daher besteht die dringende Notwendigkeit neue Substanzen und Mittel zur Fertilitätskontrolle, das heißt sowohl zur Fertilitätsförderung als auch zur Fertilitätshemmung, sowohl für die Frau, als auch für den Mann, bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle. Die Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur Induktion, Stimulation oder Hemmung des LH-abhängigen-Ovar-Proteins (LHOP) getestet wird. Dies geschieht vorzugsweise in hierzu geeigneten Testverfahren, bei denen die LHOP Aktivität induziert, stimuliert oder gehemmt wird. Sowie die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung von die Fertilität kontrollierenden Mitteln.

Des weiteren betrifft die Erfindung Mittel zur Fertilitätsförderung, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur des LHOP enthalten.

Unter die Fertilität kontrollierende Mittel gemäß, vorliegender Erfindung werden alle Mittel verstanden, die sich sowohl zur Fertilitätsförderung als auch zur Fertilitätshemmung, sowohl für die Frau, als auch für den Mann, eignen.

Unter stimulierenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP Enzymaktivität steigern.

Unter induzierenden Substanzen gemäß, vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP mRNA oder Proteinmenge erhöhen.

Unter hemmenden Substanzen gemäß, vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP Enzymaktivität herabsetzen und/oder hemmen und/oder die LHOP mRNA oder Proteinmenge vermindern.

Mit Hilfe der Kombination von 2-dimensionaler Gelelektrophorese und nachfolgender Massenspektrometrie wurde ein Protein in Maus Ovarien identifiziert, das durch das luteinisierende Hormon (LH) induziert wird. Eine Datenbanksuche zeigte, daß es sich dabei um ein Protein handelt, welches eine hohe Proteinsequenzhomologie zum Maus- Vas-Deferens-Protein (MVDP) und zum humanem ARL-1 (Cao et al. 1998, J. Biol.

Chem. 273 : 11429-11435) zeigt. Das MVDP wurde zum ersten Mal von Taragnat et al., 1988 (J. Reprod. Fert. 83 : 835-842) in Samenleitern von männlichen Mäusen beschrieben. Mit den oben beschriebenen Methoden konnte ein neues Protein im Ovar (LH-abhängiges-Ovar-Protein ; LHOP) nachgewiesen werden. Zudem konnte gezeigt werden, daß LHOP im Ovar unter der Kontrolle von LH spezifisch exprimiert wird. LH wird in der Mitte des Zyklus von der Hypophyse ausgeschüttet und bewirkt die meiotische Reifung der Eizelle sowie die Ovulation der Eizelle. Dies läßt darauf schließen, daß Substanzen, welche LHOP beeinflussen (stimulieren, induzieren oder hemmen) regulativ auf die Eizellreifung, die Follikelreifung, die Steroidogenese und/oder die Ovulation wirken.

Die Induktion von LHOP durch LH erfolgt sowohl auf der mRNA, als auch auf der Proteinebene. In einem Zeitverlauf konnte gezeigt werden, daß eine Induktion der mRNA bereits 2h nach Applikation des LH beginnt.

Sequenzvergleiche zeigten, daß das LHOP Protein zur Familie der Aldo-Keto- Reduktasen gehört. Diese Gruppe von Enzymen reduziert Aldehyde oder Ketone von verschiedenen Substraten. Auch Steroide mit Aldehyd-oder Ketogruppe zählen zu den Substraten der Familie der Aldo-Keto-Reduktasen.

Eine Hemmung des LHOP (auf mRNA-, Protein-und/oder Enzymebene) führt daher zu einer Hemmung der Eizellreifung, der Follikelreifung, der Steroidogenese und/oder der Ovulation. Eine Stimulierung des Proteins (auf mRNA, Protein-und/oder Enzymebene) oder eine Verabreichung des rekombinanten Proteins hat den gegenteiligen Effekt und fördert die Fertilität (z. B. bei Ovarialinsuffizienz oder beim Auftreten von polycystischen Ovarien).

Es ist beim männlichen Tier (Maus) beschrieben, daß das dem LHO Protein sehr ähnliche MVD Protein in großen Mengen im Vas deferens vorkommt. Eine Hemmung des LHOP und/oder des MVDP wird somit die Reifung und/oder den Transport der Spermien durch den Vas Deferens negativ beeinflussen und zu einer Fertilitätshemmung führen. Eine Stimulierung des LHOP und/oder des MVDP oder Verabreichung von rekombinantem Protein hingegen hat den gegenteiligen Effekt und trägt zur Förderung der männlichen Fertilität bei.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Fertilität, z. B. bei der in vitro oder in vivo Fertilisation, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des MVDP oder ARL-1 umfassen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Fertilität, z. B. bei der in vitro oder in vivo Fertilisation, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des LHOP umfassen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle. Die Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion oder Hemmung des LHO-Proteins getestet wird. Dies geschieht vorzugsweise in hierzu geeigneten Testverfahren, bei denen die LHOP Aktivität stimuliert oder gehemmt wird. Das Testverfahren kann beispielsweise als Hochdruckdurchsatz-Screeningverfahren automatisiert werden. Substanzen, die bei diesem Hochdruckdurchsatz- Screeningverfahren als LHOP hemmende oder stimulierende Substanzen identifiziert werden, können nachfolgend durch chemische Modifikation in ihrer Wirkung optimiert werden. Diese so gewonnenen Derivate lassen sich erfindungsgemäß, einsetzen.

Bei den so aufgefundenen Substanzen kann es sich um kleine Moleküle, Antisense- RNA, Ribozyme, GeneBloc oder weitere Substanzen handeln, welche Einfluß auf die Induktion der mRNA, des Proteins oder auch auf die enzymatische Aktivität des LHOP nehmen.

So eignet sich insbesondere ein Enzymassay zum Auffinden von Substanzen, die die LHOP Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) stimulieren oder hemmen.

Zum Auffinden derartiger Substanzen wird das LHO-Protein gereinigt. Dazu kann beispielsweise der kodierende Bereich des Ihop Gens in einen Expressionsvektor insertiert werden und das Enzym in pro-oder eukaryontischen Zellen überexprimiert

werden (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, 1997, Vol. 2 ; p. 16.0.1).

Das so gewonnene rekombinante Protein kann anschließend mit bekannten chromatographischen Methoden, zum Beispiel durch Größenausschluß-und/oder Kationen-und/oder Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt werden und nach Inkubation in Phosphatpuffer mit NADPH im Enzymtest eingesetzt werden.

Mit Hilfe des beschriebenen Enzymassays können Substanzen ausgetestet werden, die die Reduktion von Substraten der LHOP Aldo-Ketoreduktase stimulieren oder hemmen.

Die so aufgefundenen stimulierenden Substanzen werden dann zur Herstellung von Mitteln zur Förderung der Fertilität bei der Frau und beim Mann verwendet. Die hemmenden Substanzen werden zur Herstellung von Mitteln, die die Fertilität bei der Frau und/oder beim Mann hemmen, verwendet.

Des weiteren sind beispielsweise Antisense (AS) Moleküle, Ribozyme (RB) oder "Genebloc Reagenzien" (GB) zur Hemmung von LHOP auf Ebene der Transkription geeignet.

Die AS, RB oder GB Moleküle, können beispielsweise mit dem Fachmann bekannten Methoden von der Sequenz des Ihop Gens abgeleitet werden und beispielsweise in geeigneten Zell-und/oder Tiermodellen auf ihre die Fertilität hemmende Wirksamkeit in vitro und/oder in vivo getestet werden.

Als Testverfahren zum Auffinden von Molekülen, die das LHOP auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, eignet sich beispielsweise das Modell des perfundierten Ovars.

Beim Modell des perfundierten Ovars wird bei Ratten oder Mäusen das Ovar präpariert, wobei Infusionskatheter in die Aorta und Vena cava gelegt werden. Das Modell ist genau bei Brännström et al. 1987 (Acta Physio. Scand. 130 : 107-14) beschrieben. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen ausgetestet werden, die die LHOP Expression auf mRNA Protein-und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren.

Die so ausgetesteten hemmenden Substanzen werden dann, zur Herstellung von Mitteln zur Fertilitätshemmung, die induzierenden werden zur Herstellung von Mitteln für die Fertilitatsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, verwendet.

Zweckmäßigerweise werden pharmakologisch verträgliche Substanzen getestet. Hierzu zählen, wie bereits ausgeführt, niedermolekulare pharmakologische Wirkstoffe, insbesondere jedoch kleine Moleküle sowie AS/RB oder GB Moleküle.

Geeignete pharmazeutische Darreichungsformen enthalten den Wirkstoff in einer Menge, die entweder die Fertilität verhindert oder aber fördert.

Der Wirkstoff kann alleine oder in Kombination mit anderen Wikstoffen entweder gleichzeitig oder sequentiell verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann neben dem Wirkstoff weitere pharmazeutisch übliche Substanzen enthalten. Die Substanz kann entweder oral, nasal, transdermal, pulmonal oder parenteral, beispielsweise durch Injektion verabreicht werden. Weiterhin denkbar sind Implantate, sowie Vaginalringe oder intrauterine Systeme.

Oral verabreichbare Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern oder Flüssigkeiten vorliegen. Durch Injektion verabreichbare Zusammensetzungen sind üblicherweise in Form einer parenteral verträglichen wässrigen Lösung oder Suspension.

Schließlich betrim die Erfindung noch ein Verfahren zur Förderung der Fertilität, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge einer das LHO-Protein stimulierenden oder induzierenden Substanz verabreicht.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fertilitätshemmung, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge einer das LHO-Protein hemmenden Substanz verabreicht.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fertilitätshemmung, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge mindestens eines Abschnittes der Aminosäureprimärstruktur des LHOP, des MVDP oder des ARL-1 verabreicht.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Antikörper, welche gegen mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des LHOP des MVDP oder des ARL-1 gerichtet sind bzw. diese erkennen (Sambrook et al., 1989, Production of Antibodies 18.3 ; Piückthun, Bio/Technology 9 (1991), 545-551 und darin zitierte Literaturstellen). Sowie die Verwendung dieser Antikörper bzw. Mittel sowie Kits diese enthaltend zur Diagnose der Fertilität beim Mann oder der Frau.

Des weiteren betrifft die Erfindung Antisensemoleküle, welche gegen mindestens einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz oder die gesamte Sequenz des Ihop, mvdp oder arl-1 gerichtet sind bzw. diese erkennen (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100,431-440)). Sowie die Verwendung dieser Antisensemoleküle bzw. Mittel sowie Kits diese enthaltend zur Diagnose der Fertilität beim Mann oder der Frau.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren erläutert.

Es zeigen : Figur 1 : Identifizierung des LHO-Proteins im Ovar.

Ovarien von immaturen, FSH-geprimten Mäusen (Alter : 19-23 Tage) wurden vor bzw. 14 h nach LH-Applikation entnommen und für die weitere Analytik präpariert. Mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese wurde ein Proteinspot detektiert, der unter LH-Einfluß signifikant variant exprimiert ist.

Figur 2 : In situ Hybridisierung zum Nachweis der Ihop mRNA im Ovar der Maus.

Ovarien von immaturen, FSH-geprimten Mäusen (Alter 19-25 Tage) wurden vor (A) bzw. nach LH-Applikation (B ; 6h nach LH-Behandlung) entnommen und in Tissue Teck zur Durchführung eine in situ Hybridisierung eingebettet. Mit Hilfe einer für die Ihop mRNA spezifischen

Sonde konnte die Ihop mRNA spezifisch in Ovarien (in Theca-und Stromazellen) nach LH-Behandlung nachgewiesen werden (B).

Figur 3 : Northern-Blot von Maus-Ovarien mRNA. Nach LH-Applikation konnte eine 300-fache Steigerung der hop mRNA gemessen werden.

Figur 4 : Vergleich zwischen dem MVDP und ARL-1-Protein.

Figur 5 : SDS-PAGE zeigt Proteinfraktionen vor/nach Überexpression von LHOP in E. coli und vor/nach Aufreinigung des überexprimierten LHOP mit Hilfe einer NiNTA Affinitätssäule. Aufgereinigte LHOP-Proteinfraktion (Spur 5) wird im Enzymassay eingesetzt.

Beispiele 1) Enzymassay zum Austesten von Substanzen, die die LHOP Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) stimulieren.

Zur Herstellung von rekombinantem LHOP Protein wurde der kodierende Bereich der LHOP cDNA unter Beachtung des Leserasters in den Expressionsvektor pQE30 (Firma Qiagen) zwischen einen IPTG induzierbaren Promotor und einem N-terminalen 6xHistidin-Signal kloniert. Der Vektor wurde in den E. coli Stamm DH5a transformiert. Nach Überexpression und Zellaufschluß erfolgte die native Proteinaufreinigung über eine Nickel- Affinitätssäule (NiNTA-Agarose, Firma Qiagen) nach Angaben des Herstellers (The QlAexpressionist, Qiagen). Die eluierte LHOP Protein Fraktion wurde gegen 10 mM Phosphatpuffer dialysiert und im Enzymassay eingesetzt. Der Standard Enzymreaktionsansatz enthielt 135 mM Natrium-Phosphatpuffer (pH 6,3), 0, 2 mM NADPH und angemessene Substrat-und Enzymkonzentrationen.

Die Enzymreaktion erfolgte bei 28°C und der Substratumsatz wurde spektrometrisch über die Abnhame der Ao von NADPH bestimmt. Die Reaktion wurde duch die Zugabe von Enzym gestartet. Es wurden standardmäßig Kontrollen ohne Substrat und ohne Enzym gemessen. Eines der Standardsubstrate für Aldo-Ketoreduktasen ist DL-glyceraldehyde. Mit Hilfe des beschriebenen Enzymassays können Substanzen ausgetestet werden, die die Reduktion von Substraten der LHOP Aldo-Ketoreduktase stimulieren.

2) Enzymassay zum Austesten von Substanzen, die die LHOP Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) hemmen.

Der oben beschriebene Enzymassay sollte analog wie unter 1) beschrieben eingesetzt werden um Substanzen aufzufinden, die die LHOP-Aktivität hemmen.

3) Einsatz von"GeneblocReagenzien" (GB) zur Hemmung der LHOP Transkription.

4 unterschiedliche Ihop spezifische GB Moleküle und ein Kontroll GB Molekül wurden mit Hilfe geeigneter Computerprogramme von der c-DNA Sequenz des

Ihop Gens abgeleitet und von der Firma Atugen synthetisiert. Die GB Moleküle sollen mit Hilfe von Alzet-pumps bei der Maus in vivo appliziert (Dosierung 3- 30mg/kg) werden. Zur Identifizierung derjenigen GB-Moleküie, die eine Transkription der Ihop mRNA inhibieren, wird die Methode der in situ Hybrisierung eingesetzt. Dazu werden die Ovarien der behandelten Tiere entnommen und in Tissue Teck eingebettet. Nachfolgend wird eine in situ- Hybridisierung mit Ihop-spezifischen Sonden nach Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100,431-440) durchgeführt. Die GB Moleküle können alternativ in vitro appliziert werden. Dazu wird eine Follikelkultur von reifen Follikeln (genaue Beschreibung siehe Fehrenbach et al., J Reprod Fertil. 1998 Ju1 ; 113 (2) : 287-97) angelegt und die o. g. Moleküle werden der Kultur zugesetzt. Durch beide Methoden der Applikation von Ihop- spezifischen GB Molekülen in vitro oder in vivo können GB Moleküle identifiziert werden, die die Bildung der Ihop-mRNA hemmen. Diese Moleküle können dann beim Menschen eingesetzt werden, wo es zu einer Hemmung der Follikelreifung, Eizellreifung und/oder der Ovulation bei der Frau kommt. Werden diese Moleküle beim Mann in vivo appliziert, wird die Reifung der Spermien und/oder der Transport durch den Vas Deferens gehemmt. Spezifische GB Moleküle, die die Transkription der Ihop-mRNA hemmen, können als Kontrazeptiva beim Mann und bei der Frau eingesetzt werden.

4) Beim Modell der perfundierten Ovars wird das Ovar von Ratten oder Mäusen präpariert, wobei Infusionskatheter in die Aorta und Vena cava gelegt werden.

Das Modell ist genau bei Brännström et al. 1987 (Acta Physio. Scand. 130 : 107- 14) beschrieben. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen aufgefunden werden, die die LHOP Expression auf mRNA-, Protein-und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen hemmenden Substanzen sind zur Fertilitätshemmung, die induzierenden sind zur Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, geeignet.

5) Auffinden von Substanzen, die das LHOP auf mRNA-, Protein-und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, mittels des Modells der hypophysektomierten Ratte Das Modell der hypophysektomierten Ratte ist von JS Richard, 1980 (Physiol.

Rev. 60 : 51-89) ausführlich beschrieben worden. Bei diesem Modell wird die Follikelreifung und die Ovulation durch ein genau definiertes Hormonregime (siehe Literaturstelle oben) induziert. Die Injektion von 17-ß-Estradiol gefolgt von Follikel-Stimulierendem Hormon (FSH) stimuliert die Follikelreifung, die nachfolgende Injektion von LH triggert die Eizellreifung, Steroidogenese und die Ovulation. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen aufgefunden werden, die die LHOP Expression auf mRNA-, Protein-und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen hemmenden Substanzen sind zur Fertilitätshemmung, die induzierenden zur Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, geeignet.

6) Auffinden von Substanzen, die das LHOP auf mRNA-Protein-und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, mittels des Modells der immaturen Ratte Im Modell der immaturen Ratte wird duch Injektion von 5-10 IU (FSH) die Follikelreifung synchron in vielen Follikeln des Ovars induziert. Nach 48 h wird

mit 10 1. U. LH die Eizellreifung, Steroidogenese und Ovulation ausgelöst. Mit Hilfe dieses Modells können ebenfalls Substanzen gefunden werden, die die LHOP Expression auf mRNA-, Protein und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen Substanzen können zur Fertilitätskontrolle beim Mann und bei der Frau eingesetzt werden.